Summary
Embryonal utvikling krever storskala koordinering av cellebevegelse. To-foton eksitasjon mediert laser ablasjon tillater den romlig kontrollerte 3-dimensjonale ablasjon av store grupper av dype celler. I tillegg kan denne teknikken sondere reaksjonen av kollektivt migrerende celler in vivo til perturbasjoner i deres mekaniske miljø.
Abstract
Morfogenese innebærer mange cellebevegelser for å organisere celler i vev og organer. For riktig utvikling må alle disse bevegelsene være tett koordinert, og akkumulerende bevis tyder på at dette oppnås, i det minste delvis, gjennom mekaniske interaksjoner. Testing av dette i embryoet krever direkte fysiske perturbasjoner. Laserablasjoner er et stadig mer brukt alternativ som gjør det mulig å lindre mekaniske begrensninger eller fysisk isolere to cellepopulasjoner fra hverandre. Imidlertid utføres mange ablasjoner med en ultrafiolett (UV) laser, som tilbyr begrenset aksial oppløsning og vevsinntrengning. En metode er beskrevet her for å fyre opp dype, betydelige og romlig veldefinerte volumer ved hjelp av et to-fotonmikroskop. Ablasjoner er demonstrert i en transgen sebrafisklinje som uttrykker det grønne fluorescerende proteinet i det aksiale mesendodermet og brukes til å kutte det aksiale mesendodermet uten å påvirke det overliggende ektodermet eller den underliggende eggeplommecellen. Cellevirkemåte overvåkes av levende avbildning før og etter ablasjonen. Ablasjonsprotokollen kan brukes på forskjellige utviklingsstadier, på hvilken som helst celletype eller vev, i skalaer som spenner fra noen få mikron til mer enn hundre mikron.
Introduction
Cellecelleinteraksjoner spiller viktige roller i utviklingen. Celler gir signaler om at deres direkte naboer, eller celler lenger unna, kan oppfatte, og dermed påvirke deres skjebne og / eller oppførsel. Mange av disse signalene er kjemiske. For eksempel, i de godt karakteriserte induksjonshendelsene, produserer en cellegruppe diffusible molekyler som påvirker skjebnen til en annen cellepopulasjon1. Andre signaler er imidlertid mekaniske; celler utøver krefter og begrensninger på sine naboer, som naboene oppfatter og reagerer på2.
En måte å studere viktigheten av disse cellecelleinteraksjonene in vivo er å eliminere noen celler og observere etterfølgende utvikling. Dessverre er tilgjengelige teknikker for å fjerne eller ødelegge celler begrenset. Celler kan fjernes kirurgisk3,4, ved hjelp av nåler eller små ledninger, men slike behandlinger er invasive, ikke veldig presise, og vanligvis utført under et stereomikroskop, og forhindrer umiddelbar avbildning under et mikroskop. Videre innebærer målretting av dype celler piercing et hull i overlysende vev, og skaper uønskede perturbasjoner. Genetisk kodede fotosensibiliserere, som KillerRed, har blitt brukt til å indusere celledød via lysbelysning5. Fotosensibilisatorer er kromoforer som genererer reaktive oksygenarter ved lysbestråling. Deres hovedbegrensning er at de krever lange lysbelysninger (rundt 15 min), noe som kan være vanskelig å oppnå hvis cellene beveger seg, og at de induserer celledød gjennom apoptose, noe som ikke er umiddelbart.
Til slutt har laserablasjoner blitt utviklet og mye brukt de siste 15 årene6,7,8,9,10,11,12. En laserstråle er fokusert på målrettet celle / vev. Det induserer sin ablasjon gjennom oppvarming, fotoablasjon eller plasmaindusert ablasjon; den involverte prosessen avhenger av strømtettheten og eksponeringstiden13. De fleste ablasjonsprotokoller bruker UV-lasere for sin høye energi. UV-lys absorberes imidlertid både og spres av biologisk vev. Dermed krever målretting av dype celler en høy laserkraft, som deretter induserer skader i mer overfladisk, ut-av-plan vev. Dette begrenser bruken av UV-lasere til overfladiske strukturer og forklarer deres relativt lave aksiale oppløsning. Ikke-lineær optikk (såkalt to-fotonmikroskopi) bruker ikke-lineære lysegenskaper for å begeistre en fluorofor med to fotoner med omtrent halv energi i det infrarøde domenet. Når det brukes på ablasjoner, har dette tre hovedfordeler. For det første er det infrarøde lyset mindre spredt og mindre absorbert enn UV-lys av biologisk vev14, slik at det kan nå dypere strukturer uten å øke den nødvendige laserkraften. For det andre gir bruken av en femtosecond pulserende laser svært høye effekttettheter, noe som skaper en ablasjon gjennom plasmainduksjon, som i motsetning til oppvarming ikke diffuserer romlig15. For det tredje oppnås krafttettheten som induserer plasmadannelse bare ved fokuspunktet. Takket være disse egenskapene kan to-foton laser ablasjoner brukes til å målrette dype celler nøyaktig uten å påvirke det omkringliggende vevsmiljøet.
Kollektive migrasjoner er et utmerket eksempel på utviklingsprosesser der cellecelleinteraksjoner er grunnleggende. Kollektive migrasjoner defineres som cellemigrasjoner der nærliggende celler påvirker oppførselen til en celle16. Arten av disse interaksjonene (kjemisk eller mekanisk) og hvordan de påvirker cellemigrasjon kan variere sterkt og er ofte ikke helt forstått. Evnen til å fjerne celler og observere hvordan dette påvirker de andre er avgjørende for å videreutvikle disse kollektive prosessene. For noen år siden etablerte vi – ved hjelp av kirurgiske tilnærminger – at polsterens migrasjon under sebrafisk gastrulation er en kollektiv migrasjon17. Polsteren er en gruppe celler som utgjør de første internaliseringscellene på dorsalsiden av embryoet18. Disse cellene, merket i grønt i Tg(gsc:GFP) transgen linje, ligger dypt i embryoet, under flere lag med epiblastceller. Under gastrulation fører denne gruppen utvidelsen av aksial mesoderm, migrerer fra den embryonale arrangøren til dyrepolen19,20,21,22,23 (figur 1A). Vi slo fast at celler krever kontakt med sine naboer for å orientere sin migrasjon i retning av dyrestangen. Imidlertid innebærer bedre forståelse av de cellulære og molekylære basene til denne kollektive migrasjonen å fjerne noen celler for å se hvordan dette påvirker de resterende. Vi utviklet derfor ablasjoner av store og dype volumer ved hjelp av et to-foton mikroskopioppsett. Her demonstrerer vi bruken av denne protokollen for å kutte polsteren i midten og observere konsekvensene på cellemigrering ved å spore kjerner merket med Histone2B-mCherry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt dyrearbeid ble godkjent av Etikkkomiteen N 59 og Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche under filnummeret APAFIS#15859-2018051710341011v3. Noen av trinnene beskrevet nedenfor er spesifikke for utstyret og programvaren vår, men kan enkelt tilpasses til forskjellig utstyr.
1. Injeksjonspreparat
- Forbered 75 ml 1% agaroseoppløsning i embryomedium (EM).
- Legg injiseringsformen i en 90 mm Petri-tallerken og hell ca. 50 ml agarose, nok til at formen flyter. La agarose størkne og fjern injiseringsformen.
- Forbered en agarosebelagt tallerken ved å helle 1 ml agarose i en 30 mm Petri-tallerken.
- Forbered 4 μL 30 ng/μL Histone2B-mCherry mRNA-løsning ved å fortynne lagerløsningen i RNase-fritt vann og holde på is.
MERK: Pass på at du bruker hansker mens du manipulerer mRNA for å unngå RNase-mediert nedbrytning. - Trekk en injeksjonsnål fra en kapillær ved hjelp av mikropipettetrekkeren.
2. Embryo forberedelse
- Når fiskene har lagt egg, samle, skyll og høst i en 90 mm Petri-tallerken i EM. Plasser embryoene i en inkubator på 28,5 °C.
- Vent i 20 minutter til den første cellen blir synlig.
- Overfør 30 embryoer til injeksjonsplaten fylt med EM. Klem embryoer i sporene ved hjelp av litt stumpe tang og orienter dem med dyrestangen opp.
- Bruk en mikrolasterspiss til å fylle en injeksjonsnål med 2 μL mRNA-oppløsning. Sett nålen inn i kapillærholderen plassert i en mikromanipulator koblet med polytetrafluoretylen (PTFE) slange til en luftinjektor.
- Under stereomikroskopet bryter du forsiktig spissen av nålen.
- Injiser mRNA-løsningen i 1-cellers stadium embryoer ved å sette nålen i cellen.
MERK: Volumet som injiseres er omtrent en tredjedel av cellevolumet. - Plasser tilbake injiserte embryoer i inkubatoren på 28,5 °C.
3. Forberedelse av det tofotoniske mikroskopet
MERK: To lasere brukes i denne protokollen. Den ene brukes til å avbilde GFP (ved 920 nm) og utføre ablasjoner (ved 820 nm). Det vil bli referert til som den grønne / ablasjonslaseren. Den andre brukes ved 1160 nm til image mCherry. Det vil bli referert til som den røde laseren.
- Sett den grønne/ablasjonslaseren til 820 nm (ablasjonsbølgelengde) og den røde laseren til 1160 nm (mCherry excitation).
- Bruk bevegelige speil på den optiske banen, juster grønne/ablasjons- og røde laserstråler både ved inngangen og utgangen av skannehodet.
MERK: Dette øker laserstrålefokuset og minimerer brennvidde for eksitasjon og ablasjon. - Mål maksimal effekt på den grønne/ablasjonslaseren ved 820 nm under målet. For å gjøre dette, plasser kraftmåleren under målet, lukk det svarte kammeret, sett grønn / ablasjon laserkraft til 100%, og åpne skoddene. Beregn prosentandelen av laserkraft som trengs for å nå 300 mW.
- Sett den grønne/ablasjonslaseren tilbake til 920 nm (GFP-eksitasjon) og sett lasereffekten til 7 %. Sett den røde laserstrømmen til 15%.
- Aktiver EPI-PhotoMultiplier Tubes (PMT)-detektorer for grønne og røde linjer; innstilt grønn og rød linje PMT følsomhet til 65.
- Sett synsfeltet til 400 x 400 μm, bildeoppløsning til 512 x 512 piksler og skannefrekvens til 800 Hz.
- Velg 3D-bildebehandlingsmodus for tidsforløp . Deretter oppretter du en mappe og aktiverer Automatisk lagring for data etter hver anskaffelse.
- Monter varmekammeret og sett det til 28 °C. Vent minst 10 min på kammeret og målet om å varme.
4. Montering av embryoet
- Under et fluorescens stereomikroskop, identifiser embryoer ved 70% epiboly som uttrykker GFP.
MERK: Velg embryoer med et sterkt signal i aksialmesoderm og ingen bakgrunnsfluorescens for bedre bildekvalitet. - Overfør tre til fire utvalgte embryoer i den agarosebelagte parabolen (trinn 1.3) ved hjelp av en pasteurpipette i plast og dechorionate dem forsiktig ved hjelp av fine tang.
MERK: Dechorionated embryoer er svært delikate og vil briste ved kontakt med luft eller plast. - Hell 1 ml 0,2% agarose i 1x penicillin-streptomycin EM i et lite hetteglass med glass. Plasser hetteglasset i en forvarmet 42 °C tørrblokkvarmer.
MERK: Følgende trinn må utføres raskt for å tillate embryoorientering før agarosesett. - Overfør et dechorionated embryo i 0,2% agarose glass hetteglass ved hjelp av en brannpolert glasspipette. Pass på at du ikke legger til for mye EM i agarose for å unngå å fortynne det. Kast den gjenværende EM fra pipetten og aspirer embryoet tilbake sammen med nok agarose til å dekke lysbildet på glassbunnsfatet før embryoet faller ut av pipetten.
- Blås agarose og embryoet på glasssklie av parabolen. Pass på at embryoet ikke berører luften eller plastsiden av parabolen. Fyll deretter kammeret rundt glasssklie med agarose.
- Bruk en øyenvippe til å orientere embryoet slik at den målrettede regionen er øverst (figur 1B).
MERK: Når du orienterer embryoer, må du passe på å bare berøre blastodermen, ikke den svært skjøre eggeplommen. Agarose vil sette inn rundt 1 min, avhengig av romtemperatur. - Vent ~ 5 min for at agarose å sette helt, og deretter legge til noen dråper penicillin-streptomycin EM.
5. Lokalisering av embryo og pre-ablasjonsavbildning
- Plasser glassbunnsfatet under målet i det oppvarmede kammeret. Fordyp målet i penicillin-streptomycin EM og lukk det oppvarmede kammeret.
- Flytt glidebryteren for å angi lysbanen til okularer. Deretter, ved hjelp av okularer, fluorescerende lamper og scenekontroll, finn et embryo og sett fokus på embryooverflaten.
- Slå av fluorescenslampen, sett lysbanen til PMTs, og lukk det svarte kammeret.
MERK: Pass på at du slår av alle lyskilder i det svarte kammeret, da det kan skade PMT-ene. - Start live bildebehandling og finn aksial mesoderm. Juster de grønne/ablasjons- og røde laserkreftene slik at de har et godt signal (dvs. mellom 1000 og 20 000 fotoner per piksel for GFP-uttrykksområder). Bruk den røde kanalen til å flytte scenen helt til toppen av embryoet og sett denne posisjonen som Z = 0.
- Velg et tidstrinn på 1 min og et Z-trinn på 2 μm. Et Z-kurs på 110 μm er tilstrekkelig til å omfatte hele polsteren og er anskaffet på mindre enn 1 min med disse innstillingene. Sett den første skive 15 μm over aksial mesoderm (i mer overfladisk ektoderm).
MERK: Polsteren beveger seg langs en buet linje slik at den nederste delen av Z-stabelen settes 30 μm dypere enn polsterens dypeste posisjon for å imøtekomme bevegelsen under tidsforløpavbildningen (figur 1E). - Ta opp 10-15 min med før-ablasjonsfilm.
Figur 1: Vellykket utfall av laserablasjoner. (A) Ordning av et gasstrulaterende embryo ved 70% epiboly i dorsalvisning; pAM: bakre aksial mesoderm; svart pil markerer retningen for polster migrasjon; svart firkant angir et typisk synsfelt for ablasjoner i polsteren. (B) Ordning for embryomontering for polsterav severing. Sidevisning. Embryoet er montert slik at polsterplanet er vinkelrett på den optiske aksen. (C) overlevelse og (D) morfologi av kontroll og ablated embryoer ved 24 timers etterbefruktning. Skala bar er 300 μm. (E) Tidssekvens fra laser ablasjon i polster av en Tg (gsc:GFP) embryo uttrykker Histone2B-mCherry. Visninger med den grønne kanalen er bare maksimale projeksjoner. Nærbildet viser det ablerte området som inneholder cellerester. Visninger med grønne og røde (vises som magenta) kanaler er XY- og XZ-skiver før og etter ablasjon (det grønne lynet representerer ablasjon). XZ-skiver viser at overliggende vev (magenta nuclei uten GFP-uttrykk) ikke har blitt påvirket av ablasjon av underliggende strukturer. Den gule stiplede boksen tilsvarer avkastningen som er valgt for laserablasjonsbehandling. Skalalinjen er 50 μm i stor utsikt og 25 μm i nærbilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Målplassering og laserablasjon
- Finn polsterkonturen på levende bildebehandling, og bruk verktøyet Electro-Optic Modulator Region of Interest (EOM ROI) til å tegne et stort rektangel på 20 piksler (15 μm) som strekker seg over polsterens bredde. Plasser dette rektangelet midt i polsteren (figur 1E).
- Legg merke til den aksiale posisjonen til de høyeste og laveste planene som inneholder polsterceller. Ablasjoner vil bli utført hver 10 μm mellom disse to planene. Pass på at avkastningen ikke overlapper eggeplommecellen på noen av disse planene.
- Plasser scenen i laveste Z-posisjon i intervallet. Ablasjoner må utføres nedenfra og opp da rusk absorberer lys.
- Sett den grønne/ablasjonslaserbølgelengden til 820 nm og sett strømprosenten for å få en utgangseffekt på 300 mW (trinn 3.3).
- Sett bildefrekvensen til 200 Hz.
- Sett EOM for laseravbildning av grønn/ablasjon til 0, og velg ROI-treat-modus .
- Slå på EOM og sett behandlingen til å starte umiddelbart (etter 0 ramme).
- Sett bildemodus til Timelapse, og deaktiver automatisk lagring.
- Sett tidstrinnet i hurtigmodus.
- Sett antall behandlingsrammer og antall rammer til verdien som tilsvarer den angitte dybden (tabell 1).
| Dybde (μm) | Behandlingsrammer |
| -30 | 1 |
| -35 | 1-2 |
| -40 | 1-2 |
| -45 | 2 |
| -50 | 2-3 |
| -55 | 3 |
| -60 | 3-4 |
| -65 | 4 |
| -70 | 4 |
| -75 | 4-5 |
| -80 | 4-5 |
| -85 | 5 |
| -90 | 5 |
| -95 | 5-6 |
| -100 | 6 |
| -105 | 6 |
Tabell 1: Foreslått antall laserbehandlingsrammer som en funksjon av målrettet celledybde i embryoet (0 er embryoets overflate).
- Begynn å forestille deg. Oppkjøpet er svart når lukkeren til PMT lukkes under EOM-behandling.
- Flytt opp fasen til neste Z-posisjon for listen (trinn 6.2).
- Gjenta trinn 6.10 til 6.12 til toppen av polsteren er nådd.
7. Verifisering og avbildning etter ablasjon
- Sett den grønne/ablasjonslaseren til 920 nm og 5 % effekt. Sett EOM for grønn/ablasjonslaser til 100, og velg Fullfield-modus .
- Sett bildefrekvensen til 800 Hz. Slå av EOM.
- Gå gjennom hele bunken i live-modus for å sjekke om hvert fly har blitt ablated. Hvis dette ikke er tilfelle, går du tilbake til trinn 6.2.
MERK: Ablasjon induserer noen ganger et vertikalt skifte av nærliggende vev, slik at Z-stabelen kanskje må omdestilles. - Sett bildemodus til 3D-tidsforløp, og aktiver automatisk lagring på nytt. Ta opp 40-60 min med post-ablation film.
- Sjekk, i etter-ablasjonsfilmen, om de målrettede cellene effektivt ble ablated. Fluorescensgjenvinning, eller målrettede celler som opptar plass og hindrer følgerceller i å bevege seg gjennom, indikerer at målrettede celler bare ble fotobleket og ikke ablated (figur 1E og figur 2A).
Figur 2: Negative resultater av laserablasjoner. (A) Typiske eksempler på potensielle feil ved laserablasjon. Store XY-visninger er maksimale projeksjoner, XZ-visning er en rekonstruert seksjon. Laserbehandlet område er plassert mellom de to hvite pilspissene. Tre fokusplan er uthevet i den rekonstruerte delen og vises til høyre. De tilsvarer tre forskjellige typer feil. Plan 1 viser at celler over polsteren har blitt ablated. Dette kan identifiseres ved tilstedeværelse av autofluorescent rusk på dette brennplanet (se nærbilde) over polsteren (se posisjon av plan 1 på den rekonstruerte delen). Dette skyldes sannsynligvis at en feil definisjon av regionen blir ablated. Plan 2 viser celler som er bleket, men ikke ablated. De kan identifiseres som det lave fluorescenssignalet avslører fortsatt intakte cellekonturer (se nærbilde). Plan 3 viser intakte celler, som knapt har blitt bleket av laserbehandling. Dette kan skyldes feil definisjon av regionen som skal ablated eller fra dårlig behandling. I situasjonene som er avbildet i plan 2 og 3, er det mulig å påføre ablasjonsbehandlingen på de ikke-ablerte målrettede cellene på nytt. Skalalinjen er 50 μm i stor utsikt og 20 μm i nærbilde. (B) Et typisk eksempel på bobler (merket med hvite stjerner) dannet av kavitasjon på grunn av en for intens laserbehandling. Slike bobler er ikke begrenset til et Z-plan, noen ganger til og med som spenner over polsterens fulle høyde, deformerer nærliggende vev. Skalalinjen er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
8. Dataanalyse
- Åpne intervallserier med bildeanalyseprogramvaren og angi riktig pikselstørrelse.
- I Spot-funksjonen setter du Objektstørrelse til 10 μm, da dette er den gjennomsnittlige kjernestørrelsen under gastrulation. Kjør deretter Spot-funksjonen for å oppdage og spore kjernene.
MERK: Deteksjonen kan forbedres litt ved å vurdere den lavere aksiale oppløsningen, og montere en 12 μm lang ellipsoidal form langs Z-aksen. - Bruk filtre til å fjerne falske positiver. I Tg(Gsc:GFP)- linjen er celler fra den embryonale aksen og noen endodermale celler merket med grønt. Derfor tillater filtrering på grønn intensitet et raskt utvalg av disse cellene (figur 3A).
- Sett maksimal avstand mellom påfølgende punkter til en verdi som er kompatibel med hastigheten på cellene.
MERK: Vær forsiktig med å vurdere tidsintervallet mellom to bilder. Polsterceller migrerer ved 2,8 ± 0,8 μm/min. Derfor fjerner 4 μm maksimal forskyvning i et tidstrinn på 1 min de fleste artefaktuelle spor. - Hvis du tillater hull over ett eller to tidspunkter, får du lengre kontinuerlige spor, men kan føre til sporingsfeil. Hvis en kjerne ikke oppdages riktig på et engangspunkt, bør du vurdere å kjøre spotgjenkjenning på nytt med forskjellige parametere/filtre.
- Kontroller sporene visuelt, og korriger dem om nødvendig.
- Eksporter resultatene som en .xlsx fil. Behandle filen ved hjelp av publiserte regnearkrutiner24 (figur 3B) og tilpassede rutiner på dataanalyseprogramvare (tilgjengelig på forespørsel).
Figur 3: Isolering av den fremre halvdelen av polsteren påvirker celleretningen. (A) 3D rekonstruksjonerer et Tg(gsc:GFP) -embryo som uttrykker Histone2B-mCherry (vist i magenta), før og etter en laserablasjon som kutter polsteren i midten. Kjerner som tilhører den fremre halvdelen av polsteren er merket med en magenta prikk og spores over tid før og etter ablasjon (se Film S1). Skalalinjen er 50 μm. (B) Som et mål på migrasjon utholdenhet, retning automatisk korrelasjon av celler som tilhører den fremre delen av polster før og etter ablasjon. Celler viser en kontinuerlig bevegelse før ablasjon, som drastisk avtar etter ablasjon, noe som indikerer tap av kollektiv-orientert migrasjon. Retningskorrelasjon ble også målt på celler som danner den fremre halvdelen av polsteren til et ikke-ablated embryo, som en kontroll. Grafkonvoluttene indikerer standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å kutte polsteren i midten ble et Tg(gsc:GFP) embryo, injisert med Histone2B-mCherry mRNAer montert på 70% epiboly stadium, som beskrevet i trinn 4. Polsteren ble identifisert av GFP-uttrykket, og embryoet ble montert slik at polsterplanet er vinkelrett på den optiske aksen (figur 1B). Å vippe embryoet bort fra denne posisjonen vil komplisere prosedyren. Lyset må gå gjennom flere vev for å nå ablasjonsplanene, og ablasjonsfly vil bli vippet i forhold til embryonale akser. Etter å ha bekreftet at alle cellekjernene er riktig merket, ble det registrert en tidsforløp på 10 minutter før ablasjon for å fange cellebevegelser før ablasjon (figur 1E og figur 3A, film S1).
Polsteren ble morfologisk identifisert, og et rektangulært område på 15 μm x 200 μm, som ligger i midten, ble ablated på fem fokale plan for å sikre kutt på hele polsterens dybde (Figur 1E, Movie S1). Imaging ble startet på nytt rett etter ablasjon og brukes til å overvåke effektiviteten av prosedyren. Hvis det lykkes, vil ablasjonen ha eliminert alle cellulære strukturer og GFP og mCherry fluorescens slik at det ablerte volumet skal vises som et signalfritt volum. Noen rusk kan imidlertid opprettes. Dette avfallet er autofluorescent, både i de grønne og røde kanalene, og viser vanligvis uregelmessige langstrakte former parallelt med ablasjonsretningen (figur 1E). En for intens behandling vil danne en stor mengde rusk som kan fungere som en hindring og perturbcelleadferd. Sterkere behandlinger vil til og med indusere kavitasjon, preget av dannelse av bobler i vevet (figur 2B). Kavitasjon er forbundet med en mekanisk støtbølge som forplanter seg i vev og kan indusere skader ut av det målrettede volumet13,15. Embryoer med kavitasjonsbobler bør kastes, og behandlingen bør stilles ned ved å utføre færre behandlingsrammer.
Omvendt kan for lite behandling fotobleach fluoroforer uten å indusere plasmadannelse, derav uten ablating (figur 2A). Ufullstendig fotobleking kan lett oppdages ved tilstedeværelse av svak fluorescens med en karakteristisk cellulær form (figur 2A). Slike embryoer bør kastes eller behandles igjen og utføre flere behandlingsrammer. Fullstendig fotobleaching er mer utfordrende å skille fra vellykket ablasjon, da begge vil resultere i et signalfritt volum. Photobleaching kan imidlertid identifiseres i ettertid, da fluorescens gradvis vil komme seg i løpet av etter-ablasjonsavbildningen. Dette innebærer imidlertid at ikke-ablated embryoer er avbildet i minst en halv time, noe som er tidkrevende. Vi foreslår derfor å justere behandlingsintensiteten (ved å øke antall behandlinger) for å indusere dannelsen av få synlige rusk, noe som ikke vil påvirke celleadferd, men umiddelbart bekrefte effektiv ablasjon. Til slutt bør fraværet av skade i celler rundt ablasjonsvolumet kontrolleres på de første bildene etter ablasjon (figur 2A). Når laserbehandling er riktig innstilt (dannelse av få rusk), er det lite sannsynlig at skader i nærliggende vev skyldes romlig spredning av ablasjonen, som er veldig godt romlig definert, men snarere skyldes unøyaktig valg av regionen som skal ablated og / eller vevsbevegelser i tiden mellom målvalg og ablasjon. Embryoer med berørt nærliggende vev bør kastes.
Etter vellykket ablasjon ble Z-stabler fanget hvert minutt i 40 minutter, og registrerte både GFP-cytoplasmatisk signal og mCherry-atomsignalet. Nuclei ble deretter sporet, og deres bevegelse ble brukt som proxy for cellebevegelse. Spor som tilsvarer polsterceller ble identifisert på deres sterke GFP-signal (figur 3A, Film S1). Vedvarende cellebevegelse ble målt ved å beregne celleretningen autokorrelasjon24. Fokus på polsterceller plassert i den fremre halvdelen av polsteren avslørte at å kutte polsteren i midten, og dermed skille disse cellene fra den bakre delen av polsteren, reduserte deres retnings autokorrelasjon (figur 3B), og viste at riktig migrasjon av polsterceller krever integritet av hele polsteren, i tråd med den demonstrerte kollektive migrasjonen17.
Etter å ha anskaffet post-ablation filmen, embryoer kan demonteres, forsiktig trekke dem ut fra agarose ved hjelp av fine tang, og inkuberes ved 28,5 °C til de når 24 h etter befruktning. Igjen skal embryoer overleve og bør ikke presentere noen tilsynelatende morfologisk defekt (figur 1C,D).
Film S1: Vellykket laser ablasjon. Laser ablasjon i midten av polster av en Tg (gsc:GFP) embryo uttrykker Histone2B-mCherry. Kjerner fra den fremre delen av polsteren spores over tid og merkes med magenta prikker. Sporene er tidsfargekodet (figur 3). Tomme rammer tilsvarer laserablasjon. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll som bruker ikke-lineær optikk for å utføre dype og romlig veldefinerte volumablasjoner. Det mest kritiske trinnet i protokollen er å finne behandlingsforhold som gir tilstrekkelig energi til å tillate ablasjoner, men ikke for mye energi, for å unngå overdreven rusk eller kavitasjon. Mengden levert energi på målstedet avhenger hovedsakelig av: (1) laserutgangseffekten, (2) kvaliteten på laserjusteringen, (3) vevets natur gjennom hvilket lyset passerer for å nå ablasjonsplanet, (4) dybden på ablasjonsplanet. Derfor, før hvert eksperiment, er det avgjørende å måle laserutgangskraft, justere den til en referanseverdi (300 mW ved 820 nm i vår protokoll), og sikre riktig laserjustering. Under disse forutsetningene bør behandlingsforholdene være reproduserbare fra en eksperimentell dag til en annen. Vi anbefaler å utføre omfattende tester for å definere optimale parametere (laserkraft og antall behandlingsrammer) for en bestemt prøvetype. Disse parametrene kan deretter brukes i alle lignende eksperimenter. I eksemplet som er beskrevet her (severing av polsteren under gastrulation), har vi for eksempel etablert behandlingsforhold for ablasjoner på forskjellige dybder i embryoet (tabell 1) og er nå avhengige av dette diagrammet når vi utfører eksperimenter. Vær oppmerksom på at bølgelengden på 820 nm ble valgt som den er, på vårt system, bølgelengden som gir de høyeste toppenergiene (på grunn av laser- og optikkegenskaper). Kortere eller lengre bølgelengder kan brukes avhengig av systemegenskapene6,11,12. Dybden av det målrettede vevet er en kritisk parameter, embryomontering er også et avgjørende skritt, da feil montering kan øke vevstykkelsen som lyset må passere gjennom for å nå målvolumet.
En av de opprinnelige funksjonene i den beskrevne protokollen er å fyre opp et helt volum ved å utføre påfølgende ablasjoner på forskjellige fokusplan. Siden ablasjoner vil generere rusk som absorberer lys, identifiserte vi at det er avgjørende å starte ablasjon på det mest dyptgripende planet og sekvensielt brenne fra det dypeste til det mest overfladiske planet.
Denne protokollen beskriver ablasjon av dype og store volumer og opptak av nærliggende vevsrespons i løpet av minutter etter ablasjon til over en time. En av de potensielle begrensningene i protokollen er tiden det tar å utføre ablasjon og starte avbildning på nytt. To faktorer begrenser denne forsinkelsen. Den første er tiden som trengs for å utføre ablasjoner på flere fokalplan. På vårt system utføres severing av polsteren av en opplært bruker i 2-3 min. Dette kan reduseres ved å optimalisere programvaren for å automatisere ablasjonen på forskjellige plan. Likevel vil total ablasjonstid tilsvare tiden som kreves for å skanne målområdet, ganger antall repetisjoner på hvert brennplan, ganger antall brennfly, som under våre forhold er ca. 1 min. Med tanke på cellemigreringshastighet betyr dette at noen celler kan komme inn i eller ut av det målrettede området under ablasjonsprosedyren. I vårt tilfelle viste dette seg ikke å være et problem, men kan være hvis en absolutt presisjon i cellemålretting er nødvendig. Den andre begrensende faktoren er at den samme laseren brukes til å utføre ablasjon (ved 820 nm) og begeistre grønn fluorofor (ved 920 nm). Forsinkelsen mellom siste ablasjon og starten av innspillingen er dermed definert av tiden det tar å stille inn laseren fra 820 nm til 920 nm, fra 30 s til 1 min.
I noen tilfeller, spesielt for mindre ablasjoner (encellet ablasjon, ablasjoner av subcellulære komponenter som cytoskeletonelementer), kan registrering av den umiddelbare responsen til cellen / vevet være avgjørende for å utlede sin mekaniske tilstand25,26,27. I slike tilfeller kan begrensningen omgås, enten ved å forestille seg med en annen laser (her, for eksempel, registrere bare røde signaler med 1160 nm laser eller bruke en tredje laserlinje) eller imaging grønn fluorofor ved 820 nm. Dette er ikke den optimale bølgelengden for avbildning (begrenset eksitasjon av fluoroforer, sterke fototoksiske effekter), men kan brukes over korte perioder for å registrere umiddelbar vevsrespons.
Få teknikker er tilgjengelige for å eliminere celler og se hvordan dette påvirker resten av embryoet. De to viktigste alternativene er å fjerne celler fysisk eller å ødelegge dem, som i laser ablations. Sammenlignet med fysisk fjerning kan celleødeleggelse frigjøre cytoplasmisk innhold, noe som kan påvirke nærliggende celler. Dette ble historisk fremhevet av kontroversen og avvikende resultater oppnådd av Wilhelm Roux og Hans Driesch angående mosaikk eller regulativ utvikling av frosken og kråkebolle embryo28. Mer nylig har det blitt observert forskjeller i sårhelingsanalyser, avhengig av om såret er opprettet ved riper (som ødelegger noen celler) eller fjerner en innsats29. Men fysisk fjerning av celler uten å skade andre vev er bare mulig for celler på selve overflaten av embryoet og celler som ikke er for tilhenger av sine naboer, og dermed begrenser rekkevidden av slike tilnærminger. Følgelig er det utviklet forskjellige strategier for å ødelegge celler, laserblasjoner er de mest sysselsatte. UV-laserblasjoner har blitt og brukes i økende grad, spesielt for å utføre små, overfladiske ablasjoner og observere umiddelbar vevsrespons.
Vi beskrev her bruken av infrarødt lys for å utføre dypere og romlig veldefinerte ablasjoner. Hovedbegrensningen i denne protokollen er kravet til en infrarød pulserende laser og et to-foton bildeoppsett. Imidlertid blir slikt utstyr stadig hyppigere på bildeplattformer. I tillegg kan EOM som brukes her til å fyre opp en region i bildet selektivt erstattes av en Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)-modul. Selv om det er mindre praktisk, kan det til og med være mulig å utføre protokollen uten EOM- eller FRAP-moduler ved ganske enkelt å zoome på det målrettede området10. Å bruke en pulserende infrarød laser gir to hovedfordeler sammenlignet med de fleste klassiske ablasjonsprotokoller. For det første, takket være effektiv penetrasjon av infrarødt lys i levende vev, kan dype fokusfly nås med laserkrefter som ikke induserer skader utenfor fokus. Dette tillot oss å målrette celler så dypt som 120 μm, utenfor rekkevidde med en-foton eksitasjonsprotokoller. For det andre sikrer bruk av ikke-lineær optikk utmerket aksial oppløsning, slik at nøyaktig kontrollerte 3D-ablasjoner, selv i dybden i vevet. Kombinere disse to fordelene tillater ablasjon av spesielt definerte, dype og til slutt store volumer.
Vi beskriver å bruke et to-foton mikroskop for å kutte polsteren, et eksperiment vi og andre nylig utførte30. Med få justeringer kan den foreslåtte protokollen imidlertid tilpasses mange forskjellige prøver. Vi har for eksempel vellykket brukt den til å utføre fullstendig ablasjon av polsteren, ablasjoner i lateral mesoderm under gastrulation, eller ablasjoner av individuelle Schwan-celler under deres migrasjon på deres tilknyttede axon, uten å påvirke axon. Vi mener derfor at denne protokollen er et verdifullt og allsidig verktøy, som bør være nyttig i mange eksperimentelle systemer for å analysere virkningen av noen celler / vev på oppførselen og utviklingen av nabostrukturene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Emilie Menant for fiskepleie, Polytechnique Bioimaging Facility, spesielt Pierre Mahou, for hjelp med levende bildebehandling på utstyret deres delvis støttet av Région Ile-de-France (interDIM) og Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging). Dette arbeidet ble støttet av ANR-tilskuddene 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016, og EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen No 840201, Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche og Centre National de la Recherche Scientifique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Agarose | PanReac AppliChem | A8963,0500 | |
| Data analysis software : Matlab | Math Works | ||
| Electro-optic modulator (EOM) | ConOptics | 350-80LA | |
| Embryo Medium (EM) solution | Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000). | ||
| Environmental chamber chamber | Okolab | H201-T-UNIT-BL | |
| EOM driver | ConOptics | 302RM | |
| Fluorescence source | Lumencor | SOLA | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | 300085 | Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm |
| Glass pipettes | Volac | D810 | Tip should be fire polished |
| Green/ablation laser | Spectra Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| Histone2B-mCherry mRNA | Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012) | ||
| Image analysis software: IMARIS | Bitplane | ||
| ImSpector software | Abberior Instruments Development Team | ||
| Injection mold | Adapative Science Tools | I-34 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140-122 | 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hammamatsu | H7422-40 | |
| PicoPump (Air injector) | World Precision Instrument | PV820 | |
| Red laser | Spectra Physics | OPO/Insight DeepSee | |
| RNAse free water for injection | Sigma | W3500 | |
| Spreadsheet software: Excel | Microsoft | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | |
| Tg(gsc:GFP) zebrafish line | Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002). | ||
| TriM Scope II microscope | La Vision Biotech |
References
- Slack, J. M. W.
- Fernandez-Sanchez, M. -E., Brunet, T., Röper, J. -C., Farge, E. Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Selleck, M. A. J. Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).
- Bulina, M. E., et al.
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues. Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).
- Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1189, Clifton, N.J. 219-235 (2015).
- Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
- Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
- Bonnet, I., et al. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).
- Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition - Four Volume Set. , Springer International Publishing. Cham. (2019).
- Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).
- Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).
- Theveneau, E., David, N. B.
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Montero, J. -A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -P. Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells. Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).
- Ulrich, F., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Kai, M., Heisenberg, C. -P., Tada, M. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation. Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).
- Smutny, M., et al. Friction forces position the neural anlage. Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).
- Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear β-Catenin pools. Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Grill, S. W., Howard, J., Schäffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. The distribution of active force generators controls mitotic spindle position. Science. 301 (5632), New York, N.Y. 518-521 (2003).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Farhadifar, R., Röper, J. -C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. Foundations of Experimental Embryology. , Prentice-Hall. Englewood Cliffs. (1964).
- Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).
- Bosze, B., et al. Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).
