Summary
虚血性心疾患に対する心筋遺伝子治療は、将来の治療法に大きな期待を寄せています。ここでは、虚血性心拍における遺伝子治療の有効性を評価するための大型動物モデルを紹介します。
Abstract
冠状動脈疾患は、世界中の死亡率と罹患率の重要な原因の1つです。現在の治療法の進歩にもかかわらず、冠状動脈疾患患者のかなりの割合が症候性のままです。遺伝子治療を介した治療血管新生は、心筋灌流を改善し、症状を緩和するための新しい治療法を提供します。異なる血管新生因子を用いた遺伝子治療は、いくつかの臨床試験で研究されている。この方法の新規性のために、心筋遺伝子治療の進歩はベンチからベッドサイドへの連続的な経路である。したがって、安全性と有効性を評価するために大型動物モデルが必要です。大型動物モデルが元の疾患と臨床で使用されるエンドポイントを特定すればするほど、臨床試験からの結果がより予測可能になります。ここでは、虚血性ブタ心臓における遺伝子治療の有効性を評価するための大型動物モデルを紹介する。超音波イメージングや 15H2O-PETなどの臨床的に関連するイメージング方法を使用しています。所望の領域への遺伝子導入を標的化するために、電気解剖学的マッピングが使用される。この方法の目的は、(1)慢性冠動脈疾患を模倣すること、(2)心臓の低酸素領域で治療的血管新生を誘発すること、および(3)関連するエンドポイントを使用して遺伝子治療の安全性と有効性を評価することです。
Introduction
冠動脈疾患は、世界中の死亡率と疾病負荷の大部分を占めています1。現在の治療戦略は、経皮的介入、薬物治療、バイパス手術です2。しかし、これらの現在の治療法の進歩にもかかわらず、多くの患者がいわゆる難治性狭心症に苦しんでおり、新しい治療アプローチの満たされていない必要性を強調しています3。遺伝子治療を介した治療的血管新生は、この患者グループを標的にする可能性があります。
心筋遺伝子治療は、ほとんどの場合、異なるウイルスベクター、最も一般的には複製欠損アデノウイルス4を使用して送達される。治療遺伝子として、種々の血管新生成長因子が用いられている。最も実質的に研究されている血管新生成長因子は、血管内皮成長因子受容体(VEGFR)とその補助受容体を介して血管新生シグナル伝達を媒介する血管内皮成長因子(VEGF)です5。いくつかの臨床試験が心臓遺伝子治療の利点と安全性を証明し、この新しい治療法を虚血性心疾患を治療するための現実的な選択肢にしました6,7。しかし、この概念は、臨床に入る前に大型動物モデルでテストされる治療遺伝子とウイルスベクターの強化がまだ必要です。ブタは、その心臓が人間の心臓と非常に似ているため、実験動物として頻繁に使用されてきました。ブタの心血管系の大きさは、ヒトで使用されるのと同様のカテーテル発明の使用を可能にする。ヒトに利用可能なすべてのイメージングモダリティは、ブタ8で使用することができる。
慢性虚血にはいくつかの大型動物モデルがあります。最も一般的に使用されるのは、アメロイドコンストリクターモデル9,10,11です。この方法の欠点は、冠状血管系にアクセスするために開胸術が必要であるため、侵襲性です。以前、私たちのグループでは、慢性心筋虚血のためのミニ侵襲性ボトルネックステントモデルが開発されました12。この方法は、心筋虚血を誘発するためにこの原稿でも使用されています。
超音波イメージングの使いやすさは、イメージングモダリティの時代にもかかわらず大幅に進化してきました。たとえば、心筋株は、その新規性のために依然として主に研究用途にあります。心筋の緊張は、従来のMモード駆出率測定よりも心臓の収縮機能の変化をよく反映します13。このように、ここで大型動物モデルでは、心筋株測定が利用されている。心臓の機能を評価するために、心拍出量は血管造影中の左心室のシネイメージングによっても測定されます。心拍出量は、ストレス下の心筋機能を評価するために、安静時とドブタミン誘発ストレス下の両方で測定されます。
心機能の測定に加えて、心筋灌流に関する情報は、治療的血管新生を目的とした遺伝子治療研究に不可欠です。この動物モデルでは、15O標識放射性水陽電子放出断層撮影法(15H2O−PET)が心筋灌流を測定するためのゴールデンスタンダードであるため、動物を画像化する。15名H2O−PETは、虚血性ブタ心臓14の灌流を測定するために以前に検証されている。
したがって、上記の方法およびモダリティは、虚血性心拍における遺伝子治療の有効性を評価するための優れた視点を構成する。
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Protocol
ここで紹介する実験は、約10週齢の雌の家畜豚を使用して行われ、フィンランドの動物実験委員会によって承認されています。プロトコルの開始時に動物の体重は30〜40 kgであり、人間に対して可能な限り同じ手順の機器とイメージングモダリティを可能にします。慢性虚血は遺伝子導入の14日前に誘発され、遺伝子導入後のフォローアップ時間は使用するウイルスベクターに依存する。研究プロトコルを 図1に示します。このプロトコルは、アデノウイルスまたはAAV媒介遺伝子治療注射を行うために使用することができる。サンプル収集の時間は、使用するウイルスベクターに依存する導入遺伝子発現ピークに調整する必要があります。例えば、アデノウイルス遺伝子導入を行う場合、検体採取の時期は遺伝子導入後6日間に設定される。
1.薬
- 致命的な心室性不整脈を予防するために、200mgのアミオダロンおよび2.5mgのビソプロロールの日用量を投与する。投薬は虚血手術の1週間前に始まり、フォローアップまで毎日続けられます。
- さらに、ステント留置後の急性ステント内血栓症を予防するために、虚血手術の1日前にクロピドグレル(300mg)およびアセチルサリチル酸(300mg)の経口用量を動物に投与する。
- 心室性不整脈を防ぐために、虚血手術の開始時に100 mgのリドカインと2.5 mL(246 mg / mL)のMgSO4 を動物に静脈内投与します。.
- 感染予防のために、各手術の開始時にセフロキシム(500mg)の筋肉内注射を投与する。
- 虚血手術の開始時に30mgのエノキサパリンを静脈内投与し、血栓症予防のための手術手順の後に皮下投与する。
- 麻酔と鎮痛のために、1.5 mLのアトロピン、6 mLのアザペロン(40 mg / mL)、プロポフォール20 mg / mLを15 mg / kg / hの速度で、フェンタニル50 μg / mLを10 μg / kg / hの速度で投与します。.薬の投与量は各ブタで同じでした。用量投与については、地域の動物使用ガイドラインを参照してください。.
- すべての手術中に動物に麻酔をかけます。すべての操作は、無菌技術を使用して無菌環境で実行する必要があります。
2.経胸壁心エコー検査
- 虚血手術、遺伝子導入、安楽死の前に経胸壁心エコー検査を行い、検出可能な心膜液を評価し、心筋の緊張を判断します。
- トランスデューサーをブタの脇の下の3番目または4番目の肋間腔に配置して、僧帽弁レベル、乳頭筋、および頂端レベルで胸骨傍短軸ビューにアクセスします(ビデオ1)。トランスデューサーのマーカーはブタの胸骨を指すべきです。クリップを保存するには、「 取得」を押します。
3. 透視ガイダンス下での血管内手術
- 虚血手術、遺伝子導入および組織採取の前に冠動脈造影後に左心室シネイメージングを行う。
- 操作の準備
- 1.5 mLのアトロピンと6 mLのアザペロンの筋肉内注射でブタを鎮静させることによって手術の準備をします。
- 鎮静後、血管造影手順のために一般的なプロポフォール麻酔とフェンタニル麻酔を豚にそれぞれ15 mg / kg / hと10 μg / kg / hの用量で誘導します。.
注:ブタは手順全体を通して麻酔をかけられます。 - 挿管と人工呼吸器による換気をサポートし、ECGや呼吸パラメータなどの重要な生理学的パラメータを監視します。
- イントロデューサーシースの配置
- 心臓病学の標準的な方法として、すべての手術のために右大腿動脈にイントロデューサーシースを配置します。超音波を使用して大腿動脈を追跡し、エントリー針(18 G)で穴を開けます。
注意: 心筋内遺伝子導入には8Fイントロデューサーシースを使用し、他のすべての操作には6Fシースを使用してください。シースのガイドワイヤーを針に通して動脈に通し、針を外している間ガイドワイヤーを静止させます。 - イントロデューサーシースをガイドワイヤーに沿って挿入し、配置したらガイドワイヤーを取り外し、舌下二硝酸塩1.25 mgをブタに投与して冠血管拡張を誘発します。.
- 心臓病学の標準的な方法として、すべての手術のために右大腿動脈にイントロデューサーシースを配置します。超音波を使用して大腿動脈を追跡し、エントリー針(18 G)で穴を開けます。
- 冠動脈造影
- 虚血手術、遺伝子導入、組織採取の直前に冠動脈造影を行います。血管造影に必要な機構を 図2に示します。
- ヨウ素造影剤を使用した透視ガイダンス下で6Fカテーテルを使用して、右冠状動脈と左上行冠状動脈を画像化します(ビデオ2)。
- 安静時およびドブタミンストレス下での左心室シネイメージング
- 21mLのヨウ素造影剤のボーラスを、自動注射器を使用して5Fピグテールカテーテルを介して左心室に投与します。まず、ボーラス持続時間を3秒に設定し、総容量を21mLに設定します。次に、[シングル]と[はい]を押します。
- 血管造影ワークステーションの測定ソフトウェアで駆出率を計算します。計算を実行するには、問題の画像の心室分析を選択します。画像をスクロールして、拡張期と収縮期の時間枠を選択します。各時間枠の心室の輪郭を描画するツールを選択します。
注:ソフトウェアは、シンプソンの方法で駆出率とストローク量を計算するようになりました。駆出率の測定は、静止時およびドブタミン誘発応力下で実行されます。
- ストレスイメージング
- ドブタミン誘発ストレスイメージングのために、目標心拍数160 bpmに達するまで、ドブタミンを10 μg / kg /分から20 μg / kg /分に漸増用量で静脈内投与します。.次に、シネイメージングを行う。
- 虚血手術
- 遺伝子導入の14日前にボトルネックステントを左冠動脈(LAD)に配置し、慢性心筋虚血を誘導した。ボトルネックステント留置後、ボトルネックステントが正しく留置され、冠状動脈血流が制限されているかどうかを確認します。
注:ボトルネックステントは拡張カテーテル上に配置され、冠状動脈血流を減らすためにボトルネック形状に形成されたポリテトラフルオロエチレンチューブで覆われたベアメタルステントで構成されています9。
- 遺伝子導入の14日前にボトルネックステントを左冠動脈(LAD)に配置し、慢性心筋虚血を誘導した。ボトルネックステント留置後、ボトルネックステントが正しく留置され、冠状動脈血流が制限されているかどうかを確認します。
- ステントサイズの定義
- 血管造影ワークステーションの自動測定ソフトウェアを使用して、血管造影の左上行冠状動脈のサイズに応じて、ステントのサイズを3.0/3.5/4.0 x 8 mmのいずれかで選択します(ビデオ3)12。
- ステント留置
- 左冠状動脈にコイルを配置し、ボトルネックステントをLADまで滑らせ、最初の対角線まで遠位に配置します。
- ステントと内腔比が1.3のインデフレーターを使用して、動脈内の公称圧力までステントを膨らませ、ボトルネックを所定の位置に固定します。さらに15秒後、ステントを収縮させ、機器を動脈から引き抜きます。
注:血管造影によってボトルネックステントの正しい配置を確認します。
4.PETイメージング
注:遺伝子導入の1日前に、安静とストレス 15O標識放射性水PET / CTスキャンを実行します(病院環境と放射線技師が必要です)。
- 参照イメージング
- 安静時およびストレスイメージングの前にコンピュータ断層撮影(CT)スキャンを実行します。CT情報を使用して減衰補正を行います。
- 15名O標識放射性水イメージング
- 800 MBq 15H2Oボーラスを使用して休息およびストレスイメージングを実行します。
- ストレスイメージング
- 12分間の適切な放射性崩壊の後、さらに800 MBq 15O-水ボーラスでストレスイメージングを実行します。
注:充血は、前述のように、アデノシン(200 μg / kg /分の静脈内)によって誘発されます12。
- 12分間の適切な放射性崩壊の後、さらに800 MBq 15O-水ボーラスでストレスイメージングを実行します。
5. 遺伝子導入
- 電気解剖学的マッピング
- 冠動脈造影と機能測定(心エコー検査、LVシネイメージング)の後に電気解剖学的マッピングに進みます。
- 透視ガイダンスで大腿骨シースを介して左心室にマッピングカテーテルを導入します。
注意: 左心室の周りの約100〜150ポイントをマッピングカテーテルに登録して、電気解剖学的マップを作成します。
- 電気解剖学的マップの仕上げ
- 外れ値ポイントを削除して、左心室のより信頼性の高い電気解剖学的マップを確保します。
- これを行うには、マップの [クリップ平面 ] を選択し、心室形状を形成するポイントとは異なるポイントを削除します。次に、マップ ビューの 軌跡 を選択し、ポイント登録時に水平移動したポイントを削除します。
注意: 残りのポイントが左心室をカバーしていることを確認し、必要に応じてさらにポイントを登録します。
- 遺伝子導入注射
- 透視ガイダンスの下で大腿骨シースを介して左心室に心筋内注射カテーテルを導入します。注射針の長さを3mmに設定します。
- 心筋内注射の基準
- 電気解剖学的マッピングシステムによって遺伝子導入を導き、左心室の実行可能だが低運動領域への注射を標的にします。
注:実行可能性のために、基準として5mVを超えるユニポーラ電圧を使用してください。運動低下症の場合は、可能な限り低い局所線形短縮(LLS)を選択し、少なくとも12%未満、できれば6%未満を選択します13。
- 電気解剖学的マッピングシステムによって遺伝子導入を導き、左心室の実行可能だが低運動領域への注射を標的にします。
- 心筋内注射
- 30秒間、ベクター材料を選択点に注入し(ステップ5.4)、左心室への逆流を防ぐために収縮する前に、注射針をさらに5秒間心筋内に保持します。
6.安楽死とサンプル収集
注:ステップ3.4.1および3.5.2でそれぞれ説明した冠動脈造影図および駆出率の測定後、麻酔をかけたブタに50mLの飽和塩化カリウムを静脈内投与します。.
- 心臓の灌流固定
- 胸腔から心臓を収穫します。水ですすいでください。大動脈弁の上に18 Gの針を置き、針を灌流ポンプに取り付けます。750 mLの1%パラホルムアルデヒド(PFA)で心臓を灌流します。
- サンプル収集
- 鋭利な包丁を使って心臓を1cmの厚さにスライスします。遺伝子導入領域からサンプルを4%PFAと液体窒素に収集します。
注:ネガティブコントロールを採取するには、左心室の後壁からコントロールサンプルを収集します。
- 鋭利な包丁を使って心臓を1cmの厚さにスライスします。遺伝子導入領域からサンプルを4%PFAと液体窒素に収集します。
- 安全組織採取
- 肺、肝臓、腎臓、脾臓、卵巣などの遠隔組織からサンプルを収集します。サンプルを4%PFAと液体窒素に入れます。
7. サンプル保管
- 染色用のサンプルを4%PFAで4°Cで48時間保存します。
注意: PFAは毎日新しい液体と交換してください。- 48時間後、PFAを脱イオン水中の15%スクロースと交換する。サンプルをパラフィンブロックに包埋する前に、少なくとも24時間保管してください。急速凍結サンプルは-70°Cで保存されます。
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Representative Results
虚血手術の成功は、冠動脈造影によってこのプロトコルで確認でき、遺伝子送達に進む前に経胸壁超音波(図1)によって低運動領域を決定することによって確認できます。冠動脈閉塞の状態は冠動脈造影によって評価することができ、電気解剖学的マッピングは虚血領域と冬眠領域を確実にします。
遺伝子治療の有効性は、15H2O−PETによる円周方向のひずみ、駆出率、および心筋灌流を測定することによって分析することができる(図3)。組織サンプルは、心臓を電気解剖学的マップと比較することにより、遺伝子導入領域から直接収集できます。導入遺伝子の発現と治療的血管新生(図4)は、β-ガラクトシダーゼ染色後の陽性細胞数を解析し、CD31染色後の心筋毛細血管領域を解析することにより、免疫組織学的解析によって評価することができます。また、遺伝子治療の安全性は、画像診断(心エコー検査による心嚢液貯留評価)、免疫組織学、分布解析により評価することができる。
図1:研究プロトコル。虚血は遺伝子導入の14日前に誘発される。15名H2O−PETイメージングは、遺伝子導入の1日前および安楽死およびサンプル収集の前に行われる。サンプル収集の時間は、使用するウイルスベクターおよび治療用遺伝子に依存する。アデノウイルスベクターを使用する場合、第2の15H2O−PETは5日目であり、サンプル収集の時期はそれぞれ6日目である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:血管検査室のセットアップ。 冠動脈インターベンションに必要な機械:超音波装置、人工呼吸器、血管造影ステーション、左から右へ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:円周方向ひずみの代表画像、および虚血性心臓からの15H2O-PETおよび電気解剖学的マップ。 15名H2O-PET:赤色は最大灌流面積を表し、青色は低灌流面積を示す。電気解剖学的マップ:電気解剖学的マップの茶色の点は注射部位を表します。赤色は左心室の低運動領域を示し、紫色は正常な収縮性の領域を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:β-ガラクトシダーゼおよびPECAM-1染色の代表的な画像 。 β-ガラクトシダーゼはAdLacZ形質導入心臓で発現しており、導入遺伝子発現を示すために使用できます。PECAM-1染色は、心筋毛細血管の検出および毛細血管領域の分析に使用されます。下段は遺伝子導入から離れた領域を表す。β-ガラクトシダーゼ染色におけるスケールバー:200 μm。PECAM-1染色におけるスケールバー:100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:経胸壁心エコー検査の短軸図。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:遺伝子導入前のLADの冠動脈造影。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ3:左前下行動脈径測定。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの時点は、使用されるウイルスベクターに応じて変更され得る。また、免疫組織学的解析は、治療遺伝子に応じて選択することができる。必要に応じて、プロトコルにタイムポイントとエンドポイントを追加することもできます。
このプロトコルは、成功するために不可欠であり、後で修正することが不可能な段階で構成されています。第一に、適切な虚血を誘発できない場合、動物はさらなる手順および分析から除外されなければならない。方法とイメージングの標準化は、結果が時点と動物の間で比較可能であるようにするために重要です。第二に、サンプルは正確な遺伝子導入領域から収集され、さらなる分析を実行するために正常に処理されなければなりません。また、このプロトコルには、血管造影手順とさまざまなイメージングモダリティに関する深い知識が必要です。たとえば、冠動脈造影と鼓動中の心臓へのウイルス注射には、正しい経胸壁心エコー検査を実行するだけでなく、広範なトレーニングが必要です。それにもかかわらず、これらのイメージングモダリティは、心筋機能と灌流を測定して、さらなる研究に不可欠な情報を提供します。
ブタの心血管系は、その解剖学的および生理学的類似性のためにヒトのものに似ているため、ブタは心血管疾患の力学および手順をモデル化するためにしばしば使用される。ただし、動物の急速な成長のため、追跡期間は約6か月に制限されています。6ヶ月後、動物の取り扱いが困難になり、画像品質が低下します。
また、ブタはアテローム性動脈硬化症に対してかなり耐性があり、食事誘発性アテローム性動脈硬化症をブタでモデル化することは複雑である17。しかし、慢性虚血モデルは、元の疾患を模倣するために開発されている。このプロトコルで使用されるボトルネックステント虚血モデルの有意な利点は、ステントの段階的な閉塞が突然の閉塞よりも冠状動脈疾患をよりよく表すことである。アメロイド収縮器モデルと比較して、この方法は侵襲性が低い。第二に、経皮的ボトルネックステント留置は、実行する迅速な手順です。電気解剖学的マッピングシステムを利用することで、梗塞領域ではなく冬眠中の心筋への遺伝子導入を標的にすることができ、これは超音波ガイダンスを使用して注射を標的とする場合に起こり得る結果である。ただし、電気解剖学的マッピングの欠点は、手順の長さです。さらに、ブタの心臓は心室性不整脈に対して非常に敏感であるため、マッピングはマッピング手順中に心室細動を誘発する可能性があります。しかしながら、これらの不整脈は容易に除細動される。
この大型動物モデルで使用されるエンドポイントは、臨床試験で使用されるエンドポイントを識別し、クリニックへの移行を強化します。さらに、これらの方法は、このモデルに記載されているものに加えて、異なるフォローアップ時間および他の補助エンドポイントで心筋遺伝子治療の有効性を評価する大型動物研究に適用可能である。このプロトコルは、大型動物実験の豊富な経験の後に標準化されました。将来的には、このプロトコルは、クリニックへの翻訳前に心筋遺伝子治療の安全性と有効性を評価することに適用されます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、Maria Hedman、Tiina Laitinen、Tomi Laitinen、Pekka Poutiainen、Annika Viren、およびSeveri Sormunenに、クオピオ大学病院での 15O-PETイメージングの支援と許可に感謝する。国立実験動物センターのヘイッキ・カルフネン、ミンナ・テローネン、リッカ・ヴェナライネンが動物の仕事を支援してくれました。
この研究は、フィンランドアカデミー、ERC、およびCardioReGenix EU Horizon 2020助成金からの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 15 % sucrose | VWR | VWRC27480.294 | Prepared from solid sucrose |
| 4% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 5 F pigtail catheter | Cordis | 534-550S | |
| 6 F catheter AR2 | Cordis | 670-112-00 | |
| 6 F introducer sheath | Cordis | 504-606X | |
| 8 F introducer sheath | Cordis | 504-608X | |
| Acetylsalicylic acid | Varying producer | ||
| Amiodarone | Varying producer | ||
| Angiographic station | GE Healthcare | ||
| Angiolaboratory set | Mölnlycke | designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs | |
| Bisoprolol | Varying producer | ||
| Cefuroxime | Varying producer | ||
| Clopidogrel | Varying producer | ||
| Coroflex Blue stent | B.Braun Medical | 5029012 | Catalog number depends on stent size |
| Crile forceps | |||
| Cyclotron | GE Healthcare | ||
| Dobutamine | Varying producer | ||
| Electroanatomical mapping system | Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company | ||
| Enoxaparin | Varying producer | ||
| Fentanyl | Varying producer | ||
| Intramyocardial injection catheter | Johnson & Johnson | ||
| Iodine contrast agent | Iomeron | ||
| Kitchen knife | Varying producer | ||
| Lidocaine | Varying producer | ||
| Liquid nitrogen | Varying producer | ||
| MgSO4 | Varying producer | ||
| Needle 18 G | Cordis | 12-004943 | |
| Perfusion pump | |||
| PET-CT scanner | Siemens Healthcare | ||
| Polytetrafluoroethylene tube | |||
| Propofol | Varying producer | ||
| Scalpel no 11 | VWR | SWAN0503 | |
| Sublingual dinitrate | Takeda | ||
| Ultrasound machine | Philips |
References
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