Summary
Die myokardiale Gentherapie bei ischämischen Herzerkrankungen ist vielversprechend für zukünftige Therapeutika. Hier stellen wir ein Großtiermodell vor, um die Wirksamkeit der Gentherapie im ischämischen Herzen zu evaluieren.
Abstract
Die koronare Herzkrankheit ist weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Trotz der Progression der aktuellen Therapeutika bleibt ein beträchtlicher Teil der Patienten mit koronarer Herzkrankheit symptomatisch. Die Gentherapie-vermittelte therapeutische Angiogenese bietet eine neuartige therapeutische Methode zur Verbesserung der myokardialen Durchblutung und zur Linderung von Symptomen. Die Gentherapie mit verschiedenen angiogenen Faktoren wurde in wenigen klinischen Studien untersucht. Aufgrund der Neuartigkeit der Methode ist der Fortschritt der myokardialen Gentherapie ein kontinuierlicher Weg vom Labor bis zum Krankenbett. Daher werden Großtiermodelle benötigt, um die Sicherheit und Wirksamkeit zu bewerten. Je besser das Großtiermodell die ursprüngliche Krankheit und die in den Kliniken verwendeten Endpunkte identifiziert, desto besser sind die Ergebnisse der klinischen Studien vorhersagbar. Hier stellen wir ein Großtiermodell vor, um die Wirksamkeit der Gentherapie im ischämischen Schweineherzen zu evaluieren. Wir verwenden klinisch relevante bildgebende Verfahren wie Ultraschall und 15H2O-PET. Um die Gentransfers gezielt in den gewünschten Bereich zu bringen, wird elektroanatomisches Mapping verwendet. Das Ziel dieser Methode ist: (1) die Nachahmung der chronischen koronaren Herzkrankheit, (2) die Induktion einer therapeutischen Angiogenese an hypoxischen Herzarealen und (3) die Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit der Gentherapie anhand relevanter Endpunkte.
Introduction
Die koronare Herzkrankheit ist für den größten Teil der Sterblichkeit und Krankheitslast weltweit verantwortlich1. Aktuelle Behandlungsstrategien sind perkutane Interventionen, pharmakologische Behandlung und Bypass-Chirurgie2. Trotz des Fortschritts dieser aktuellen Therapeutika leiden jedoch viele Patienten an einer sogenannten refraktären Angina pectoris, was den ungedeckten Bedarf an neuartigen Behandlungsansätzen unterstreicht3. Gentherapie-vermittelte therapeutische Angiogenese könnte auf diese Patientengruppe abzielen.
Die myokardiale Gentherapie wird am häufigsten unter Verwendung verschiedener viraler Vektoren durchgeführt, am häufigsten mit replikationsdefizientem Adenovirus4. Als therapeutische Gene kommen verschiedene angiogene Wachstumsfaktoren zum Einsatz. Die am besten untersuchten angiogenen Wachstumsfaktoren sind die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGFs), die ihre angiogene Signalübertragung über vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktorrezeptoren (VEGFRs) und ihre Co-Rezeptoren vermitteln5. Mehrere klinische Studien haben den Nutzen und die Sicherheit der kardialen Gentherapie bewiesen und diese neuartige Behandlungsmethode zu einer realistischen Option für die Behandlung ischämischer Herzerkrankungen gemacht 6,7. Dieses Konzept muss jedoch noch verbessert werden, um die therapeutischen Gene und viralen Vektoren zu verbessern, die in Großtiermodellen getestet werden, bevor sie in die Kliniken gelangen. Das Schwein wurde häufig als Versuchstier verwendet, da sein Herz dem menschlichen Herzen sehr ähnlich ist. Die Größe des Herz-Kreislauf-Systems eines Schweins erlaubt die Verwendung ähnlicher Kathetererfindungen, wie sie beim Menschen verwendet werden. Alle bildgebenden Verfahren, die dem Menschen zur Verfügung stehen, können bei Schweinen eingesetzt werden8.
Es gibt mehrere Großtiermodelle für chronische Ischämie. Am häufigsten wird das Ameroid-Constrictor-Modell 9,10,11 verwendet. Der Nachteil dieser Methode ist die Invasivität, da eine Thorakotomie erforderlich ist, um Zugang zu den koronaren Gefäßen zu erhalten. Zuvor wurde in unserer Arbeitsgruppe ein mini-invasives Engpass-Stentmodell für chronische Myokardischämie entwickelt12. Diese Methode wird auch in diesem Manuskript verwendet, um eine myokardiale Ischämie zu induzieren.
Die Benutzerfreundlichkeit der Ultraschallbildgebung hat sich trotz des Alters der Bildgebungsmodalität erheblich weiterentwickelt. Zum Beispiel wird der Myokardstamm aufgrund seiner Neuartigkeit immer noch hauptsächlich in der Forschung eingesetzt. Die Myokardbelastung spiegelt Veränderungen in der kontraktilen Funktion des Herzens besser wider als die herkömmliche Messung der M-Mode-Ejektionsfraktion13. Daher wird hier im Großtiermodell die myokardiale Dehnungsmessung verwendet. Um die Funktion des Herzens zu beurteilen, wird das Herzzeitvolumen auch durch Cine-Bildgebung der linken Herzkammer während der Angiographie gemessen. Das Herzzeitvolumen wird sowohl in Ruhe als auch unter Dobutamin-induziertem Stress gemessen, um die Myokardfunktion unter Stress zu beurteilen.
Neben den Messungen der Herzfunktion sind Informationen über die myokardiale Perfusion in gentherapeutischen Studien zur therapeutischen Angiogenese unerlässlich. In diesem Tiermodell werden die Tiere mit einer15-O-markierten Radiowasser-Positronen-Emissions-Tomographie (15H2O-PET) abgebildet, da dies der goldene Standard für die Messung der myokardialen Perfusion ist. 15H2O-PET wurde bereits für die Messung der Perfusion von ischämischem Schweineherzvalidiert 14.
Die oben genannten Methoden und Modalitäten stellen somit eine hervorragende Perspektive dar, um die Wirksamkeit der Gentherapie im ischämischen Herzen zu bewerten.
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Protocol
Die hier vorgestellten Experimente werden an etwa 10 Wochen alten weiblichen Hausschweinen durchgeführt und sind von der Tierversuchskommission in Finnland zugelassen. Die Tiere wiegen zu Beginn des Protokolls 30-40 kg, was die gleiche prozedurale Ausrüstung und Bildgebungsmodalitäten wie für den Menschen ermöglicht. Die chronische Ischämie wird 14 Tage vor dem Gentransfer induziert, und die Nachbeobachtungszeit nach dem Gentransfer hängt vom verwendeten viralen Vektor ab. Das Studienprotokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um adenovirale oder AAV-vermittelte Gentherapie-Injektionen durchzuführen. Der Zeitpunkt der Probenentnahme muss an den Transgenexpressionspeak angepasst werden, der vom verwendeten viralen Vektor abhängt. Zum Beispiel wird bei der Durchführung von adenoviralen Gentransfers der Zeitpunkt der Probenentnahme auf 6 Tage nach dem Gentransfer festgelegt.
1. Medikation
- Verabreichen Sie eine Tagesdosis von 200 mg Amiodaron und 2,5 mg Bisoprolol, um tödliche ventrikuläre Arrhythmien zu verhindern. Die Medikation beginnt 1 Woche vor der Ischämie-Operation und wird täglich bis zur Nachuntersuchung fortgesetzt.
- Zusätzlich sollten den Tieren 1 Tag vor der Ischämieoperation perorale Dosen von Clopidogrel (300 mg) und Acetylsalicylsäure (300 mg) verabreicht werden, um eine akute In-Stent-Thrombose nach dem Einsetzen des Stents zu verhindern.
- Verabreichen Sie den Tieren zu Beginn der Ischämieoperation 100 mg Lidocain und 2,5 ml (246 mg/ml) MgSO4 intravenös, um ventrikuläre Arrhythmien zu verhindern.
- Verabreichen Sie zu Beginn jeder Operation eine intramuskuläre Injektion von Cefuroxim (500 mg) zur Infektionsprophylaxe.
- Verabreichen Sie 30 mg Enoxaparin intravenös zu Beginn der Ischämieoperationen und subkutan nach dem Operationsverfahren zur Thromboseprophylaxe.
- Für Anästhesie und Analgesie verabreichen Sie 1,5 ml Atropin, 6 ml Azaperon (40 mg/ml), Propofol 20 mg/ml mit einer Rate von 15 mg/kg/h und Fentanyl 50 μg/ml mit einer Rate von 10 μg/kg/h. Die Dosierung der Medikamente war für jedes Schwein gleich. Beachten Sie die örtlichen Richtlinien zur Verwendung von Tieren für die Verabreichung der Dosis.
- Betäuben Sie die Tiere während aller Operationen. Alle Operationen sollten in einer sterilen Umgebung mit einer sterilen Technik durchgeführt werden.
2. Transthorakale Echokardiographie
- Führen Sie vor einer Ischämieoperation, einem Gentransfer und einer Euthanasie eine transthorakale Echokardiographie durch, um nachweisbare Perikardflüssigkeit zu beurteilen und die Myokardbelastung zu bestimmen.
- Platzieren Sie den Schallkopf im dritten oder vierten Interkostalraum unter der Achselhöhle des Schweins, um parasternale Kurzachsenansichten auf Höhe der Mitralklappe, des Papillarmuskels und der apikalen Ebene zu erhalten (Video 1). Die Markierung des Schallkopfs sollte auf das Brustbein des Schweins zeigen. Um einen Clip zu speichern, drücken Sie die Taste "Erfassen".
3. Endovaskuläre Operationen unter Durchleuchtungskontrolle
- Führen Sie eine Bildgebung des linken Ventrikels nach Koronarangiogrammen vor einer Ischämieoperation, einem Gentransfer und einer Gewebeentnahme durch.
- Vorbereitung der Operation
- Bereiten Sie sich auf die Operationen vor, indem Sie die Schweine mit einer intramuskulären Injektion von 1,5 ml Atropin und 6 ml Azaperon sedieren.
- Nach der Sedierung ist bei den Schweinen eine allgemeine Propofol- und Fentanyl-Anästhesie für die angiographischen Eingriffe mit Dosen von 15 mg/kg/h bzw. 10 μg/kg/h einzuleiten.
HINWEIS: Die Schweine werden während des gesamten Eingriffs betäubt. - Unterstützen Sie die Beatmung durch Intubation und Beatmung und überwachen Sie die physiologischen Vitalparameter wie EKG und Atemparameter.
- Platzierung des Einführmantels
- Platzieren Sie eine Einführschleuse in die rechte Oberschenkelarterie für alle Operationen, wie es in der Kardiologie üblich ist. Verfolgen Sie die Oberschenkelarterie mit Ultraschall und stechen Sie sie mit einer Eintrittsnadel (18 G) ein.
HINWEIS: Verwenden Sie eine 8F-Einführschleuse für intramyokardiale Gentransfers und eine 6F-Schleuse für alle anderen Operationen. Führen Sie den Führungsdraht der Scheide durch die Nadel ein, um die Arterie einzufädeln, und halten Sie den Führungsdraht ruhig, während Sie die Nadel entfernen. - Führen Sie die Einführschleuse entlang des Führungsdrahtes ein, entfernen Sie den Führungsdraht und verabreichen Sie dem Schwein 1,25 mg sublinguales Dinitrat, um eine koronare Vasodilatation zu induzieren.
- Platzieren Sie eine Einführschleuse in die rechte Oberschenkelarterie für alle Operationen, wie es in der Kardiologie üblich ist. Verfolgen Sie die Oberschenkelarterie mit Ultraschall und stechen Sie sie mit einer Eintrittsnadel (18 G) ein.
- Koronarangiografie
- Führen Sie eine Koronarangiografie direkt vor der Ischämie-Operation, dem Gentransfer und der Gewebeentnahme durch. Die für die Angiogramme benötigte Maschinerie ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Verwenden Sie einen 6F-Katheter unter Durchleuchtungskontrolle mit einem Jodkontrastmittel, um die rechte Koronararterie und die linke aufsteigende Koronararterie darzustellen (Video 2).
- Bildgebung des linken Ventrikels unter Ruhe und Dobutaminbelastung
- Verabreichen Sie einen 21-ml-Bolus Jodkontrastmittel über einen 5F-Pigtail-Katheter mit einem Autoinjektor in die linke Herzkammer. Stellen Sie zunächst die Bolusdauer auf 3 s und das Gesamtvolumen auf 21 ml ein. Drücken Sie dann Single und Ja.
- Berechnen Sie die Ejektionsfraktion mit der Messsoftware des angiographischen Arbeitsplatzes. Um die Berechnung durchzuführen, wählen Sie Ventrikuläre Analyse des betreffenden Bildes. Scrollen Sie durch das Bild, um einen Zeitrahmen auszuwählen, einen in der Diastole und einen in der Systole. Wählen Sie ein Werkzeug aus, um ventrikuläre Umrisse für jeden Zeitrahmen zu zeichnen.
HINWEIS: Die Software berechnet jetzt die Auswurffraktion und das Hubvolumen nach der Simpson-Methode. Die Messung der Ejektionsfraktion erfolgt in Ruhe und unter Dobutamin-induziertem Stress.
- Belastungs-Bildgebung
- Dosis Dobutamin intravenös in ansteigenden Dosen von 10 μg/kg/min bis 20 μg/kg/min für die Dobutamin-induzierte Stressbildgebung, bis die Zielherzfrequenz von 160 Schlägen pro Minute erreicht ist. Führen Sie dann die Cine-Bildgebung durch.
- Ischämie-Operation
- Platzieren Sie 14 Tage vor dem Gentransfer einen Engpass-Stent in die linke Koronararterie (LAD), um eine chronische Myokardischämie zu induzieren. Prüfen Sie nach dem Einsetzen des Engpass-Stents, ob der Engpass-Stent richtig platziert ist und den koronaren Blutfluss einschränkt.
HINWEIS: Der Flaschenhals-Stent wird auf einen Dilatationskatheter gelegt und besteht aus einem Bare-Metal-Stent, der von einem Polytetrafluorethylen-Röhrchen bedeckt ist, das in Flaschenhalsform ausgebildet ist, um den koronaren Blutflusszu reduzieren 9.
- Platzieren Sie 14 Tage vor dem Gentransfer einen Engpass-Stent in die linke Koronararterie (LAD), um eine chronische Myokardischämie zu induzieren. Prüfen Sie nach dem Einsetzen des Engpass-Stents, ob der Engpass-Stent richtig platziert ist und den koronaren Blutfluss einschränkt.
- Festlegen der Stentgröße
- Wählen Sie die Größe des Stents, entweder 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, entsprechend der Größe der linken aufsteigenden Koronararterie im Angiogramm, indem Sie die automatische Messsoftware am angiographischen Arbeitsplatz verwenden (Video 3)12.
- Platzierung von Stents
- Platzieren Sie eine Spule an der linken Koronararterie und gleiten Sie den Flaschenhals-Stent zum LAD, wobei Sie ihn distal zur ersten Diagonalen platzieren.
- Pumpen Sie den Stent mit einem In-Deflator mit einem Stent-Lumen-Verhältnis von 1,3 auf Nenndruck in der Arterie auf und verankern Sie den Flaschenhals. Lassen Sie nach weiteren 15 s die Luft aus dem Stent ab und ziehen Sie das Gerät aus der Arterie zurück.
HINWEIS: Bestätigen Sie die korrekte Platzierung des Engpass-Stents durch ein Angiogramm.
4. PET-Bildgebung
HINWEIS: Führen Sie einen Tag vor dem Gentransfer 15O-markierte Radiowasser-PET/CT-Scans durch (erfordert Krankenhausumgebung und radiologische Techniker).
- Referenz-Bildgebung
- Führen Sie Computertomographien (CT) vor Ruhe- und Belastungsbildgebungen durch. Verwenden Sie die CT-Informationen zur Dämpfungskorrektur.
- 15O-markierte Radiowasser-Bildgebung
- Führen Sie eine Ruhe- und Stressbildgebung mit einem 800 MBq 15H2O Bolus durch.
- Belastungs-Bildgebung
- Führen Sie eine Stressbildgebung mit einem weiteren 800 MBq 15 O-Wasser-Bolus nach einem geeigneten radioaktiven Zerfall von 12min durch.
HINWEIS: Hyperämie wird durch Adenosin (200 μg/kg/min intravenös) induziert, wie zuvor beschrieben12.
- Führen Sie eine Stressbildgebung mit einem weiteren 800 MBq 15 O-Wasser-Bolus nach einem geeigneten radioaktiven Zerfall von 12min durch.
5. Gentransfer
- Elektroanatomische Kartierung
- Fahren Sie mit der elektroanatomischen Kartierung nach einem Koronarangiogramm und funktionellen Messungen (Echokardiographie, LV-Cine-Bildgebung) fort.
- Ein Kartierungskatheter wird über die Femurschleuse unter fluoroskopischer Führung in den linken Ventrikel eingeführt.
HINWEIS: Registrieren Sie mit dem Kartierungskatheter etwa 100-150 Punkte um den linken Ventrikel herum, um die elektroanatomische Karte zu erstellen.
- Fertigstellung der elektroanatomischen Karte
- Löschen Sie die Ausreißerpunkte, um eine zuverlässigere elektroanatomische Karte des linken Ventrikels zu gewährleisten.
- Wählen Sie dazu die Option Ebenen der Karte ausschneiden aus, und löschen Sie die Punkte, die sich von den Punkten unterscheiden, die die ventrikuläre Form bilden. Wählen Sie als Nächstes Trajektorien für die Kartenansicht aus, und löschen Sie die Punkte, die während der Punktregistrierung horizontal zurückgelegt wurden.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die verbleibenden Punkte den linken Ventrikel abdecken, und registrieren Sie bei Bedarf weitere Punkte.
- Gentransfer-Injektionen
- Ein intramyokardialer Injektionskatheter wird über die Hüftschleuse unter Durchleuchtungskontrolle in die linke Herzkammer eingeführt. Stellen Sie die Länge der Injektionsnadel auf 3 mm ein.
- Kriterien für intramyokardiale Injektionen
- Führen Sie die Gentransfers durch ein elektroanatomisches Kartierungssystem und zielen Sie die Injektionen gezielt in lebensfähige, aber hypokinetische Bereiche des linken Ventrikels ab.
Anmerkungen: Verwenden Sie für die Durchführbarkeit eine unipolare Spannung über 5 mV als Kriterium. Wählen Sie bei Hypokinesie eine lokale lineare Verkürzung (LLS) so niedrig wie möglich, mindestens unter 12 %, vorzugsweise aber unter 6 %13.
- Führen Sie die Gentransfers durch ein elektroanatomisches Kartierungssystem und zielen Sie die Injektionen gezielt in lebensfähige, aber hypokinetische Bereiche des linken Ventrikels ab.
- Intramyokardiale Injektionen
- Injizieren Sie das Vektormaterial während 30 s in den Auswahlpunkt (Schritt 5.4) und halten Sie die Injektionsnadel weitere 5 s im Myokard, bevor Sie sie zurückziehen, um einen Rückfluss in die linke Herzkammer zu verhindern.
6. Euthanasie und Probenentnahme
HINWEIS: Nach den in den Schritten 3.4.1 bzw. 3.5.2 beschriebenen Messungen des Koronarangiogramms und der Ejektionsfraktion sind dem anästhesierten Schwein 50 ml gesättigtes Kaliumchlorid intravenös zu verabreichen.
- Perfusionsfixierung des Herzens
- Ernte das Herz aus der Brusthöhle. Mit Wasser abspülen. Setzen Sie eine 18-G-Nadel über die Aortenklappe und befestigen Sie die Nadel an einer Perfusionspumpe. Perfundierten Sie das Herz mit 750 ml 1%igem Paraformaldehyd (PFA).
- Musterkollektion
- Das Herz mit einem scharfen Küchenmesser in 1 cm dicke Scheiben schneiden. Sammeln Sie die Proben aus dem Gentransferbereich in 4% PFA und flüssigen Stickstoff.
HINWEIS: Um Negativkontrollen zu entnehmen, entnehmen Sie eine Kontrollprobe aus der hinteren Wand des linken Ventrikels.
- Das Herz mit einem scharfen Küchenmesser in 1 cm dicke Scheiben schneiden. Sammeln Sie die Proben aus dem Gentransferbereich in 4% PFA und flüssigen Stickstoff.
- Entnahme von Sicherheitstüchern
- Entnahme von Proben aus entfernten Geweben wie Lunge, Leber, Niere, Milz und Eierstöcken. Proben mit 4 % PFA und flüssigem Stickstoff.
7. Lagerung von Proben
- Lagern Sie die Proben zur Färbung in 4 % PFA für 48 h bei 4 °C.
Anmerkungen: Ersetzen Sie die PFA täglich durch eine frische Flüssigkeit.- Ersetzen Sie nach 48 Stunden die PFA durch 15%ige Saccharose in deionisiertem Wasser. Mindestens 24 Stunden lagern, bevor die Proben in Paraffinblöcke eingebettet werden. Schnappgefrorene Proben werden bei -70 °C gelagert.
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Representative Results
Der Erfolg der Ischämieoperation kann mit diesem Protokoll durch ein Koronarangiogramm und durch die Bestimmung des hypokinetischen Bereichs durch transthorakalen Ultraschall (Abbildung 1) bestätigt werden, bevor mit der Genabgabe fortgefahren wird. Der Zustand des Koronarverschlusses kann durch ein Koronarangiogramm beurteilt werden, und die elektroanatomische Kartierung stellt die ischämischen und überwinternden Bereiche sicher.
Die Wirksamkeit der Gentherapie kann durch Messung der Umfangsdehnung, der Ejektionsfraktion und der myokardialen Perfusion mit 15H2O-PET analysiert werden (Abbildung 3). Die Gewebeproben können direkt aus dem Gentransferbereich entnommen werden, indem das Herz mit der elektroanatomischen Karte verglichen wird. Die Transgenexpression und die therapeutische Angiogenese (Abbildung 4) können durch immunhistologische Analysen durch Analyse der Anzahl positiver Zellen nach Beta-Galactosidase-Färbung und durch Analyse des Myokardkapillarbereichs nach CD31-Färbung bewertet werden. Darüber hinaus kann die Sicherheit der Gentherapie durch diagnostische Bildgebung (Perikardergussbeurteilung mittels Echokardiographie), Immunhistologie und Verteilungsanalyse beurteilt werden.
Abbildung 1: Studienprotokoll. Die Ischämie wird 14 Tage vor dem Gentransfer induziert. 15DieH2O-PET-Bildgebung wird 1 Tag vor dem Gentransfer und vor der Euthanasie und Probenentnahme durchgeführt. Der Zeitpunkt der Probenentnahme hängt vom verwendeten viralen Vektor und therapeutischen Gen ab. Bei der Verwendung adenoviraler Vektoren ist die zweite 15H2O-PET am 5. Tag bzw. der Zeitpunkt der Probenentnahme am 6. Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Aufbau des Angiolabors. Die Geräte, die für koronare Eingriffe benötigt werden: Ultraschallgerät, Beatmungsgerät und Angiographiestation, von links nach rechts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentatives Bild der Umfangsdehnung und 15H2O-PET und eine elektroanatomische Karte des ischämischen Herzens. 15H2O-PET: Die rote Farbe steht für den Bereich der maximalen Perfusion und blau für den Bereich der Hypoperfusion. Elektroanatomische Karte: Braune Punkte in der elektroanatomischen Karte stellen die Injektionsstellen dar. Die rote Farbe zeigt die hypokinetischen Bereiche der linken Herzkammer an, während die violette Farbe den Bereich der normalen Kontraktionsfähigkeit anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentatives Bild von β-Galactosidase- und PECAM-1-Färbungen. β-Galactosidase wird in AdLacZ-transduzierten Herzen exprimiert und kann zur Darstellung der Transgenexpression verwendet werden. Die PECAM-1-Färbung wird zum Nachweis von Myokardkapillaren und zur Analyse des Kapillarbereichs verwendet. Die untere Zeile stellt den Bereich dar, der vom Gentransfer entfernt ist. Maßstabsbalken in β-Galactosidase-Färbungen: 200 μm. Maßstabsbalken in PECAM-1-Färbungen: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Transthorakale Echokardiographie Kurzachsenansicht. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Koronarangiogramm der LAD vor dem Gentransfer. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: Messung des Durchmessers der linken vorderen absteigenden Arterie. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Die Zeitpunkte dieses Protokolls können je nach verwendetem viralen Vektor geändert werden. Auch die immunhistologischen Analysen können entsprechend dem therapeutischen Gen ausgewählt werden. Es ist auch möglich, dem Protokoll bei Bedarf weitere Zeitpunkte und Endpunkte hinzuzufügen.
Dieses Protokoll besteht aus Phasen, die für den Erfolg unerlässlich sind und die im Nachhinein nicht mehr korrigiert werden können. Erstens, wenn es nicht gelingt, eine angemessene Ischämie herbeizuführen, muss das Tier von weiteren Verfahren und Analysen ausgeschlossen werden. Die Standardisierung der Methoden und der Bildgebung ist entscheidend, damit die Ergebnisse zwischen den Zeitpunkten und den Tieren vergleichbar sind. Zweitens müssen die Proben aus dem exakten Gentransferbereich entnommen und erfolgreich verarbeitet werden, um weitere Analysen durchführen zu können. Außerdem erfordert dieses Protokoll eine gründliche Vertrautheit mit angiographischen Verfahren und verschiedenen Bildgebungsmodalitäten. Zum Beispiel erfordern Koronarangiogramme und Virusinjektionen in ein schlagendes Herz eine umfangreiche Ausbildung sowie die Durchführung einer korrekten transthorakalen Echokardiographie. Nichtsdestotrotz messen diese bildgebenden Verfahren die Myokardfunktion und -perfusion, um wichtige Informationen für weitere Studien zu liefern.
Das Herz-Kreislauf-System eines Schweins ähnelt aufgrund seiner anatomischen und physiologischen Ähnlichkeiten dem menschlichen, und daher werden Schweine häufig verwendet, um die Mechanik und Verfahren von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu modellieren. Die Nachbeobachtungszeit ist jedoch aufgrund des schnellen Wachstums des Tieres auf ca. 6 Monate begrenzt. Nach 6 Monaten wird der Umgang mit dem Tier zu einer Herausforderung und die Bildqualität verschlechtert sich.
Außerdem sind Schweine sehr resistent gegen Arteriosklerose, was die Modellierung einer ernährungsinduzierten Atherosklerose bei Schweinen erschwert17. Es wurden jedoch Modelle für chronische Ischämien entwickelt, um die ursprüngliche Krankheit nachzuahmen. Der wesentliche Vorteil des in diesem Protokoll verwendeten Ischämiemodells für Enghals-Stents besteht darin, dass der allmähliche Verschluss des Stents eine koronare Herzkrankheit besser darstellt als ein plötzlicher Verschluss. Im Vergleich zum Ameroid-Constrictor-Modell ist diese Methode weniger invasiv. Zweitens ist die Platzierung eines perkutanen Enghals-Stents ein schnell durchzuführendes Verfahren. Die Verwendung des elektroanatomischen Kartierungssystems ermöglicht es, den Gentransfer gezielt auf das überwinternde Myokard und nicht auf den Infarktbereich zu richten, was ein mögliches Ergebnis ist, wenn die Injektionen unter Ultraschallkontrolle eingesetzt werden. Der Nachteil des elektroanatomischen Mappings ist jedoch die Länge des Eingriffs. Da das Schweineherz außerdem sehr empfindlich auf ventrikuläre Arrhythmien reagiert, kann das Mapping während des Mapping-Verfahrens Kammerflimmern induzieren. Diese Herzrhythmusstörungen lassen sich jedoch leicht defibrillieren.
Die Endpunkte, die in diesem Großtiermodell verwendet werden, identifizieren diejenigen, die in klinischen Studien verwendet werden, und erleichtern so den Übergang in die Kliniken. Darüber hinaus sind diese Methoden für Großtierstudien anwendbar, in denen die Wirksamkeit der myokardialen Gentherapie mit unterschiedlichen Nachbeobachtungszeiten und anderen zusätzlichen Endpunkten zusätzlich zu den in diesem Modell beschriebenen untersucht wird. Dieses Protokoll wurde nach einer großen Erfahrung mit Großtierversuchen standardisiert. In Zukunft gilt dieses Protokoll für die Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit der myokardialen Gentherapie vor der Translation in die Kliniken.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Maria Hedman, Tiina Laitinen, Tomi Laitinen, Pekka Poutiainen, Annika Viren und Severi Sormunen für die Unterstützung und die Genehmigung der 15O-PET-Bildgebung am Universitätskrankenhaus Kuopio; und Heikki Karhunen, Minna Törrönen und Riikka Venäläinen vom National Laboratory Animal Center für ihre Unterstützung bei der Tierarbeit.
Diese Studie wird durch Zuschüsse der Finnish Academy, des ERC und des CardioReGenix EU Horizon 2020 Grants unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 15 % sucrose | VWR | VWRC27480.294 | Prepared from solid sucrose |
| 4% PFA | VWR | VWRC28794.295 | Prepared from paraformaldehyde powder |
| 5 F pigtail catheter | Cordis | 534-550S | |
| 6 F catheter AR2 | Cordis | 670-112-00 | |
| 6 F introducer sheath | Cordis | 504-606X | |
| 8 F introducer sheath | Cordis | 504-608X | |
| Acetylsalicylic acid | Varying producer | ||
| Amiodarone | Varying producer | ||
| Angiographic station | GE Healthcare | ||
| Angiolaboratory set | Mölnlycke | designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs | |
| Bisoprolol | Varying producer | ||
| Cefuroxime | Varying producer | ||
| Clopidogrel | Varying producer | ||
| Coroflex Blue stent | B.Braun Medical | 5029012 | Catalog number depends on stent size |
| Crile forceps | |||
| Cyclotron | GE Healthcare | ||
| Dobutamine | Varying producer | ||
| Electroanatomical mapping system | Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company | ||
| Enoxaparin | Varying producer | ||
| Fentanyl | Varying producer | ||
| Intramyocardial injection catheter | Johnson & Johnson | ||
| Iodine contrast agent | Iomeron | ||
| Kitchen knife | Varying producer | ||
| Lidocaine | Varying producer | ||
| Liquid nitrogen | Varying producer | ||
| MgSO4 | Varying producer | ||
| Needle 18 G | Cordis | 12-004943 | |
| Perfusion pump | |||
| PET-CT scanner | Siemens Healthcare | ||
| Polytetrafluoroethylene tube | |||
| Propofol | Varying producer | ||
| Scalpel no 11 | VWR | SWAN0503 | |
| Sublingual dinitrate | Takeda | ||
| Ultrasound machine | Philips |
References
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