Summary
I denne protokol produceres AAV2 vektor af co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insektceller med baculovirus (BV)-AAV2-grønt fluorescerende protein (GFP) eller terapeutisk gen og BV-AAV2-rep-cap inficerede Sf9-celler i suspension kultur. AAV partikler frigives fra cellerne ved hjælp af vaskemiddel, afklaret, renset ved affinitet kolonne kromatografi, og koncentreret ved tangentiel flow filtrering.
Abstract
Adeno-associerede vira (AAV) er lovende vektorer for genterapi applikationer. Her produceres AAV2-vektoren af co-kultur af Spodoptera frugiperda (Sf9) celler med Sf9-celler inficeret med baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) og BV-AAV2-rep-cap i serumfri suspensionskultur. Celler dyrkes i en kolbe i en orbital shaker eller Wave bioreaktor. For at frigive AAV-partiklerne lyser producentcellerne i bufferholdigt vaskemiddel, som efterfølgende afklares ved lavhastighedscentrifugering og filtrering. AAV-partikler renses fra cellelyset ved hjælp af AVB Sepharose kolonnekromatografi, som binder AAV-partikler. Bundne partikler vaskes med PBS for at fjerne forurenende stoffer og uddrives fra harpiksen ved hjælp af natriumcitratbuffer ved pH 3.0. Den sure eluat neutraliseres med alkalisk Tris-HCl buffer (pH 8.0), fortyndet med fosfatbuffered saltvand (PBS) og yderligere koncentreret med tangentiel flowfiltrering (TFF). Protokollen beskriver små prækliniske vektor produktion kompatibel med opskalering til storstilet klinisk kvalitet AAV fremstilling for human genterapi applikationer.
Introduction
Adeno-associerede vira (AAV) er ikke-indhyllede human parvovirus, der indeholder et enkeltstrenget DNA på 4,6 kb. AAV vektorer har flere fordele i forhold til andre virale vektorer til genterapi applikationer1,2,3,4. AAVs er naturligvis replikering-inkompetente, dermed kræver en hjælper virus og vært maskiner til replikation. AAVs forårsager ingen sygdom og har lav immunogenicitet hos den inficerede vært3,5. AAV kan inficere både quiescent og aktivt dividere celler og kan fortsætte som episome uden at integrere i genomet af værtscellerne (AAV sjældent integreres i værtsgenomet)1,3. Disse funktioner har gjort AAV et ønskeligt værktøj til genterapi applikationer.
For at generere en AAV-genoverførselsvektor klones transgenekassetten, herunder det terapeutiske gen, mellem to interne terminalrevationer (ITR'er), som typisk er afledt af AAV-serotype 2. Den maksimale størrelse fra 5' ITR til 3' ITR, inklusive transgenesekvensen, er 4,6 kb6. Forskellige capsider kan have en anden celle eller væv trotropi. Derfor bør capsider vælges ud fra vævs- eller celletypen, der er beregnet til at blive målrettet med AAV-vektoren7.
Rekombinant AAV vektorer er almindeligt produceret i pattedyr cellelinjer såsom menneskelige embryonale nyreceller, HEK293 ved forbigående overførsel af AAV genoverførsel vektor, AAV rep-cap, og hjælper virus plasmider2,3. Der er dog flere begrænsninger for storskala AAV-produktion ved forbigående transfektion af klæbende HEK293-celler. For det første er der brug for et stort antal cellestakke eller rulleflasker. For det andet er der behov for plasmid-DNA- og transfectionreagenser af høj kvalitet, hvilket øger produktionsomkostningerne. Endelig er serumet, når der bruges klæbende HEK293-celler, ofte nødvendigt for optimal produktion, hvilket komplicerer downstream-forarbejdning1,2,3. En alternativ metode til fremstilling af AAV indebærer brug af insektcellelinjen, Spodoptera frugiperda (Sf9) celler og en insektvirus kaldet rekombinant Autographa californica multicapsid nuklear polyhedrosevirus (AcMNPV eller baculovirus)8,9,10. Sf9-celler dyrkes i serumfri suspensionskultur, der er let at skalere op og er kompatibel med den nuværende produktion af god fremstillingspraksis (cGMP) i stor skala, hvilket ikke kræver plasmid- eller transfectionreagenser. Desuden er omkostningerne ved AAV-produktionen ved hjælp af Sf9-baculovirus-systemet lavere end omkostningerne ved at anvende forbigående transfektion af plasmider i HEK293-cellerne11.
Det oprindelige rAAV-produktionssystem ved hjælp af baculovirus-Sf9-celler anvendte tre baculovirus: en baculovirus, der indeholder genoverførselskassette, den anden baculovirus, der indeholder rep-gen, og den tredje baculovirus, der indeholder serotypespecifikt capsid-gen12,13. Baculovirus, der indeholdt rep construct, var imidlertid genetisk ustabil på flere passager, hvilket forhindrede forstærkning af baculovirus til den store AAV-produktion. For at løse dette problem blev der udviklet et nyt rAAV-vektorsystem, som indeholdt to baculovirus (TwoBac): en baculovirus, der indeholder AAV-genoverførselskassetten og en anden baculovirus, der indeholder AAV rep-cap-generne sammen, som er genetisk mere stabile end det oprindelige system og mere bekvemme at producere rAAV på grund af brug af TwoBac i stedet for tre14, 15. OneBac-systemet bruger AAV-genoverførselskassetten og rep-cap-generne i en enkelt baculovirus, som er mere praktisk at producere rAAV på grund af brug af en baculovirus i stedet for at bruge TwoBac eller ThreeBac2,16,17. I vores undersøgelse blev TwoBac-systemet brugt til optimering.
Baculovirussystemet til AAV-produktion har også begrænsninger: baculoviruspartikler er ustabile til langtidsopbevaring i serumfri medium11, og hvis baculovirus titeren er lav, er der behov for en stor mængde baculovirus supernatant, som kan blive giftig for væksten af Sf9-celler under AAV-produktion (personlig observation). Brugen af titer-mindre inficeret celle bevarelse og opskalering (TIPS) celler, eller baculovirus-inficerede insektceller (BIIC), giver en god mulighed for AAV produktion, hvor baculovirus-inficerede Sf9 celler er forberedt, kryopreserveret, og efterfølgende anvendes til infektion af friske Sf9 celler. En anden fordel er den øgede stabilitet af baculovirus (BV) i Sf9-celler efter kryopræservering10,11.
To typer AF TIPS celler er genereret for at muliggøre AAV produktion: den første ved infektion af Sf9 celler med BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen, og den anden ved infektion af Sf9 celle med BV-AAV2-rep-cap. TIPS celler er cryopreserved i små og klar til brug aliquots. AAV vektorer produceres i serum-fri suspension kultur i en kolbe placeret i en orbital shaker eller Wave bioreaktor ved co-dyrkning TIPS celler, der producerer baculovirus og friske Sf9 celler. Sf9 celler er inficeret med baculovirus, der bærer AAV2-GFP vektor og rep-cap sekvenser til at generere AAV. Fire til fem dage senere, når AAV udbytter er de højeste, er producentcellerne lysed med vaskemiddel til at frigive AAV partikler. Cellelyset afklares efterfølgende ved lavhastighedscentrifugering og filtrering. AAV partikler renses fra lysatet ved AVB Sepharose kolonnekromatografi. Endelig er AAV vektorer koncentreret ved hjælp af TFF. Protokollen beskriver produktionen af AAV i lille skala, nyttig til forskning og prækliniske undersøgelser. Metoderne er dog skalerbare og kompatible med fremstilling af AAV-vektorer af klinisk kvalitet til genterapiapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se figur 1 for en illustration, der opsummerer protokollen.
1. Generering af baculovirus-inficerede TIPS-celler
- Optø et hætteglas af Sf9-celler og frø dem straks i 50 mL insektcellekulturmedie. Knyt Sf9-celler i en orbital shaker inkubator ved 125 omdrejninger og 28 °C i runde bundkolber med løst fastgjort hætte til udveksling af luft8,9. Overfør cellerne i en 1 L kolbe indeholdende 200 mL medium til at opnå nok celler til TIPS celler produktion.
- Der tilsættes 50 mL Sf9-celler ved 2 x 106 celler/mL i to kolber: inerken af en kolbe sf9-celler med 0,5 mL baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) og den anden kolbe af celler med 0,5 mL BV-AAV2-rep-cap.
BEMÆRK: AAV vektor plasmider blev generøst leveret af Dr. Robert M. Kotin (NIH). Baculovirusproduktion fra bacmid DNA (Bac-to-Bac System) er tidligere blevet beskrevet8,9. Baculovirusstabiliteten under passagen er et kritisk problem for opskaleringsproduktionen af rAAV. Det er bedre at bruge et lavere passage antal baculovirus (op til passage nummer 4). Bestem den optimale volumen af baculovirus supernatant empirisk ved at kontrollere baculovirus infektion effektivitet ved hjælp af flow cytometri (Figur 2) under TIPS celle produktion. - Monitor baculovirus infektion 3-4 dage efter infektion ved farvning baculovirus gp64 i inficerede Sf9 celler som følger.
- Plet 2 x 105 Sf9-celler (både ikke-inficerede og baculovirusinficerede celler) med 0,5 μg mus anti-baculovirus gp64 antistof (1:200), der indeholder et fluorescerende farvestof i 100 μL af blokerende buffer i 30 min ved omgivelsestemperatur.
- Vask cellerne med 1 mL PBS for at fjerne antistoffet og genanvende de farvede celler i 300 μL PBS indeholdende 0,5% kvæg serum albumin.
- Analysér baculovirus gp64-udtrykket på celler ved hjælp af flowcytometri (Figur 2).
BEMÆRK: Bestem gating strategi for flow cytometri erhvervelse og analyse empirisk. I alt 10.000 enkelte levende celler er erhvervet. Baculovirus gp64 udtryk på Sf9 celleoverflader indikerer baculovirus infektion. Efter 3-4 dage bliver de fleste af Sf9-cellerne inficeret med baculovirus, som det fremgår af baculovirus gp64 udtryk (Figur 2).
- Når cellerne er 80%-90% levedygtige med en stigning i diameteren (Figur 3), høste cellerne og kryopreserve 1 x 107 celler i 1 mL insektkultur medium suppleret med 10% føtalt kvæg serum og 10% dimethyl sulfoxid i en langsomt frysende beholder ved -80 °C. Den næste dag overføres røret, der indeholder TIPS-celler, til en flydende nitrogenfryser til langtidsopbevaring.
BEMÆRK: Udfør cellekultur i et biosikkerhedskab efter standard aseptisk laboratorieteknik på Biosafety Level 2 (BSL-2).
2. Produktion af AAV vektor
- Dag 1: Co-kultur Sf9 celler med baculovirus-inficerede TIPS celler
- Kultur og vokse naive Sf9 celler på 1 x 106 celler / mL ved 28 °C i flere 2 L kolber indeholdende 400 mL insekt celle kultur medium i en shaker inkubator, der er nødvendig for AAV produktion. Efter 3-4 dage øges celletætheden op til 5 x 106-6 x 106 celler/mL.
BEMÆRK: CO2 og fugtighed er ikke vigtige faktorer for væksten af Sf9-celler. - Frø Sf9-cellerne enten i rystekolber eller i en bioreaktor som følger.
- AAV produktion i kolber i en orbital shaker inkubator: Brug en pipette eller en peristaltisk pumpe til at så 400 mL sf9 kultur ved 2 x 106 celler / mL i en 2 L kolbe aseptisk. Opsæt orbital shaker ved 125 omdrejninger og 28 °C.
BEMÆRK Brug en peristaltisk pumpe eller standardpipette afhængigt af omfanget af AAV-produktionen. - AAV produktion i en bioreaktor: Brug en peristaltisk pumpe til at så 1 L sf9 kultur på 2 x 106 celler / mL i en 10 L bioreaktor taske aseptisk. Læg posen på Bioreaktorenheden til dyrkning ved 28 °C. Tilsæt 40% ilt til bioreaktorposen ved 0,1 psi. Opsæt bioreaktorenheden i en vinkel på 20°, og ryst posen ved 25 omdrejninger.
- AAV produktion i kolber i en orbital shaker inkubator: Brug en pipette eller en peristaltisk pumpe til at så 400 mL sf9 kultur ved 2 x 106 celler / mL i en 2 L kolbe aseptisk. Opsæt orbital shaker ved 125 omdrejninger og 28 °C.
- Optø et hætteglas af hver BV-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) og BV-AAV2-rep-cap TIPS celler. Fortynd cellerne med 20 mL insektkulturmedie og udfør et levedygtighedstal af cellerne ved hjælp af trypanblå. Pod begge TIPS-celler i et forhold på 1:10.000 i forhold til de naive Sf9-celler, der dyrkes i en shakerkolbe eller bioreaktor.
BEMÆRK: TIPS-cellernes overlevelse reduceres på grund af kryopræservering, og restitutionshastigheden er ca. 50%, når cellelevedygtighed bestemmes med trypanblå farvning. Udfør et pilotforsøg for empirisk at bestemme forholdet mellem TIPS-celler og naive Sf9-celler før storskala rAAV-produktion.
- Kultur og vokse naive Sf9 celler på 1 x 106 celler / mL ved 28 °C i flere 2 L kolber indeholdende 400 mL insekt celle kultur medium i en shaker inkubator, der er nødvendig for AAV produktion. Efter 3-4 dage øges celletætheden op til 5 x 106-6 x 106 celler/mL.
- Dag 2: Kulturovervågning
- Høst 1 mL af Sf9 kultur aseptisk. Plet med Trypan blå farvestof til at analysere celletal, levedygtighed, og morfologi.
- Dag 3: Kulturovervågning og fodring
- Høst 1 mL sf9 kultur og analysere celletal, levedygtighed, og morfologi. Kontroller status for baculovirusinfektion efter farvning af Sf9-cellerne som nævnt i trin 1.3.
BEMÆRK: Stigning i cellediameter og cytopatisk effekt er tegn på baculovirusinfektion. Stigningen i diameteren går forud for et fald i celle levedygtighed, og disse parametre bruges til at bestemme celle høst tid under AAV produktion. Bestem det optimale tidspunkt empirisk. - Foder Sf9-kulturen med frisk insektkultur medium i et forhold på 1:5 aseptisk.
- Høst 1 mL sf9 kultur og analysere celletal, levedygtighed, og morfologi. Kontroller status for baculovirusinfektion efter farvning af Sf9-cellerne som nævnt i trin 1.3.
- Dag 4: Kulturovervågning
- Høst 1 mL sf9 kultur og analysere celletal, levedygtighed, og morfologi. Afbryd ilttilførslen fra bioreaktorposen.
- Dag 5: Kulturovervågning og høst
- Høst 1 mL sf9 kultur og analysere celletal, levedygtighed, og morfologi. Høst kulturmediet og cellerne, når Sf9-celle levedygtigheden er faldet til omkring 50 % (Figur 4).
- Drej celleaffjedringen ved 2100 x g i 15 min ved 4 °C. Saml supernatanten og cellepillen, og opbevar dem ved -80 °C.
3. Lysis af celler og frigivelse af AAV
- Optø AAV producent celle pellet. Der tilsættes 100 mL celle lysisbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM natriumchlorid, 0,5 % Triton-X-100) til cellepillen, blandes kraftigt og inkuberes i 30 min ved omgivelsestemperatur for at frigive AAV-partiklerne.
- Centrifuge ved 2100 × g i 30 min ved 4 °C og overføre cellelyset til en ny beholder. Bland cellelysatet og cellekulturens supernatant efter optøning.
- Tilsæt 20 U/mL nuklease og 10 mM MgCl2 til cellelyset for at fordøje DNA og RNA. Inkuberes i 2-4 timer ved 37 °C.
- Lysatet filtreres gennem et dobbelt filtreringssystem på 0,8 μm og 0,2 μmpolyethersulfone ved hjælp af en pumpe.
- Opbevar det afklarede cellelys ved 4 °C natten over, eller rengør straks AAV'en.
4. Rensning af AAV vektor ved hjælp af affinitet kolonne kromatografi system
- Kromatografiinstrumentet forberedes ved sekventielt at vaske prøve- og bufferlinjerne med sterilt vand, 1 N natriumhydroxid, vand og fosfatbuffered saltvand (PBS, pH 7.4) med en strømningshastighed på 50 ml/min.
- Monter AVB Sepharose kolonnen (10,0 mL) i kromatografisystemet, og kør 100 gtL PBS med en strømningshastighed på 5 mL/min.
BEMÆRK: Brug en lavere eller større mængde AVB Sepharose-kolonne afhængigt af omfanget af AAV-produktionen, og konfigurer strømningshastigheden som foreslået af kolonne- eller harpiksproducenten (se Materialetabel). - For at opsamle fraktioner af kolonne pass-through opløsning, vask buffer, og elution buffer, der indeholder AAV partikler, indsætte rør i fraktionen samler slots af kromatografi instrument.
- Ekvilibrere kolonnen med PBS med en strømningshastighed på 5,0 mL/min.
- Læg det filtrerede cellelyat, der indeholder AAV-partikler, på kolonnen ved hjælp af kromatografimaskinen, der er udstyret med en prøvepumpe. Prøven køres med en strømningshastighed på 3,0 mL pr. minut.
- Kør PBS gennem AVB Sepharose kolonnen med en strømningshastighed på 3,0 mL/min, indtil ultraviolet (UV) absorbanskurven (280 nm) vender tilbage til baseline og bliver stabil.
- Eluter AAV-partiklerne fra kolonnen med 50 mM natriumcitrat (pH 3.0) buffer med en strømningshastighed på 3,0 mL/min (Figur 5).
BEMÆRK: Mens AAV-partiklerne tager afstand fra harpiksen og passerer gennem UV-detektoren, kan der ses en elutionstop af protein på kromatogrammet. - Fortynd straks AAV-supernatanten med et femtedels volumen på 500 mM Tris-HCl (pH 8.0) for at øge pH-PH'en for AAV'en, der indeholder supernatant, til ca. pH 5,5 for at forhindre pH-medieret nedbrydning med sur elutionsbuffer. Desuden fortyndes AAV supernatant 10-fold med PBS for fuldt ud at neutralisere pH.'en.
BEMÆRK: pH-værdien er ca. 5,5 efter neutralisering af rAAV-opløsningen. Efter neutraliserelse af AAV fortyndes rAAV-opløsningen 10 gange med PBS (pH 7.4), så AAV er i en fysiologisk buffer. - Gem 1 mL af hver kolonne gennemløbsprøver, vaskebuffer og 100 μL af den eluted AAV supernatant for at evaluere tilstedeværelsen af AAV ved infektion af målcellerne.
- AVB Sepharose kolonnen rengøres med 100 mL 100 mM citronsyre (pH 2,1) og 100 mL PBS (pH7.4) med en strømningshastighed på 5,0 mL/min. Kolonnen skylles med 20 % ethanol med en strømningshastighed på 5,0 mL/min, og opbevares ved 4 °C.
- Kromatografiinstrumentets rørledninger rengøres med kolonnens offlineposition som beskrevet i punkt 4.1. Endelig skylles kromatografisystemet med 200 mL 20% ethanol med en strømningshastighed på 50,0 mL/min og opbevares i 20% ethanol.
5. Koncentration og diafiltration af AAV vektor ved hjælp af tangentiel flow filtrering (TFF)
- Konfigurer TFF-systemet udstyret med en polysulfonmembranpatron (100 kDa Molekylvægt cut off) for at koncentrere AAV' en.
- Equilibrate TFF modul med 200 mL PBS i 10 min.
- Læg AAV-prøven ved at styre pumpens flow, indtil prøven reduceres til det ønskede volumen, samtidig med at der opretholdes et transmembrantryk ved 2-3 psi.
- Diafiltrere retentate med 100 mL PBS, som anvendes i denne undersøgelse, eller empirisk definere alternativ buffer, der understøtter langsigtet stabilitet af AAV.
- Når AAV-prøven er koncentreret om det ønskede volumen, opsamles AAV-prøven, filtreres den gennem et 0,2 μm polyethersulfonefilter, aliquot, og opbevares derefter ved -80 °C.
6. Infektion af AAV-prøver i målcellerne for at evaluere tilstedeværelsen af AAV i rensningstrinene
- Pod 7 x 104 HT1080 celler/brønd i en 24-brønds plade i 500 μL af Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) suppleret med 1% L-glutamin, 1% natrium pyruvat og 10% fosterkvæg serum (FBS) dagen før infektion. Kuld cellerne i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Tæl cellerne før infektion. Tilsæt den fortyndede ikke-færdige AAV-masseprøve, før søjlekørslen, kolonnegennemløbsprøverne, vaskebufferen og den rensede AAV-prøve.
BEMÆRK: Tæl Trypan blåfarvede celler med et hæmocytometer. Bestem fortyndingsfaktoren og volumen (μL) af AAV-prøverne empirisk. Jo højere AAV titers er, jo mere fortynding er nødvendig. Sørg for, at baculoviruspartiklerne i den ikke-aktiverede bulkprøve, før søjlen løber, kolonnegennemløbsprøver, vaskebufferen opvarmes ved 50 °C i 50 minutter, før målcellerne inficeres for at bestemme infektiøse titere af AAV. - To dage efter infektion analyseres proteinekspressionen (f.eks. GFP eller terapeutisk gen) i cellerne ved hjælp af et flowcytometer.
- Beregn infektiøse titere af AAV ved hjælp af antallet af celler på tidspunktet for infektion, fortyndingsfaktor og procentdel af GFP + celler med formlen: (Samlet antal celler x Procenter GFP + celler x Fortynding Factor) / Volumen af AAV i milliliter.
BEMÆRK: For eksempel er antallet af celler 1 x 105, procentdelen af GFP + celler er 3,4%, fortyndingsfaktoren er 100, og mængden af AAV tilsat er 2 μL. Titeren af AAV er 1,7 x 108 infektiøs enhed (IU)/mL. Den samlede mængde rensede AAV-partikler i 25 gtL af den eluterede fraktion er 4,3 x 109 infektiøse enheder (IU)/mL (Figur 6). Det samlede antal oprindelige upurificerede AAV-partikler er 1,09 x10 10 IE/mL, og rensede AAV-partikler er 4,3 x 109 IE/mL. Derfor er procentdelen af inddrivelsen 39,4%. Procentdelen af GFP+-celler skal være mellem 1%-30%, hvilket svarer til et lineært interval, når det bruges til at beregne den smitsomme titer af AAV. Hvis mere koncentrerede AAV vektor partikler er inficeret i målcellerne; der er en mulighed for, at flere kopier af AAV partikler kan inficere en enkelt celle, der vil vise som en enkelt kopi af vektoren. Fortynd derfor AAV vektor supernatant for at opnå 1%-30% vektorinfektion i målcellerne. Hvis AAV vektor ikke har en reporter gen, plette transgene eller terapeutiske gen udtrykt af AAV vektor med et antistof, der indeholder et fluorescerende farvestof, der kan detekteres og kvantificeres ved hjælp af en strømning cytometer. Ikke alle AAV-serotyper kan effektivt inficere HT1080-celler. Derfor, for at udføre infektionsevne assay for andre AAV serotyper, bruge forskellige cellelinjer. Titer AAV2-GFP partiklerne før rensning og efter rensning på HT1080 celler og måle GFP udtryk ved flow cytometri. Genfind restitutionen (%) med forholdet mellem antallet af rensede AAV-partikler og antallet af AAV-partikler før rensning ganget med 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her vises de repræsentative resultater af procesudvikling til produktion og rensning af AAV-vektorer ved hjælp af Sf9-insektcellesystemet. Metoden omfatter samkultur af Sf9-celler med baculovirusinficerede TIPS-celler, fodring af cellerne med vækstmedium, høst og lysis af producentcellerne for at frigive AAV-partiklerne, afklaring af cellelyset med nukleasebehandling, centrifugering og filtrering, rensning af AAV ved hjælp af AVB Sepharose affinitetskromatografi og koncentration med TFF (figur 1).
TIPS celler genereres ved infektion af BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen og BV-AAV2-rep-cap i Sf9 celler separat. De fleste af Sf9-cellerne bliver inficeret med baculovirus i 3-4 dage på grund af de mange runder af infektion, hvilket fremgår af baculovirus glycoprotein gp64 udtryk i (Figur 2) og cellerne viser en stigning i diameter (Figur 3). TIPS celler høstes 3-4 dage efter infektion og cryopreserved. Sf9-celler er co-dyrkes med TIPS celler, der udskiller baculovirus partikler i kulturmediet, der inficerer naive Sf9 celler. Baculovirus er replikationskompektionskompektion; derfor stiger antallet af inficerede celler hurtigt med flere runde infektioner med nyproducerede baculoviruspartikler, der udskilles i kulturmediet8,9. Cellerne viser en stigning i diameter, cytoppatisk effekt, og omkring halvdelen af cellerne dør i 5 dage efter infektion, som er tegn på færdiggørelse af AAV produktion (Figur 4).
AAV-producentcellerne høstes ved centrifugering ved lav hastighed, lysed med buffer indeholdende vaskemiddel for at frigive AAV i cellelyset. Dette behandles derefter med nuklease for fordøjelse af DNA og RNA for at reducere viskositeten, filtreres gennem en 0,8 μm og 0,2 μm membran og efterfølgende renset og koncentreret. Cellelyset indlæses på en AVB Sepharose kolonne ved hjælp af et kromatografisystem. AVB Sepharose harpiks binder AAV2 partikler på grund af sin affinitet til capsid proteiner. Vaskebuffer køres gennem AVB Sepharose kolonnen for at fjerne ubundne og løst bundne materialer, indtil ultraviolet (UV) absorbanskurven (280 nm) bliver stabil ved baseline. Da AAV-partikler binder AVB Sepharose kraftigt, opdages der ikke et betydeligt antal AAV2-partikler under vask. AAV-partiklerne er eluted med sure buffer (pH 3.0), som tager afstand fra samspillet mellem AAV partikler og AVB Sepharose harpiks. For at forhindre pH-medieret nedbrydning af AAV ved den sure opløsning neutraliseres eluanten med en alkalisk buffer (pH 8.0). Der ses et højdepunkt af protein under fortynding med sur buffer svarende til AAV-fraktionen (figur 5 og figur 6). Renset AAV fortyndes 10 gange med PBS, koncentreret og buffer udveksles med et TFF-system. I dette eksempel er de samlede AAV-partikler i cellelyt (560 mL) 1,1 x 1014 vektorgenom (vg), efter ATB Sepharose kromatografirensning (25 mL) er 4,1 x 1013 vg, og efter koncentration med TFF (25 mL) er 2,4 x 1013 vg. De rensede AAV-prøver viser tre forskellige capsidproteiner, VP1, VP2 og VP3, efter SDS-PAGE og sølvfarvning (Figur 7)
Figur 1: Et skemadiagram til produktion og rensning af AAV Vector. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Flowcytometrianalyse af baculovirus gp64 udtryk i Sf9-celler. Baculovirus inficerede Sf9 celler er plettet med en mus anti-baculovirus gp64 antistof, der indeholder en fluorescerende farvestof, som påvises ved flow cytometri. (A) Ikke -inficerede Sf9 - celler. (B) Baculovirus inficerede Sf9-celler viser gp64 udtryk i de fleste af cellerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Morfologi af de baculovirusinficerede Sf9-celler (TIPS). Baculovirus er inficeret i Sf9-cellerne for at producere TIPS-cellerne. (A) Ikke -inficerede Sf9 - celler. (B) Baculovirus inficerede Sf9 (TIPS) celler. Celler vises ved 200x forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Morfologi af de baculovirusinficerede Sf9-celler under AAV-produktionen. TIPS celler udskille baculovirus, der inficerer co-dyrkede naive Sf9 celler under AAV produktion. (A) Ikke -inficerede Sf9 - celler. (B) Baculovirus inficerede Sf9 - celler viser en stigning i diameteren. Fem dage efter infektionen dør næsten halvdelen af cellerne (visualiseret under et omvendt fasemikroskop efter trypan blå farvning). Røde pile angiver dynamiske celler, og blå pile angiver døde celler. Celler vises ved 200x forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: AAV rensning ved hjælp af AVB Sepharose kolonnekromatografi. Et kromamatogram viser absorbansen af proteinprøver ved 280 nm under prøvebelastning på søjle, vask og fortynding. Kromatogrammet er blevet ændret, så det passer ind i figuren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Antallet af infektiøse AAV-partikler i gennemstrømningen under belastning på søjlen, vask og fortynding. I alt 560 mL AAV prøver er indlæst på en 10 mL AVB Sepharose kolonne. Brøkvolumen for kolonnebelastningen er 50 mL, kolonnevask er 50 mL, og elution er 25 mL. AAV-titere måles efter infektion af HT1080-celler med kolonnegennemgangsprøverne under indlæsning på søjle, vask og elution for at undersøge tilstedeværelsen af AAV ved hvert trin i rensningen. Det samlede rensede AAV-udbytte er 4,3 x 109 infektiøse enheder. Hvert diamantformet symbol repræsenterer AAV's sfektiøse enheder (IU) i hver brøk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. SDS-PAGE og sølv farvning af ren AAV vektor viser capsid proteiner. De reducerede AAV-prøver køres på SDS-PAGE, og der udføres sølvfarvning. Tre forskellige bånd af AAV capsid proteiner, VP1, VP2 og VP3, er synlige. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De parametre, der anvendes i denne protokol til procesudvikling af produktion, rensning og koncentration af AAV-vektorer, kan anvendes til både små og store fremstilling af AAV-vektorer til genterapiapplikationer. Hele opstrøms- og nedstrømsprocessen kan udføres i et lukket system, der er kompatibelt med den aktuelle god fremstillingspraksis (cGMP). De største fordele ved Sf9-baculovirus-systemet er skalerbarhed til storskala AAV-produktion af GMP-kvalitet til en overkommelig pris. Systemet behøver ikke dyre plasmider og transfection reagenser, som er nødvendige for produktionen af AAV ved hjælp af HEK293 celler. Det er blevet rapporteret, at både HEK293 celler og Sf9 celler giver lignende kvalitet AAV vektorer (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Abstract # 100). Den største udfordring er, at dette system kræver generering af baculovirus og TIPS-celler, der har brug for en betydelig tid og kræfter.
I denne protokol blev der anvendt to typer TIPS-celler (TwoBac-system): en TIPS-celle, der indeholder baculovirus med AAV-genoverførselskassette og en anden TIPS-celle, der indeholder AAV-rep-cap. OneBac-systemet2,16,17 kan generere TIPS-celler, der indeholder både AAV-genoverførselskassette og rep-cap gener i en enkelt baculovirus. OneBac-systemet giver en alternativ tilgang til at producere rAAV ved hjælp af kun ét sæt TIPS-celler i stedet for to som beskrevet i TwoBac-systemet, hvilket yderligere ville forenkle protokollen.
I denne protokol beskrives AAV-produktion i Sf9-celler. Det er vigtigt at optimere forholdet mellem de baculovirus-inficerede TIPS-celler til at producere naive Sf9-celler for at opnå et godt AAV-udbytte. Hvis dette forhold er suboptimalt, reduceres udbyttet af AAV11. For eksempel, hvis der genereres flere AAV ITR- indeholdende genoverførselsvektorer end capsiderne i producentcellerne på grund af det suboptimale forhold mellem TIPS og producentceller, vil alle tilgængelige genoverførselsvektorer ikke få nok capsider til at producere fulde AAV-partikler. På den anden side, hvis der genereres flere capsider end AAV-genoverførselsvektorerne i producentcellerne, får alle capsider ikke AAV ITR, der indeholder genoverførselsvektorer, der resulterer i tomme AAV-partikler.
Efterhånden som cellerne formerer sig, bliver næringsstofferne i kulturmediet opbrugt, og metaboliske affaldsprodukter akkumuleres. Derfor kan tilskud af 20% frisk vækstmedium i cellekulturen 2 dage efter co-kultur af TIPS-celler og Sf9-celler øge AAV-titere betydeligt (Amine A. Kamen, National Research Council Canada, personlig kommunikation).
Renheden af AAV-partikler er en afgørende faktor for at opnå effektiv transduktion af målceller uden cytotoksicitet for både in vitro- og in vivo-studier 3,5. Derfor er det vigtigt at inkludere et kromatografitrin, der selektivt kan rense AAV-partikler og eliminere urenheder som værtscelleproteiner og snavs, genomisk og baculoviralt DNA og aggregerede og fragmenterede vektorer. Under indlæsning af AAV-supernatant på en AVB Sepharose-kolonne er det vigtigt at kontrollere gennemstrømningsprøverne for tilstedeværelsen af AAV-partikler, der kan passere gennem kolonnen uden binding til harpiksen. Hvis dette er tilfældet, (1) en lavere kørehastighed, der resulterer i en længere opholdstid vil være nødvendig for at binde AAV partikler, (2) mængden af lastet prøve på kolonnen skal reduceres, og / eller (3) volumenet af AVB Sepharose bør øges, således at bindingskapaciteten af kolonnen aldrig overstiger antallet af AAV partikler. AVB Sepharose harpiks evne til at binde AAV partikler ved en høj strømningshastighed og med høj affinitet og kapacitet er vigtigt at reducere rensningstiden. Den største begrænsning af AVB Sepharose er, at det binder capsid af AAV serotyper 1, 2 og 5. Derfor bør forskellige kromatografiharpikser testes og anvendes til rensning af andre AAV-serotyper18. Downstream-rensningsprotokollen, der er beskrevet heri, kan også bruges til at rense AAV produceret i HEK 293-celler.
Denne protokol kan rense AAV fra cellelysatet, men kan ikke fjerne tomme partikler. Et par artikler har beskrevet metoder, der kan skelne tomme vs. fulde AAV-partikler i rensede AAV-lagre19,20. Vi mener dog, at AAV-produktionen bør optimeres på upstream procesniveau for at minimere generering af tomme partikler. Hvis forholdet mellem AAV-genoverførselsvektor og capsidproduktion i producentceller ikke er optimalt, kan der genereres flere tomme partikler.
Ud over at binde fulde AAV-partikler binder AVB Sepharose medium fragmenterede AAV-partikler eller capsidproteiner, som kan fjernes ved hjælp af TFF. De fleste af de lav molekylvægt partikler elimineres fra AAV prøver ved at inkludere TFF skridt nedstrøms kolonnen kromatografi. Derudover bruges TFF til at udføre en bufferudveksling/-diafiltration og til at koncentrere AAV10,21.
Selvom ultracentrifugering af AAV-lysatet med cæsiumchlorid eller joxanolgradient er den foretrukne metode til mindre og præklinisk AAV-rensning, er denne metode ikke skalerbar og mindre egnet til storskala rensning af AAV21,22.
Afslutningsvis vil denne protokol til procesudvikling af produktion og rensning af AAV være nyttig til mindre præklinisk og storskala fremstilling af rekombinant AAV til genterapi af arvelige genetiske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) for generøst at give os AAV plasmider og Danielle Steele og Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) for deres tekniske bistand. Dette arbejde er støttet af Start-Up fonden fra Cincinnati Children's Research Foundation til M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
References
- Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
- Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
- Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
- Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
- Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
- Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
- Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
- Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M.
- Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
- Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
- Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
- Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
- Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).
