Summary
In dit protocol wordt de AAV2-vector geproduceerd door het co-kweken van Spodoptera frugiperda (Sf9) insectencellen met baculovirus (BV)-AAV2-groen fluorescerend eiwit (GFP) of therapeutisch gen en BV-AAV2-rep-cap geïnfecteerde Sf9-cellen in suspensiecultuur. AAV-deeltjes komen vrij uit de cellen met behulp van detergent, worden geklaard, gezuiverd door affiniteitskolomchromatografie en geconcentreerd door tangentiële stromingsfiltratie.
Abstract
Adeno-geassocieerde virussen (AAV) zijn veelbelovende vectoren voor gentherapietoepassingen. Hier wordt de AAV2-vector geproduceerd door co-kweek van Spodoptera frugiperda (Sf9) cellen met Sf9 cellen geïnfecteerd met baculovirus (BV)-AAV2-GFP (of therapeutisch gen) en BV-AAV2-rep-cap in serumvrije suspensiecultuur. Cellen worden gekweekt in een kolf in een orbitale shaker of Wave bioreactor. Om de AAV-deeltjes vrij te maken, worden productiecellen in bufferbevattend reinigingsmiddel gelyseerd, dat vervolgens wordt geklaard door centrifugeren en filtratie met lage snelheid. AAV-deeltjes worden uit het cellysaat gezuiverd met behulp van AVB Sepharose-kolomchromatografie, die AAV-deeltjes bindt. Gebonden deeltjes worden gewassen met PBS om verontreinigingen te verwijderen en geëlueerd uit de hars met behulp van natriumcitraatbuffer bij pH 3,0. Het zure eluaat wordt geneutraliseerd met alkalische Tris-HCl-buffer (pH 8,0), verdund met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en verder geconcentreerd met tangentiële stroomfiltratie (TFF). Het protocol beschrijft kleinschalige preklinische vectorproductie die compatibel is met opschaling naar grootschalige klinische AAV-productie voor menselijke gentherapietoepassingen.
Introduction
Adeno-geassocieerde virussen (AAV) zijn niet-omhulde menselijke parvovirussen die een enkelstrengs DNA van 4,6 kb bevatten. AAV-vectoren hebben verschillende voordelen ten opzichte van andere virale vectoren voor gentherapietoepassingen1,2,3,4. AAV's zijn van nature replicatie-incompetent, waardoor een helpervirus en gastheermachinerie nodig zijn voor replicatie. AAV's veroorzaken geen ziekte en hebben een lage immunogeniciteit in de geïnfecteerde gastheer3,5. AAV kan zowel rustige als actief delende cellen infecteren en kan als episoom blijven bestaan zonder te integreren in het genoom van de gastheercellen (AAV integreert zelden in het gastheergenoom)1,3. Deze kenmerken hebben AAV tot een wenselijk hulpmiddel gemaakt voor gentherapietoepassingen.
Om een AAV-genoverdrachtsvector te genereren, wordt de transgencassette, inclusief het therapeutische gen, gekloond tussen twee interne terminale herhalingen (ITR's), die meestal zijn afgeleid van het AAV-serotype 2. De maximale grootte van 5' ITR tot 3' ITR, inclusief de transgensequentie, is 4,6 kb6. Verschillende capsiden kunnen een ander cel- of weefseltropisme hebben. Daarom moeten capsiden worden gekozen op basis van het weefsel- of celtype dat bedoeld is om te worden gericht met de AAV-vector7.
Recombinante AAV-vectoren worden vaak geproduceerd in zoogdiercellijnen zoals menselijke embryonale niercellen, HEK293 door voorbijgaande transfectie van de AAV-genoverdrachtsvector, AAV rep-cap en helpervirusplasmiden2,3. Er zijn echter verschillende beperkingen voor grootschalige AAV-productie door voorbijgaande transfectie van adherente HEK293-cellen. Ten eerste is een groot aantal celstapels of rolflessen nodig. Ten tweede zijn hoogwaardige plasmide-DNA en transfectiereagentia nodig, wat de productiekosten verhoogt. Ten slotte is het serum bij het gebruik van adherente HEK293-cellen vaak nodig voor een optimale productie, wat de downstream-verwerking1,2,3bemoeilijkt. Een alternatieve methode van AAV-productie omvat het gebruik van de insectencellijn, Spodoptera frugiperda (Sf9) -cellen en een insectenvirus genaamd recombinant Autographa californica multicapsid nucleair polyhedrosevirus (AcMNPV of baculovirus)8,9,10. Sf9-cellen worden gekweekt in serumvrije suspensiecultuur die gemakkelijk op te schalen is en compatibel is met de huidige productie van goede productiepraktijken (cGMP) op grote schaal, waarvoor geen plasmide- of transfectiereagentia nodig zijn. Bovendien zijn de kosten van de AAV-productie met behulp van het Sf9-baculovirussysteem lager dan de kosten van het gebruik van voorbijgaande transfectie van plasmiden in HEK293-cellen11.
Het oorspronkelijke rAAV-productiesysteem met baculovirus-Sf9-cellen gebruikte drie baculovirussen: een baculovirus met genoverdrachtcassette, het tweede baculovirus met rep-gen en het derde baculovirus met serotype-specifiek capsid-gen12,13. Het baculovirus bevattende rep-construct was echter genetisch instabiel bij meerdere passagerondes, wat amplificatie van het baculovirus voor de grootschalige AAV-productie voorkwam. Om dit probleem op te lossen, werd een nieuw rAAV-vectorsysteem ontwikkeld, dat twee baculovirussen (TwoBac) bevatte: een baculovirus met de AAV-genoverdrachtcassette en een ander baculovirus dat de AAV-rep-cap-genen samen bevat die genetisch stabieler zijn dan het oorspronkelijke systeem en handiger om rAAV te produceren vanwege het gebruik van TwoBac in plaats van drie14, 15. Het OneBac-systeem maakt gebruik van de AAV-genoverdrachtcassette en de rep-cap-genen in een enkel baculovirus, wat handiger is om de rAAV te produceren vanwege het gebruik van één baculovirus in plaats van TwoBac of ThreeBac2,16,17. In onze studie werd het TwoBac-systeem gebruikt voor optimalisatie.
Het baculovirussysteem voor AAV-productie heeft ook beperkingen: baculovirusdeeltjes zijn onstabiel voor langdurige opslag in serumvrij medium11, en als de baculovirustiter laag is, is een groot volume baculovirussupernatant nodig, dat giftig kan worden voor de groei van Sf9-cellen tijdens AAV-productie (persoonlijke observatie). Het gebruik van titerloze infected-cell preservation and scale-up (TIPS) cellen, of baculovirus-geïnfecteerde insectencellen (BIIC), biedt een goede optie voor AAV-productie waarbij baculovirus-geïnfecteerde Sf9-cellen worden bereid, gecryopreserveerd en vervolgens gebruikt voor infectie van verse Sf9-cellen. Een ander voordeel is de verhoogde stabiliteit van baculovirus (BV) in Sf9-cellen na cryopreservatie10,11.
Twee soorten TIPS-cellen worden gegenereerd om AAV-productie mogelijk te maken: de eerste door infectie van Sf9-cellen met het BV-AAV2-GFP of therapeutische gen, en de tweede door infectie van Sf9-cel met BV-AAV2-rep-cap. TIPS-cellen worden gecryopreserveerd in kleine en gebruiksklare aliquots. AAV-vectoren worden geproduceerd in serumvrije suspensiecultuur in een kolf die in een orbitale shaker of Wave-bioreactor wordt geplaatst door TIPS-cellen die baculovirussen en verse Sf9-cellen produceren, samen te kweken. Sf9-cellen worden geïnfecteerd door baculovirussen die de AAV2-GFP-vector en de rep-cap-sequenties dragen om AAV te genereren. Vier tot vijf dagen later, wanneer de AAV-opbrengsten het hoogst zijn, worden de productiecellen gelyseerd met wasmiddel om de AAV-deeltjes vrij te geven. Het cellysaat wordt vervolgens geklaard door centrifugeren en filtratie met lage snelheid. AAV-deeltjes worden uit het lysaat gezuiverd door AVB Sepharose-kolomchromatografie. Ten slotte worden AAV-vectoren geconcentreerd met behulp van TFF. Het protocol beschrijft de productie van AAV op kleine schaal, nuttig voor onderzoek en preklinische studies. De methoden zijn echter schaalbaar en compatibel met de productie van klinische AAV-vectoren voor gentherapietoepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zie figuur 1 voor een illustratie van het protocol.
1. Generatie van baculovirus-geïnfecteerde TIPS-cellen
- Ontdooi een injectieflacon met Sf9-cellen en zaai ze onmiddellijk in 50 ml insectencelkweekmedium. Kweek Sf9-cellen in een orbitale schuddersubcubator bij 125 tpm en 28 °C in ronde bodemkolven met een losjes bevestigde dop voor luchtuitwisseling8,9. Vermeerder de cellen in een kolf van 1 L met 200 ml medium om voldoende cellen te verkrijgen voor de productie van TIPS-cellen.
- Voeg 50 ml Sf9-cellen bij 2 x 106 cellen/ml toe in twee kolven: infecteer een kolf Sf9-cellen met 0,5 ml baculovirus (BV)-AAV2-GFP (of therapeutisch gen) en de andere celkolf met 0,5 ml BV-AAV2-rep-cap.
OPMERKING: AAV vector plasmiden werden genereus geleverd door Dr. Robert M. Kotin (NIH). Baculovirus productie uit bacmid DNA (Bac-to-Bac System) is eerder beschreven8,9. De stabiliteit van het baculovirus tijdens de passage is een kritiek probleem voor de opschaling van de productie van rAAV. Het is beter om een lager passagegetal baculovirus te gebruiken (tot passage nummer 4). Bepaal het optimale volume van het baculovirus supernatant empirisch door de baculovirusinfectie-efficiëntie te controleren met behulp van flowcytometrie (figuur 2) tijdens de productie van TIPS-cellen. - Controleer de baculovirusinfectie 3-4 dagen na infectie door baculovirus gp64 als volgt in geïnfecteerde Sf9-cellen te kleuren.
- Kleur 2 x 105 Sf9-cellen (zowel niet-geïnfecteerde als baculovirus-geïnfecteerde cellen) met 0,5 μg muisantilichaam tegen baculovirus gp64 (1:200) met een fluorescerende kleurstof in 100 μL blokkerende buffer gedurende 30 minuten bij omgevingstemperatuur.
- Was de cellen met 1 ml PBS om het antilichaam te verwijderen en resuspend de gekleurde cellen in 300 μL PBS met 0,5% runderserumalbumine.
- Analyseer de baculovirus gp64-expressie op cellen met behulp van flowcytometrie(figuur 2).
OPMERKING: Bepaal de gating-strategie voor flowcytometrie-acquisitie en -analyse empirisch. In totaal worden 10.000 enkele levende cellen verworven. Baculovirus gp64 expressie op Sf9 celoppervlakken duidt op baculovirus infectie. Na 3-4 dagen raken de meeste Sf9-cellen geïnfecteerd met het baculovirus, zoals blijkt uit baculovirus gp64-expressie (figuur 2).
- Wanneer de cellen 80%-90% levensvatbaar zijn met een toename van de diameter (figuur 3), oogst de cellen en cryopreserve 1 x 107 cellen in 1 ml insectenkweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 10% dimethylsulfoxide in een langzaam vriescontainer bij -80 °C. Breng de volgende dag de buis met TIPS-cellen over naar een vriezer met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
OPMERKING: Voer celkweek uit in een bioveiligheidskast volgens de standaard aseptische laboratoriumtechniek op bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2).
2. Productie van AAV vector
- Dag 1: Kweek Sf9-cellen met de baculovirus-geïnfecteerde TIPS-cellen
- Kweek en kweek naïeve Sf9-cellen bij 1 x 106 cellen/ml bij 28 °C in verschillende kolven van 2 L met 400 ml insectencelkweekmedium in een schudderincubator die nodig is voor de productie van AAV. Na 3-4 dagen is de celdichtheid verhoogd tot 5 x 106-6 x 106 cellen / ml.
OPMERKING: CO2 en vochtigheid zijn geen belangrijke factoren voor de groei van Sf9-cellen. - Zaai de Sf9-cellen als volgt in schudkolven of in een bioreactor.
- AAV-productie in kolven in een orbitale schudderincubator: Gebruik een pipet of een peristaltische pomp om 400 ml Sf9-cultuur bij 2 x 106 cellen / ml aseptisch in een kolf van 2 L te zaaien. Stel de orbitale shaker in op 125 rpm en 28 °C.
OPMERKING Gebruik een peristaltische pomp of standaardpipet, afhankelijk van de schaal van de AAV-productie. - AAV-productie in een bioreactor: Gebruik een peristaltische pomp om 1 L Sf9-cultuur bij 2 x 106 cellen / ml aseptisch in een bioreactorzak van 10 L te zaaien. Laad de zak op de bioreactoreenheid om te kweken bij 28 °C. Voeg 40% zuurstof toe aan de bioreactorzak bij 0,1 psi. Zet de bioreactoreenheid in een hoek van 20° en schud de zak bij 25 tpm.
- AAV-productie in kolven in een orbitale schudderincubator: Gebruik een pipet of een peristaltische pomp om 400 ml Sf9-cultuur bij 2 x 106 cellen / ml aseptisch in een kolf van 2 L te zaaien. Stel de orbitale shaker in op 125 rpm en 28 °C.
- Ontdooi één injectieflacon van elke BV-AAV2-GFP (of therapeutisch gen) en BV-AAV2-rep-cap TIPS-cellen. Verdun de cellen met 20 ml insectenkweekmedium en voer een levensvatbaarheidstelling van de cellen uit met trypan blue. Ent beide TIPS-cellen in een verhouding van 1:10.000 ten opzichte van de naïeve Sf9-cellen die in een shakerkolf of bioreactor zijn gekweekt.
OPMERKING: De overleving van de TIPS-cellen wordt verminderd als gevolg van cryopreservatie en het herstelpercentage is ongeveer 50% wanneer de levensvatbaarheid van de cel wordt bepaald met de trypanblauwe kleuring. Voer een pilotexperiment uit om de verhouding tussen TIPS-cellen en naïeve Sf9-cellen empirisch te bepalen vóór grootschalige rAAV-productie.
- Kweek en kweek naïeve Sf9-cellen bij 1 x 106 cellen/ml bij 28 °C in verschillende kolven van 2 L met 400 ml insectencelkweekmedium in een schudderincubator die nodig is voor de productie van AAV. Na 3-4 dagen is de celdichtheid verhoogd tot 5 x 106-6 x 106 cellen / ml.
- Dag 2: Cultuurmonitoring
- Oogst 1 ml Sf9-cultuur aseptisch. Kleur met de Trypan blauwe kleurstof om het celgetal, de levensvatbaarheid en de morfologie te analyseren.
- Dag 3: Cultuurmonitoring en voeding
- Oogst 1 ml Sf9-cultuur en analyseer het celgetal, de levensvatbaarheid en de morfologie. Controleer de status van baculovirusinfectie na het kleuren van de Sf9-cellen zoals vermeld in stap 1.3.
OPMERKING: Toename van de celdiameter en cytopathisch effect zijn indicaties van baculovirusinfectie. De toename in diameter gaat vooraf aan een afname van de levensvatbaarheid van de cel en deze parameters worden gebruikt om de celoogsttijd tijdens de AAV-productie te bepalen. Bepaal empirisch het optimale tijdspunt. - Voed de Sf9-cultuur met vers insectenkweekmedium in een verhouding van 1:5 aseptisch.
- Oogst 1 ml Sf9-cultuur en analyseer het celgetal, de levensvatbaarheid en de morfologie. Controleer de status van baculovirusinfectie na het kleuren van de Sf9-cellen zoals vermeld in stap 1.3.
- Dag 4: Cultuurmonitoring
- Oogst 1 ml Sf9-cultuur en analyseer het celgetal, de levensvatbaarheid en de morfologie. Koppel de zuurstoftoevoer van de bioreactorzak los.
- Dag 5: Cultuurmonitoring en oogst
- Oogst 1 ml Sf9-cultuur en analyseer het celgetal, de levensvatbaarheid en de morfologie. Oogst het kweekmedium en de cellen wanneer de levensvatbaarheid van de Sf9-cel is afgenomen tot ongeveer 50%(figuur 4).
- Draai de celsuspensie gedurende 15 minuten bij 4 °C op 2100 x g. Verzamel het supernatant en de celkorrel en bewaar ze bij -80 °C.
3. Lysis van cellen en afgifte van AAV
- Ontdooi de AAV-producentcelkorrel. Voeg 100 ml cellysebuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM natriumchloride, 0,5 % Triton-X-100) toe aan de celkorrel, meng krachtig en incubeer gedurende 30 minuten bij omgevingstemperatuur om de AAV-deeltjes vrij te maken.
- Centrifugeer bij 2100 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C en breng het cellysaat over in een nieuwe container. Meng het cellysaat en celkweek supernatant na het ontdooien.
- Voeg 20 U/ml nuclease en 10 mM MgCl2 toe aan het cellysaat om het DNA en RNA te verteren. Incubeer gedurende 2-4 uur bij 37 °C.
- Filtreer het lysaat door een 0,8 μm en 0,2 μmpolyethersulfone dubbel filtratiesysteem met behulp van een pomp.
- Bewaar het geklaarde cellysaat bij 4 °C 's nachts of zuiver de AAV onmiddellijk.
4. Zuivering van AAV-vector met behulp van affiniteitskolomchromatografiesysteem
- Bereid het chromatografie-instrument voor door het monster en de bufferlijnen achtereenvolgens te wassen met steriel water, 1 N natriumhydroxide, water en fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) met een stroomsnelheid van 50 ml/min.
- Monteer de AVB Sepharose-kolom (10,0 ml) in het chromatografiesysteem en voer 100 ml PBS uit met een stroomsnelheid van 5 ml / min.
OPMERKING: Gebruik een lager of hoger volume AVB Sepharose-kolom, afhankelijk van de schaal van AAV-productie en stel het debiet in zoals voorgesteld door de kolom- of harsfabrikant (zie Tabel met materialen). - Om de fracties van kolomdoorvoeroplossing, wasbuffer en elutiebuffer met AAV-deeltjes te verzamelen, plaatst u buizen in de fractiecollectorsleuven van het chromatografie-instrument.
- Breng de kolom in evenwicht met PBS met een debiet van 5,0 ml/min.
- Laad het gefilterde cellysaat met AAV-deeltjes op de kolom met behulp van de chromatografiemachine die is uitgerust met een monsterpomp. Voer het monster uit met een stroomsnelheid van 3,0 ml per minuut.
- Voer PBS door de AVB Sepharose-kolom met een stroomsnelheid van 3,0 ml /min totdat de ultraviolette (UV) absorptiecurve (280 nm) terugkeert naar de basislijn en stabiel wordt.
- Eluteer de AAV-deeltjes uit de kolom met een buffer van 50 mM natriumcitraat (pH 3,0) bij een stroomsnelheid van 3,0 ml/min(figuur 5).
OPMERKING: Terwijl de AAV-deeltjes zich distantiëren van de hars en door de UV-detector gaan, is een elutiepiek van eiwit te zien op het chromatogram. - Verdun het AAV-supernatant onmiddellijk met een volume van een vijfde van 500 mM Tris-HCl (pH 8,0) om de pH van het AAV-bevattende supernatant te verhogen tot ongeveer pH 5,5 om pH-gemedieerde afbraak met zure elutiebuffer te voorkomen. Verdun verder het AAV-supernatant 10-voudig met PBS om de pH volledig te neutraliseren.
OPMERKING: De pH-waarde is ongeveer 5,5 na het neutraliseren van de rAAV-oplossing. Na het neutraliseren van AAV verdunt u de rAAV-oplossing 10-voudig met PBS (pH 7,4) zodat AAV zich in een fysiologische buffer bevindt. - Bewaar 1 ml van elke kolomdoorloopmonsters, wasbuffer en 100 μL van het geëlueerde AAV-supernatant om de aanwezigheid van AAV door infectie van de doelcellen te evalueren.
- Reinig de AVB Sepharose kolom met 100 ml citroenzuur (pH 2,1) en 100 ml PBS (pH7,4) bij een debiet van 5,0 ml/min. Spoel de kolom af met 20% ethanol bij een debiet van 5,0 ml/min en bewaar bij 4 °C.
- Reinig de leidingen van het chromatografie-instrument met de kolom offline positie zoals beschreven in paragraaf 4.1. Spoel ten slotte het chromatografiesysteem met 200 ml 20% ethanol bij een debiet van 50,0 ml/min en bewaar in 20% ethanol.
5. Concentratie en diafiltratie van AAV-vector met behulp van tangentiële stroomfiltratie (TFF)
- Installeer het TFF-systeem uitgerust met een polysulfonmembraancartridge (100 kDa Molecular Weight Cut Off) om de AAV te concentreren.
- Evenwicht TFF-module met 200 ml PBS gedurende 10 minuten.
- Belast het AAV-monster door de stroom van de pomp te regelen totdat het monster is teruggebracht tot het gewenste volume met behoud van een transmembraandruk van 2-3 psi.
- Diafiltreer het retentaat met 100 ml PBS, zoals gebruikt in deze studie, of definieer empirisch alternatieve buffer die de stabiliteit van AAV op lange termijn ondersteunt.
- Nadat u het AAV-monster tot het gewenste volume hebt geconcentreerd, verzamelt u het AAV-monster, filtert u het door een polyethersulfonfilter van 0,2 μm, aliquot, en bewaart u het vervolgens bij -80 °C.
6. Infectie van AAV-monsters in de doelcellen om de aanwezigheid van AAV in de zuiveringsstappen te evalueren
- Ent 7 x 104 HT1080 cellen/put in een 24-putplaat in 500 μL Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 1% L-glutamine, 1% natriumpyruvaat en 10% foetaal runderserum (FBS) de dag voor infectie. Kweek de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Tel de cellen vóór infectie. Voeg het verdunde ongezuiverde AAV-bulkmonster toe voordat de kolom wordt uitgevoerd, kolomdoorloopmonsters, wasbuffer en geëlueerd gezuiverd AAV-monster.
OPMERKING: Tel de Trypan blauwgekleurde cellen met een hemocytometer. Bepaal de verdunningsfactor en het volume (μL) van de AAV-monsters empirisch. Hoe hoger de AAV-titers, hoe meer verdunning nodig is. Zorg ervoor dat de baculovirusdeeltjes van het ongezuiverde bulkmonster vóór de kolomloop, kolomdoorloopmonsters, wasbuffer gedurende 50 minuten bij 50 °C worden geïnactiveerd voordat de doelcellen worden geïnfecteerd om infectieuze titers van AAV te bepalen. - Analyseer twee dagen na infectie de eiwitexpressie (bijv. GFP of therapeutisch gen) in de cellen met behulp van een flowcytometer.
- Bereken infectieuze titers van AAV met behulp van het aantal cellen op het moment van infectie, verdunningsfactor en percentage GFP + -cellen met de formule: (Totaal aantal cellen x Percentages GFP + cellen x Verdunningsfactor) / Volume van AAV in milliliters.
OPMERKING: Het aantal cellen is bijvoorbeeld 1 x 105,het percentage GFP + -cellen is 3,4%, de verdunningsfactor is 100 en het volume toegevoegde AAV is 2 μL. De titer van AAV is 1,7 x 108 infectieuze eenheid (IE) / ml. De totale hoeveelheid gezuiverde AAV-deeltjes in 25 ml van de geëlueerde fractie is 4,3 x 109 infectieuze eenheden (IE) / ml(figuur 6). Het totale aantal initiële ongezuiverde AAV-deeltjes is 1,09 x 1010 IE / ml en gezuiverde AAV-deeltjes zijn 4,3 x 109 IE / ml. Daarom is het percentage herstel 39,4%. Het percentage GFP+ cellen moet tussen 1%-30% liggen, wat overeenkomt met een lineair bereik wanneer het wordt gebruikt om de infectieuze titer van AAV te berekenen. Als meer geconcentreerde AAV-vectordeeltjes in de doelcellen worden geïnfecteerd; er is een mogelijkheid dat meerdere kopieën van de AAV-deeltjes een enkele cel kunnen infecteren die zich als een enkele kopie van de vector zal laten zien. Verdun daarom het AAV-vectorsupernatant om 1% -30% vectorinfectie in de doelcellen te verkrijgen. Als de AAV-vector geen reporter-gen heeft, kleur dan het transgen of het therapeutische gen dat tot expressie wordt gebracht door de AAV-vector met een antilichaam dat een fluorescerende kleurstof bevat die kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van een flowcytometer. Niet alle AAV-serotypen kunnen HT1080-cellen efficiënt infecteren. Gebruik daarom verschillende cellijnen om de infectiviteitstest voor andere AAV-serotypen uit te voeren. Titer de AAV2-GFP deeltjes voor zuivering en na zuivering op HT1080 cellen en meet de GFP expressie door flowcytometrie. Bereken de terugwinning (%) door de verhouding van het aantal gezuiverde AAV-deeltjes en het aantal AAV-deeltjes voorafgaand aan zuivering vermenigvuldigd met 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier worden de representatieve resultaten van procesontwikkeling voor de productie en zuivering van AAV-vectoren met behulp van het Sf9-insectencelsysteem getoond. De methode omvat co-kweek van Sf9-cellen met baculovirus-geïnfecteerde TIPS-cellen, het voeden van de cellen met groeimedium, het oogsten en lysis van de productiecellen om de AAV-deeltjes vrij te maken, verduidelijking van het cellysaat met nucleasebehandeling, centrifugatie en filtratie, zuivering van AAV met behulp van AVB Sepharose-affiniteitschromatografie en concentratie met TFF (figuur 1).
TIPS-cellen worden gegenereerd door infectie van BV-AAV2-GFP of therapeutisch gen en BV-AAV2-rep-cap in Sf9-cellen afzonderlijk. De meeste Sf9-cellen raken binnen 3-4 dagen geïnfecteerd met het baculovirus als gevolg van de meerdere infectierondes, aangetoond door baculovirus glycoproteïne gp64-expressie in (figuur 2) en de cellen vertonen een toename in diameter (figuur 3). TIPS-cellen worden 3-4 dagen na infectie geoogst en gecryopreserveerd. Sf9-cellen worden samen gekweekt met de TIPS-cellen die baculovirusdeeltjes afscheiden in het kweekmedium die naïeve Sf9-cellen infecteren. Baculovirus is replicatie-competent; daarom neemt het aantal geïnfecteerde cellen snel toe door meerdere ronde infecties met nieuw geproduceerde baculovirusdeeltjes die worden uitgescheiden in het kweekmedium8,9. De cellen vertonen een toename in diameter, cytopathisch effect en ongeveer de helft van de cellen sterft in 5 dagen na infectie, wat de tekenen zijn van voltooiing van de AAV-productie(figuur 4).
De AAV-productiecellen worden geoogst door centrifugering met lage snelheid, gelyseerd met bufferbevattend reinigingsmiddel om de AAV in het cellysaat vrij te geven. Dit wordt vervolgens behandeld met nuclease voor de vertering van DNA en RNA om de viscositeit te verminderen, gefilterd door een membraan van 0,8 μm en 0,2 μm en vervolgens gezuiverd en geconcentreerd. Het cellysaat wordt met behulp van een chromatografiesysteem op een AVB Sepharose kolom geladen. De AVB Sepharose hars bindt AAV2 deeltjes door zijn affiniteit met de capsid eiwitten. Wasbuffer wordt door de AVB Sepharose-kolom geleid om ongebonden en losgebonden materialen te verwijderen totdat de ultraviolette (UV) absorptiecurve (280 nm) stabiel wordt op de basislijn. Omdat AAV-deeltjes AVB Sepharose sterk binden, wordt er tijdens het wassen geen significant aantal AAV2-deeltjes gedetecteerd. De AAV-deeltjes worden geëlueerd met een zure buffer (pH 3,0), die de interactie tussen AAV-deeltjes en AVB-sepharosehars dissocieert. Om de pH-gemedieerde afbraak van de AAV door de zure oplossing te voorkomen, wordt de eluant geneutraliseerd met een alkalische buffer (pH 8,0). Een piek van eiwit wordt gezien tijdens de elutie met zure buffer die overeenkomt met de AAV-fractie(figuur 5 en figuur 6). Gezuiverde AAV wordt 10-voudig verdund met PBS, geconcentreerd en buffer uitgewisseld met een TFF-systeem. In dit voorbeeld zijn de totale AAV-deeltjes in cellysaat (560 ml) 1,1 x 1014 vectorgenoom (vg), na AVB sepharosechromatografiezuivering (25 ml) 4,1 x 1013 vg en na concentratie met TFF (25 ml) 2,4 x 1013 vg. De gezuiverde AAV-monsters tonen drie verschillende capsid-eiwitten, VP1, VP2 en VP3, na SDS-PAGE en zilverkleuring(Figuur 7)
Figuur 1: Een schematisch diagram voor de productie en zuivering van AAV Vector. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Flowcytometrie analyse van baculovirus gp64 expressie in Sf9 cellen. Baculovirus geïnfecteerde Sf9-cellen worden gekleurd met een muis anti-baculovirus gp64-antilichaam met een fluorescerende kleurstof, die wordt gedetecteerd door flowcytometrie. (A) Niet-geïnfecteerde Sf9-cellen. (B) Baculovirus geïnfecteerde Sf9 cellen vertonen gp64 expressie in de meeste cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Morfologie van de baculovirus-geïnfecteerde Sf9 (TIPS) cellen. Baculovirus wordt geïnfecteerd in de Sf9-cellen om de TIPS-cellen te produceren. (A) Niet-geïnfecteerde Sf9-cellen. (B) Baculovirus geïnfecteerd Sf9 (TIPS) cellen. Cellen worden weergegeven met een vergroting van 200x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Morfologie van de baculovirus-geïnfecteerde Sf9-cellen tijdens de productie van AAV. TIPS-cellen scheiden baculovirussen af die tijdens de productie van AAV co-gekweekte naïeve Sf9-cellen infecteren. (A) Niet-geïnfecteerde Sf9-cellen. (B) Baculovirus geïnfecteerde Sf9 cellen vertonen een toename in diameter. Vijf dagen na infectie sterft bijna de helft van de cellen af (gevisualiseerd onder een omgekeerde fasemicroscoop na trypan blauwe kleuring). Rode pijlen geven levende cellen aan en blauwe pijlen geven dode cellen aan. Cellen worden weergegeven met een vergroting van 200x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: AAV-zuivering met behulp van AVB Sepharose kolomchromatografie. Een chromatogram toont de absorptie van eiwitmonsters bij 280 nm tijdens het laden van het monster op kolom, wassen en elutie. Het chromatogram is aangepast om in de figuur te passen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Het aantal infectieuze AAV-deeltjes in de doorstroming tijdens het laden op de kolom, wassen en elutie. In totaal wordt 560 ml AAV-monsters geladen op een AVB Sepharose-kolom van 10 ml. Het fractievolume voor de kolombelasting is 50 ml, kolomwas is 50 ml en elutie is 25 ml. AAV-titers worden gemeten na infectie van HT1080-cellen met de kolomdoorloopmonsters tijdens het laden op de kolom, wassen en elutie om de aanwezigheid van AAV bij elke stap van de zuivering te onderzoeken. De totale gezuiverde AAV-opbrengst is 4,3 x 109 infectieuze eenheden. Elk ruitvormig symbool vertegenwoordigt de infectieuze eenheden (IE) van AAV in elke fractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. SDS-PAGE en zilverkleuring van pure AAV vector met capsid eiwitten. De gereduceerde AAV-monsters worden uitgevoerd op SDS-PAGE en er wordt zilverkleuring uitgevoerd. Drie verschillende banden van AAV capsid eiwitten, VP1, VP2 en VP3, zijn zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De parameters die in dit protocol worden gebruikt voor de procesontwikkeling van productie, zuivering en concentratie van AAV-vectoren kunnen worden toegepast op zowel kleine als grootschalige productie van AAV-vectoren voor gentherapietoepassingen. Het gehele upstream en downstream proces kan worden uitgevoerd in een gesloten systeem dat compatibel is met de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP). De grote voordelen van het Sf9-baculovirussysteem zijn schaalbaarheid voor grootschalige GMP-grade AAV-productie tegen een betaalbare prijs. Het systeem heeft geen dure plasmiden en transfectiereagentia nodig, die nodig zijn voor de productie van AAV met behulp van HEK293-cellen. Er is gemeld dat zowel HEK293-cellen als Sf9-cellen AAV-vectoren van vergelijkbare kwaliteit opleveren (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Abstract # 100). De grote uitdaging is dat dit systeem de generatie van baculovirussen en TIPS-cellen vereist die veel tijd en moeite kosten.
In dit protocol werden twee soorten TIPS-cellen (TwoBac-systeem) gebruikt: een TIPS-cel met baculovirus met AAV-genoverdrachtcassette en een andere TIPS-cel met AAV-rep-cap. Het OneBac-systeem2,16,17 kan TIPS-cellen genereren die zowel AAV-genoverdrachtcassette als rep-cap-genen bevatten in een enkel baculovirus. Het OneBac-systeem biedt een alternatieve benadering om de rAAV te produceren met slechts één set TIPS-cellen in plaats van twee zoals beschreven in het TwoBac-systeem, wat het protocol verder zou vereenvoudigen.
Dit protocol beschrijft de AAV-productie in Sf9-cellen. Het is belangrijk om de verhouding tussen de baculovirus-geïnfecteerde TIPS-cellen en de producent van naïeve Sf9-cellen te optimaliseren om een goede AAV-opbrengst te verkrijgen. Als deze verhouding suboptimaal is, wordt de opbrengst van AAV verminderd11. Als er bijvoorbeeld meer AAV ITR-bevattende genoverdrachtsvectoren worden gegenereerd dan de capsiden in de productiecellen vanwege de suboptimale verhouding van TIPS en productiecellen, zullen alle beschikbare genoverdrachtsvectoren niet genoeg capsiden krijgen om volledige AAV-deeltjes te produceren. Aan de andere kant, als er meer capsiden worden gegenereerd dan de AAV-genoverdrachtsvectoren in de productiecellen, krijgen alle capsiden geen AAV ITR-bevattende genoverdrachtvectoren die resulteren in lege AAV-deeltjes.
Naarmate de cellen zich vermenigvuldigen, raken de voedingsstoffen van het kweekmedium uitgeput en hopen metabole afvalproducten zich op. Daarom kan suppletie van 20% vers groeimedium in de celkweek 2 dagen na co-kweek van TIPS-cellen en Sf9-cellen de AAV-titers aanzienlijk verhogen (Amine A. Kamen, National Research Council Canada, persoonlijke communicatie).
De zuiverheid van AAV-deeltjes is een kritische factor voor het bereiken van effectieve transductie van doelcellen zonder enige cytotoxiciteit voor zowel in vitro als in vivo studies3,5. Daarom is het belangrijk om een chromatografiestap op te nemen die selectief AAV-deeltjes kan zuiveren en onzuiverheden zoals gastheerceleiwitten en -puin, genomisch en baculoviral DNA en geaggregeerde en gefragmenteerde vectoren kan elimineren. Tijdens het laden van AAV-supernatant op een AVB Sepharose-kolom, is het van cruciaal belang om de doorstroommonsters te controleren op de aanwezigheid van AAV-deeltjes die door de kolom kunnen gaan zonder zich aan de hars te binden. Als dat het geval is, (1) is een lagere loopsnelheid nodig die resulteert in een langere verblijftijd voor het binden van de AAV-deeltjes, (2) moet de hoeveelheid geladen monster op de kolom worden verminderd en/of (3) moet het volume van de AVB Sepharose worden verhoogd, zodat de bindingscapaciteit van de kolom nooit groter is dan het aantal AAV-deeltjes. Het vermogen van AVB Sepharose hars om AAV deeltjes te binden met een hoge stroomsnelheid en met hoge affiniteit en capaciteit is belangrijk om de zuiveringstijd te verkorten. De belangrijkste beperking van AVB Sepharose is dat het de capsid van AAV-serotypen 1, 2 en 5 bindt. Daarom moeten verschillende chromatografieharsen worden getest en gebruikt voor de zuivering van andere AAV-serotypen18. Het stroomafwaartse zuiveringsprotocol dat hierin wordt beschreven, kan ook worden gebruikt om AAV geproduceerd in HEK 293-cellen te zuiveren.
Dit protocol kan AAV zuiveren uit cellysaat, maar kan geen lege deeltjes verwijderen. Een paar artikelen hebben methoden beschreven die lege versus volledige AAV-deeltjes in gezuiverde AAV-voorraden kunnen onderscheiden19,20. Wij zijn echter van mening dat de AAV-productie moet worden geoptimaliseerd op het upstream-procesniveau om het genereren van lege deeltjes te minimaliseren. Als de verhouding tussen AAV-genoverdrachtsvector en capsideproductie in productiecellen niet optimaal is, kunnen er meer lege deeltjes ontstaan.
Naast het binden van volledige AAV-deeltjes, bindt AVB Sepharose medium gefragmenteerde AAV-deeltjes of capside-eiwitten die kunnen worden verwijderd met behulp van TFF. De meeste deeltjes met een laag molecuulgewicht worden geëlimineerd uit AAV-monsters door de TFF-stap stroomafwaarts van de kolomchromatografie op te nemen. Daarnaast wordt TFF gebruikt om een bufferuitwisseling/diafiltratie uit te voeren en de AAV10,21te concentreren.
Hoewel ultracentrifugatie van het AAV-lysaat met cesiumchloride of iodixanolgradiënt de voorkeursmethode is voor kleinschalige en preklinische AAV-zuivering, is deze methode niet schaalbaar en minder geschikt voor grootschalige zuivering van AAV21,22.
Kortom, dit protocol voor de procesontwikkeling van productie en zuivering van AAV zal nuttig zijn voor kleinschalige preklinische en grootschalige productie van recombinant AAV voor de gentherapie van erfelijke genetische ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
We willen Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) bedanken voor het genereus verstrekken van de AAV-plasmiden en Danielle Steele en Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) voor hun technische assistentie. Dit werk wordt ondersteund door het Start-Up fonds van Cincinnati Children's Research Foundation aan M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
References
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
- Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
- Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
- Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
- Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
- Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
- Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M.
- Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
- Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
- Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
- Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
- Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).
