Summary
Embryonal udvikling kræver storstilet koordinering af cellebevægelse. To-foton excitation medieret laser ablation tillader rumligt kontrolleret 3-dimensionelle ablation af store grupper af dybe celler. Derudover kan denne teknik sondere reaktionen af kollektivt migrerende celler in vivo til forstyrrelser i deres mekaniske miljø.
Abstract
Morfogenese indebærer mange cellebevægelser for at organisere celler i væv og organer. For at opnå en ordentlig udvikling skal alle disse bevægelser koordineres nøje, og akkumulerende beviser tyder på, at dette opnås, i det mindste delvist, gennem mekaniske interaktioner. Testning af dette i embryoet kræver direkte fysiske forstyrrelser. Laser ablations er en stadig mere brugt mulighed, der gør det muligt at lindre mekaniske begrænsninger eller fysisk isolere to cellepopulationer fra hinanden. Men, mange ablations udføres med en ultraviolet (UV) laser, som tilbyder begrænset aksial opløsning og væv penetration. En metode er beskrevet her for at ablate dybe, betydelige og rumligt veldefinerede mængder ved hjælp af et to-foton mikroskop. Ablationer demonstreres i en transgen zebrafisk linje udtrykker den grønne fluorescerende protein i den aksiale mesendoderm og bruges til at afskære den aksiale mesendoderm uden at påvirke den alt for meget ektoderm eller den underliggende æggeblomme celle. Celleadfærd overvåges af levende billeddannelse før og efter ablationen. Ablationsprotokollen kan anvendes på forskellige udviklingsstadier, på enhver celletype eller væv, i skalaer, der spænder fra et par mikron til mere end hundrede mikron.
Introduction
Celle-celle interaktioner spiller afgørende roller i udviklingen. Celler giver signaler, at deres direkte naboer, eller celler længere væk, kan opfatte, og dermed påvirke deres skæbne og / eller adfærd. Mange af disse signaler er kemiske. For eksempel producerer en cellegruppe i de velkarakteri karakteriserede induktionshændelser diffusible molekyler, der påvirker en anden cellepopulations skæbne1. Andre signaler er imidlertid mekaniske; celler udøver kræfter og begrænsninger på deres naboer, som naboerne opfatter og reagerer på2.
En måde at studere betydningen af disse celle-celle interaktioner in vivo er at fjerne nogle celler og observere efterfølgende udvikling. Desværre er tilgængelige teknikker til at fjerne eller ødelægge celler begrænsede. Celler kan fjernes kirurgisk3,4, ved hjælp af nåle eller små ledninger, men sådanne behandlinger er invasive, ikke meget præcise, og normalt udføres under et stereomikroskop, forhindrer øjeblikkelig billeddannelse under et mikroskop. Desuden, målretning dybe celler indebærer piercing et hul i overlying væv, skabe uønskede forstyrrelser. Genetisk kodede fotoensibilisatorer, såsom KillerRed, er blevet brugt til at fremkalde celledød via lysbelysning5. Photosensitizers er kromoser, der genererer reaktive iltarter ved lysbestråling. Deres primære begrænsning er, at de kræver lange lysbelysninger (ca. 15 min), hvilket kan være vanskeligt at opnå, hvis cellerne bevæger sig, og at de fremkalder celledød gennem apoptose, hvilket ikke er umiddelbart.
Endelig er laser ablations blevet udviklet og udbredt i de sidste 15 år6,7,8,9,10,11,12. En laserstråle er fokuseret på den målrettede celle / væv. Det fremkalder sin ablation gennem opvarmning, fotoablation, eller plasma-induceret ablation; den involverede proces afhænger af effekttætheden og eksponeringstiden13. De fleste ablation protokoller bruger UV-lasere til deres høje energi. UV-lys absorberes og spredes dog både af biologisk væv. Således, målretning dybe celler kræver en høj laser magt, som derefter fremkalder skader i mere overfladiske, out-of-plane væv. Dette begrænser brugen af UV-lasere til overfladiske strukturer og forklarer deres relativt lave aksiale opløsning. Ikke-lineær optik (såkaldt to-fotonmikroskopi) bruger ikke-lineære egenskaber af lys til at ophidse en fluorophore med to fotoner af ca. halv energi i det infrarøde domæne. Når det anvendes på ablations, har dette tre hovedfordele. For det første er det infrarøde lys mindre spredt og mindre absorberet end UV-lys af biologisk væv14, hvilket gør det muligt at nå dybere strukturer uden at øge den nødvendige laserkraft. For det andet giver brugen af en femtosecond pulserende laser meget høj effekttæthed, hvilket skaber en ablation gennem plasmainduktion, som i modsætning til opvarmning ikke spredes rumligt15. For det tredje opnås den effekttæthed, der fremkalder plasmadannelse, kun ved omdrejningspunktet. Takket være disse egenskaber kan to-foton laser ablationer bruges til præcist at målrette dybe celler uden at påvirke det omgivende vævsmiljø.
Kollektive migremigrationer er et glimrende eksempel på udviklingsprocesser, hvor cellecelleinteraktioner er grundlæggende. Kollektive migreringer defineres som cellemigreringer, hvor naboceller påvirker funktionsmåden for en celle16. Arten af disse interaktioner (kemisk eller mekanisk), og hvordan de påvirker cellemigrationen, kan variere meget og er ofte ikke helt forstået. Evnen til at fjerne celler og observere, hvordan dette påvirker de andre, er afgørende for yderligere optrævling af disse kollektive processer. For nogle få år siden konstaterede vi — ved hjælp af kirurgiske metoder — at polsterens migration under zebrafiskegastrulation er en kollektiv migration17. Polsteren er en gruppe celler, der udgør de første internaliserende celler på den dorsale side af embryoet18. Disse celler, mærket med grønt i Tg(gsc:GFP) transgene linje, er placeret dybt i embryoet, under flere lag af epiblast celler. Under gastrulation fører denne gruppe udvidelsen af den aksiale mesoderm, der migrerer fra den embryonale organisator til dyrestangen19,20,21,22,23 (Figur 1A). Vi fastslog, at celler kræver kontakt med deres naboer for at orientere deres migration i retning af dyrestangen. Men en bedre forståelse af de cellulære og molekylære baser af denne kollektive migration indebærer at fjerne nogle celler for at se, hvordan dette påvirker de resterende. Vi udviklede derfor ablations af store og dybe mængder ved hjælp af en to-foton mikroskopi setup. Her demonstrerer vi brugen af denne protokol til at afskære polsteren i midten og observere konsekvenserne for cellemigration ved at spore kerner mærket med Histone2B-mCherry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt dyrearbejde blev godkendt af Det Etiske Udvalg N 59 og Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche under sagsnummeret APAFIS#15859-2018051710341011v3. Nogle af de trin, der er beskrevet nedenfor, er specifikke for vores udstyr og software, men kunne nemt tilpasses til forskelligt udstyr.
1. Injektionspræparat
- Klargør 75 mL 1% agaroseopløsning i Embryo Medium (EM).
- Placer injektion skimmel i en 90 mm Petri fad og hæld ca 50 mL af agarose, nok til formen til at flyde. Lad agarose størkne og fjerne injektion skimmel.
- Forbered en agarose-belagt skål ved at hælde 1 mL af agarose i en 30 mm Petri fad.
- 4 μL 30 ng/μL Histone2B-mCherry mRNA-opløsning ved at fortynde lageropløsningen i RNasefrit vand og holde på is.
BEMÆRK: Pas på at bære handsker, mens du manipulerer mRNA for at undgå RNase-medieret nedbrydning. - Træk en injektionsnål ud af en kapillær ved hjælp af mikropipettens puller.
2. Forberedelse af embryoner
- Når fisk har lagt æg, indsamle, skylles og høste i en 90 mm Petriskål i EM. Embryonerne placeres i en inkubator på 28,5 °C.
- Vent 20 min for den første celle at blive synlig.
- Overfør 30 embryoner til injektionspladen fyldt med EM. Klem embryoner i rillerne ved hjælp af lidt stumpe sammenkværn og orientere dem med dyrestangen op.
- Fyld en injektionsnål med 2 μL mRNA-opløsning ved hjælp af en mikrolastspids. Sæt nålen i kapillærholderen, der er anbragt i en mikromanipulator, der er forbundet med ptfe-slange (polytetrafluoroethylen) på en luftinjektor.
- Under stereomikroskopet brydes nålespidsen forsigtigt.
- Indsprøjt mRNA-opløsningen i 1-cellede fase embryoner ved at indsætte nålen i cellen.
BEMÆRK: Den injicerede diskenhed er ca. en tredjedel af cellevolumenet. - Der placeres tilbage injicerede embryoner i inkubatoren på 28,5 °C.
3. Forberedelse af to-foton mikroskop
BEMÆRK: Der bruges to lasere i denne protokol. Den ene bruges til at afbilde GFP (ved 920 nm) og udføre ablations (ved 820 nm). Det vil blive omtalt som den grønne / ablation laser. Den anden bruges ved 1160 nm til billedet mCherry. Det vil blive omtalt som den røde laser.
- Indstil den grønne/ablationslaser til 820 nm (ablationsbølgelængde) og den røde laser til 1160 nm (mCherry excitation).
- Brug bevægelige spejle på den optiske sti, justere grøn / ablation og røde laserstråler både ved ind- og udstigning af scanningshovedet.
BEMÆRK: Dette øger laserstrålefokus og minimerer brændvolumen for excitation og ablation. - Mål den maksimale effekt af den grønne/ablationslaser ved 820 nm under målet. For at gøre dette skal du placere effektmåleren under målet, lukke det sorte kammer, indstille grøn / ablation laserkraft til 100% og åbne skodderne. Beregne den procentdel af laserkraft, der er nødvendig for at nå 300 mW.
- Sæt den grønne/ablationslaser tilbage til 920 nm (GFP excitation) og indstil lasereffekten til 7 %. Indstil den røde lasereffekt til 15 %.
- Aktiver EPI-PhotoMultiplier Tubes (PMT) detektorer til grønne og røde linjer; indstille grøn og rød linje PMT-følsomhed til 65.
- Indstil synsfeltet til 400 x 400 μm, billedopløsning til 512 x 512 pixel og scanningsfrekvens til 800 Hz.
- Vælg 3D-timelapsebilledtilstand . Opret derefter en mappe, og aktiver Gem automatisk for data efter hver anskaffelse.
- Varmekammeret samles, og sæt det til 28 °C. Vent mindst 10 minutter på kammeret og målet om at varme.
4. Montering af embryoet
- Under et fluorescens stereomikroskop, identificere embryoner på 70% epiboly, der udtrykker GFP.
BEMÆRK: Vælg embryoner med et klart signal i den aksiale mesoderm og ingen baggrundslyscens for bedre billedkvalitet. - Overfør tre til fire udvalgte embryoner i den agarosebelagte skål (trin 1.3) ved hjælp af en pastaurpipette af plast og afchorionere dem forsigtigt ved hjælp af fine pincet.
BEMÆRK: Dechorionerede embryoner er meget sarte og vil briste ved kontakt med luft eller plast. - Hæld 1 mL af 0,2% agarose i 1x penicillin-streptomycin EM i et lille glas hætteglas. Hætteglasset placeres i en forvarmet 42 °C tør blokvarmer.
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres hurtigt for at tillade embryo orientering før agarose sæt. - Overfør et dechorioneret embryo i 0,2% agarose glasglasset ved hjælp af en brandpoleret glaspipette. Pas på ikke at tilføje for meget EM i agarose for at undgå fortynding det. Kassér den resterende EM fra pipetten og aspirer embryoet tilbage sammen med nok agarose til at dække diaset af glasbundsskålen, før embryoet falder ud af pipetten.
- Blæs agarose og embryoet på glasrutschebanen på fadet. Pas på ikke at lade embryoet røre luften eller plastiksiden af skålen. Fyld derefter kammeret omkring glasrutschebanen med agarose.
- Brug en øjenvippe til at orientere embryoet, så den målrettede region er øverst (figur 1B).
BEMÆRK: Når du orienterer embryoner, skal du sørge for kun at røre ved blastodermen, ikke den meget skrøbelige æggeblomme. Agarose vil indstille i omkring 1 min, afhængigt af stuetemperatur. - Vent ~ 5 min for agarose at indstille helt, og derefter tilføje et par dråber penicillin-streptomycin EM.
5. Lokalisering af embryo og præablationsbilleddannelse
- Placer glasbundsskålen under målet i det opvarmede kammer. Fordyb målet i penicillin-streptomycin EM og luk det opvarmede kammer.
- Flyt skyderen for at indstille lysstien til okulær. Derefter, ved hjælp af okulære, lysstofrør, og scene kontrol, finde et foster og sætte fokus til overfladen af embryoet.
- Sluk fluorescenslampen, sæt lysstien til PMT'er, og luk det sorte kammer.
BEMÆRK: Vær omhyggelig med at slukke for alle lyskilder i det sorte kammer, da det kan beskadige PMT'erne. - Start live imaging og finde aksial mesoderm. Juster de grønne/ablations- og røde laserkræfter for at have et godt signal (dvs. mellem 1.000 og 20.000 fotoner pr. pixel til GFP-udtryksområder). Brug den røde kanal til at flytte scenen til toppen af embryoet og indstille denne position som Z = 0.
- Vælg et trin på 1 min og et Z-trin på 2 μm. Et Z-kursus på 110 μm er tilstrækkeligt til at omfatte hele polsteren og erhverves på mindre end 1 minut med disse indstillinger. Sæt den første skive 15 μm over den aksiale mesoderm (i den mere overfladiske ectoderm).
BEMÆRK: Polsteren bevæger sig langs en buet linje, så den nederste skive af Z-stakken skal indstilles 30 μm dybere end polsterens dybeste position for at imødekomme dens bevægelse under time-lapse imaging (Figur 1E). - Optag 10-15 min af pre-ablation film.
Figur 1: Vellykket resultat af laserablationer. (A) Ordning med et gastrulaterende embryo ved 70% epiboly i dorsal visning; pAM: bageste aksiale mesoderm; sort pil markerer retningen af polster migration; sort firkant angiver et typisk synsfelt for ablations i polsteren. B) Ordning med embryomontering til polsterskæring. Sideværtsvisning. Embryoet er monteret således, at polsterens plan er vinkelret på den optiske akse. C) overlevelse og (D) morfologi af kontrol og ablated embryoner ved 24 timer efter befrugtning. Skalastang er 300 μm. (E) Tidssekvens fra laserablation i polsteren af et Tg(gsc:GFP) embryo, der udtrykker Histone2B-mCherry. Visninger med den grønne kanal er kun maksimale fremskrivninger. Nærbillede viser det ablated område, der indeholder celleaffald. Visninger med grønne og røde (vises som magenta) kanaler er XY og XZ skiver før og efter ablation (det grønne lyn repræsenterer ablation). XZ skiver viser, at de overliggende væv (magentakerner uden GFP-udtryk) ikke er blevet påvirket af ablation af underliggende strukturer. Den gule stiplede boks svarer til det investeringsafkast, der er valgt til laserablationsbehandling. Skalastangen er 50 μm i stor udsigt og 25 μm i nærbillede. Klik her for at se en større version af dette tal.
6. Målplacering og laserablation
- Find polsterkonturen på livebilleddannelse, og tegn et stort rektangel på 20 pixel (15 μm), der spænder over polsterens bredde, ved hjælp af værktøjet EOM ROI (Electro-Optic Modulator Region of Interest). Placer dette rektangel i midten af polsteren (figur 1E).
- Bemærk den aksiale position af de højeste og laveste planer, der indeholder polsterceller. Ablations vil blive udført hver 10 μm i mellem disse to planer. Pas på, at ROI ikke overlapper æggeblommecellen på nogen af disse planer.
- Placer scenen på den laveste Z-position i intervallet. Ablationer skal udføres nedefra og op, da snavs absorberer lys.
- Indstil den grønne/ablationslaserbølgelængde til 820 nm, og indstil effektprocenten for at opnå en udgangseffekt på 300 mW (trin 3.3).
- Indstil billedfrekvensen til 200 Hz.
- Indstil grøn/ablation laser imaging EOM til 0, og vælg ROI-Treat-tilstand .
- Tænd for EOM og indstil behandlingen til at starte med det samme (efter 0 ramme).
- Indstil billedbehandlingstilstanden til Timelapse, og deaktiver Automatisk lagring.
- Indstil tidstrinnet til hurtig tilstand.
- Angiv antallet af behandlingsrammer og antallet af rammer til den værdi, der svarer til den målrettede dybde (tabel 1).
| Dybde (μm) | Behandlingsrammer |
| -30 | 1 |
| -35 | 1-2 |
| -40 | 1-2 |
| -45 | 2 |
| -50 | 2-3 |
| -55 | 3 |
| -60 | 3-4 |
| -65 | 4 |
| -70 | 4 |
| -75 | 4-5 |
| -80 | 4-5 |
| -85 | 5 |
| -90 | 5 |
| -95 | 5-6 |
| -100 | 6 |
| -105 | 6 |
Tabel 1: Foreslået antal laserbehandlingsrammer som funktion af målrettet celledybde i embryoet (0 er embryoets overflade).
- Start billeddannelse. Købet er sort, da lukkeren til PMT lukker under EOM-behandling.
- Flyt fasen op til listens næste Z-placering (trin 6.2).
- Gentag trin 6.10 til 6.12, indtil toppen af polsteren er nået.
7. Kontrol og billeddannelse efter ablation
- Indstil den grønne/ablationslaser til 920 nm og 5 % strøm. Indstil den grønne/ablation laser imaging EOM til 100 og vælg Fullfield-tilstand .
- Indstil billedfrekvensen til 800 Hz. Slå EOM fra.
- Gå gennem hele stakken i live-tilstand for at kontrollere, om hvert fly er blevet ablated. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du gå tilbage til trin 6.2.
BEMÆRK: Ablation undertiden inducerer en lodret skift af tilstødende væv, således at Z-stakken måske skal omdefineres. - Indstil billedbehandlingstilstanden til 3D Timelapse, og genaktiver Automatisk lagring. Optag 40-60 min post-ablation film.
- Kontroller, i post-ablation filmen, om de målrettede celler var effektivt ablated. Fluorescensgendannelse eller målrettede celler, der optager rummet og forhindrer følgeceller i at bevæge sig igennem, indikerer, at målrettede celler kun blev fotoblecheret og ikke ablated (figur 1E og figur 2A).
Figur 2: Negative resultater af laserabblationer. (A) Typiske eksempler på potentielle fejl i laserablation. Store XY-visninger er maksimale fremskrivninger, XZ-visning er en rekonstrueret sektion. Laserbehandlet område er placeret mellem de to hvide pilespidser. Tre fokale planer fremhæves i den rekonstruerede sektion og vises til højre. De svarer til tre forskellige former for fejl. Plan 1 viser, at celler over polsteren er blevet ablated. Dette kan identificeres ved tilstedeværelsen af autofluorescent vragrester på dette fokale plan (se nærbillede) over polsteren (se positionen af plan 1 på den rekonstruerede sektion). Dette skyldes sandsynligvis en forkert definition af den region, der skal ablated. Plan 2 viser celler, der er blevet bleget, men ikke ablated. De kan identificeres som den lave fluorescens signal stadig afslører intakt celle konturer (se close-up). Plan 3 viser intakte celler, som næppe er blevet bleget ved laserbehandling. Dette kan skyldes en forkert definition af, at regionen skal ablated eller fra dårlig behandling. I de situationer, der er afbildet i plan 2 og 3, er det muligt at anvende ablationsbehandlingen på de ikke-ablerede målrettede celler igen. Skalastangen er 50 μm i stor udsigt og 20 μm i nærbilleder. (B) Et typisk eksempel på bobler (markeret med hvide stjerner) dannet ved kavitation på grund af en for intens laserbehandling. Sådanne bobler er ikke begrænset til en Z-plan, nogle gange endda spænder over den fulde højde af polster, deformere tilstødende væv. Skalalinjen er 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
8. Dataanalyse
- Åbn time-lapse-serien med billedanalysesoftwaren, og angiv den korrekte pixelstørrelse.
- I funktionen Spot skal du indstille objektstørrelsen til 10 μm, da dette er den gennemsnitlige kernestørrelse under gastrulation. Kør derefter funktionen Staffage for at registrere og spore kernerne.
BEMÆRK: Detektionen kan forbedres en smule ved at tage hensyn til den lavere aksiale opløsning, idet der er monteret en 12 μm lang ellipsoidform langs Z-aksen. - Brug filtre til at fjerne falske positiver. I Tg(Gsc:GFP) linjen er celler fra den embryonale akse og nogle endodermale celler mærket med grønt. Derfor giver filtrering af grøn intensitet mulighed for et hurtigt valg af disse celler (Figur 3A).
- Indstil den maksimale afstand mellem fortløbende punkter til en værdi, der er kompatibel med cellernes hastighed.
BEMÆRK: Vær omhyggelig med at overveje tidsintervallet mellem to rammer. Polsterceller migrerer ved 2,8 ± 0,8 μm/min. Derfor, tillader 4 μm af maksimal forskydning for en tid trin på 1 min fjerner de fleste artefaktiske spor. - Hvis du tillader huller over et eller to tidspunkter, kan der spores længere, men kan medføre sporingsfejl. Hvis en kerne ikke registreres korrekt på et engangspunkt, kan du overveje at køre stedet igen med forskellige parametre/filtre.
- Visuelt kontrollere spor og om nødvendigt rette dem.
- Eksporter resultaterne som en .xlsx fil. Behandle filen ved hjælp af udgivne regnearksrutiner24 (Figur 3B) og brugerdefinerede rutiner på dataanalysesoftware (tilgængelig på forespørgsel).
Figur 3: Isolering af den forreste halvdel af polsteren påvirker celleretningen. (A) 3D-rekonstruktioner et Tg(gsc:GFP) embryo, der udtrykker Histone2B-mCherry (vises i magenta), før og efter en laserablation, der afskærer polsteren i midten. Kerner, der tilhører den forreste halvdel af polsteren, er markeret med en magenta prik og spores over tid før og efter ablation (se Movie S1). Skalalinjen er 50 μm. (B) Som et mål for migrations persistens, retning autokorrelation af celler, der tilhører den forreste del af polsteren før og efter ablation. Celler viser en kontinuerlig bevægelse før ablation, som drastisk falder efter ablation, hvilket indikerer tab af kollektivt orienteret migration. Retning auto-korrelation blev også målt på celler, der danner den forreste halvdel af polster af en ikke-ablated embryo, som en kontrol. Grafkonvolutterne angiver standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at afskære polsteren i midten blev et Tg(gsc:GFP) embryo, injiceret med Histone2B-mCherry mRNAs monteret på 70% epiboly fase, som beskrevet i trin 4. Polsteren blev identificeret ved GFP-udtryk, og embryoet blev monteret, så polsterplanet er vinkelret på den optiske akse (figur 1B). Hvis du vipper embryoet væk fra denne position, vil det komplicere proceduren. Lyset bliver nødt til at gå gennem mere væv for at nå ablation fly, og ablation fly vil blive vipget i forhold til embryonale akser. Efter at have kontrolleret, at alle cellekerner er korrekt mærket, blev der registreret en 10 min pre-ablation time-lapse for at fange cellebevægelser før ablation (Figur 1E og Figur 3A, Movie S1).
Polsteren blev morfologisk identificeret, og et rektangulært område på 15 μm x 200 μm, der ligger i midten, blev ablated på fem fokale fly for at sikre afskæring på hele dybden af polsteren (Figur 1E, Movie S1). Billedbehandling blev genstartet lige efter ablation og bruges til at overvåge effektiviteten af proceduren. Hvis det lykkes, vil ablationen have elimineret alle cellulære strukturer og GFP og mCherry fluorescens, så den ablated volumen skal fremstå som et signalfrit volumen. Der kan dog oprettes nogle vragrester. Dette snavs er autofluorescent, både i de grønne og røde kanaler, og viser normalt uregelmæssige aflange former parallelt med retningen af ablation (Figur 1E). En for intens behandling vil danne en stor mængde af vragrester, der kan fungere som en hindring og forstyrre celle adfærd. Stærkere behandlinger vil endda fremkalde kavitation, præget af dannelsen af bobler i vævet (Figur 2B). Kavitation er forbundet med en mekanisk chokbølge formering i væv og kan fremkalde skader ud af den målrettede volumen13,15. Embryoner med kavitationsbobler skal kasseres, og behandlingen bør indstilles ved at udføre færre behandlingsrammer.
Omvendt kan for lidt behandling fotoblere fluorophorer uden at fremkalde plasmadannelse, dermed uden at antænde (figur 2A). Ufuldstændig fotografering kan let ses ved tilstedeværelsen af dim fluorescens med en karakteristisk cellulær form (Figur 2A). Sådanne embryoner bør kasseres eller behandles igen og udføre flere behandlingsrammer. Komplet fotobleaching er mere udfordrende at skelne fra vellykket ablation, da begge ville resultere i en signalfri volumen. Photobleaching kan dog identificeres med tilbagevirkende kraft, da fluorescens gradvist vil komme sig i løbet af postablationsbilleddannelsen. Dette indebærer imidlertid, at ikke-ablerede embryoner afbildes i mindst en halv time, hvilket er tidskrævende. Vi foreslår derfor at justere behandlingsintensiteten (ved at øge antallet af behandlinger) for at fremkalde dannelsen af få synlige snavs, hvilket ikke vil påvirke celleadfærden, men straks bekræfte effektiv ablation. Endelig bør fraværet af skader i celler omkring ablationsvolumen kontrolleres på de første postablationsbilleder (figur 2A). Når laserbehandling er indstillet korrekt (dannelse af få snavs), skader i tilstødende væv er usandsynligt, at skyldes den rumlige spredning af ablation, som er meget godt geografisk defineret, men snarere skyldes unøjagtig udvælgelse af regionen, der skal ablated og / eller væv bevægelser i tiden mellem mål udvælgelse og ablation. Embryoner med berørte tilstødende væv skal kasseres.
Efter vellykket ablation blev Z-stakke fanget hvert minut i 40 min, optagelse både GFP cytoplasmisk signal og mCherry nukleare signal. Kerner blev derefter sporet, og deres bevægelse blev brugt som en proxy for cellebevægelse. Spor svarende til polsterceller blev identificeret på deres stærke GFP-signal (Figur 3A, Movie S1). Den vedholdenhed af celle bevægelse blev målt ved computing cellen retning auto-korrelation24. Fokus på polsterceller placeret i den forreste halvdel af polsteren afslørede, at afskære polster i midten, og dermed adskille disse celler fra den bageste del af polster, mindsket deres retning autokorrelation (Figur 3B), der viser, at korrekt migration af polster celler kræver integritet af hele polster, i overensstemmelse med dens påviste kollektive migration17.
Efter erhvervelse af post-ablation film, embryoner kan afmonteres, omhyggeligt udvinde dem fra agarose ved hjælp af fine sammenkædning, og inkuberes ved 28,5 °C, indtil de når 24 timer efter befrugtning. Igen bør embryoner overleve og bør ikke udgøre nogen tilsyneladende morfologisk defekt (figur 1C, D).
Film S1: Vellykket laser ablation. Laser ablation i midten af polster af en Tg (gsc:GFP) embryo udtrykker Histone2B-mCherry. Kerner fra den forreste del af polsteren spores over tid og markeres med magentaprikker. Spor er tidsfarvekodede (figur 3). Tomme rammer svarer til laserablation. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokol, der bruger ikke-lineær optik til at udføre dybe og rumligt veldefinerede volumen ablations. Det mest kritiske trin i protokollen er at finde behandlingsbetingelser, der giver tilstrækkelig energi til at tillade ablationer, men ikke for meget energi, for at undgå overdreven snavs eller kavitation. Mængden af leveret energi på målstedet afhænger hovedsagelig af: (1) laserudgangseffekten, (2) kvaliteten af laserjusteringen, (3) arten af det væv, hvorigennem lyset passerer for at nå ablationsplanet, (4) ablationsplanets dybde. Derfor er det før hvert eksperiment afgørende at måle laserudgangseffekt, justere den til en referenceværdi (300 mW ved 820 nm i vores protokol) og sikre korrekt laserjustering. Under disse antagelser bør behandlingsbetingelserne kunne reproduceres fra en forsøgsdag til en anden. Vi anbefaler, at du udfører omfattende tests for at definere optimale parametre (lasereffekt og antal behandlingsrammer) for en bestemt prøvetype. Disse parametre kan derefter bruges i alle lignende eksperimenter. I det eksempel, der er beskrevet her (afbrydelse af polsteren under gastrulation), har vi for eksempel etableret behandlingsbetingelser for ablations på forskellige dybder i embryoet (tabel 1) og stoler nu på dette diagram, når vi udfører eksperimenter. Bemærk, at 820 nm bølgelængden blev valgt som det er på vores system, bølgelængden giver de højeste peak energier (på grund af laser og optik egenskaber). Kortere eller længere bølgelængder kan anvendes afhængigt af systemets egenskaber6,11,12. Dybden af det målrettede væv er en kritisk parameter, embryo montering er også et afgørende skridt, da forkert montering kan øge væv tykkelse, at lyset skal passere igennem for at nå målet volumen.
Et af de oprindelige træk ved den beskrevne protokol er at ablate et helt volumen ved at udføre successive ablations på forskellige fokale planer. Da ablations vil generere snavs, der absorberer lys, identificerede vi, at det er afgørende at begynde ablation på det mest dybtgående plan og sekventielt ablate fra det dybeste til det mest overfladiske plan.
Denne protokol beskriver ablation af dybe og store mængder og registrering af tilstødende væv svar inden for få minutter efter ablation til over en time. En af de potentielle begrænsninger i protokollen er den tid, det tager at udføre ablation og genstart billeddannelse. To faktorer begrænser denne forsinkelse. Den første er den tid, der er nødvendig for at udføre ablations på flere fokale planer. På vores system udføres afskæring af polsteren af en uddannet bruger i 2-3 min. Dette kunne reduceres ved at optimere softwaren til at automatisere ablation på forskellige fly. Alligevel vil den samlede ablationstid svare til den tid, der kræves for at scanne målregionen, gange antallet af gentagelser på hvert fokalplan, gange antallet af fokale fly, hvilket under vores forhold er ca. 1 min. I betragtning af cellemigreringshastighed betyder det, at nogle celler kan komme ind eller ud af det målrettede område under ablationsproceduren. I vores tilfælde viste dette sig ikke at være et problem, men kunne være, hvis en absolut præcision i cellemålretning er påkrævet. Den anden begrænsende faktor er, at den samme laser bruges til at udføre ablation (ved 820 nm) og ophidse grøn fluorophore (ved 920 nm). Forsinkelsen mellem den sidste ablation og starten af optagelsen er således defineret af den tid, det tager at tune laseren fra 820 nm til 920 nm, fra 30 s til 1 min.
I nogle tilfælde kan registrering af cellens/vævs umiddelbare reaktion være afgørende for at udlede dens mekaniske tilstand25,26,27, især for mindre ablationer (encellet ablation, ablationer af subcellulære komponenter såsom cytoskeletonelementer). I sådanne tilfælde kan begrænsningen omgås, enten ved billeddannelse med en anden laser (her f.eks. kun ved optagelse af røde signaler med 1160 nm laser eller ved hjælp af en tredje laserlinje) eller billeddannelse af grøn fluorophore ved 820 nm. Dette er ikke den optimale bølgelængde til billeddannelse (begrænset excitation af fluorophores, stærke foto-toksiske virkninger), men kan bruges over korte perioder til at registrere øjeblikkelig vævsrespons.
Få teknikker er tilgængelige for at fjerne celler og se, hvordan dette påvirker resten af embryoet. De to vigtigste muligheder er at fjerne celler fysisk eller at ødelægge dem, som i laser ablations. Sammenlignet med fysisk fjernelse kan celledestruktion frigive cytoplasmisk indhold, hvilket kan påvirke naboceller. Dette blev historisk fremhævet af kontroverser og divergerende resultater opnået af Wilhelm Roux og Hans Driesch om mosaik eller regulativ udvikling af frøen og søpindsvin embryo28. For nylig, forskelle er blevet observeret i sårheling assays, afhængigt af om såret er skabt af bunden (som ødelægger nogle celler) eller fjerne en insert29. Fysisk fjernelse af celler uden at beskadige andre væv er imidlertid kun muligt for celler på selve overfladen af embryoet og celler, der ikke er for klæbende for deres naboer, hvilket begrænser rækkevidden af sådanne tilgange. Derfor er der udviklet forskellige strategier til at ødelægge celler, laser ablations er den mest anvendte. UV laser ablations er blevet og bruges i stigende grad, især til at udføre små, overfladiske ablations, og observere øjeblikkelig vævsrespons.
Vi beskrev her brugen af infrarødt lys til at udføre dybere og rumligt veldefinerede ablationer. Den vigtigste begrænsning af denne protokol er kravet om en infrarød pulserende laser og en to-foton imaging setup. Men sådant udstyr bliver mere og mere hyppigt på billeddannelsesplatforme. Derudover kunne EOM, der bruges her til at ablate en region i billedet selektivt, erstattes af et fluorescensgendannelse efter photobleaching (FRAP) modul. Selvom det er mindre praktisk, kunne det endda være muligt at udføre protokollen uden EOM eller FRAP-moduler ved blot at zoome på det målrettede område10. Ved hjælp af en pulserende infrarød laser bringer to vigtigste fordele i forhold til de fleste klassiske ablation protokoller. For det første, takket være den effektive indtrængen af infrarødt lys i levende væv, kan dybe fokale planer nås med laserkræfter, der ikke fremkalder skader uden for fokus. Dette gjorde det muligt for os at målrette celler så dybt som 120 μm, uden for rækkevidde med en-foton excitation protokoller. For det andet sikrer brugen af ikke-lineær optik fremragende aksial opløsning, der tillader præcist kontrollerede 3D-ablationer, selv i dybden i vævet. Ved at kombinere disse to fordele giver ablation af specifikt definerede, dybe og i sidste ende store mængder.
Vi beskriver ved hjælp af en to-foton mikroskop til at afskære polster, et eksperiment vi og andre for nylig udført30. Med få justeringer kunne den foreslåede protokol dog tilpasses mange forskellige prøver. Vi har for eksempel med succes brugt det til at udføre fuldstændig ablation af polsteren, ablationer i den laterale mesoderm under gastrulation eller ablationer af individuelle Schwan-celler under deres migration på deres tilknyttede axon uden at påvirke axonen. Vi mener derfor, at denne protokol er et værdifuldt og alsidigt værktøj, som bør være nyttigt i mange eksperimentelle systemer til at analysere virkningen af nogle celler / væv på adfærden og udviklingen af de omkringliggende strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Emilie Menant for fiskepleje, Polytechnique Bioimaging Facility, især Pierre Mahou, for hjælp til live imaging på deres udstyr delvist støttet af Région Ile-de-France (interDIM) og Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging). Dette arbejde blev støttet af ANR-stipendierne 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016 og Eu's Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. 840201, Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche og Centre National de la Recherche Scientifique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Agarose | PanReac AppliChem | A8963,0500 | |
| Data analysis software : Matlab | Math Works | ||
| Electro-optic modulator (EOM) | ConOptics | 350-80LA | |
| Embryo Medium (EM) solution | Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000). | ||
| Environmental chamber chamber | Okolab | H201-T-UNIT-BL | |
| EOM driver | ConOptics | 302RM | |
| Fluorescence source | Lumencor | SOLA | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | 300085 | Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm |
| Glass pipettes | Volac | D810 | Tip should be fire polished |
| Green/ablation laser | Spectra Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| Histone2B-mCherry mRNA | Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012) | ||
| Image analysis software: IMARIS | Bitplane | ||
| ImSpector software | Abberior Instruments Development Team | ||
| Injection mold | Adapative Science Tools | I-34 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140-122 | 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hammamatsu | H7422-40 | |
| PicoPump (Air injector) | World Precision Instrument | PV820 | |
| Red laser | Spectra Physics | OPO/Insight DeepSee | |
| RNAse free water for injection | Sigma | W3500 | |
| Spreadsheet software: Excel | Microsoft | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | |
| Tg(gsc:GFP) zebrafish line | Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002). | ||
| TriM Scope II microscope | La Vision Biotech |
References
- Slack, J. M. W.
- Fernandez-Sanchez, M. -E., Brunet, T., Röper, J. -C., Farge, E. Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Selleck, M. A. J. Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).
- Bulina, M. E., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues. Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).
- Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1189, Clifton, N.J. 219-235 (2015).
- Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
- Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
- Bonnet, I., et al. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).
- Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition - Four Volume Set. , Springer International Publishing. Cham. (2019).
- Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).
- Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).
- Theveneau, E., David, N. B.
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Montero, J. -A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -P. Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells. Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).
- Ulrich, F., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Kai, M., Heisenberg, C. -P., Tada, M. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation. Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).
- Smutny, M., et al. Friction forces position the neural anlage. Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).
- Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear β-Catenin pools. Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Grill, S. W., Howard, J., Schäffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. The distribution of active force generators controls mitotic spindle position. Science. 301 (5632), New York, N.Y. 518-521 (2003).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Farhadifar, R., Röper, J. -C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. Foundations of Experimental Embryology. , Prentice-Hall. Englewood Cliffs. (1964).
- Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).
- Bosze, B., et al. Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).
