Summary
In questo protocollo, il vettore AAV2 è prodotto co-coltivando cellule di insetti Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) o gene terapeutico e cellule Sf9 infette da BV-AAV2-rep-cap in coltura in sospensione. Le particelle AAV vengono rilasciate dalle cellule utilizzando detergente, chiarificate, purificate mediante cromatografia a colonna di affinità e concentrate mediante filtrazione a flusso tangenziale.
Abstract
I virus adeno-associati (AAV) sono vettori promettenti per le applicazioni di terapia genica. Qui, il vettore AAV2 è prodotto dalla co-coltura di cellule di Spodoptera frugiperda (Sf9) con cellule Sf9 infettate da baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gene terapeutico) e BV-AAV2-rep-cap in coltura in sospensione senza siero. Le cellule vengono coltivate in un pallone in uno shaker orbitale o in un bioreattore Wave. Per rilasciare le particelle AAV, le cellule produttrici vengono lisate in un tampone contenente detergente, che viene successivamente chiarito mediante centrifugazione e filtrazione a bassa velocità. Le particelle AAV vengono purificate dal lisato cellulare utilizzando la cromatografia a colonna AVB Sepharose, che lega le particelle AAV. Le particelle legate vengono lavate con PBS per rimuovere i contaminanti ed eluite dalla resina utilizzando un tampone di citrato di sodio a pH 3,0. L'eluato acido viene neutralizzato con tampone alcalino Tris-HCl (pH 8,0), diluito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e ulteriormente concentrato con filtrazione a flusso tangenziale (TFF). Il protocollo descrive la produzione di vettori pre-clinici su piccola scala compatibile con la produzione AAV di grado clinico su larga scala per applicazioni di terapia genica umana.
Introduction
I virus adeno-associati (AAV) sono parvovirus umani non avvolti contenenti un DNA a singolo filamento di 4,6 kb. I vettori AAV hanno diversi vantaggi rispetto ad altri vettori virali per applicazioni di terapiagenica 1,2,3,4. Gli AAV sono naturalmente incompetenti per la replicazione, quindi richiedono un virus helper e un meccanismo ospite per la replicazione. Gli AAV non causano alcuna malattia e hanno una bassa immunogenicità nell'ospite infetto3,5. L'AAV può infettare sia le cellule quiescenti che quelle che si dividono attivamente e può persistere come episoma senza integrarsi nel genoma delle cellule ospiti (AAV raramente si integra nel genoma dell'ospite)1,3. Queste caratteristiche hanno reso AAV uno strumento desiderabile per le applicazioni di terapia genica.
Per generare un vettore di trasferimento genico AAV, la cassetta transgenica, incluso il gene terapeutico, viene clonata tra due ripetizioni terminali interne (ITR), che sono tipicamente derivate dal sierotipo AAV 2. La dimensione massima da 5' ITR a 3' ITR, compresa la sequenza transgenica, è 4,6 kb6. Capsidi diversi possono avere un diverso tropismo cellulare o tissutale. Pertanto, i capsidi dovrebbero essere scelti in base al tessuto o al tipo di cellula destinati ad essere presi di mira con il vettore AAV7.
I vettori AAV ricombinanti sono comunemente prodotti in linee cellulari di mammiferi come le cellule renali embrionali umane, HEK293 per trasfezione transitoria del vettore di trasferimento genico AAV, AAV rep-cap e plasmidi del virus helper2,3. Tuttavia, ci sono diverse limitazioni per la produzione di AAV su larga scala mediante trasfezione transitoria di cellule HEK293 aderenti. In primo luogo, è necessario un gran numero di pile di celle o bottiglie a rulli. In secondo luogo, sono necessari DNA plasmidico di alta qualità e reagenti di trasfezione, il che aumenta il costo di produzione. Infine, quando si utilizzano cellule HEK293 aderenti, il siero è spesso necessario per una produzione ottimale, complicando la lavorazione a valle1,2,3. Un metodo alternativo di produzione AAV prevede l'utilizzo della linea cellulare di insetti, cellule Spodoptera frugiperda (Sf9) e un virus di insetti chiamato virus ricombinante Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV o baculovirus)8,9,10. Le cellule Sf9 sono coltivate in colture in sospensione senza siero che è facile da scalare ed è compatibile con l'attuale produzione di buone pratiche di fabbricazione (cGMP) su larga scala, che non richiede plasmidi o reagenti di trasfezione. Inoltre, il costo della produzione di AAV utilizzando il sistema Sf9-baculovirus è inferiore al costo dell'utilizzo della trasfezione transitoria di plasmidi in cellule HEK29311.
Il sistema di produzione rAAV originale che utilizzava cellule baculovirus-Sf9 utilizzava tre baculovirus: un baculovirus contenente cassetta di trasferimento genico, il secondo baculovirus contenente gene rep e il terzo baculovirus contenente il gene del capside sierotipo specifico12,13. Tuttavia, il costrutto di rep contenente baculovirus era geneticamente instabile su più cicli di passaggi, il che impediva l'amplificazione del baculovirus per la produzione di AAV su larga scala. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un nuovo sistema vettoriale rAAV, che conteneva due baculovirus (TwoBac): un baculovirus contenente la cassetta di trasferimento genico AAV e un altro baculovirus contenente i geni AAV rep-cap insieme che sono geneticamente più stabili del sistema originale e più convenienti per produrre rAAV a causa dell'utilizzo di TwoBac invece di tre14, 15. Il sistema OneBac utilizza la cassetta di trasferimento genico AAV e i geni rep-cap in un singolo baculovirus che è più conveniente per produrre il rAAV a causa dell'utilizzo di un baculovirus invece di utilizzare TwoBac o ThreeBac2,16,17. Nel nostro studio, il sistema TwoBac è stato utilizzato per l'ottimizzazione.
Il sistema di baculovirus per la produzione di AAV ha anche dei limiti: le particelle di baculovirus sono instabili per la conservazione a lungo termine nel mezzo privo di siero11e se il titolo del baculovirus è basso, è necessario un grande volume di surnatante di baculovirus, che può diventare tossico per la crescita delle cellule Sf9 durante la produzione di AAV (osservazione personale). L'uso di cellule TIPS (Tip) senza titolo di conservazione e scale-up delle cellule infette da titolo, o cellule di insetti infette da baculovirus (BIIC), fornisce una buona opzione per la produzione di AAV in cui le cellule Sf9 infette da baculovirus vengono preparate, crioconservate e successivamente utilizzate per l'infezione di cellule Sf9 fresche. Un altro vantaggio è la maggiore stabilità del baculovirus (BV) nelle cellule Sf9 dopo crioconservazione10,11.
Vengono generati due tipi di cellule TIPS per consentire la produzione di AAV: la prima per infezione di cellule Sf9 con il BV-AAV2-GFP o gene terapeutico, e la seconda per infezione della cellula Sf9 con BV-AAV2-rep-cap. Le cellule TIPS sono crioconservate in aliquote piccole e pronte all'uso. I vettori AAV sono prodotti in coltura di sospensione priva di siero in un pallone posto in uno shaker orbitale o bioreattore Wave co-coltivando cellule TIPS che producono baculovirus e cellule Sf9 fresche. Le cellule Sf9 sono infettate da baculovirus che trasportano il vettore AAV2-GFP e le sequenze rep-cap per generare AAV. Quattro o cinque giorni dopo, quando le rese AAV sono le più alte, le cellule produttrici vengono lisate con detergente per rilasciare le particelle AAV. Il lisato cellulare viene successivamente chiarito mediante centrifugazione e filtrazione a bassa velocità. Le particelle AAV vengono purificate dal lisato mediante cromatografia a colonna di sefarosio AVB. Infine, i vettori AAV sono concentrati utilizzando TFF. Il protocollo descrive la produzione di AAV su piccola scala, utile per la ricerca e gli studi pre-clinici. Tuttavia, i metodi sono scalabili e compatibili con la produzione di vettori AAV di grado clinico per applicazioni di terapia genica.
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Protocol
Vedere la Figura 1 per un'illustrazione che riepiloga il protocollo.
1. Generazione di cellule TIPS infette da baculovirus
- Scongelare una fiala di cellule Sf9 e seminarle immediatamente in 50 ml di terreno di coltura cellulare di insetti. Coltiva celle Sf9 in un incubatore shaker orbitale a 125 giri/min e 28 °C in palloni a fondo tondo con un tappo liberamente fissato per lo scambio d'aria8,9. Propagare le cellule in un pallone da 1 L contenente 200 mL di terreno per ottenere un numero sufficiente di cellule PER LA PRODUZIONE DI CELLULE TIPS.
- Aggiungere 50 mL di cellule Sf9 a 2 x 106 cellule/mL in due palloni: infettare un pallone di cellule Sf9 con 0,5 mL di baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gene terapeutico) e l'altro pallone di cellule con 0,5 mL di BV-AAV2-rep-cap.
NOTA: I plasmidi vettoriali AAV sono stati generosamente forniti dal Dr. Robert M. Kotin (NIH). La produzione di baculovirus dal DNA bacmid (Bac-to-Bac System) è stata descritta in precedenza8,9. La stabilità del baculovirus durante il passaggio è un problema critico per la produzione scale-up di rAAV. È meglio usare un numero di passaggio inferiore di baculovirus (fino al passaggio numero 4). Determinare empiricamente il volume ottimale del surnatante baculovirus controllando l'efficienza dell'infezione da baculovirus utilizzando la citometria a flusso (Figura 2) durante la produzione di cellule TIPS. - Monitorare l'infezione da baculovirus 3-4 giorni dopo l'infezione colorando baculovirus gp64 in cellule Sf9 infette come segue.
- Macchiare 2 x 105 cellule Sf9 (sia cellule non infette che infette da baculovirus) con 0,5 μg di anticorpo anti-baculovirus gp64 di topo (1:200) contenente un colorante fluorescente in 100 μL di tampone bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con 1 mL di PBS per rimuovere l'anticorpo e risospesciare le cellule colorate in 300 μL di PBS contenente lo 0,5% di albumina sierica bovina.
- Analizzare l'espressione del baculovirus gp64 sulle cellule utilizzando la citometria a flusso (Figura 2).
NOTA: Determinare empiricamente la strategia di gating per l'acquisizione e l'analisi della citometria a flusso. Viene acquisito un totale di 10.000 singole cellule vive. L'espressione di Baculovirus gp64 sulle superfici cellulari Sf9 indica l'infezione da baculovirus. Dopo 3-4 giorni, la maggior parte delle cellule Sf9 viene infettata dal baculovirus, come evidenziato dall'espressione di baculovirus gp64 (Figura 2).
- Quando le cellule sono vitali all'80%-90% con un aumento del diametro (Figura 3), raccogliere le cellule e crioconservare 1 x 107 cellule in 1 mL di terreno di coltura di insetti integrato con il 10% di siero bovino fetale e il 10% di dimetilsolfossido in un contenitore a congelamento lento a -80 °C. Il giorno successivo, trasferire il tubo contenente le celle TIPS in un congelatore ad azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
NOTA: Eseguire la coltura cellulare in un armadio di biosicurezza seguendo la tecnica di laboratorio asettica standard al livello di biosicurezza 2 (BSL-2).
2. Produzione del vettore AAV
- Giorno 1: Co-coltura di cellule Sf9 con le cellule TIPS infette da baculovirus
- Coltivare e coltivare cellule Sf9 naïve a 1 x 106 cellule/mL a 28 °C in diversi palloni da 2 L contenenti 400 mL di terreno di coltura cellulare di insetti in un incubatore shaker necessario per la produzione di AAV. Dopo 3-4 giorni, la densità cellulare viene aumentata fino a 5 x 106-6 x 106 cellule / ml.
NOTA: CO2 e umidità non sono fattori importanti per la crescita delle cellule Sf9. - Seminare le cellule Sf9 in palloni shake o in un bioreattore come segue.
- Produzione di AAV in palloni in un incubatore shaker orbitale: utilizzare una pipetta o una pompa peristaltica per seminare 400 mL di coltura Sf9 a 2 x10 6 celle/mL in un pallone da 2 L in modo asettico. Impostare lo shaker orbitale a 125 giri/min e 28 °C.
NOTA Utilizzare una pompa peristaltica o una pipetta standard a seconda della scala della produzione AAV. - Produzione di AAV in un bioreattore: utilizzare una pompa peristaltica per seminare asetticamente 1 L di coltura sf9 a 2 x10 6 cellule/ mL in una sacca per bioreattore da 10 L. Caricare il sacchetto sull'unità bioreattore per la coltivazione a 28 °C. Aggiungere il 40% di ossigeno alla sacca del bioreattore a 0,1 psi. Impostare l'unità del bioreattore con un angolo di 20° e scuotere il sacchetto a 25 giri/min.
- Produzione di AAV in palloni in un incubatore shaker orbitale: utilizzare una pipetta o una pompa peristaltica per seminare 400 mL di coltura Sf9 a 2 x10 6 celle/mL in un pallone da 2 L in modo asettico. Impostare lo shaker orbitale a 125 giri/min e 28 °C.
- Scongelare una fiala di ogni BV-AAV2-GFP (o gene terapeutico) e BV-AAV2-rep-cap TIPS cellule. Diluire le cellule con 20 ml di terreno di coltura di insetti ed eseguire un conteggio di vitalità delle cellule utilizzando il tripano blu. Inoculare entrambe le cellule TIPS con un rapporto di 1:10.000 rispetto alle cellule Naïve Sf9 coltivate in un pallone shaker o bioreattore.
NOTA: La sopravvivenza delle cellule TIPS è ridotta a causa della crioconservazione e il tasso di recupero è di circa il 50% quando la vitalità cellulare è determinata con la colorazione blu tripano. Eseguire un esperimento pilota per determinare empiricamente il rapporto tra cellule TIPS e cellule Sf9 naïve prima della produzione di rAAV su larga scala.
- Coltivare e coltivare cellule Sf9 naïve a 1 x 106 cellule/mL a 28 °C in diversi palloni da 2 L contenenti 400 mL di terreno di coltura cellulare di insetti in un incubatore shaker necessario per la produzione di AAV. Dopo 3-4 giorni, la densità cellulare viene aumentata fino a 5 x 106-6 x 106 cellule / ml.
- Giorno 2: Monitoraggio della cultura
- Raccogli 1 mL di coltura Sf9 in modo asettico. Stain con il colorante blu Trypan per analizzare il numero di cellule, la vitalità e la morfologia.
- Giorno 3: Monitoraggio e alimentazione della coltura
- Raccogli 1 mL di coltura Sf9 e analizza il numero di cellule, la vitalità e la morfologia. Controllare lo stato dell'infezione da baculovirus dopo aver colorato le cellule Sf9 come menzionato nel passaggio 1.3.
NOTA: L'aumento del diametro cellulare e l'effetto citopatico sono indicazioni di infezione da baculovirus. L'aumento del diametro precede una diminuzione della vitalità cellulare e questi parametri vengono utilizzati per determinare il tempo di raccolta delle cellule durante la produzione di AAV. Determinare empiricamente il punto temporale ottimale. - Nutrire la coltura Sf9 con un terreno di coltura di insetti freschi in un rapporto di 1:5 in modo asettico.
- Raccogli 1 mL di coltura Sf9 e analizza il numero di cellule, la vitalità e la morfologia. Controllare lo stato dell'infezione da baculovirus dopo aver colorato le cellule Sf9 come menzionato nel passaggio 1.3.
- Giorno 4: Monitoraggio della cultura
- Raccogli 1 mL di coltura Sf9 e analizza il numero di cellule, la vitalità e la morfologia. Scollegare l'apporto di ossigeno dalla sacca del bioreattore.
- Giorno 5: Monitoraggio della coltura e raccolta
- Raccogli 1 mL di coltura Sf9 e analizza il numero di cellule, la vitalità e la morfologia. Raccogliere il terreno di coltura e le cellule quando la vitalità cellulare Sf9 è diminuita a circa il 50% (Figura 4).
- Ruotare la sospensione cellulare a 2100 x g per 15 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante e il pellet cellulare e conservarli a -80 °C.
3. Lisi delle cellule e rilascio di AAV
- Scongelare il pellet di cella del produttore AAV. Aggiungere 100 mL di tampone di lisi cellulare (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM di cloruro di sodio, 0,5 % Triton-X-100) al pellet cellulare, mescolare vigorosamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per rilasciare le particelle AAV.
- Centrifugare a 2100 × g per 30 minuti a 4 °C e trasferire il lisato cellulare in un nuovo contenitore. Mescolare il lisato cellulare e il surnatante di coltura cellulare dopo lo scongelamento.
- Aggiungere 20 U/mL di nucleasi e 10 mM di MgCl2 al lisato cellulare per digerire il DNA e l'RNA. Incubare per 2-4 ore a 37 °C.
- Filtrare il lisato attraverso un sistema di doppia filtrazione da 0,8 μm e 0,2 μmpolyethersulfone utilizzando una pompa.
- Conservare il lisato cellulare chiarificato a 4 °C durante la notte o purificare immediatamente l'AAV.
4. Purificazione del vettore AAV utilizzando il sistema di cromatografia a colonna di affinità
- Preparare lo strumento cromatografico lavando sequenzialmente il campione e le linee tampone con acqua sterile, idrossido di sodio 1 N, acqua e soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) ad una portata di 50 ml / min.
- Montare la colonna AVB Sepharose (10,0 mL) nel sistema di cromatografia ed eseguire 100 mL di PBS ad una portata di 5 mL/min.
NOTA: utilizzare un volume inferiore o superiore di colonna di sefarosio AVB a seconda della scala di produzione AAV e impostare la portata come suggerito dal produttore della colonna o della resina (vedere Tabella dei materiali). - Per raccogliere le frazioni di soluzione pass-through della colonna, tampone di lavaggio e tampone di eluizione contenente particelle AAV, inserire i tubi negli slot del collettore di frazioni dello strumento cromatografico.
- Equilibrare la colonna con PBS ad una portata di 5,0 ml/min.
- Caricare il lisato cellulare filtrato contenente particelle AAV sulla colonna utilizzando la cromatografica dotata di una pompa campione. Eseguire il campione a una portata di 3,0 ml al minuto.
- Eseguire PBS attraverso la colonna AVB Sepharose a una portata di 3,0 ml / min fino a quando la curva di assorbanza ultravioletta (UV) (280 nm) ritorna alla linea di base e diventa stabile.
- Eluire le particelle AAV dalla colonna con tampone di citrato di sodio (pH 3,0) da 50 mM ad una portata di 3,0 ml/min (Figura 5).
NOTA: Mentre le particelle AAV si dissociano dalla resina e passano attraverso il rilevatore UV, sul cromatogramma si può vedere un picco di eluizione di proteine. - Diluire immediatamente il surnatante AAV con un quinto del volume di 500 mM Tris-HCl (pH 8,0) per aumentare il pH del surnatante contenente AAV a circa pH 5,5 per prevenire la degradazione mediata dal pH con tampone di eluizione acida. Inoltre, diluire il surnatante AAV 10 volte con PBS per neutralizzare completamente il pH.
NOTA: il valore del pH è di circa 5,5 dopo aver neutralizzato la soluzione di rAAV. Dopo aver neutralizzato AAV, diluire la soluzione rAAV 10 volte con PBS (pH 7,4) in modo che AAV sia in un tampone fisiologico. - Conservare 1 mL di ciascun campione run-through della colonna, tampone di lavaggio e 100 μL del surnatante AAV eluito per valutare la presenza di AAV per infezione delle cellule bersaglio.
- Pulire la colonna di sefarosio AVB con 100 mL di acido citrico da 100 mM (pH 2,1) e 100 mL di PBS (pH7,4) ad una portata di 5,0 mL/min. Risciacquare la colonna con etanolo al 20% ad una portata di 5,0 ml/min e conservare a 4 °C.
- Pulire le tubazioni dello strumento per cromatografia con la colonna in posizione offline come descritto al punto 4.1. Infine, risciacquare il sistema di cromatografia con 200 mL di etanolo al 20% ad una portata di 50,0 ml/min e conservare in etanolo al 20%.
5. Concentrazione e diafiltrazione del vettore AAV mediante filtrazione a flusso tangenziale (TFF)
- Installare il sistema TFF dotato di una cartuccia a membrana di polisolfone (100 kDa Molecular Weight Cut Off) per concentrare l'AAV.
- Equilibrare il modulo TFF con 200 mL di PBS per 10 min.
- Caricare il campione AAV controllando il flusso della pompa fino a quando il campione non viene ridotto al volume desiderato mantenendo una pressione trans-membrana a 2-3 psi.
- Diafiltrare il retentato con 100 ml di PBS, come utilizzato in questo studio, o definire empiricamente un tampone alternativo che supporti la stabilità a lungo termine dell'AAV.
- Dopo aver concentrato il campione AAV al volume desiderato, raccogliere il campione AAV, filtrarlo attraverso un polietersolfonetro da 0,2 μm, aliquota, quindi conservarlo a -80 °C.
6. Infezione di campioni AAV nelle cellule bersaglio per valutare la presenza di AAV nelle fasi di purificazione
- Inoculare 7 x 104 cellule HT1080 / pozzetto in una piastra a 24 pozzetti in 500 μL di Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) integrato con 1% L-glutammina, 1% piruvato di sodio e 10% siero bovino fetale (FBS) il giorno prima dell'infezione. Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C e 5% CO2.
- Contare le cellule prima dell'infezione. Aggiungere il campione di massa AAV diluito non purificato prima dell'esecuzione della colonna, i campioni di run-through della colonna, il tampone di lavaggio e il campione AAV purificato diluito.
NOTA: Contare le cellule macchiate di blu di Trypan con un emocitometro. Determinare empiricamente il fattore di diluizione e il volume (μL) dei campioni AAV. Più alti sono i titoli AAV, maggiore è la diluizione necessaria. Assicurarsi che le particelle di baculovirus del campione di massa non purificato prima dell'esecuzione della colonna, i campioni di scorrimento della colonna, il tampone di lavaggio siano inattivati termicamente a 50 ° C per 50 minuti prima di infettare le cellule bersaglio per determinare i titoli infettivi di AAV. - Due giorni dopo l'infezione, analizzare l'espressione proteica (ad esempio, GFP o gene terapeutico) nelle cellule utilizzando un citometro a flusso.
- Calcola i titoli infettivi di AAV usando il numero di cellule al momento dell'infezione, il fattore di diluizione e la percentuale di cellule GFP + con la formula: (Numero totale di cellule x Percentuali di cellule GFP + x Fattore di diluizione) / Volume di AAV in millilitri.
NOTA: ad esempio, il numero di celle è 1 x 105, la percentuale di celle GFP + è 3,4%, il fattore di diluizione è 100 e il volume di AAV aggiunto è 2 μL. Il titolo di AAV è 1,7 x 108 unità infettive (UI) / mL. La quantità totale di particelle AAV purificate in 25 mL della frazione eluita è 4,3 x 109 unità infettive (UI)/mL (Figura 6). Il numero totale di particelle AAV iniziali non purificate è 1,09 x 1010 UI / mL e le particelle AAV purificate sono 4,3 x 109 UI / mL. Pertanto, la percentuale di recupero è del 39,4%. La percentuale di cellule GFP+ dovrebbe essere compresa tra l'1% e il 30%, che corrisponde a un intervallo lineare quando viene utilizzato per calcolare il titolo infettivo di AAV. Se particelle vettoriali AAV più concentrate vengono infettate nelle cellule bersaglio; esiste la possibilità che più copie delle particelle AAV possano infettare una singola cellula che verrà mostrata come una singola copia del vettore. Pertanto, diluire il surnatante vettore AAV per ottenere l'infezione da vettore 1% -30% nelle cellule bersaglio. Se il vettore AAV non ha un gene reporter, colorare il transgene o il gene terapeutico espresso dal vettore AAV con un anticorpo contenente un colorante fluorescente che può essere rilevato e quantificato utilizzando un citometro a flusso. Non tutti i sierotipi AAV possono infettare in modo efficiente le cellule HT1080. Pertanto, per eseguire il test di infettività per altri sierotipi AAV, utilizzare diverse linee cellulari. Legare le particelle AAV2-GFP prima della purificazione e dopo la purificazione su cellule HT1080 e misurare l'espressione GFP mediante citometria a flusso. Calcolare il recupero (%) in base al rapporto tra il numero di particelle AAV purificate e il numero di particelle AAV prima della purificazione moltiplicato per 100.
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Representative Results
Qui vengono mostrati i risultati rappresentativi dello sviluppo del processo per la produzione e la purificazione di vettori AAV utilizzando il sistema cellulare di insetti Sf9. Il metodo include la co-coltura di cellule Sf9 con cellule TIPS infette da baculovirus, l'alimentazione delle cellule con terreno di crescita, la raccolta e la lisi delle cellule produttrici per rilasciare le particelle AAV, la chiarificazione del lisato cellulare con trattamento della nucleasi, la centrifugazione e la filtrazione, la purificazione dell'AAV utilizzando la cromatografia di affinità di sefarosio AVB e la concentrazione con TFF (Figura 1).
Le cellule TIPS sono generate dall'infezione di BV-AAV2-GFP o gene terapeutico e BV-AAV2-rep-cap in cellule Sf9 separatamente. La maggior parte delle cellule Sf9 viene infettata dal baculovirus in 3-4 giorni a causa dei molteplici cicli di infezione, evidenziati dall'espressione della glicoproteina gp64 del baculovirus in (Figura 2) e le cellule mostrano un aumento del diametro (Figura 3). Le cellule TIPS vengono raccolte 3-4 giorni dopo l'infezione e crioconservate. Le cellule Sf9 sono co-coltivate con le cellule TIPS che secernono particelle di baculovirus nel terreno di coltura che infettano le cellule Sf9 naïve. Il baculovirus è competente per la replicazione; pertanto, il numero di cellule infette aumenta rapidamente da più infezioni rotonde con particelle di baculovirus di nuova produzione che vengono secrete nel terreno dicoltura 8,9. Le cellule mostrano un aumento del diametro, effetto citopatico, e circa la metà delle cellule muore in 5 giorni dopo l'infezione, che sono i segni del completamento della produzione di AAV (Figura 4).
Le cellule produttrici di AAV vengono raccolte mediante centrifugazione a bassa velocità, lisate con tampone contenente detergente per rilasciare l'AAV nel lisato cellulare. Questo viene poi trattato con nucleasi per la digestione di DNA e RNA per ridurre la viscosità, filtrato attraverso una membrana di 0,8 μm e 0,2 μm e successivamente purificato e concentrato. Il lisato cellulare viene caricato su una colonna di sefarosio AVB utilizzando un sistema di cromatografia. La resina di sefarosio AVB lega le particelle AAV2 grazie alla sua affinità con le proteine del capside. Il tampone di lavaggio viene fatto scorrere attraverso la colonna AVB Sepharose per rimuovere i materiali non legati e liberamente legati fino a quando la curva di assorbanza ultravioletta (UV) (280 nm) diventa stabile alla linea di base. Poiché le particelle AAV legano fortemente il sefarosio AVB, durante il lavaggio non viene rilevato alcun numero significativo di particelle AAV2. Le particelle AAV sono eluite con tampone acido (pH 3,0), che dissocia l'interazione tra particelle AAV e resina di sefarosio AVB. Per prevenire la degradazione mediata dal pH dell'AAV da parte della soluzione acida, l'eluente viene neutralizzato con un tampone alcalino (pH 8,0). Si osserva un picco di proteine durante l'eluizione con tampone acido corrispondente alla frazione AAV (Figura 5 e Figura 6). L'AAV purificato viene diluito 10 volte con PBS, concentrato e tampone scambiato con un sistema TFF. In questo esempio, le particelle AAV totali nel lisato cellulare (560 mL) sono 1,1 x 1014 genoma vettoriale (vg), dopo la purificazione della cromatografia AVB Sepharose (25 mL) sono 4,1 x 1013 vg e dopo la concentrazione con TFF (25 mL) sono 2,4 x 1013 vg. I campioni AAV purificati mostrano tre distinte proteine del capside, VP1, VP2 e VP3, dopo SDS-PAGE e colorazione dell'argento (Figura 7)
Figura 1: Diagramma schematico per la produzione e la purificazione di AAV Vector. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi citometrica a flusso dell'espressione di baculovirus gp64 in cellule Sf9. Le cellule Sf9 infette da baculovirus sono macchiate con un anticorpo anti-baculovirus gp64 di topo contenente un colorante fluorescente, che viene rilevato dalla citometria a flusso. (A) Cellule Sf9 non infette. (B) Le cellule Sf9 infette da baculovirus mostrano espressione di gp64 nella maggior parte delle cellule. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Morfologia delle cellule Sf9 (TIPS) infette da baculovirus. Il baculovirus viene infettato nelle cellule Sf9 per produrre le cellule TIPS. (A) Cellule Sf9 non infette. (B) Cellule Sf9 (TIPS) infette da baculovirus. Le celle vengono visualizzate con un ingrandimento di 200x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Morfologia delle cellule Sf9 infette da baculovirus durante la produzione di AAV. Le cellule TIPS secernono baculovirus che infettano le cellule Sf9 naïve co-coltivate durante la produzione di AAV. (A) Cellule Sf9 non infette. (B) Le cellule Sf9 infette da baculovirus mostrano un aumento del diametro. Cinque giorni dopo l'infezione, quasi la metà delle cellule muore (visualizzate al microscopio a fase invertita dopo la colorazione blu tripano). Le frecce rosse indicano le cellule vive e le frecce blu indicano le cellule morte. Le celle vengono visualizzate con un ingrandimento di 200x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Purificazione AAV mediante cromatografia a colonna AVB Sepharose. Un cromatogramma mostra l'assorbanza dei campioni proteici a 280 nm durante il caricamento del campione su colonna, il lavaggio e l'eluizione. Il cromatogramma è stato modificato per adattarsi alla figura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Il numero di particelle AAV infettive nel flusso attraverso il carico sulla colonna, il lavaggio e l'eluizione. Un totale di 560 mL di campioni AAV vengono caricati su una colonna di sefarosio AVB da 10 mL. Il volume di frazione per il carico della colonna è di 50 ml, il lavaggio della colonna è di 50 ml e l'eluizione è di 25 ml. I titoli AAV vengono misurati dopo l'infezione delle cellule HT1080 con i campioni run-through della colonna durante il caricamento su colonna, il lavaggio e l'eluizione per indagare sulla presenza di AAV in ogni fase della purificazione. La resa totale di AAV purificato è di 4,3 x 109 unità infettive. Ogni simbolo a forma di diamante rappresenta le unità infettive (UI) di AAV in ogni frazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7. SDS-PAGE e colorazione dell'argento del vettore AAV puro che mostra le proteine del capside. I campioni AAV ridotti vengono eseguiti su SDS-PAGE e viene eseguita la colorazione dell'argento. Sono visibili tre bande distinte di proteine del capside AAV, VP1, VP2 e VP3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I parametri utilizzati in questo protocollo per lo sviluppo del processo di produzione, purificazione e concentrazione di vettori AAV possono essere applicati sia alla produzione su piccola che su larga scala di vettori AAV per applicazioni di terapia genica. L'intero processo a monte e a valle può essere eseguito in un sistema chiuso compatibile con le attuali Good Manufacturing Practices (cGMP). I principali vantaggi del sistema Sf9-baculovirus sono la scalabilità per la produzione di AAV di livello GMP su larga scala a un costo accessibile. Il sistema non ha bisogno di costosi plasmidi e reagenti di trasfezione, che sono necessari per la produzione di AAV utilizzando celle HEK293. È stato riportato che sia le cellule HEK293 che le cellule Sf9 producono vettori AAV di qualità simile (Eric D. Horowitz, ASGCT 2018, Abstract #100). La sfida principale è che questo sistema richiede la generazione di baculovirus e cellule TIPS che richiedono tempo e sforzi significativi.
In questo protocollo sono stati utilizzati due tipi di cellule TIPS (sistema TwoBac): una cellula TIPS contenente baculovirus con cassetta di trasferimento genico AAV e un'altra cellula TIPS contenente AAV-rep-cap. Il sistema OneBac2,16,17 può generare cellule TIPS contenenti sia cassette di trasferimentogenicoAAV che geni rep-cap in un singolo baculovirus. Il sistema OneBac fornisce un approccio alternativo per produrre il rAAV utilizzando un solo set di celle TIPS anziché due come descritto nel sistema TwoBac, il che semplificherebbe ulteriormente il protocollo.
Questo protocollo descrive la produzione di AAV in celle Sf9. È importante ottimizzare il rapporto tra le cellule TIPS infette da baculovirus e le cellule Sf9 naïve del produttore per ottenere una buona resa AAV. Se questo rapporto è sub-ottimale, la resa di AAV sarà ridotta11. Ad esempio, se vengono generati più AAV ITR contenenti vettori di trasferimento genico rispetto ai capsidi nelle cellule produttrici a causa del rapporto sub-ottimale tra TIPS e cellule produttrici, tutti i vettori di trasferimento genico disponibili non otterranno abbastanza capsidi per produrre particelle AAV complete. D'altra parte, se vengono generati più capsidi rispetto ai vettori di trasferimento genico AAV nelle cellule produttrici, tutti i capsidi non otterranno AAV ITR contenente vettori di trasferimento genico che si traducono in particelle AAV vuote.
Man mano che le cellule si moltiplicano, i nutrienti del terreno di coltura si esauriscono e i prodotti di scarto metabolici si accumulano. Pertanto, l'integrazione del 20% di terreno di crescita fresco nella coltura cellulare 2 giorni dopo la co-coltura delle cellule TIPS e delle cellule Sf9 può aumentare significativamente i titoli AAV (Amine A. Kamen, National Research Council Canada, comunicazione personale).
La purezza delle particelle AAV è un fattore critico per ottenere un'efficace trasduzione delle cellule bersaglio senza alcuna citotossicità per studi sia in vitro che in vivo 3,5. Pertanto, è importante includere una fase di cromatografia in grado di purificare selettivamente le particelle AAV ed eliminare impurità come proteine e detriti delle cellule ospiti, DNA genomico e baculovirale e vettori aggregati e frammentati. Durante il caricamento del surnatante AAV su una colonna di sefarosio AVB, è fondamentale controllare i campioni di flusso per la presenza di particelle AAV che possono passare attraverso la colonna senza legarsi alla resina. In tal caso, (1) sarà necessaria una velocità di esecuzione inferiore che si traduce in un tempo di permanenza più lungo per legare le particelle AAV, (2) la quantità di campione caricato sulla colonna dovrebbe essere ridotta e/o (3) il volume del sefarosio AVB dovrebbe essere aumentato, in modo che la capacità di legame della colonna non superi mai il numero di particelle AAV. La capacità della resina di sefarosio AVB di legare le particelle AAV ad una portata elevata e con elevata affinità e capacità è importante per ridurre i tempi di purificazione. La principale limitazione di AVB Sepharose è che lega il capside dei sierotipi AAV 1, 2 e 5. Pertanto, diverse resine cromatografiche devono essere testate e utilizzate per la purificazione di altri sierotipi AAV18. Il protocollo di purificazione a valle qui descritto può essere utilizzato anche per purificare l'AAV prodotto in celle HEK 293.
Questo protocollo può purificare aAV dal lisato cellulare ma non può rimuovere le particelle vuote. Alcuni articoli hanno descritto metodi in grado di distinguere le particelle AAV vuote rispetto a quelle piene nelle scorte AAV purificate19,20. Tuttavia, riteniamo che la produzione di AAV debba essere ottimizzata a livello di processo a monte per ridurre al minimo la generazione di particelle vuote. Se il rapporto tra il vettore di trasferimento genico AAV e la produzione di capside nelle cellule produttrici non è ottimale, possono generarsi più particelle vuote.
Oltre a legare particelle AAV complete, il mezzo AVB Sepharose lega particelle AAV frammentate o proteine capidi che possono essere rimosse utilizzando TFF. La maggior parte delle particelle a basso peso molecolare vengono eliminate dai campioni AAV includendo il gradino TFF a valle della cromatografia su colonna. Inoltre, TFF viene utilizzato per eseguire uno scambio/diafiltrazione tampone e per concentrare l'AAV10,21.
Sebbene l'ultracentrifugazione del lisato AAV con cloruro di cesio o gradiente di iodixanolo sia il metodo preferito per la purificazione AAV su piccola scala e di grado pre-clinico, questo metodo non è scalabile e meno adatto per la purificazione su larga scala di AAV21,22.
In conclusione, questo protocollo per lo sviluppo del processo di produzione e purificazione di AAV sarà utile per la produzione pre-clinica su piccola scala e su larga scala di AAV ricombinante per la terapia genica di malattie genetiche ereditarie.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) per averci generosamente fornito i plasmidi AAV e Danielle Steele e Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è supportato dal fondo Start-Up dalla Cincinnati Children's Research Foundation a M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| 2 L flasks | ThermoFisher Scientific | 431281 | Flask for suspension culture |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of supernatants |
| 24-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Adherent cell culture plate |
| 250 mL flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| Akta Avant 150 with Unicorn Software | Cytiva | 28976337 | Chromatography system |
| AVB Sepharose High Performance | Cytiva | 28411210 | Chromatography medium |
| Baculovirus-AAV-2 GFP | In-house | non-catalog | AAV transfer vector |
| Baculovirus-AAV-2 rep-cap | In-house | non-catalog | AAV packaging vector |
| Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Blocking buffer | Santa Cruz Biotechnologies | 516214 | Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells |
| Cell lysis buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100 |
| Cellbag, 2 L and 10 L | Cytiva | 28937662 | Bioreactor bag |
| Cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 100 mM citric acid (pH 2.1) |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For cryopreservation |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For disinfection and storage of the chromatography |
| Filtration unit | Pall Corporation | 12941 | Membrane filter |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| HyClone™ SFX-Insect culture media | Cytiva | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Peristaltic Pump | Pall Corporation | Non-catalog item | TFF pump |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| Microscope | Nikon | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody | Santa Cruz Biotechnologies | 65498 PE | Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells |
| Oxygen tank | Praxair | Non-catalog item | 40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012027 | Wash buffer |
| Silver Staining kit | ThermoFisher Scientific | LC6100 | Staining AAV capsid proteins |
| Sf9 cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge | Pall Corporation | OA100C12 | TFF cartridge to concentrate the AAV |
| Tris-HCl, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV |
| WAVE Bioreactor System 20/50 | Cytiva | 28-9378-00 | Bioreactor |
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