Summary
Embryonale ontwikkeling vereist grootschalige coördinatie van celbewegingen. Twee-foton excitatie gemedieerde laserablatie maakt de ruimtelijk gecontroleerde 3-dimensionale ablatie van grote groepen diepe cellen mogelijk. Bovendien kan deze techniek de reactie van collectief migrerende cellen in vivo op verstoringen in hun mechanische omgeving onderzoeken.
Abstract
Morfogenese omvat veel celbewegingen om cellen in weefsels en organen te organiseren. Voor een goede ontwikkeling moeten al deze bewegingen nauw worden gecoördineerd, en accumulerend bewijs suggereert dat dit, althans gedeeltelijk, wordt bereikt door mechanische interacties. Het testen hiervan in het embryo vereist directe fysieke verstoringen. Laserablaties zijn een steeds vaker gebruikte optie die het mogelijk maakt om mechanische beperkingen te verlichten of twee celpopulaties fysiek van elkaar te isoleren. Veel ablaties worden echter uitgevoerd met een ultraviolette (UV) laser, die een beperkte axiale resolutie en weefselpenetratie biedt. Hier wordt een methode beschreven om diepe, significante en ruimtelijk goed gedefinieerde volumes af te breken met behulp van een microscoop met twee fotonen. Ablaties worden gedemonstreerd in een transgene zebravislijn die het groene fluorescerende eiwit in het axiale mesendoderm tot expressie brengt en wordt gebruikt om het axiale mesendoderm af te snijden zonder het bovenliggende ectoderm of de onderliggende dooiercel te beïnvloeden. Het celgedrag wordt gevolgd door live beeldvorming voor en na de ablatie. Het ablatieprotocol kan worden gebruikt in verschillende ontwikkelingsstadia, op elk celtype of weefsel, op schalen variërend van enkele micron tot meer dan honderd micron.
Introduction
Cel-cel interacties spelen een vitale rol in de ontwikkeling. Cellen geven signalen die hun directe buren, of cellen verder weg, kunnen waarnemen, waardoor hun lot en/of gedrag wordt beïnvloed. Veel van deze signalen zijn chemisch van aard. Bijvoorbeeld, in de goed gekarakteriseerde inductiegebeurtenissen produceert een celgroep diffuusibele moleculen die het lot van een andere celpopulatie beïnvloeden1. Andere signalen zijn echter mechanisch; cellen oefenen krachten en beperkingen uit op hun buren, die de buren waarnemen en waarop ze reageren2.
Een manier om het belang van deze cel-cel interacties in vivo te bestuderen, is door sommige cellen te elimineren en de daaropvolgende ontwikkeling te observeren. Helaas zijn de beschikbare technieken om cellen te verwijderen of te vernietigen beperkt. Cellen kunnen chirurgisch worden verwijderd3,4, met behulp van naalden of kleine draden, maar dergelijke behandelingen zijn invasief, niet erg nauwkeurig en worden meestal uitgevoerd onder een stereomicroscoop, waardoor onmiddellijke beeldvorming onder een microscoop wordt voorkomen. Bovendien impliceert het richten op diepe cellen het doorboren van een gat in bovenliggende weefsels, waardoor ongewenste verstoringen ontstaan. Genetisch gecodeerde fotosensitizers, zoals KillerRed, zijn gebruikt om celdood te induceren via lichtverlichting5. Fotosensitizers zijn chromoforen die reactieve zuurstofsoorten genereren bij lichtbestraling. Hun belangrijkste beperking is dat ze lange lichtverlichting nodig hebben (ongeveer 15 minuten), wat moeilijk te bereiken kan zijn als cellen bewegen, en dat ze celdood induceren door apoptose, wat niet onmiddellijk is.
Ten slotte zijn laserablaties ontwikkeld en op grote schaal gebruikt in de afgelopen 15 jaar6,7,8,9,10,11,12. Een laserstraal wordt gericht op de beoogde cel/weefsel. Het induceert zijn ablatie door verhitting, fotoablatie of plasma-geïnduceerde ablatie; het betrokken proces is afhankelijk van de vermogensdichtheid en belichtingstijd13. De meeste ablatieprotocollen gebruiken UV-lasers voor hun hoge energie. UV-licht wordt echter zowel geabsorbeerd als verstrooid door biologische weefsels. Het richten op diepe cellen vereist dus een hoog laservermogen, dat vervolgens schade veroorzaakt in meer oppervlakkige, buiten het vlak gelegen weefsels. Dit beperkt het gebruik van UV-lasers tot oppervlakkige structuren en verklaart hun relatief lage axiale resolutie. Niet-lineaire optica (zogenaamde twee-fotonenmicroscopie) maakt gebruik van niet-lineaire eigenschappen van licht om een fluorofoor te prikkelen met twee fotonen van ongeveer halve energie in het infrarode domein. Wanneer toegepast op ablaties, heeft dit drie belangrijke voordelen. Ten eerste wordt het infraroodlicht minder verstrooid en minder geabsorbeerd dan UV-licht door biologische weefsels14, waardoor diepere structuren kunnen worden bereikt zonder het vereiste laservermogen te vergroten. Ten tweede zorgt het gebruik van een femtoseconde gepulseerde laser voor zeer hoge vermogensdichtheden, waardoor een ablatie ontstaat door plasma-inductie, die, in tegenstelling tot verwarming, niet ruimtelijk diffundeert15. Ten derde wordt de vermogensdichtheid die plasmavorming induceert alleen op het brandpunt bereikt. Dankzij deze eigenschappen kunnen laserablaties met twee fotonen worden gebruikt om diepe cellen nauwkeurig te richten zonder de omliggende weefselomgeving te beïnvloeden.
Collectieve migraties zijn een uitstekend voorbeeld van ontwikkelingsprocessen waarbij cel-cel interacties fundamenteel zijn. Collectieve migraties worden gedefinieerd als celmigraties waarbij naburige cellen het gedrag van één cel beïnvloeden16. De aard van deze interacties (chemisch of mechanisch) en hoe ze celmigratie beïnvloeden, kan sterk variëren en wordt vaak niet helemaal begrepen. Het vermogen om cellen te verwijderen en te observeren hoe dit de anderen beïnvloedt, is van cruciaal belang bij het verder ontrafelen van deze collectieve processen. Een paar jaar geleden stelden we vast – met behulp van chirurgische benaderingen – dat de migratie van de polster tijdens zebravisgastrulatie een collectieve migratie is17. De polster is een groep cellen die de eerste internaliserende cellen aan de dorsale kant van het embryo vormt18. Deze cellen, gelabeld in groen in de Tg (gsc: GFP) transgene lijn, bevinden zich diep in het embryo, onder verschillende lagen epiblastcellen. Tijdens gastrulatie leidt deze groep de uitbreiding van het axiale mesoderm, migrerend van de embryonale organizer naar de dierlijke pool19,20,21,22,23 (figuur 1A). We stelden vast dat cellen contact met hun buren nodig hebben om hun migratie in de richting van de dierenpool te oriënteren. Een beter begrip van de cellulaire en moleculaire bases van deze collectieve migratie houdt echter in dat sommige cellen worden verwijderd om te zien hoe dit de resterende cellen beïnvloedt. Daarom ontwikkelden we ablaties van grote en diepe volumes met behulp van een microscopie-opstelling met twee fotonen. Hier demonstreren we het gebruik van dit protocol om de polster in het midden te scheiden en de gevolgen voor celmigratie te observeren door kernen te volgen die zijn gelabeld met Histone2B-mCherry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Ethische Commissie N 59 en het Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche onder het dossiernummer APAFIS#15859-2018051710341011v3. Sommige van de onderstaande stappen zijn specifiek voor onze apparatuur en software, maar kunnen eenvoudig worden aangepast aan verschillende apparatuur.
1. Injectie voorbereiding
- Bereid 75 ml 1% agarose-oplossing in Embryo Medium (EM).
- Plaats de spuitvorm in een petrischaaltje van 90 mm en giet ongeveer 50 ml agarose, genoeg om de mal te laten drijven. Laat de agarose stollen en verwijder de spuitvorm.
- Bereid een met agarose bedekte schaal door 1 ml agarose in een petrischaaltje van 30 mm te gieten.
- Bereid 4 μL van 30 ng/μL Histone2B-mCherry mRNA-oplossing door de stamoplossing te verdunnen in RNase-vrij water en op ijs te houden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u handschoenen draagt tijdens het manipuleren van mRNA om RNase-gemedieerde degradatie te voorkomen. - Trek een injectienaald uit een capillair met behulp van de micropipette puller.
2. Embryopreparatie
- Zodra vissen eieren hebben gelegd, verzamelen, spoelen en oogsten in een petrischaaltje van 90 mm in EM. Plaats de embryo's in een couveuse van 28,5 °C.
- Wacht 20 minuten tot de eerste cel zichtbaar is.
- Breng 30 embryo's terug naar de injectieplaat gevuld met EM. Knijp embryo's in de groeven met een licht stompe tang en oriënteer ze met de dierenpaal omhoog.
- Vul met behulp van een microladerpunt een injectienaald met 2 μL mRNA-oplossing. Steek de naald in de capillaire houder die is geplaatst in een micromanipulator die is verbonden met een slang van polytetrafluorethyleen (PTFE) op een luchtinjector.
- Breek onder de stereomicroscoop voorzichtig de punt van de naald.
- Injecteer de mRNA-oplossing in de embryo's van het 1-celstadium door de naald in de cel in te brengen.
OPMERKING: Het geïnjecteerde volume is ongeveer een derde van het celvolume. - Plaats de geïnjecteerde embryo's terug in de couveuse van 28,5 °C.
3. Voorbereiding van de twee-fotonenmicroscoop
OPMERKING: In dit protocol worden twee lasers gebruikt. Men wordt gebruikt om GFP in beeld te brengen (bij 920 nm) en ablaties uit te voeren (bij 820 nm). Het wordt de groene /ablatielaser genoemd. De andere wordt gebruikt bij 1160 nm om mCherry in beeld te brengen. Het zal de rode laser worden genoemd.
- Stel de groene/ablatielaser in op 820 nm (ablatiegolflengte) en de rode laser op 1160 nm (mCherry excitatie).
- Gebruik beweegbare spiegels op het optische pad om groene/ablatie- en rode laserstralen uit te lijnen, zowel bij het in- als uitstappen van de scankop.
OPMERKING: Dit verhoogt de focus van de laserstraal en minimaliseert het focale volume voor excitatie en ablatie. - Meet het maximale vermogen van de groen/ablatielaser bij 820 nm onder het objectief. Plaats hiervoor de vermogensmeter onder het objectief, sluit de zwarte kamer, stel het groene / ablatielaservermogen in op 100% en open de luiken. Bereken het percentage laservermogen dat nodig is om 300 mW te bereiken.
- Zet de groene/ablatielaser terug op 920 nm (GFP excitatie) en stel het laservermogen in op 7%. Stel het rode laservermogen in op 15%.
- Activeer epi-PhotoMultiplier Tubes (PMT) detectoren voor groene en rode lijnen; stel de PMT-gevoeligheid van de groene en rode lijn in op 65.
- Stel het gezichtsveld in op 400 x 400 μm, de beeldresolutie op 512 x 512 pixels en de scanfrequentie op 800 Hz.
- Selecteer 3D Timelapse Imaging-modus . Maak vervolgens een map en activeer Automatisch opslaan voor gegevens na elke acquisitie.
- Monteer de verwarmingskamer en stel deze in op 28 °C. Wacht minstens 10 minuten tot de kamer en het doel opwarmen.
4. Montage van het embryo
- Identificeer onder een fluorescentieseomicroscoop embryo's met 70% epibolie die GFP tot expressie brengen.
OPMERKING: Selecteer embryo's met een helder signaal in het axiale mesoderm en geen achtergrondfluorescentie voor een betere beeldkwaliteit. - Breng drie tot vier geselecteerde embryo's over in de met agarose beklede schaal (stap 1.3) met behulp van een plastic Pasteur-pipet en dechorioneer ze zorgvuldig met een fijne tang.
OPMERKING: Gedórioneerde embryo's zijn zeer delicaat en zullen barsten bij contact met lucht of plastic. - Giet 1 ml van 0,2% agarose in 1x penicilline-streptomycine EM in een kleine glazen injectieflacon. Plaats de injectieflacon in een voorverwarmde droge blokverwarmer van 42 °C.
OPMERKING: De volgende stappen moeten snel worden uitgevoerd om embryo-oriëntatie mogelijk te maken voordat agarose ondergaat. - Breng een gedechorioneerd embryo over in de 0,2% agarose glazen injectieflacon met behulp van een vuurgepolijste glazen pipet. Zorg ervoor dat u niet te veel EM in de agarose toevoegt om te voorkomen dat deze verdunt. Gooi de resterende EM uit de pipet en anspirateer het embryo terug samen met voldoende agarose om de glijbaan van de glazen bodemschaal te bedekken voordat het embryo uit de pipet valt.
- Blaas de agarose en het embryo op de glasplaat van de schaal. Zorg ervoor dat het embryo de lucht of de plastic kant van de schaal niet raakt. Vul vervolgens de kamer rond de glasplaat met agarose.
- Gebruik een wimper om het embryo zo te oriënteren dat het beoogde gebied zich bovenaan bevindt (figuur 1B).
OPMERKING: Let er bij het oriënteren van embryo's op dat u alleen het blastoderm aanraakt, niet de zeer fragiele dooier. Agarose zal in ongeveer 1 min ingaan, afhankelijk van de kamertemperatuur. - Wacht ~ 5 minuten tot de agarose volledig is uitgehard en voeg dan een paar druppels penicilline-streptomycine EM toe.
5. Lokalisering van het embryo en pre-ablatie beeldvorming
- Plaats de glazen bodemschaal onder het objectief in de verwarmde kamer. Dompel het doel onder in penicilline-streptomycine EM en sluit de verwarmde kamer.
- Verplaats de schuifregelaar om het lichtpad in te stellen op een oculair. Zoek vervolgens met behulp van oculairen, fluorescentielampen en podiumcontrole een embryo en stel de focus op het oppervlak van het embryo.
- Schakel de fluorescentielamp uit, stel het lichtpad in op PMT's en sluit de zwarte kamer.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u alle lichtbronnen in de zwarte kamer uitschakelt, omdat dit de PMT's kan beschadigen. - Start live beeldvorming en lokalis mesoderm. Pas de groene/ablatie- en rode laserkrachten aan om een goed signaal te hebben (d.w.z. tussen 1.000 en 20.000 fotonen per pixel voor GFP-expressiegebieden). Gebruik het rode kanaal om het podium naar de top van het embryo te verplaatsen en stel deze positie in als Z = 0.
- Kies een tijdstap van 1 min en een Z-stap van 2 μm. Een Z-kuur van 110 μm is voldoende om de hele polster te omvatten en wordt met deze instellingen in minder dan 1 minuut verkregen. Plaats de eerste plak 15 μm boven het axiale mesoderm (in het meer oppervlakkige ectoderm).
OPMERKING: De polster beweegt langs een gebogen lijn, zodat het onderste deel van de Z-stack 30 μm dieper moet worden ingesteld dan de diepste positie van de polster om de beweging tijdens de time-lapse-beeldvorming mogelijk te maken (figuur 1E). - Neem 10-15 minuten pre-ablatiefilm op.
Figuur 1: Succesvolle uitkomst van laserablaties. (A) Schema van een gastrulerend embryo bij 70% epibolie in dorsale weergave; pAM: posterieur axiale mesoderm; zwarte pijl markeert de richting van polstermigratie; zwart vierkant geeft een typisch gezichtsveld aan voor ablaties in de polster. (B) Schema voor het verzamelen van embryo's voor het scheiden van polster. Zijdelingse weergave. Het embryo is zo gemonteerd dat het vlak van de polster loodrecht staat op de optische as. (C) overleving en (D) morfologie van controle- en geableerde embryo's 24 uur na de bevruchting. Schaalbalk is 300 μm. (E) Tijdsequentie van laserablatie in de polster van een Tg (gsc: GFP) embryo dat Histone2B-mCherry tot expressie brengt. Weergaven met alleen het groene kanaal zijn maximale projecties. De close-up toont het opgeblazen gebied met celresten. Weergaven met groene en rode (weergegeven als magenta) kanalen zijn XY- en XZ-segmenten voor en na ablatie (de groene bliksemschicht staat voor ablatie). XZ-plakjes laten zien dat de bovenliggende weefsels (magentakernen zonder GFP-expressie) niet zijn aangetast door de ablatie van onderliggende structuren. Het gele vak met streepjes komt overeen met de ROI die is geselecteerd voor laserablatiebehandeling. De schaalbalk is 50 μm in grote weergaven en 25 μm in de close-up. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Doellocatie en laserablatie
- Zoek de polstercontour op live imaging en teken met behulp van het gereedschap Electro-Optic Modulator Region of Interest (EOM ROI) een grote rechthoek van 20 pixels (15 μm) die de breedte van de polster overspant. Plaats deze rechthoek in het midden van de polster (figuur 1E).
- Let op de axiale positie van het hoogste en laagste vlak dat polstercellen bevat. Ablaties zullen elke 10 μm tussen deze twee vlakken worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat de ROI de dooiercel op geen van deze vlakken overlapt.
- Plaats het podium op de laagste Z-positie van het interval. Ablaties moeten bottom-up worden uitgevoerd omdat vuil licht absorbeert.
- Stel de golflengte van de groene/ablatielaser in op 820 nm en stel het vermogenspercentage in om een uitgangsvermogen van 300 mW te verkrijgen (stap 3.3).
- Stel de beeldfrequentie in op 200 Hz.
- Stel groene/ablatielaserbeeldvorming EOM in op 0 en selecteer ROI-Treat-modus .
- Schakel de EOM in en stel de behandeling in om onmiddellijk te starten (na 0 frame).
- Stel de beeldmodus in op Timelapse en schakel Automatisch opslaan uit.
- Stel de tijdstap in op de snelle modus.
- Stel het aantal behandelingsframes en het aantal frames in op de waarde die overeenkomt met de beoogde diepte (tabel 1).
| Diepte (μm) | Behandelframes |
| -30 | 1 |
| -35 | 1-2 |
| -40 | 1-2 |
| -45 | 2 |
| -50 | 2-3 |
| -55 | 3 |
| -60 | 3-4 |
| -65 | 4 |
| -70 | 4 |
| -75 | 4-5 |
| -80 | 4-5 |
| -85 | 5 |
| -90 | 5 |
| -95 | 5-6 |
| -100 | 6 |
| -105 | 6 |
Tabel 1: Voorgesteld aantal laserbehandelingsframes als functie van de beoogde celdiepte in het embryo (0 is het oppervlak van het embryo).
- Begin met beeldvorming. De overname is zwart als de sluiter naar PMT sluit tijdens de EOM-behandeling.
- Ga omhoog in het werkgebied naar de volgende Z-positie van de lijst (stap 6.2).
- Herhaal stap 6.10 tot 6.12 totdat de bovenkant van de polster is bereikt.
7. Post-ablatie verificatie en beeldvorming
- Stel de groen/ablatielaser in op 920 nm en 5% vermogen. Stel de groene/ablatie laser imaging EOM in op 100 en selecteer de Fullfield-modus .
- Stel de beeldfrequentie in op 800 Hz. Schakel EOM uit.
- Ga door de hele stapel in live-modus om te controleren of elk vliegtuig is geableerd. Als dit niet het geval is, gaat u terug naar stap 6.2.
OPMERKING: Ablatie induceert soms een verticale verschuiving van naburige weefsels, zodat de Z-stack mogelijk opnieuw moet worden gedefinieerd. - Stel de beeldmodus in op 3D Timelapse en activeer Automatisch opslaan opnieuw. Neem 40-60 minuten post-ablatiefilm op.
- Controleer in de post-ablatiefilm of de beoogde cellen effectief werden geableerd. Fluorescentieherstel, of gerichte cellen die ruimte innemen en voorkomen dat volgcellen er doorheen bewegen, geven aan dat gerichte cellen alleen gefotobleekt waren en niet opgeblazen (figuur 1E en figuur 2A).
Figuur 2: Negatieve resultaten van laserablaties. (A) Typische voorbeelden van mogelijke storingen in laserablatie. Grote XY-weergaven zijn maximale projecties, XZ-weergave is een gereconstrueerd gedeelte. Laserbehandeld gebied bevindt zich tussen de twee witte pijlpunten. Drie brandpuntsvlakken worden gemarkeerd in het gereconstrueerde gedeelte en aan de rechterkant weergegeven. Ze komen overeen met drie verschillende soorten mislukkingen. Vlak 1 laat zien dat cellen boven de polster zijn geableerd. Dit is te herkennen aan de aanwezigheid van autofluorescent puin op dit brandpuntsvlak (zie close-up) boven de polster (zie positie van vlak 1 op het gereconstrueerde gedeelte). Dit is waarschijnlijk het gevolg van een onjuiste definitie van de regio die moet worden geableerd. Vlak 2 toont cellen die gebleekt zijn maar niet geableerd. Ze kunnen worden geïdentificeerd omdat het lage fluorescentiesignaal nog steeds intacte celcontouren onthult (zie close-up). Vlak 3 toont intacte cellen, die nauwelijks zijn gebleekt door laserbehandeling. Dit kan het gevolg zijn van een onjuiste definitie van de regio die moet worden geableerd of van een slechte behandeling. In de situaties die in de vlakken 2 en 3 worden afgebeeld, is het mogelijk om de ablatiebehandeling opnieuw toe te passen op de niet-geableerde doelcellen. De schaalbalk is 50 μm in grote weergaven en 20 μm in close-ups. (B) Een typisch voorbeeld van bellen (gemarkeerd door witte sterretjes) gevormd door cavitatie als gevolg van een te intense laserbehandeling. Dergelijke bubbels zijn niet beperkt tot een Z-vlak, soms zelfs over de volledige hoogte van de polster, waardoor naburige weefsels worden vervormd. De schaalbalk is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
8. Data-analyse
- Open time-lapse-series met de beeldanalysesoftware en stel de juiste pixelgrootte in.
- Stel in de spotfunctie de objectgrootte in op 10 μm, omdat dit de gemiddelde kerngrootte is tijdens gastrulatie. Voer vervolgens de spotfunctie uit om de kernen te detecteren en te volgen.
OPMERKING: De detectie kan enigszins worden verbeterd door rekening te houden met de onderste axiale resolutie, passend bij een 12 μm lange ellipsoïdale vorm langs de Z-as. - Gebruik filters om valse positieven te verwijderen. In de Tg(Gsc:GFP)- lijn zijn cellen van de embryonale as en sommige endodermale cellen groen gelabeld. Daarom maakt filteren op groene intensiteit een snelle selectie van deze cellen mogelijk (figuur 3A).
- Stel de maximale afstand tussen opeenvolgende punten in op een waarde die compatibel is met de snelheid van de cellen.
OPMERKING: Houd rekening met het tijdsinterval tussen twee frames. Polstercellen migreren met 2,8 ± 0,8 μm/min. Daarom verwijdert het toestaan van 4 μm maximale verplaatsing gedurende een tijdstap van 1 minuut de meeste artefactuele sporen. - Het toestaan van hiaten over een of twee tijdspunten zorgt voor langere continue tracks, maar kan trackingfouten veroorzaken. Als een kern op een eenmalig punt niet correct wordt gedetecteerd, overweeg dan om spotdetectie opnieuw uit te voeren met verschillende parameters/filters.
- Controleer tracks visueel en corrigeer ze indien nodig.
- Exporteer de resultaten als een .xlsx bestand. Verwerk het bestand met behulp van gepubliceerde spreadsheetroutines24 (figuur 3B) en aangepaste routines op data-analysesoftware (beschikbaar op aanvraag).
Figuur 3: Isolatie van de voorste helft van de polster beïnvloedt de richting van de cel. (A) 3D reconstrueert een Tg(gsc:GFP) embryo dat Histone2B-mCherry tot expressie brengt (weergegeven in magenta), voor en na een laserablatie die de polster in het midden doorsnijdt. Kernen die tot de voorste helft van de polster behoren, zijn gemarkeerd met een magenta-stip en worden in de tijd voor en na ablatie gevolgd (zie Film S1). De schaalbalk is 50 μm. (B) Als maat voor migratiepersistentie, richtingsautocorrelatie van cellen die behoren tot het voorste deel van de polster voor en na ablatie. Cellen vertonen een continue beweging vóór ablatie, die drastisch afneemt na ablatie, wat wijst op verlies van collectief georiënteerde migratie. Richting auto-correlatie werd ook gemeten op cellen die de voorste helft van de polster van een niet-geableerd embryo vormden, als een controle. De grafiekenveloppen geven een standaardfout aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de polster in het midden te snijden, werd een Tg(gsc:GFP) embryo, geïnjecteerd met Histone2B-mCherry mRNA's gemonteerd in het 70% epiboly stadium, zoals beschreven in stap 4. De polster werd geïdentificeerd door GFP-expressie en het embryo werd zo gemonteerd dat het vlak van de polster loodrecht op de optische as staat (figuur 1B). Het kantelen van het embryo uit deze positie zal de procedure bemoeilijken. Het licht zal door meer weefsels moeten gaan om de ablatievlakken te bereiken, en ablatievlakken zullen worden gekanteld ten opzichte van embryonale assen. Na te hebben geverifieerd dat alle celkernen correct zijn gelabeld, werd een pre-ablatie time-lapse van 10 minuten geregistreerd om celbewegingen vóór ablatie vast te leggen (figuur 1E en figuur 3A, film S1).
De polster werd morfologisch geïdentificeerd en een rechthoekig gebied van 15 μm x 200 μm, gelegen in het midden, werd op vijf brandpunten gesust om ervoor te zorgen dat de hele diepte van de polster werd doorsneden (Figuur 1E, Film S1). De beeldvorming werd direct na de ablatie opnieuw gestart en gebruikt om de efficiëntie van de procedure te controleren. Indien succesvol, zal de ablatie alle cellulaire structuren en GFP- en mCherry-fluorescentie hebben geëlimineerd, zodat het opgeblazen volume als een signaalvrij volume zou moeten verschijnen. Er kan echter wat puin ontstaan. Dit puin is autofluorescent, zowel in het groene als in het rode kanaal, en vertoont meestal onregelmatige langwerpige vormen parallel aan de ablatierichting (figuur 1E). Een te intensieve behandeling zal een grote hoeveelheid puin vormen die als een obstakel kan fungeren en het gedrag van cellen kan verstoren. Sterkere behandelingen zullen zelfs cavitatie veroorzaken, gekenmerkt door de vorming van bellen in het weefsel (figuur 2B). Cavitatie wordt geassocieerd met een mechanische schokgolf die zich voortplant in weefsels en kan schade veroorzaken uit het beoogde volume13,15. Embryo's met cavitatiebellen moeten worden weggegooid en de behandeling moet worden afgesteld door minder behandelingsframes uit te voeren.
Omgekeerd kan te weinig behandeling fluoroforen fotobleachen zonder plasmavorming te induceren, dus zonder te aborteren (figuur 2A). Onvolledige fotobleaching kan gemakkelijk worden opgemerkt door de aanwezigheid van zwakke fluorescentie met een karakteristieke cellulaire vorm (figuur 2A). Dergelijke embryo's moeten worden weggegooid of opnieuw worden behandeld met meer behandelingsframes. Volledige fotobleaching is uitdagender om te onderscheiden van succesvolle ablatie, omdat beide zouden resulteren in een signaalvrij volume. Fotobleaching kan echter retrospectief worden geïdentificeerd, omdat fluorescentie zich geleidelijk zal herstellen in de loop van de post-ablatiebeeldvorming. Dit houdt echter in dat niet-geableerde embryo's minstens een half uur in beeld worden gebracht, wat tijdrovend is. We stellen daarom voor om de behandelingsintensiteit aan te passen (door het aantal behandelingen te verhogen) om de vorming van weinig zichtbaar puin te induceren, wat het celgedrag niet zal beïnvloeden, maar onmiddellijk effectieve ablatie zal bevestigen. Ten slotte moet de afwezigheid van schade in cellen rond het ablatievolume worden gecontroleerd op de eerste post-ablatiebeelden (figuur 2A). Wanneer de laserbehandeling correct is afgestemd (vorming van weinig puin), is het onwaarschijnlijk dat schade in naburige weefsels het gevolg is van de ruimtelijke verspreiding van de ablatie, die zeer goed ruimtelijk is gedefinieerd, maar eerder het gevolg is van onnauwkeurige selectie van het te ableren gebied en / of weefselbewegingen in de tijd tussen doelselectie en ablatie. Embryo's met aangetaste naburige weefsels moeten worden weggegooid.
Na succesvolle ablatie werden gedurende 40 minuten elke minuut Z-stacks gevangen, waarbij zowel het GFP cytoplasmatisch signaal als het mCherry nucleaire signaal werden geregistreerd. Kernen werden vervolgens gevolgd en hun beweging werd gebruikt als een proxy voor celbeweging. Sporen die overeenkomen met polstercellen werden geïdentificeerd op hun sterke GFP-signaal (Figuur 3A, Film S1). De persistentie van celbewegingen werd gemeten door de celrichting auto-correlatie te berekenen24. Door zich te concentreren op polstercellen in de voorste helft van de polster bleek dat het scheiden van de polster in het midden, waardoor deze cellen van het achterste deel van de polster werden gescheiden, hun richting autocorrelatie verminderde (figuur 3B), wat aantoont dat een goede migratie van polstercellen integriteit van de hele polster vereist, in overeenstemming met de aangetoonde collectieve migratie17.
Na het verkrijgen van de post-ablatiefilm kunnen embryo's worden losgemaakt, zorgvuldig uit de agarose worden geëxtraheerd met behulp van een fijne tang en geïncubeerd bij 28,5 ° C totdat ze 24 uur na de bevruchting bereiken. Nogmaals, embryo's moeten overleven en mogen geen duidelijk morfologisch defect vertonen (figuur 1C,D).
Film S1: Succesvolle laserablatie. Laserablatie in het midden van de polster van een Tg(gsc:GFP) embryo dat Histone2B-mCherry tot expressie brengt. Kernen van het voorste deel van de polster worden in de loop van de tijd gevolgd en gemarkeerd door magenta-stippen. Tracks hebben een tijdskleurcode (figuur 3). Lege frames komen overeen met laserablatie. Klik hier om deze film te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een protocol dat niet-lineaire optica gebruikt om diepe en ruimtelijk goed gedefinieerde volumeablaties uit te voeren. De meest kritieke stap van het protocol is het vinden van behandelingsomstandigheden die voldoende energie leveren om ablaties mogelijk te maken, maar niet te veel energie, om overmatig vuil of cavitatie te voorkomen. De hoeveelheid geleverde energie op de doellocatie hangt voornamelijk af van: (1) het laseruitgangsvermogen, (2) de kwaliteit van de laseruitlijning, (3) de aard van het weefsel waardoor het licht passeert om het ablatievlak te bereiken, (4) de diepte van het ablatievlak. Daarom is het voor elk experiment cruciaal om het laseruitgangsvermogen te meten, aan te passen aan een referentiewaarde (300 mW bij 820 nm in ons protocol) en te zorgen voor een goede laseruitlijning. Volgens deze aannames moeten de behandelingsomstandigheden van de ene experimentele dag op de andere reproduceerbaar zijn. We raden aan om uitgebreide tests uit te voeren om optimale parameters (laservermogen en aantal behandelingsframes) voor een specifiek monstertype te definiëren. Deze parameters kunnen vervolgens in alle vergelijkbare experimenten worden gebruikt. In het hier beschreven voorbeeld (het verbreken van de polster tijdens gastrulatie) hebben we bijvoorbeeld behandelingsvoorwaarden vastgesteld voor ablaties op verschillende diepten in het embryo (tabel 1) en vertrouwen we nu op deze grafiek bij het uitvoeren van experimenten. Van belang is dat de golflengte van 820 nm werd gekozen zoals deze op ons systeem de golflengte is die de hoogste piekenergieën levert (vanwege laser- en optische eigenschappen). Kortere of langere golflengten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de systeemeigenschappen6,11,12. Omdat de diepte van het beoogde weefsel een kritische parameter is, is embryomontage ook een cruciale stap, omdat onjuiste montage de weefseldikte kan vergroten waar licht doorheen moet om het doelvolume te bereiken.
Een van de oorspronkelijke kenmerken van het beschreven protocol is om een heel volume af te breken door opeenvolgende ablaties uit te voeren op verschillende brandpuntsvlakken. Omdat ablaties puin zullen genereren dat licht absorbeert, hebben we vastgesteld dat het cruciaal is om ablatie op het meest diepgaande vlak te starten en sequentieel af te breken van het diepste naar het meest oppervlakkige vlak.
Dit protocol beschrijft de ablatie van diepe en grote volumes en de registratie van naburige weefselrespons binnen enkele minuten na ablatie tot meer dan een uur. Een van de mogelijke beperkingen van het protocol is de tijd die nodig is om ablatie uit te voeren en de beeldvorming opnieuw te starten. Twee factoren beperken deze vertraging. De eerste is de tijd die nodig is om ablaties uit te voeren op meerdere focale vlakken. Op ons systeem wordt het verbreken van de polster uitgevoerd door een getrainde gebruiker in 2-3 minuten. Dit kan worden verminderd door de software te optimaliseren om de ablatie op verschillende vlakken te automatiseren. Toch is de totale ablatietijd gelijk aan de tijd die nodig is om het doelgebied te scannen, maal het aantal herhalingen op elk brandpuntsvlak, maal het aantal brandpuntsvlakken, wat in onze omstandigheden ongeveer 1 min is. Gezien de celmigratiesnelheid betekent dit dat sommige cellen het beoogde gebied kunnen binnenkomen of verlaten tijdens de ablatieprocedure. In ons geval bleek dit geen probleem te zijn, maar zou dit kunnen zijn als een absolute precisie in celtargeting vereist is. De tweede beperkende factor is dat dezelfde laser wordt gebruikt om ablatie uit te voeren (bij 820 nm) en groene fluorofoor te prikkelen (bij 920 nm). De vertraging tussen de laatste ablatie en het begin van de opname wordt dus bepaald door de tijd die nodig is om de laser af te stemmen van 820 nm tot 920 nm, variërend van 30 s tot 1 min.
In sommige gevallen, met name voor kleinere ablaties (eencellige ablatie, ablaties van subcellulaire componenten zoals cytoskeletelementen), kan het registreren van de onmiddellijke respons van de cel/het weefsel van cruciaal belang zijn om de mechanische toestand ervan af te leiden25,26,27. In dergelijke gevallen kan de beperking worden omzeild, hetzij door beeldvorming met een andere laser (hier bijvoorbeeld alleen rode signalen opnemen met de 1160 nm-laser of met behulp van een derde laserlijn) of door groene fluorofoor bij 820 nm af te beelden. Dit is niet de optimale golflengte voor beeldvorming (beperkte excitatie van fluoroforen, sterke fototoxische effecten), maar kan gedurende korte perioden worden gebruikt om onmiddellijke weefselrespons vast te leggen.
Er zijn weinig technieken beschikbaar om cellen te elimineren en te zien hoe dit de rest van het embryo beïnvloedt. De twee belangrijkste opties zijn om cellen fysiek te verwijderen of te vernietigen, zoals bij laserablaties. In vergelijking met fysieke verwijdering kan celvernietiging cytoplasmatische inhoud vrijgeven, wat naburige cellen kan beïnvloeden. Dit werd historisch benadrukt door de controverse en uiteenlopende resultaten verkregen door Wilhelm Roux en Hans Driesch met betrekking tot het mozaïek of de regulerende ontwikkeling van het kikker- en zee-egelembryo28. Meer recent zijn er verschillen waargenomen in wondgenezingstests, afhankelijk van of de wond wordt gemaakt door kras (die sommige cellen vernietigt) of het verwijderen van een insert29. Het fysiek verwijderen van cellen zonder andere weefsels te beschadigen is echter alleen mogelijk voor cellen aan het oppervlak van het embryo en cellen die niet al te gehecht zijn aan hun buren, waardoor het bereik van dergelijke benaderingen wordt beperkt. Daarom zijn er verschillende strategieën ontwikkeld om cellen te vernietigen, waarbij laserablaties het meest worden gebruikt. UV-laserablaties werden en worden in toenemende mate gebruikt, met name om kleine, oppervlakkige ablaties uit te voeren en een onmiddellijke weefselrespons te observeren.
We beschreven hier het gebruik van infrarood licht om diepere en ruimtelijk goed gedefinieerde ablaties uit te voeren. De belangrijkste beperking van dit protocol is de vereiste voor een infrarood gepulseerde laser en een beeldvormingsopstelling met twee fotonen. Dergelijke apparatuur komt echter steeds vaker voor op beeldvormingsplatforms. Bovendien zou de EOM die hier wordt gebruikt om één gebied in het beeld selectief af te breken, kunnen worden vervangen door een Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) -module. Hoewel het minder handig is, zou het zelfs mogelijk kunnen zijn om het protocol uit te voeren zonder EOM- of FRAP-modules door simpelweg in te zoomen op het beoogde gebied10. Het gebruik van een gepulseerde infraroodlaser brengt twee belangrijke voordelen met zich mee ten opzichte van de meeste klassieke ablatieprotocollen. Ten eerste kunnen dankzij de efficiënte penetratie van infrarood licht in levende weefsels diepe focale vlakken worden bereikt met laserkrachten die geen onscherpe schade veroorzaken. Dit stelde ons in staat om cellen zo diep als 120 μm te targeten, buiten bereik met excitatieprotocollen met één foton. Ten tweede zorgt het gebruik van niet-lineaire optica voor een uitstekende axiale resolutie, waardoor nauwkeurig gecontroleerde 3D-ablaties mogelijk zijn, zelfs op diepte in het weefsel. Door deze twee voordelen te combineren, kan ablatie van specifiek gedefinieerde, diepe en uiteindelijk grote volumes worden gemaakt.
We beschrijven het gebruik van een microscoop van twee fotonen om de polster te verbreken, een experiment dat wij en anderen onlangs hebben uitgevoerd30. Met weinig aanpassingen kon het voorgestelde protocol echter worden aangepast aan veel verschillende steekproeven. We hebben het bijvoorbeeld met succes gebruikt om volledige ablatie van de polster, ablaties binnen het laterale mesoderm tijdens gastrulatie of ablaties van individuele Schwan-cellen uit te voeren tijdens hun migratie op hun bijbehorende axon, zonder het axon te beïnvloeden. Wij geloven daarom dat dit protocol een waardevol en veelzijdig hulpmiddel is, dat nuttig zou moeten zijn in veel experimentele systemen om de impact van sommige cellen / weefsels op het gedrag en de ontwikkeling van de naburige structuren te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We danken Emilie Menant voor de visverzorging, de Polytechnique Bioimaging Facility, in het bijzonder Pierre Mahou, voor hulp bij live beeldvorming op hun apparatuur, gedeeltelijk ondersteund door Région Ile-de-France (interDIM) en Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging). Dit werk werd ondersteund door de ANR-subsidies 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016 en het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 840201, het Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche en het Centre National de la Recherche Scientifique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Agarose | PanReac AppliChem | A8963,0500 | |
| Data analysis software : Matlab | Math Works | ||
| Electro-optic modulator (EOM) | ConOptics | 350-80LA | |
| Embryo Medium (EM) solution | Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000). | ||
| Environmental chamber chamber | Okolab | H201-T-UNIT-BL | |
| EOM driver | ConOptics | 302RM | |
| Fluorescence source | Lumencor | SOLA | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | 300085 | Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm |
| Glass pipettes | Volac | D810 | Tip should be fire polished |
| Green/ablation laser | Spectra Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| Histone2B-mCherry mRNA | Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012) | ||
| Image analysis software: IMARIS | Bitplane | ||
| ImSpector software | Abberior Instruments Development Team | ||
| Injection mold | Adapative Science Tools | I-34 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140-122 | 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hammamatsu | H7422-40 | |
| PicoPump (Air injector) | World Precision Instrument | PV820 | |
| Red laser | Spectra Physics | OPO/Insight DeepSee | |
| RNAse free water for injection | Sigma | W3500 | |
| Spreadsheet software: Excel | Microsoft | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | |
| Tg(gsc:GFP) zebrafish line | Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002). | ||
| TriM Scope II microscope | La Vision Biotech |
References
- Slack, J. M. W.
- Fernandez-Sanchez, M. -E., Brunet, T., Röper, J. -C., Farge, E. Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Selleck, M. A. J. Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).
- Bulina, M. E., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues. Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).
- Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1189, Clifton, N.J. 219-235 (2015).
- Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
- Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
- Bonnet, I., et al. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).
- Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition - Four Volume Set. , Springer International Publishing. Cham. (2019).
- Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).
- Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).
- Theveneau, E., David, N. B.
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Montero, J. -A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -P. Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells. Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).
- Ulrich, F., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Kai, M., Heisenberg, C. -P., Tada, M. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation. Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).
- Smutny, M., et al. Friction forces position the neural anlage. Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).
- Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear β-Catenin pools. Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Grill, S. W., Howard, J., Schäffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. The distribution of active force generators controls mitotic spindle position. Science. 301 (5632), New York, N.Y. 518-521 (2003).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Farhadifar, R., Röper, J. -C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. Foundations of Experimental Embryology. , Prentice-Hall. Englewood Cliffs. (1964).
- Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).
- Bosze, B., et al. Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).
