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Immunology and Infection

अलगाव और अस्थि मज्जा की इन विट्रो संस्कृति-व्युत्पन्न मैक्रोफेज NO-Redox जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/62834
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1BHF Centre of Research Excellence, Division of Cardiovascular Medicine, Radcliffe Department of Medicine, John Radcliffe Hospital, University of Oxford, 2Wellcome Centre for Human Genetics, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल को संस्कृति tetrahydrobiopterin (BH4) के लिए स्थापित किया गया है - और inducible नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (iNOS) - NO-redox जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक मुरीन मैक्रोफेज की कमी। अध्ययन बीएच 4 और पारंपरिक अलगाव और संस्कृति विधियों में पाए जाने वाले अन्य कलाकृतियों के संभावित संदूषण को कम करने पर केंद्रित है जो प्रयोगात्मक परिणामों और परिणामों की व्याख्या को भ्रमित कर सकते हैं।

Abstract

मैक्रोफेज पूरे शरीर में हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाओं से व्युत्पन्न होते हैं, भड़काऊ प्रक्रियाओं के लिए केंद्रीय होते हैं, और जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में भाग लेते हैं। मैक्रोफेज के इन विट्रो अध्ययन को पेरिटोनियम से पूर्व विवो संस्कृति द्वारा या अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) बनाने के लिए माइलॉयड अस्थि मज्जा पूर्वज कोशिकाओं के भेदभाव के माध्यम से किया जा सकता है। अग्रदूतों से मैक्रोफेज भेदभाव के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण में L929 कोशिकाओं (LCM) से वातानुकूलित मीडिया का उपयोग शामिल है। यह मीडिया स्व-उत्पादन के लिए आसान है, लेकिन बैच परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है, और इसके घटक अपरिभाषित हैं। इसी तरह, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का उपयोग विकास का समर्थन करने के लिए किया जाता है, लेकिन इसमें अपरिभाषित अणुओं का एक विशाल मिश्रण होता है जो बैचों के बीच भिन्न हो सकता है। ये विधियां नाइट्रिक ऑक्साइड जीव विज्ञान और रेडॉक्स तंत्र के अध्ययन के लिए पर्याप्त नहीं हैं क्योंकि वे दोनों में पर्याप्त मात्रा में छोटे अणु होते हैं जो या तो रेडॉक्स तंत्र या कोफ़ैक्टर्स के पूरक स्तर के साथ हस्तक्षेप करते हैं, जैसे कि टेट्राहाइड्रोबिओप्टेरिन (बीएच 4), इंड्यूसिबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (आईएनओएस) से एनओ के उत्पादन के लिए आवश्यक है। इस रिपोर्ट में, हम सेल विकास और भेदभाव के लिए उपयुक्त परिस्थितियों को बनाए रखते हुए बहिर्जात बायोप्टेरिन के स्तर को कम करके नो-रेडॉक्स पर्यावरण के नियंत्रण के लिए अनुमति देने वाला एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। संस्कृति मीडिया संरचना का तंग नियंत्रण प्रयोगात्मक पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने में मदद करता है और परिणामों की सटीक व्याख्या की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में, BMDM को एक GTP cyclohydrolase (GCH) से प्राप्त किया गया था - माउस मॉडल की कमी। BMDM की संस्कृति या तो (i) वातानुकूलित LCM, या (ii) पुनः संयोजक M-CSF और GM-CSF युक्त मीडिया के साथ किया गया था, जबकि BH4 और NO-कमी वाली संस्कृति की स्थिति प्राप्त करते हुए न्यूनतम कलाकृतियों का उत्पादन करने के लिए - इस प्रकार NO-redox जीव विज्ञान और विट्रो में immunometabolism के पुनरुत्पादक अध्ययन के लिए अनुमति देता है।

Introduction

मैक्रोफेज को विभिन्न प्रकार की बीमारियों और स्थितियों में एक दिलचस्प सेल प्रकार के रूप में स्थापित किया गया है, कई प्रतीत होता है कि जन्मजात प्रतिरक्षा पर उनके पारंपरिक ध्यान से असंबंधित हैं। चूंकि मैक्रोफेज फिजियोलॉजी ऊतक या पर्यावरण पर बहुत अधिक निर्भर है, इसलिए उनके कार्य और इसमें शामिल विभिन्न मार्गों का अध्ययन करने के लिए कई तरीके और मॉडल उत्पन्न हुए हैं। ऐतिहासिक रूप से, मैक्रोफेज सेल लाइनों, जैसे RAW264.7, क्षेत्र पर हावी थे, लेकिन इन्हें धीरे-धीरे विभिन्न प्राथमिक सेल मॉडल के पक्ष में बदल दिया गया है। उदाहरण के लिए, थायोग्लाइकोलेट के साथ उपचार के बाद मुरीन मैक्रोफेज को पेरिटोनियल लैवेज से अलग किया जा सकता है। ऊतक-निवासी कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान करते समय, इन पेरिटोनियल मैक्रोफेज को विभिन्न बाहरी उत्तेजनाओं के लिए अधिक वश में प्रतिक्रिया प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है, जिससे कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उनकी उपयुक्ततासीमित हो जाती है।

एक विकल्प के रूप में, अस्थि मज्जा में माइलॉयड पूर्वज कोशिकाओं से व्युत्पन्न अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम), मैक्रोफेज जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल के रूप में उभरे हैं, जिसमें परिपक्वता और मैक्रोफेज से जुड़े विभिन्न शास्त्रीय फेनोटाइप, एम 0 (भोले, गैर-सक्रिय), एम 1 (प्रो-इंफ्लेमेटरी, आमतौर पर एलपीएस / आईएफएन के साथ सक्रिय) और एम 2 (प्रो-रिज़ॉल्यूशन, आमतौर पर आईएल -4)2 के साथ सक्रिय होता है, ३ । हालांकि, बीएमडीएम में माइलॉयड पूर्वज कोशिकाओं का भेदभाव संस्कृति मीडिया 4,5 में मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) की उपस्थिति पर निर्भर करता है। यह या तो मीडिया में जोड़े गए शुद्ध प्रोटीन के रूप में या L929 वातानुकूलित मीडिया (LCM) से आपूर्ति की जा सकती है। बीएमडीएम (लागत और दक्षता) का उपयोग करने के फायदों को विभिन्न उत्तेजनाओं (साइटोकिन्स, चयापचय मध्यवर्ती, और आरएनएस / आरओएस) के प्रति उनकी संवेदनशीलता द्वारा प्रस्तुत सीमाओं के खिलाफ तौला जाना चाहिए।

पिछले आंकड़ों से संकेत मिलता है कि एलसीएम की सामग्री खराब रूप से परिभाषित और आंतरिक रूप से परिवर्तनशील है, जिसके परिणामस्वरूप उनके विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अविश्वसनीय और अनुपयुक्त हैं, विशेष रूप से वे विशेष रूप से एनओ या रेडॉक्स जीव विज्ञान से संबंधित हैं, क्योंकि ये बहिर्जात यौगिकों की उपस्थिति से बहुत प्रभावित हो सकते हैं। इस प्रकार, यह विस्तृत प्रोटोकॉल अच्छी तरह से परिभाषित DMEM के उपयोग के लिए कहता है: बैच भिन्नता के लिए कम बैच के साथ F12 मीडिया और पुनः संयोजक मुरीन एम-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ (ग्रैनुलोसाइट्स-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक) के अलावा। इसके अलावा, भ्रूण गोजातीय सीरम आमतौर पर ऊतक संस्कृति मीडिया में एक पूरक के रूप में उपयोग किया जाता है, खराब परिभाषित यौगिकों और अंतर्निहित परिवर्तनशीलता का एक और स्रोत प्रदान करता है। इसलिए, बीएमडीएम की विश्वसनीय संस्कृति सुनिश्चित करने के लिए इस तरह के एडिटिव्स के उपयोग को नियंत्रित करना और अनुकूलित करना आवश्यक है। एफबीएस के एक परिभाषित कम एंडोटॉक्सिन स्रोत का उपयोग करके और यह सुनिश्चित करके कि एकल बैचों को थोक खरीदा जाता है, संस्कृति की स्थिति को मज़बूती से परिभाषित किया जाता है, और पुनरुत्पादन सुनिश्चित किया जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को 95% शुद्धता से ऊपर एक मैक्रोफेज संस्कृति का उत्पादन करने के लिए प्रदर्शित किया गया है जब प्रवाह साइटोमेट्री 6 द्वारा मैक्रोफेज सतह मार्करों CD45 और CD11b के लिए मूल्यांकन किया जाताहै।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को अनुमोदित किया गया था और ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय की नैतिक समिति और यूके होम ऑफिस एनिमल्स (वैज्ञानिक प्रक्रियाएं) अधिनियम 1986 के अनुसार किया गया था। सभी प्रक्रियाएं यूरोपीय संसद के निर्देश 2010/63/EU के अनुरूप थीं।

1. अस्थि मज्जा कोशिकाओं का अलगाव

  1. बलिदान जंगली प्रकार (C57BL / 6), या Gch1-कमी (R26-CreERT2Gchfl / fl) चूहों (10-16 सप्ताह पुराने) गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा और हिंद अंगों को इकट्ठा।
    नोट: किसी भी सेक्स के लिए कोई वरीयता नहीं बनाई गई है। आयु-मिलान वाली महिलाएं अपने पुरुष समकक्षों की तुलना में थोड़ी छोटी होंगी, जो शुरुआती सामग्री की प्रारंभिक उपज को प्रभावित करती हैं।
    1. संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ चूहों को स्प्रे करें।
    2. शरीर से फर और त्वचा को हटाने के लिए विच्छेदन कैंची के साथ पेट में एक छोटा सा कट बनाएं। पिछले अंगों पर मांसपेशियों को उजागर करने के लिए त्वचा को छील लें।
    3. माउस को उसके पेट पर रखें और घुटने के जोड़ से उठाकर और कूल्हों पर दबाव डालकर हिंद अंगों को विस्थापित करें। विस्थापन कूल्हे के जोड़ पर महसूस किया जा सकता है।
    4. कूल्हे पर मांसपेशियों के माध्यम से सावधानीपूर्वक काटकर हिंद पैरों को हटा दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि फीमर को कोई नुकसान न हो।
    5. टखने के जोड़ के ऊपर काटें, पैर को हटा दें और पैर से किसी भी शेष त्वचा को साफ करें।
    6. विच्छेदित पैरों को 25 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे पीबीएस (कोई एंटीबायोटिक की आवश्यकता नहीं) के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें और इसे बर्फ पर रखें।
      नोट: कई जानवरों को विच्छेदित किया जा सकता है, और पैरों को बर्फ पर रखा जा सकता है।
  2. एक ऊतक संस्कृति हुड में बाँझ स्थितियों के तहत, पैरों से मांसपेशियों को हटा दें और अस्थि मज्जा को उजागर करने के लिए हड्डियों के सिरों को हटा दें।
    1. संदूषण को कम करने और किसी भी फर या अवशेष को धोने के लिए पैरों को 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में रखें।
    2. पैरों को एक साफ, बाँझ, बैक्टीरियोलॉजिकल पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। मांसपेशियों को हटाने के लिए ब्लेड के किनारे के साथ हड्डियों के साथ दृढ़ता से और सावधानीपूर्वक स्क्रैप करने के लिए संदंश और एक स्केलपेल का उपयोग करें। प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए टेंडन के माध्यम से काटें।
    3. अस्थि मज्जा को उजागर करने के लिए प्रत्येक हड्डी के छोर पर एपिफिसिस को हटा दें। फीमर को किसी भी छोर पर काटा जाता है, जो संबंधित जोड़ों से कम होता है।
    4. टिबिया को शीर्ष पर काटा जाता है, घुटने के जोड़ से बस कम, और फाइबुला के साथ चौराहे के बिंदु के ठीक ऊपर नीचे।
  3. पीबीएस के साथ हड्डियों से अस्थि मज्जा फ्लश और यह एक 50 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में इकट्ठा.
    1. PBS के 10 mL के साथ एक 10 mL सिरिंज भरें और एक 25 G x 0.5 x 16 मिमी सुई के लिए संलग्न करें। यह एक माउस से सभी हड्डियों को फ्लश करने के लिए पर्याप्त है।
    2. सुई को हड्डी की मज्जा गुहा में डालें और धीरे से अस्थि मज्जा को पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर के साथ बाहर निकालें, यह सुनिश्चित करने के लिए हड्डी के माध्यम से सुई को ऊपर और नीचे चलाएं कि सभी अस्थि मज्जा विस्थापित हो गए हैं।
    3. सभी हड्डियों के लिए दोहराएं, एक साफ पेट्री डिश में फ्लश किए गए अस्थि मज्जा को इकट्ठा करें।
    4. एक बाँझ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, निलंबन को सिरिंज के अंदर और बाहर 5-10 बार खींचकर अस्थि मज्जा को अलग करें जब तक कि कोई गांठ टूट न जाए।
    5. 1 एमएल सिरिंज में अलग-अलग अस्थि मज्जा को इकट्ठा करें और इसे एक साफ 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 70 μM सेल छलनी के माध्यम से पारित करें। एकत्र अस्थि मज्जा को बर्फ पर रखें, जबकि आगे के नमूने एकत्र किए जाते हैं।
      नोट:: चित्र 1 - भाग 1 में प्रोटोकॉल योजना देखें।

2. चयन, भेदभाव, और BMDM की उत्तेजना

  1. बाद के उपयोग के लिए अस्थि मज्जा को फ्रीज करने के लिए, 5 मिनट के लिए 1000 x g पर centrifugation द्वारा अस्थि मज्जा को गोली मारें और 5% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) युक्त कम एंडोटॉक्सिन FBS के 2 mL में resuspend।
    1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 1000 x g पर अस्थि मज्जा निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। एक रक्त-लाल गोली का निर्माण होगा।
    2. supernatant को छोड़ दें।
    3. धीरे से कम एंडोटॉक्सिन एफबीएस के 2 मिलीलीटर में छर्रे को फिर से निलंबित कर दिया गया जिसमें 5% डीएमएसओ होता है और दीर्घकालिक भंडारण के लिए वाष्प-चरण तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करने से पहले रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज हो जाता है।
  2. अस्थि मज्जा का तुरंत उपयोग करने के लिए, अस्थि मज्जा चढ़ाने से पहले लाल रक्त कोशिकाओं को लाइस करें।
    1. आरटी में 5 मिनट के लिए 1000 x g पर अस्थि मज्जा निलंबन सेंट्रीफ्यूज। एक रक्त-लाल गोली का निर्माण होगा।
    2. 1x लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 3 mL में गोली resuspend और 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट.
    3. RT पर 5 मिनट के लिए 10 mL PBS और centrifuge को 1000 x g पर जोड़ें। supernatant को छोड़ दें।
    4. चरण 2.3.5 से जारी रखकर तत्काल उपयोग के लिए कोशिकाओं को प्लेट करें।
  3. मैक्रोफेज को डीफ्रॉस्ट करें और कोशिकाओं को पैलेट करने से पहले चढ़ाना मीडिया के 3 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें।
    1. DMEM तैयार करें: F12 जिसमें 5% कम एंडोटॉक्सिन FBS, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, एल-ग्लूटामाइन और 25 ng / mL M-CSF शामिल हैं।
      नोट: एम-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ को 0.1% बाँझ बीएसए युक्त बाँझ पानी में सूखे प्रोटीन को फिर से निलंबित करके तैयार किया जा सकता है, और बाद में उपयोग के लिए एलीकोट को -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है।
    2. जमे हुए सेल निलंबन को 37 डिग्री सेल्सियस पर तेजी से डीफ्रॉस्ट करें।
    3. सेल निलंबन (0.5 मिलीलीटर) को एक साफ, बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें तैयार DMEM के 3 mL शामिल हैं: F12 मीडिया।
    4. RT पर 5 मिनट के लिए 1000 x g पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। supernatant को छोड़ दें।
    5. तैयार DMEM के 3 mL में गोली resuspend: F12 मीडिया.
    6. एक पसंदीदा विधि द्वारा कक्षों की गणना करें।
  4. दिन 0: प्लेट कोशिकाओं.
    1. DMEM में गैर-टीसी-लेपित प्लास्टिक के बर्तन में कोशिकाओं को प्लेट करें: F12 मीडिया जिसमें 5% कम एंडोटॉक्सिन FBS, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, एल-ग्लूटामाइन और 25 ng / mL M-CSF शामिल हैं।
      नोट: प्रतिनिधि सीडिंग घनत्व तालिका 1 में वर्णित हैं। एक माउस से पैरों की एक पूरी जोड़ी 15-20 मिलियन अग्रदूत कोशिकाएं प्रदान करती है।
    2. 5% CO2 के साथ 37 °C पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. दिन 5: कोशिकाओं को खिलाएं।
    1. DMEM की मूल मात्रा का 50% जोड़कर कोशिकाओं को खिलाएं: F12 मीडिया जिसमें 5% कम एंडोटॉक्सिन FBS, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, एल-ग्लूटामाइन, और 50 ng / mL M-CSF शामिल हैं।
  6. दिन 6: जीएम-सीएसएफ के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें।
    1. तैयार जीएम-सीएसएफ को कोशिकाओं पर सेल संस्कृति मीडिया में सीधे 50 एनजी / एमएल की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
  7. तैयार DMEM: F12 के साथ मीडिया को बदलें।
    1. कक्षों से सभी मीडिया निकालें.
    2. कोशिकाओं को पहले से गर्म पीबीएस में संक्षेप में धोएं।
    3. DMEM जोड़ें: F12 मीडिया जिसमें 2% कम एंडोटॉक्सिन FBS, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, एल-ग्लूटामाइन, 25 ng / mL M-CSF और 50 ng / mL GM-CSF शामिल हैं।
    4. चरण 2.7.5-2.7.7 में वर्णित उत्तेजनाओं के साथ M0, M1, या M2 फेनोटाइप्स के लिए मैक्रोफेज को सक्रिय करें।
    5. M0 - कोई उत्तेजना की आवश्यकता नहीं है। मीडिया में रात भर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    6. M1 - 100 ng / mL LPS और 10 ng / mL IFNπ (अंतिम सांद्रता) रात भर के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें।
    7. एम 2 - रात भर में 100 एनजी / एमएल आईएल -4 (अंतिम एकाग्रता) के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें।
  8. दिन 8: कोशिकाओं को काटें।
    1. कोशिकाओं से मीडिया निकालें (मीडिया इकट्ठा और डाउनस्ट्रीम assays के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज).
    2. 5 मिनट के लिए बर्फ-ठंडे पीबीएस (मीडिया वॉल्यूम का 50%) में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    3. कोमल scraping या दोहराया pipetting के साथ प्लेट से कोशिकाओं को अलग.
    4. RT पर 5 मिनट के लिए 2500 x g पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। supernatant को छोड़ दें।
    5. बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल छर्रों को फ्रीज करें।
      नोट:: प्रोटोकॉल योजना चित्रा 1 - भाग 2 देखें।

Representative Results

मैक्रोफेज में इस प्रोटोकॉल की दक्षता का प्रदर्शन करने से पहले, नाइट्राइट और बीएच 4 स्तरों का मूल्यांकन मीडिया में किया गया था, जिसमें एफबीएस के 10% के साथ पूरक किया गया था, जिसमें या तो एलसीएम का 10% या केवल पुनः संयोजक एम-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ शामिल था। नाइट्राइट, हालांकि नाइट्रिक ऑक्साइड चयापचय के अंतिम उत्पाद के रूप में लंबे समय तक माना जाता है, अब नाइट्रिक ऑक्साइड के शारीरिक भंडारण के रूप में माना जाता है, जिसे आवश्यक होने पर पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है और इस प्रकार अक्सर नाइट्रिक ऑक्साइड जैवउपलब्धता के संकेतक के रूप में उपयोग किया जाता है। BH4 कोई उत्पादन के लिए NOS का एक आवश्यक cofactor है. जैसा कि चित्रा 2 में देखा गया है, 10% एफबीएस के साथ पूरक मीडिया में एम-सीएसएफ / जीएम-सीएसएफ या एलसीएम की परवाह किए बिना समान नाइट्राइट स्तर थे। हालांकि, विभिन्न एलसीएम बैचों के बीच अधिक परिवर्तनशीलता देखी गई थी। यह अवलोकन बीएच 4 माप पर भी लागू होता है। वास्तव में, एलसीएम के एक बैच (बैच # 3) में अन्य दो (बैच # 1 और # 2) की तुलना में बीएच 4 का काफी उच्च स्तर था। इसके अलावा, एलसीएम बैचों में 10% एफबीएस और पुनः संयोजक साइटोकिन्स के साथ पूरक मीडिया की तुलना में काफी अधिक बायोप्टेरिन शामिल थे। बैचों के बीच कुल बायोप्टेरिन की महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता को भी मापा गया था। ये परिणाम एलसीएम की तुलना में एम-सीएसएफ के कम चर स्रोत का उपयोग करने के महत्व को प्रदर्शित करते हैं।

इसके अलावा, 10% FBS के साथ पूरक मीडिया में FBS के 2% या 5% वाले मीडिया की तुलना में नाइट्राइट के काफी उच्च स्तर शामिल थे। BH4 के लिए 10% और 5% के बीच का अंतर अत्यधिक महत्वपूर्ण (पी < 0.05) था। हालांकि, बायोप्टेरिन के समान स्तरों को परिमाणित किया गया था। इसकी तुलना में, OptiMEM + 0.2% BSA नाइट्राइट और BH4 से रहित था, जिससे यह एक बहुत ही स्वच्छ और उपयुक्त मीडिया बन गया। हालांकि, जैसा कि बेली एट अल द्वारा वर्णित है, हालांकि OptiMEM का मतलब मैक्रोफेज को उत्तेजित करते समय केवल एक बार रात भर उपयोग किया जाना है, भुखमरी के कारण कोशिका मृत्यु देखी गई थी। DMEM: FBS के 2% के साथ पूरक F12 को इस मुद्दे को दूर करने के लिए चुना गया था, जिससे स्वस्थ कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त पोषक तत्वहोने के दौरान न्यूनतम नाइट्राइट और BH4 संदूषण की अनुमति मिलती है। दरअसल, कुछ नाइट्राइट का पता लगाने के बावजूद, एलपीएस / आईएफएन प्रेरित डब्ल्यूटी मैक्रोफेज (1 x 106 कोशिकाओं के लिए 30-80 μM; डेटा नहीं दिखाया गया है) की तुलना में स्तर नगण्य (~ 0.2 μM) हैं।

प्रयोगात्मक डेटा के साथ इस बेहतर प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए, एक नए BH4-कमी वाले माउस मॉडल से BMDM के अलगाव और लक्षण वर्णन, R26-CreERT2Gchfl / fl को यहां प्रस्तुत किया गया है। BH4 जीटीपी cyclohydrolase I (Gch1) जीन द्वारा उत्पादित किया जाता है। जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, जीसीएच 1 में कमी बीएच 4 के नुकसान और परिणामस्वरूप एनओ और बाद में नाइट्राइट के गायब होने की ओर ले जाती है, और सुपरऑक्साइड अनियन में वृद्धि ऑक्सीडेटिव तनाव का कारण बनती है जैसा कि मैकनील एट अल.8 द्वारा पहले प्रदर्शित किया गया था। यद्यपि इस प्रोटोकॉल को पहले से ही अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है और विभिन्न क्रे-सिस्टम से अन्य बीएच 4-कमी वाले मैक्रोफेज को संस्कृति करने के लिए उपयोग किया जाता है जैसे कि जीसीएचएफएल / एफएलटी 2 सी मॉडल 6,8, आर 26-सीआर टी2जीसीएच एफएल / एफएल मॉडल अद्वितीय है क्योंकि यह टेमोक्सीफेन उपचार के बाद जीसीएच 1 जीन को हटाने के लिए क्रे-ईआरटी 2 सिस्टम के सशर्त सक्रियण का उपयोग करता है (चित्रा 3 बी, सी)। यह विभिन्न समय बिंदुओं पर नॉकआउट और एक वाहन बनाम टैमोक्सीफेन उपचार के रूप में आंतरिक नियंत्रण के उपयोग की अनुमति देता है। इस उदाहरण में, कोशिकाओं को या तो वाहन (95% इथेनॉल) या 0.1/1.0 μM 4-OH tamoxifen के साथ दिन 1 और 3 पर इलाज किया गया था (वाहन और टैमोक्सीफेन स्टॉक दोनों ने मीडिया में 1:100 पतला किया था, इससे पहले कि 0.7/7.0 μL मौजूदा संस्कृति मात्रा के 1 मिलीलीटर में जोड़ा गया)।

जैसा कि चित्रा 3 डी में देखा गया है, जीटीपीसीएच प्रोटीन को R26-CreerT2Gchfl / fl कोशिकाओं में Tamoxifen उपचार के बाद समाप्त कर दिया जाता है, लेकिन Gchfl / fl एक में नहीं। महत्वपूर्ण रूप से, दोनों R26-CreERT2Gchfl / fl और Gchfl / fl नियंत्रण कोशिकाएं अभी भी LPS / IFN उत्तेजना (चित्रा 3B, C) के बाद iNOS का उत्पादन करने में सक्षम हैं। Gch1 जीन अभिव्यक्ति में इन परिवर्तनों और जीटीपीसीएच प्रोटीन में परिणामी परिवर्तन ने इंट्रासेल्युलर बीएच 4 स्तरों और नाइट्राइट के क्षीण उत्पादन को काफी परेशान किया। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, R26-CreERT2Gchfl / fl चूहों से अलग और सुसंस्कृत BMDM ने काफी कम BH4 उत्पादन का प्रदर्शन किया और मीडिया में नाइट्राइट संचय में कमी आई, टैमोक्सीफेन की उपस्थिति में नियंत्रण GCHfl / fl कोशिकाओं की तुलना में। इसी तरह, एलसीएम मीडिया में सुसंस्कृत एक ही कोशिकाओं ने भी समाप्त Gch1 अभिव्यक्ति को दिखाया; हालांकि इन कोशिकाओं ने अभी भी 4 OH tamoxifen के साथ Gch1 अभिव्यक्ति के नॉकआउट के बाद BH4 और नाइट्राइट दोनों की महत्वपूर्ण मात्रा का उत्पादन किया, संभवतः BH4 के साथ मीडिया और FBS के संदूषण के कारण। यह नई विधि के एक स्पष्ट सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, एल-सेल युक्त मीडिया में कोशिकाओं को संवर्धित करने पर।

इस मॉडल के आगे के लक्षण वर्णन गैर-सक्रिय (M0) Gchfl / fl और R26-CreERT2Gchfl / fl BMDM के बीच आकारिकी में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दर्शाता है, जो टेमोक्सीफेन की विभिन्न सांद्रता के बाद दिन 8 पर है। जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, दोनों मॉडल लम्बी चरम सीमाओं के साथ एक गोल आकार से बने अनुयायी कोशिकाओं की एक समान मात्रा प्रदर्शित करते हैं, आमतौर पर अउत्तेजित मैक्रोफेज9 की अपेक्षित विशेषताएं।

एक साथ लिया गया, इन परिणामों से पता चलता है कि बीएमडीएम के अलगाव और संस्कृति की यह विधि मुरीन मैक्रोफेज की संस्कृति के लिए उपयुक्त कोशिकाओं की एक शुद्ध आबादी प्रदान करती है। यह विधि कुछ मीडिया योगों में मौजूद बहिर्जात यौगिकों के हस्तक्षेप के बिना मुरीन मैक्रोफेज की संस्कृति के लिए अनुमति देती है।

Figure 1
चित्रा 1: बीएमडीएम (भाग 2) के चयन, भेदभाव और उत्तेजना के लिए अस्थि मज्जा कोशिकाओं के अलगाव (भाग 1) को दर्शाने वाला योजनाबद्ध आरेख। (ए) बाँझ परिस्थितियों में, विच्छेदित पैरों को 70% इथेनॉल में धोने के बाद एक स्वच्छ बैक्टीरियोलॉजिकल पेट्री डिश में रखा जाता है। (बी) हड्डियों के साथ संदंश और स्केलपेल स्क्रैपिंग का उपयोग करके मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाता है। (सी) अस्थि मज्जा को उजागर करने के लिए हड्डियों के चरम को काट दिया जाता है। (डी) अस्थि मज्जा को हड्डी के लुमेन में सुई डालकर 10 मिलीलीटर पीबीएस से भरे 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके हड्डियों से फ्लश किया जाता है। (ई) सुई को हड्डी के माध्यम से ऊपर और नीचे चलाया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी अस्थि मज्जा को हटा दिया गया है। हड्डी को उस चरण में पेट्री डिश में एकत्र अस्थि मज्जा के साथ सफेद और स्पष्ट दिखाई देना चाहिए। (F-G) सभी हड्डियों के लिए दोहराएं, 1 एमएल सिरिंज में अलग-अलग अस्थि मज्जा एकत्र करें, और इसे 70 μm सेल छलनी के माध्यम से एक साफ 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पारित करें। बाद में उपयोग के लिए ठंड मीडिया में कोशिकाओं को नीचे स्पिन और पुन: निलंबित करें। भाग 2 चयन, भेदभाव, और BMDMs की उत्तेजना से पता चलता है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: DMEM में नाइट्राइट और BH4 स्तर: F12 + GM-CSF + M-CSF या DMEM: F12 + L-सेल मीडिया। (ए) विभिन्न मीडिया में नाइट्राइट के स्तर Griess परख विधि का उपयोग कर मापा गया. (बी) बीएच 4 और बायोप्टेरिन के स्तर को बीएच 4 मानक का उपयोग करके एचपीएलसी परिमाणीकरण द्वारा विभिन्न मीडिया में मापा गया था। डेटा को माध्य (n = 3) ± SD के रूप में व्यक्त किया जाता है। कई तुलनाओं द्वारा एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। प्रतीक समूहों के बीच p < 0.05 का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: R26CreERT2 मॉडल का परिचय. (A) रेडॉक्स जीव विज्ञान में एक NOS cofactor के रूप में BH4 की भूमिका को दर्शाने वाली योजना। (बी) योजनाबद्ध रूप से जीसीएच 1 में महत्वपूर्ण एक्सोन (2 और 3) के उच्छेदन का विवरण देना, क्योंकि फ्लैंकिंग लोक्सपी साइटों और इस मुरीन मॉडल में टैमोक्सीफेन के साथ क्रे-ईआरटी 2 के सशर्त सक्रियण के कारण। (सी) पीसीआर (एन = 3 स्वतंत्र जानवरों का प्रतिनिधि) महत्वपूर्ण एक्सोन के उच्छेदन का प्रदर्शन करता है जब बीएमडीएम को टैमोक्सीफेन के साथ इलाज किया जाता है। डब्ल्यूटी चूहे एक 1030 बीपी पीसीआर उत्पाद का उत्पादन करते हैं, जबकि क्रे की उपस्थिति में, एक 1392 बीपी उत्पाद का उत्पादन किया जाता है, जो महत्वपूर्ण एक्सोन के उच्छेदन की पुष्टि करता है। (डी) आईएनओएस, जीसीएच, और बी-ट्यूबुलिन के इम्युनोब्लॉट (एन = 3 स्वतंत्र जानवरों का प्रतिनिधि)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मैक्रोफेज में बीएच 4-कमी का लक्षण वर्णन। (A, B) qRT-PCR R26-CreERT2Gchfl/ fl मॉडल tamoxifen के साथ इलाज में Gch1 अभिव्यक्ति के नुकसान की पुष्टि करता है। नीला = नई MCSF विधि, हरा = शास्त्रीय LCM विधि. (C,D) HPLC द्वारा इंट्रासेल्युलर BH4 के विश्लेषण से पता चलता है कि 0.1 μM और 1.0 μM BH4 स्तरों को काफी कम करने के लिए पर्याप्त हैं। (E, F) Griess परख का उपयोग कर मीडिया में नाइट्राइट के माप से पता चलता है कि unstimulated BMDM नाइट्राइट का पता लगाने योग्य स्तर का उत्पादन नहीं करते हैं, जबकि Gchfl / fl औरR26-Creer T2Gchfl / fl BMDM LPS / IFN की उपस्थिति में नाइट्राइट का उत्पादन करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, R26-CreERT2Gchfl/fl का टैमोक्सीफेन उपचार उत्तेजित BMDM में नाइट्राइट के स्तर को काफी कम कर देता है। डेटा को (n = 3) ± SD के माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। कई तुलनाओं द्वारा एक तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। प्रतीक समूहों के बीच p < 0.05 का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: बीएमडीएम आकृति विज्ञान की तुलना। टेमोक्सीफेन के अलग-अलग उपचार के साथ दिन 8 पर बीएमडीएम की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त तस्वीरें। स्केल छवि में इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

संस्कृति पकवान मीडिया वॉल्यूम सीडिंग घनत्व
12 अच्छी तरह से पकवान 1 मिलीलीटर 500,000 कक्ष
6 अच्छी तरह से पकवान 2 मिलीलीटर 1,000,000 कोशिकाएं
100 मिमी पकवान 10 mL 3,000,000 कोशिकाएं
75 सेमी2 फ्लास्क 15 mL 5,000,000 कोशिकाएं

तालिका 1: प्रतिनिधि सीडिंग घनत्व।

Discussion

इस BH4- और NO-कमी वाले BMDM संस्कृति प्रोटोकॉल को टेट्राहाइड्रोबिओप्टेरिन (BH4) और अन्य हस्तक्षेप कलाकृतियों की कमी के माध्यम से प्राथमिक मैक्रोफेज में NO-redox जीव विज्ञान की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसका उद्देश्य इन प्रयोगात्मक मॉडलों से प्राप्त परिणामों की विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन को बढ़ाना है।

महत्वपूर्ण चरणों में सही प्लास्टिक के बर्तन का उपयोग शामिल है। मैक्रोफेज पूर्वज अनुयायी कोशिकाएं हैं और बहुत चिपचिपा हैं; इसलिए गैर-ऊतक संस्कृति (टीसी) उपचारित प्लेटों का उपयोग उन्हें अन्य पूर्वज कोशिकाओं से चुनने और अलग करने में महत्वपूर्ण है, जो अन्यथा शुद्धता को संलग्न और कम कर सकते हैं। फसल के दिन, प्लेटों से मैक्रोफेज को अलग करने के लिए बर्फ-ठंडे पीबीएस की आवश्यकता होती है, लेकिन ईडीटीए का उपयोग करना या यहां तक कि स्क्रैपिंग कोशिकाओं को बहुत धीरे-धीरे डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के आधार पर किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, लिसेड बनाम लाइव सेल प्रयोग)। संदूषण के संबंध में भी विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए। अस्थि मज्जा को बाहर निकालते समय, बचे हुए फर और त्वचा से बैक्टीरिया या वायरल कणों के साथ संभावित क्रॉस-संदूषण हो सकता है। तब जितना संभव हो उतना सावधान और बाँझ होना आवश्यक है; इसलिए कुछ मिनटों के लिए 70% इथेनॉल में विच्छेदित पैरों को डुबोने को प्रोत्साहित किया जाता है। इसी तरह, मैक्रोफेज बढ़ने के दौरान एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करना अत्यधिक अनुशंसित है।

इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा दिन 0 पर सेल-चढ़ाना घनत्व से उत्पन्न होती है। फ्लश अस्थि मज्जा में विभिन्न प्रकार की कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें गलत तरीके से गिना जा सकता है और मैक्रोफेज पूर्वजों के रूप में शामिल किया जा सकता है, इस प्रकार एक झूठी कुल सेल संख्या के लिए अग्रणी है। बाद और संभावित परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, अलग-थलग मैक्रोफेज को दिन 7 पर गर्म पीबीएस का उपयोग करके धीरे-धीरे फ्लश किया जा सकता है और 2% एफबीएस डीएमईएम में सही घनत्व पर फिर से मढ़वाया जा सकता है: पालन की अनुमति देने के लिए उत्तेजना से पहले एफ 12 कम से कम 1 घंटे पहले।

अंत में, Griess परख द्वारा नाइट्राइट के स्तर की जाँच बड़े मैक्रोफेज से मीडिया का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करने के लिए अनिवार्य है. प्लस पक्ष पर, इस परख त्वरित और सस्ती प्रदर्शन करने के लिए है.

जैसा कि यहां प्रदर्शित किया गया है, यह अनुकूलित प्रोटोकॉल एल-सेल वातानुकूलित मीडिया (एलसीएम) का उपयोग करके मैक्रोफेज को अलग करने और खेती करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिक सामान्य प्रोटोकॉल के लिए एक अधिक परिभाषित और बेहतर विकल्प है। दरअसल, नो-रेडॉक्स जीव विज्ञान का अध्ययन करते समय एलसीएम का उपयोग करने वाली मुख्य चिंताओं में से एक बायोप्टेरिन की महत्वपूर्ण मात्रा का पता लगाया जाता है, जिससे संभावित चयापचय परिवर्तन10 हो जाते हैं। उदाहरण के लिए, बहिर्जात बीएच 4 जल्दी से कमी वाले मॉडल को फिर से भर सकता है और आईएनओएस के लिए एक कोफ़ैक्टर के रूप में कार्य कर सकता है, जिससे नाइट्रिक ऑक्साइड का अवांछित उत्पादन होता है। एलसीएम का उपयोग करने का एक और नुकसान इसके उत्पादन में निहित है - एलसीएम कॉलोनी-उत्तेजक कारकों, साइटोकिन्स और एल -929 कोशिकाओं द्वारा सीधे स्रावित अन्य उप-उत्पादों का मिश्रण है, जो सभी मैक्रोफेज फिजियोलॉजी6 को प्रभावित कर सकते हैं। एम-सीएसएफ में इसकी महान आपूर्ति के बावजूद, मैक्रोफेज प्रसार और अस्तित्व के लिए आवश्यक, बैच से बैच तक प्रत्येक घटक की भिन्नता प्रयोगों में परिवर्तनशीलता के जोखिम को बढ़ाती है।

दोनों मुद्दों को संबोधित करने के लिए, यह नया प्रोटोकॉल अच्छी तरह से परिभाषित DMEM का उपयोग करता है: F12 मीडिया जिसमें बायोप्टेरिन के निम्न स्तर होते हैं, जिसमें शुद्ध एम-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ की एक नियंत्रित मात्रा जोड़ी जाती है। दोनों साइटोकिन्स मैक्रोफेज के भेदभाव और विकास में सहायता करते हैं। एम-सीएसएफ विशेष रूप से मैक्रोफेज11 में हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव का आश्वासन देकर अस्थि मज्जा पूर्वज कोशिकाओं से बीएमडीएम की पीढ़ी की ओर जाता है। इसके अलावा, जीएम-सीएसएफ को भड़काऊ साइटोकाइन और नो उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है जब उत्तेजना से पहले जोड़ा जाता है, तो नो-रेडॉक्स जीव विज्ञान12,13 का अध्ययन करते समय एक वास्तविक लाभ।

अन्य मुख्य कारक इस नई विधि को संबोधित करता है कि एफबीएस, आमतौर पर अच्छे स्वास्थ्य और कोशिकाओं के विकास के लिए आवश्यक पोषक तत्वों के स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है। एलसीएम के समान, एफबीएस में बायोप्टेरिन के महत्वपूर्ण स्तर होते हैं। जबकि उत्तेजना से पहले कोशिकाओं की पूरी सीरम भुखमरी को शुरू में OptiMEM + 0.2% BSA का उपयोग करके माना जाता था, मैक्रोफेज ने टुकड़ी के संकेत दिखाए, जो बेली एट अल.6 द्वारा वर्णित सेल व्यवहार्यता में कमी का संकेत था। हालांकि, जैसा कि मैक्रोफेज ने सीरम के लिए एक पूर्ण आवश्यकता का प्रदर्शन किया, बायोवेस्ट से अल्ट्रा-लो एंडोटॉक्सिन एफबीएस का चयन किया गया था। बैचों को बायोप्टेरिन के लिए परीक्षण किया गया था और एक विश्वसनीय और अच्छी तरह से परिभाषित आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए थोक खरीद से पहले पूर्व-चयनित किया गया था। बायोप्टेरिन के प्रदूषणकारी स्रोतों को कम करने के उद्देश्य से आगे बढ़ने के लिए, एफबीएस की कम सांद्रता का परीक्षण किया गया था। सेल संस्कृति में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले 10% सीरम का उपयोग करने के बजाय, एफबीएस स्तर को मैक्रोफेज में अस्थि मज्जा के 7-दिवसीय भेदभाव के दौरान 5% तक रखा जाता है और अंतिम दिन रातभर उत्तेजना के दौरान 2% तक कम कर दिया जाता है। यह बायोप्टेरिन के नगण्य स्तर का पता लगाया गया है लेकिन अच्छे स्वास्थ्य और मैक्रोफेज के पालन के लिए पर्याप्त पोषक तत्व सुनिश्चित करता है। यद्यपि पुनः संयोजक एम-सीएसएफ का उपयोग करके इस नए अनुकूलित प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप प्राथमिक मैक्रोफेज की संस्कृति और सक्रियण के लिए अधिक नियंत्रित वातावरण होता है, मुख्य सीमा यह है कि यह विधि एलसीएम विधि का उपयोग करने की तुलना में अधिक महंगी है।

इन सभी कारकों को ध्यान में रखते हुए, दोनों तरीकों की तब सीधे तुलना की गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, पुनः संयोजक एम-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ का उपयोग करके यहां प्रस्तुत किए गए नए संशोधित प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप एक अधिक पुनरुत्पादक प्रणाली हुई जहां मीडिया बीएच 4 को दूषित करने से रहित था। इसके प्रभाव दो गुना थे; बीएच 4-कमी वाली कोशिकाओं में वास्तव में बीएच 4 की कमी थी, जिसके परिणामस्वरूप एलपीएस के साथ एम 1 स्थिति के लिए उत्तेजना के बाद मीडिया में न्यूनतम पता लगाने योग्य नाइट्राइट संचय हुआ। यह एलसीएम में सुसंस्कृत उन्हीं बीएमडीएम कोशिकाओं के विपरीत था, जहां महत्वपूर्ण बीएच 4 और नाइट्राइट का पता लगाया गया था।

निष्कर्ष निकालने के लिए, इस विधि की ताकत प्रत्येक पैरामीटर का पूरी तरह से आकलन करके बायोप्टेरिन के स्तर को नियंत्रित करने के प्रयास में निहित है जो मैक्रोफेज में नो और रेडॉक्स सिग्नलिंग को प्रभावित कर सकती है। विशेष रूप से, यह NO-redox जीव विज्ञान क्षेत्र में अधिकतम reproducibility और मानकीकरण सुनिश्चित करता है।

Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को एम.जे. .C(FS/14/56/31049), ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन प्रोग्राम अनुदान (RG/17/10/32859 और RG/12/5/29576), वेलकम ट्रस्ट (090532/Z/09/Z), और NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Centre को सम्मानित किया गया था। लेखक बीएचएफ सेंटर ऑफ रिसर्च एक्सीलेंस, ऑक्सफोर्ड (आरई / 13 / 1 / 30181 और आरई / 18 / 3 / 34214) से समर्थन को भी स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe Terumo SS+01T1 1mL 6% LUER syringe
10 mL plastic syringe Fisher scientific 14955453
6 well plate sterile non-treated CytoOne CC7672-7506 Flat bottom
DMEM/F-12 (1:1) (1x) Gibco, Life Technologies 21331-020
DMSO sterile Sigma-aldrich D2650-100ML
Easy flask 260 mL Thermo Scientific 156800
L-Glutamine Solution 200 mM Sigma-aldrich G7513-100ML
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-aldrich L4391-1MG
Mutlidish 12 sterile non-treated Thermo Scientific 150200 Flat bottom
Needle 25G, 0.5 x 16 mm BD Microlance 3 300600
PBS (pH7.4, 1x) Gibco, Life Technologies 10010-015
Penicillin-Streptomycin Sigma-aldrich P0781-100ML
petri dish 100 x15 mm sterile Falcon, Corning incorporated 351029
Recombinant murine GM-CSF PEPROTECH 315-03
Recombinant murine IFN-γ PEPROTECH 315-05
Recombinant murine M-CSF PEPROTECH 315-02
Scalpel n23 Swann-Morton 0510
Ultra-low endotoxin FBS Biowest S1860-500
VWR cell strainers 70 µm nylon VWR 732-2758

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 183
अलगाव और अस्थि मज्जा की <em>इन विट्रो</em> संस्कृति-व्युत्पन्न मैक्रोफेज NO-Redox जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए
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Diotallevi, M., Nicol, T., Ayaz, F., Bailey, J., Shaw, A., McNeill, E., Davies, B., Channon, K. M., Crabtree, M. J. Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology. J. Vis. Exp. (183), e62834, doi:10.3791/62834 (2022).

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