Summary
이 프로토콜은 NO-산화환원 생물학을 연구하기 위해 테트라하이드로바이오프테린(BH4)- 및 유도성 일차 뮤린 대식세포-결핍 일차 뮤린 대식세포를 배양하기 위해 확립되었다. 이 연구는 실험 결과와 결과의 해석을 혼동 할 수있는 전통적인 격리 및 배양 방법에서 발견되는 BH4 및 기타 유물의 잠재적 오염을 줄이는 데 중점을 둡니다.
Abstract
대식세포는 몸 전체의 조혈 전구 세포로부터 유래되고, 염증 과정의 중심이며, 선천적 및 적응성 면역 반응에 참여한다. 대식세포의 시험관내 연구는 복막으로부터의 생체외 배양에 의해 또는 골수 유래 대식세포(BMDMs)를 형성하기 위해 골수성 골수 전구 세포의 분화를 통해 수행될 수 있다. 전구체로부터의 대식세포 분화에 대한 일반적인 접근법은 L929 세포 (LCM)로부터의 컨디셔닝 배지의 사용을 포함한다. 이 매체는 자체 생산하기 쉽지만 배치 변동성이 있으며 그 구성 요소는 정의되지 않았습니다. 유사하게, 태아 소 혈청 (FBS)은 성장을 지원하는 데 사용되지만 배치마다 다를 수있는 정의되지 않은 분자의 광대 한 혼합물을 포함합니다. 이러한 방법은 산화질소 생물학 및 산화환원 메커니즘의 연구에 적합하지 않은데, 둘 다 산화질소 신타제(iNOS)로부터 NO를 생산하는 데 필요한 산화질소 메커니즘 또는 보조인자인 테트라하이드로바이오프테린(BH4)과 같은 보조인자의 보충 수준을 방해하는 상당한 양의 소분자를 포함하고 있기 때문이다. 이 보고서에서, 우리는 세포 성장 및 분화에 적합한 조건을 유지하면서 외인성 바이오프테린의 수준을 감소시킴으로써 NO-산화환원 환경의 조절을 허용하는 최적화된 프로토콜을 제시한다. 배양 배지 구성을 엄격하게 제어하면 실험적 재현성을 보장하고 결과의 정확한 해석을 용이하게 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, BMDMs는 GTP 사이클로가수분해효소 (GCH)-결핍 마우스 모델로부터 수득되었다. BMDMs의 배양은 (i) 컨디셔닝 LCM, 또는 (ii) 재조합 M-CSF 및 GM-CSF를 함유하는 배지로 수행되어 BH4 및 NO-결핍 배양 조건을 수득하면서 최소한의 아티팩트를 생산한다 - 따라서 시험관내에서 NO-레독스 생물학 및 면역대사의 재현가능한 연구를 허용한다.
Introduction
대식세포는 다양한 질병 및 조건에서 흥미로운 세포 유형으로 확립되어 왔으며, 많은 사람들이 선천적 면역에 대한 전통적인 초점과 관련이없는 것으로 보입니다. 대식세포 생리학은 그들이 거주하는 조직 또는 환경에 크게 의존하기 때문에, 그들의 기능과 관련된 다양한 경로를 연구하기 위해 많은 방법과 모델이 생겨났다. 역사적으로, RAW264.7과 같은 대식세포 세포주가 이 분야를 지배했지만, 이들은 다양한 일차 세포 모델에 유리하게 점진적으로 대체되어 왔다. 예를 들어, 뮤린 대식세포는 티오글리콜레이트로 처리한 후 복막 세척으로부터 단리될 수 있다. 조직-상주 세포의 연구에 유용한 모델을 제공하면서, 이들 복막 대식세포는 다양한 외부 자극에 대한 보다 하위된 반응을 입증하는 것으로 나타났으며, 이로써 많은 하류 응용에 대한 그들의 적합성을 제한한다1.
대안으로, 골수의 골수성 전구 세포로부터 유래 된 골수 유래 대식 세포 (BMDMs)는 성숙 및 대식세포와 관련된 다양한 고전적 표현형, M0 (순진한, 비 활성화), M1 (염증성, 일반적으로 LPS / IFN으로 활성화) 및 M2 (pro-resolution, 보통 IL-4로 활성화)2를 포함한 대식세포 생물학의 다양한 측면을 연구하기위한 귀중한 모델로 부상했다. 3. 그러나, 골수성 전구 세포를 BMDMs로 분화시키는 것은 배양 배지 4,5 내의 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)의 존재에 의존한다. 이는 정제된 단백질을 배지에 첨가하거나 L929 컨디셔닝 배지(LCM)로부터 공급할 수 있다. BMDM 사용의 이점 (비용 및 효율성)은 다양한 자극 (사이토 카인, 대사 중간체 및 RNS / ROS)에 대한 민감성에 의해 제시된 한계와 비교되어야합니다.
이전의 데이터는 LCM의 내용이 잘못 정의되고 본질적으로 가변적이어서 다양한 하류 응용, 특히 NO 또는 산화 환원 생물학과 관련된 용도에 대해 신뢰할 수 없고 부적합하다는 것을 나타내며, 이는 외인성 화합물6의 존재에 의해 크게 영향을 받을 수 있기 때문이다. 이와 같이, 이러한 상세한 프로토콜은 잘 정의된 DMEM: 낮은 배치에서 배치 변동을 갖는 F12 배지의 사용과 재조합 뮤린 M-CSF 및 GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니-자극 인자)의 첨가를 요구한다. 더욱이, 조직 배양 배지에서 보충물로서 전형적으로 사용되는 태아 소 혈청은 잘못 정의된 화합물 및 내재된 가변성의 또 다른 공급원을 제공한다. 따라서, BMDM의 신뢰할 수 있는 배양을 보장하기 위해 이러한 첨가제의 사용을 제어하고 최적화하는 것이 필요하다. FBS의 정의된 저내독소 공급원을 사용하고 단일 배치가 대량 구매되도록 보장함으로써 배양 조건이 안정적으로 정의되고 재현성이 보장됩니다. 본원에 기재된 프로토콜은 유세포 분석기6에 의해 대식세포 표면 마커 CD45 및 CD11b에 대해 평가될 때 95% 순도 이상의 대식세포 배양물을 생성하는 것으로 입증되었다.
Protocol
모든 동물 절차는 옥스포드 대학 윤리위원회 및 영국 홈 오피스 동물 (과학 절차) 법 1986에 따라 승인되고 수행되었습니다. 모든 절차는 유럽 의회의 지침 2010/63/EU를 준수합니다.
1. 골수 세포의 분리
- 자궁경부 탈구에 의해 야생형(C57BL/6) 또는 Gch1 결핍(R26-CreERT2Gchfl/fl) 마우스(10-16주령)를 희생시키고 뒷다리를 수집한다.
참고 : 어느 성별에 대한 선호도는 없습니다. 연령 일치 암컷은 남성 여성보다 약간 작아서 출발 물질의 초기 수율에 영향을 미칩니다.- 오염의 위험을 줄이기 위해 마우스에 70 % 에탄올을 뿌리십시오.
- 몸에서 모피와 피부를 제거하기 위해 해부 가위로 복부를 작게 자릅니다. 뒷다리에 근육을 노출시키기 위해 피부를 벗겨냅니다.
- 마우스를 복부에 놓고 무릎 관절에서 들어 올리고 엉덩이에 압력을 가하여 뒷다리를 탈구시킵니다. 탈구는 고관절에서 느낄 수 있습니다.
- 엉덩이의 근육을 조심스럽게 절단하여 뒷다리를 제거하여 대퇴골에 손상이 발생하지 않도록하십시오.
- 발목 관절 위를 자르고 발을 제거하고 다리에서 남아있는 피부를 닦으십시오.
- 해부된 다리를 얼음처럼 차가운 PBS 25mL(항생제 필요 없음)가 있는 50mL 튜브에 넣고 얼음 위에 놓습니다.
참고 : 여러 동물을 해부 할 수 있으며 다리는 얼음 위에 보관됩니다.
- 조직 배양 후드의 멸균 조건에서 다리에서 근육을 제거하고 뼈 끝을 제거하여 골수를 노출시킵니다.
- 다리를 70 % 에탄올에 2 분 동안 넣어 오염을 줄이고 모피 나 잔류 물을 씻어 내십시오.
- 다리를 깨끗하고 멸균 된 세균 학적 페트리 접시로 옮기십시오. 포셉과 메스를 사용하여 뼈를 따라 뼈를 단단하고 조심스럽게 긁어 근육을 제거하십시오. 과정을 쉽게하기 위해 힘줄을 자르십시오.
- 골수를 노출시키기 위해 각 뼈의 말단에서 epiphysis를 제거하십시오. 대퇴골은 양쪽 끝에서 절단되며, 각 관절의 바로 아래에 있습니다.
- 경골은 무릎 관절의 바로 위, 그리고 비골과의 교차점 바로 위의 하단에서 절단됩니다.
- 뼈에서 골수를 PBS로 플러시하고 50 mL 멸균 튜브에 수집하십시오.
- 10 mL 주사기를 10 mL의 PBS로 채우고 25 G x 0.5 x 16 mm 바늘에 부착한다. 이것은 하나의 마우스에서 모든 뼈를 플러시하기에 충분합니다.
- 바늘을 뼈의 골수강에 넣고 PBS 1-2 mL로 골수를 부드럽게 내뿜고 바늘을 뼈를 통해 위아래로 실행하여 모든 골수가 빠져 나오도록하십시오.
- 모든 뼈에 대해 반복하여 깨끗한 페트리 접시에 플러시 된 골수를 수집하십시오.
- 멸균 1 mL 주사기를 사용하여, 덩어리가 부서질 때까지 주사기 안팎으로 현탁액을 5-10회 그려서 골수를 분해한다.
- 분해된 골수를 1 mL 주사기에 모으고 70 μM 세포 스트레이너를 통해 깨끗한 50 mL 원심분리 튜브에 통과시킨다. 수집 된 골수를 얼음 위에 놓고 추가 샘플을 수집하십시오.
참고: 그림 1 - 파트 1 의 프로토콜 구성표를 참조하십시오.
2. BMDM의 선택, 차별화 및 자극
- 추후 사용을 위해 골수를 동결시키기 위해, 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 골수를 펠릿화하고, 5% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 함유하는 2 mL의 저독소 FBS에 재현탁시켰다.
- 골수 현탁액을 실온에서 5분 동안 1000 x g 에서 원심분리한다(RT). 피 - 빨간 펠릿이 형성 될 것입니다.
- 상층액을 버리십시오.
- 펠렛을 5% DMSO를 함유하는 저내독소 FBS 2 mL에 부드럽게 재현탁시키고, 장기 보관을 위해 기상 액체 질소로 옮기기 전에 밤새 -80°C에서 동결시킨다.
- 골수를 즉시 사용하려면 골수를 도금하기 전에 적혈구를 용해시킵니다.
- 골수 현탁액을 RT에서 5분 동안 1000 x g 에서 원심분리한다. 피 - 빨간 펠릿이 형성 될 것입니다.
- 펠렛을 3 mL의 1x 적혈구 용해 완충액에 재현탁시키고 5분 동안 RT에서 인큐베이션한다.
- PBS 10 mL를 첨가하고 RT에서 5분 동안 1000 x g 에서 원심분리한다.
- 단계 2.3.5로부터 계속하여 즉각적인 사용을 위해 세포를 플레이트한다.
- 대식세포를 해동시키고 세포를 펠릿화하기 전에 3 mL의 도금 매체에 재현탁시킨다.
- DMEM 준비: 5% 저독소 FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민 및 25 ng/mL M-CSF를 함유하는 F12.
참고: M-CSF 및 GM-CSF는 건조된 단백질을 0.1% 멸균 BSA를 함유하는 멸균수에 재현탁시켜 제조할 수 있으며, 분취량은 추후 사용을 위해 -80°C에서 동결시킬 수 있다. - 동결된 세포 현탁액을 37°C에서 빠르게 해동시킨다.
- 세포 현탁액(0.5 mL)을 제조된 DMEM:F12 배지 3 mL를 함유하는 깨끗하고 멸균된 튜브로 옮긴다.
- RT에서 5분 동안 1000 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다.
- 펠렛을 제조된 DMEM:F12 배지의 3 mL에 재현탁시킨다.
- 선호하는 방법으로 셀을 계산합니다.
- DMEM 준비: 5% 저독소 FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민 및 25 ng/mL M-CSF를 함유하는 F12.
- Day 0: 세포를 플레이트화한다.
- 세포를 DMEM의 비 TC 코팅 플라스틱 도자기에 플레이트 : 5 % 저독소 FBS, 1x 페니실린 / 스트렙토 마이신, L- 글루타민 및 25 ng / mL M-CSF.
참고: 대표적인 시딩 밀도는 표 1에 설명되어 있다. 한 마리의 마우스에서 나온 완전한 한 쌍의 다리는 15-20 백만 개의 전구체 세포를 제공합니다. - 세포를 5%CO2와 함께 37°C에서 인큐베이션한다.
- 세포를 DMEM의 비 TC 코팅 플라스틱 도자기에 플레이트 : 5 % 저독소 FBS, 1x 페니실린 / 스트렙토 마이신, L- 글루타민 및 25 ng / mL M-CSF.
- 5 일째 : 세포에 먹이를주십시오.
- DMEM의 원래 부피의 50%를 추가하여 세포에 먹이를 줍니다: 5% 낮은 내독소 FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민 및 50 ng/mL M-CSF를 함유하는 F12 배지.
- 6 일째 : GM-CSF로 세포를 자극하십시오.
- 준비된 GM-CSF를 50 ng/mL의 최종 농도로 세포의 세포 배양 배지에 직접 첨가한다.
- 미디어를 준비된 DMEM: F12로 교체합니다.
- 세포에서 모든 배지를 제거합니다.
- 세포를 미리 가온된 PBS로 간단히 세척한다.
- DMEM 추가: 2% 저독소 FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 25ng/mL M-CSF 및 50ng/mL GM-CSF를 포함하는 F12 배지.
- 단계 2.7.5-2.7.7에 설명된 자극을 사용하여 M0, M1, 또는 M2 표현형으로 대식세포를 활성화시킨다.
- M0 - 자극이 필요하지 않습니다. 세포를 배지에서 하룻밤 동안 배양한다.
- M1 - 하룻밤 사이에 100 ng/mL LPS 및 10 ng/mL IFNγ (최종 농도)로 세포를 자극하십시오.
- M2 - 하룻밤 사이에 100 ng/mL IL-4 (최종 농도)로 세포를 자극하십시오.
- 8 일째 : 세포를 수확하십시오.
- 세포로부터 배지를 제거한다(배지를 수집하고 하류 분석을 위해 -80°C에서 동결).
- 세포를 5분 동안 빙냉 PBS (배지 부피의 50%)에서 인큐베이션한다.
- 부드러운 긁기 또는 반복 피펫팅으로 플레이트에서 세포를 분리하십시오.
- 세포를 RT에서 5분 동안 2500 x g 에서 원심분리하여 펠릿화한다.
- 나중에 사용하기 위해 세포 펠렛을 -80°C에서 동결시킨다.
참고: 프로토콜 구성표 그림 1 - 파트 2를 참조하십시오.
Representative Results
대식세포, 아질산염 및 BH4 수준에서 이 프로토콜의 효율을 입증하기 전에 LCM의 10% 또는 재조합 M-CSF 및 GM-CSF만을 함유하는 FBS의 10%로 보충된 배지에서 평가하였다. 아질산염은 오랫동안 산화 질소 대사의 최종 산물로 간주되었지만 이제는 필요할 때 재활용 할 수있는 산화 질소의 생리 학적 저장으로 간주되어 종종 산화 질소 생체 이용률의 지표로 사용됩니다7. BH4는 NO 생산을 위한 NOS의 필수 보조인자입니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이, 10% FBS로 보충된 매체는 M-CSF/GM-CSF 또는 LCM에 관계없이 유사한 아질산염 수준을 가졌다. 그러나, 상이한 LCM 배치들 사이의 더 많은 가변성이 관찰되었다. 이 관찰은 BH4 측정에도 적용되었다. 실제로, LCM의 한 배치 (배치 #3)는 다른 두 개 (배치 # 1 및 # 2)보다 BH4 수준이 상당히 높았습니다. 더욱이, LCM 배치는 10% FBS 및 재조합 사이토카인으로 보충된 배지보다 상당히 더 많은 바이오프테린을 함유하였다. 배치 사이의 총 바이오프테린의 유의한 가변성이 또한 측정되었다. 이러한 결과는 LCM보다 M-CSF의 덜 가변적인 소스를 사용하는 것이 중요하다는 것을 입증한다.
또한 10 % FBS로 보충 된 미디어에는 FBS의 2 % 또는 5 %를 포함하는 미디어에 비해 훨씬 높은 수준의 아질산염이 포함되어 있습니다. 10%와 5% 사이의 차이는 BH4에 대해 매우 유의하였다(p<0.05). 그러나, 유사한 수준의 바이오프테린이 정량화되었다. 이에 비해 OptiMEM + 0.2 % BSA에는 아질산염과 BH4가 없어 매우 깨끗하고 적합한 매체가되었습니다. 그러나, 베일리 등(Bailey et al.)에 의해 기술된 바와 같이, 비록 OptiMEM이 대식세포를 자극할 때 하룻밤 사이에 한 번만 사용되는 것을 의미하지만, 기아에 의한 세포 사멸이 관찰되었다. DMEM: 이 문제를 극복하기 위해 FBS의 2%로 보충된 F12가 선택되었으며, 아질산염과 BH4 오염을 최소화하면서 건강한 세포를 얻기 위한 충분한 영양소를 함유하고 있습니다. 실제로, 일부 아질산염이 검출되었음에도 불구하고, 수준은 LPS/IFN 자극된 WT 대식세포(1 x 106 세포에 대해 30-80 μM; 데이터는 나타내지 않음)에 비해 무시할 수 있다(~0.2 μM).
실험 데이터, 새로운 BH4 결핍 마우스 모델로부터의 BMDM의 분리 및 특성화를 통해 이 개선된 프로토콜을 검증하기 위해 R26-CreERT2Gchfl/fl이 여기에 제시되어 있습니다. BH4는 GTP 사이클로가수분해효소 I(Gch1) 유전자에 의해 생산된다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, Gch1의 결핍은 BH4의 손실과 NO 및 후속적으로 아질산염의 소실로 이어지고, McNeill et al.8에 의해 이전에 입증된 바와 같이 산화 스트레스를 유발하는 수퍼옥사이드 음이온의 증가를 초래한다. 이 프로토콜은 이미 잘 정의되어 Gch fl/fl T2C 모델6,8과 같은 다른 Cre-system의 다른 BH4 결핍 대식세포를 배양하는 데 사용되었지만, R26-CreER T2 Gch fl/fl 모델은 타목시펜 처리 후 Gch1 유전자를 제거하기 위해 Cre-ERT2시스템의 조건부 활성화를 이용하기 때문에 독특합니다 (그림 3B, C). 이것은 다양한 시점에서 녹아웃과 비히클 대 타목시펜 처리의 형태로 내부 제어의 사용을 허용합니다. 이 예에서, 세포를 제1일 및 제3일에 비히클 (95% 에탄올) 또는 0.1/1.0 μM 4-OH 타목시펜으로 처리하였다 (비히클 및 타목시펜 스톡 모두 기존 배양 부피의 1 mL에 첨가하기 전에 배지에서 1:100으로 희석하였다).
도 3D에서 볼 수 있는 바와 같이, GTPCH 단백질은 R26-CreERT2Gch fl/fl 세포에서는 타목시펜 처리 후 폐지되지만 Gchfl/fl에서는 폐지되지 않는다. 중요한 것은 R26-CreERT2Gch fl/fl 및 Gchfl/fl 대조군 세포 모두 LPS/IFN 자극 후에도 여전히 iNOS를 생성할 수 있다는 것입니다(그림 3B,C). Gch1 유전자 발현의 이러한 변화와 GTPCH 단백질의 그로 인한 변경은 세포내 BH4 수준을 현저하게 교란시키고 아질산염의 생산을 감쇠시켰다. 도 4에 나타난 바와 같이, R26-CreERT2Gch fl/fl 마우스로부터 분리 및 배양된 BMDM은 타목시펜의 존재하에 대조군 GCH fl/fl 세포로부터의 BMDM에 비해 유의하게 감소된 BH4 생산 및 배지에서의 아질산염 축적 감소를 나타내었다. 유사하게, LCM 배지에서 배양된 동일한 세포 또한 폐지된 Gch1 발현을 나타냈다; 이들 세포는 여전히 4OH 타목시펜을 사용한 Gch1 발현의 녹아웃 후 상당한 양의 BH4 및 아질산염 둘 다를 생산하였지만, 아마도 BH4를 사용한 배지 및 FBS의 오염으로 인한 것일 수 있다. 이는 L-세포 함유 배지에서 세포를 배양하는 것에 걸친 새로운 방법의 명확한 개선을 나타낸다.
이 모델의 추가 특성화는 타목시펜의 상이한 농도에 이어 제8일째에 비활성화(M0) Gch fl/fl과R26-CreER T2Gchfl/fl BMDM 사이의 형태학에서 유의한 차이가 없음을 입증한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 두 모델 모두 길쭉한 사지를 갖는 둥근 형상으로 만들어진 유사한 양의 부착성 세포를 표시하며, 전형적으로 자극되지 않은 대식세포(9)의 특징이 예상된다.
종합하면, 이들 결과는 BMDMs의 분리 및 배양의 이러한 방법이 뮤린 대식세포의 배양에 적합한 순수한 세포 집단을 제공한다는 것을 입증한다. 이 방법은 일부 배지 제형에 존재하는 외인성 화합물의 간섭 없이 뮤린 대식세포의 배양을 허용한다.
도 1: BMDMs의 선택, 분화 및 자극을 위한 골수 세포 분리(파트 1)를 도시한 모식도(파트 2). (A) 멸균 조건 하에서, 해부된 다리는 70% 에탄올로 세척된 후 깨끗한 세균학적 페트리 접시에 놓인다. (B) 근육은 뼈를 따라 긁히는 포셉과 메스를 사용하여 조심스럽게 제거합니다. (C) 뼈의 사지가 잘려서 골수를 노출시킨다. (d) 바늘을 뼈의 내강에 삽입함으로써 PBS 10 mL로 채워진 10 mL 주사기를 사용하여 골수를 뼈로부터 플러싱한다. (E) 바늘이 뼈를 통해 위아래로 움직여 모든 골수가 빠져 나간다. 뼈는 페트리 접시에 수집 된 탈락 된 골수와 함께 그 단계에서 흰색과 선명하게 나타나야합니다. (F-G) 모든 뼈에 대해 반복하고, 분해된 골수를 1 mL 주사기에 수집하고, 이를 깨끗한 50 mL 원심분리 튜브 내로 70 μm 세포 스트레이너를 통해 통과시킨다. 나중에 사용할 수 있도록 동결 배지에서 세포를 아래로 회전시키고 재현탁하십시오. 파트 2는 BMDM의 선택, 차별화 및 자극을 보여줍니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: DMEM에서의 아질산염 및 BH4 수준: F12 + GM-CSF + M-CSF 또는 DMEM: F12+ L 세포 배지. (a) 상이한 매질에서의 아질산염 수준은 Griess Assay 방법을 사용하여 측정하였다. (b) BH4 및 바이오프테린 수준을 BH4 표준을 사용한 HPLC 정량화에 의해 상이한 배지에서 측정하였다. 데이터는 SD± 평균(n=3)으로 표현된다. 데이터는 다중 비교에 의해 단방향 ANOVA를 사용하여 분석되었다. 기호는 그룹 간의 p < 0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: R26CreERT2 모델 도입 . (A) 반응식은 산화환원 생물학에서 NOS 보조인자로서의 BH4의 역할을 예시한다. (b) 이 뮤린 모델에서 loxP 부위의 측면 및 타목시펜을 사용한 Cre-ERT2의 조건부 활성화로 인한 Gch1에서 임계 엑손 (2 및 3)의 절제를 상세히 기술하는 개략도. (c) BMDM이 타목시펜으로 처리될 때 임계 엑손의 절제를 입증하는 PCR(n=3개의 독립적인 동물을 대표함). WT 마우스는 1030 bp PCR 산물을 생산하고, Cre의 존재하에, 1392 bp 생성물이 생성되어, 임계 엑손의 절제를 확인한다. (d) iNOS, GCH, 및 B-튜불린의 면역블롯 (n=3개의 독립적인 동물을 대표함). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대식세포에서 BH4 결핍의 특성화. (A, B) qRT-PCR은 타목시펜으로 처리된 R26-CreERT2Gchfl/fl 모델에서 Gch1 발현의 손실을 확인한다. 파란색 = 새로운 MCSF 방법, 녹색 = 고전적인 LCM 방법. (C,D) HPLC에 의한 세포내 BH4의 분석은 0.1 μM 및 1.0 μM이 BH4 수준을 유의하게 감소시키기에 충분하다는 것을 밝혀낸다. (E, F) Griess 분석을 사용하여 배지에서 아질산염을 측정하면 자극되지 않은 BMDM은 검출 가능한 수준의 아질산염을 생성하지 않는 반면, Gch fl/ fl 및 R26-CreERT2Gchfl / fl BMDM은 LPS / IFNγ가있는 상태에서 아질산염을 생성합니다. 유의하게도, R26-CreERT2Gchfl/fl의 타목시펜 처리는 자극된 BMDM에서 아질산염 수준을 유의하게 감소시킨다. 데이터는 SD에 ±대한 (n=3)의 평균으로 표현된다. 데이터는 다중 비교에 의해 단방향 ANOVA를 사용하여 분석되었다. 기호는 그룹 간의 p < 0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: BMDMs 형태학의 비교. 타목시펜의 다양한 처리로 제8일째에 BMDMs의 광학 현미경으로 얻은 사진. 배율이 이미지에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 문화 요리 | 미디어 볼륨 | 시드 밀도 |
| 12 웰 요리 | 1 mL | 500,000개 셀 |
| 6 웰 요리 | 2 mL | 1,000,000개 셀 |
| 100 mm 접시 | 10 mL | 3,000,000개 셀 |
| 75cm2 플라스크 | 15 mL | 5,000,000개 셀 |
표 1: 대표적인 시딩 밀도.
Discussion
이 BH4- 및 NO-결핍 BMDMs 배양 프로토콜은 테트라하이드로바이오프테린(BH4) 및 기타 간섭 아티팩트의 환원을 통해 일차 대식세포에서 NO-산화환원 생물학을 조사하기 위해 설계되었으며, 이러한 실험 모델로부터 얻은 결과의 신뢰성 및 재현성을 향상시키는 것을 목표로 한다.
중요한 단계에는 올바른 플라스틱 제품을 사용하는 것이 포함됩니다. 대식세포 전구세포는 부착성 세포이며 매우 끈적적거리고; 따라서 비조직 배양 (TC) 처리 플레이트의 사용은 다른 전구 세포로부터 그들을 선택하고 분리하는 데 결정적이며, 그렇지 않으면 부착하고 순도를 감소시킬 수 있습니다. 수확 당일에, 플레이트에서 대식세포를 분리하는 것은 얼음처럼 차가운 PBS를 필요로 하지만, EDTA 또는 심지어 세포를 매우 부드럽게 긁어내는 것은 다운스트림 적용(예를 들어, 용해 대 살아있는 세포 실험)에 따라 수행될 수 있다. 오염과 관련하여 특별한주의를 기울여야합니다. 골수를 내뿜는 동안 남은 모피와 피부의 박테리아 또는 바이러스 입자와의 잠재적 인 교차 오염이 발생할 수 있습니다. 그런 다음 가능한 한 조심하고 멸균하는 것이 필수적입니다. 따라서 해부 된 다리를 70 % 에탄올에 몇 분 동안 떨어 뜨리는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 대식세포를 성장시키면서 항생제를 사용하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜의 또 다른 한계는 Day 0에서의 셀 도금 밀도로부터 발생한다. 플러시 된 골수는 다양한 세포를 함유하고 있으며, 이는 잘못 계산되어 대식세포 전구 인자로 포함될 수 있으므로 잘못된 총 세포 수를 유발합니다. 후속 및 잠재적 변동성을 피하기 위해, 단리된 대식세포는 제7일에 따뜻한 PBS를 사용하여 부드럽게 플러싱될 수 있고, 부착을 허용하도록 자극 전에 적어도 1시간 전에 2%FBS DMEM:F12에서 정확한 밀도로 재플레이팅될 수 있다.
마지막으로, 성장한 대식세포의 배지를 사용하는 Griess 분석법에 의해 아질산염 수준을 확인하는 것은 데이터를 분석하는 데 필수적입니다. 더하기 측면에서,이 분석은 빠르고 저렴하게 수행 할 수 있습니다.
본원에 입증된 바와 같이, 이러한 맞춤형 프로토콜은 L-세포 컨디셔닝 배지(LCM)를 사용하여 대식세포를 단리하고 육성하는데 사용되는 보다 일반적인 프로토콜에 대한 보다 정의되고 개선된 대안이다. 실제로, NO-산화 환원 생물학을 연구 할 때 LCM을 사용하는 주요 관심사 중 하나는 상당한 양의 바이오 프테린이 검출되어 잠재적 인 대사 변화10을 유도한다는 것입니다. 예를 들어, 외인성 BH4는 결핍 된 모델을 신속하게 보충하고 iNOS의 보조 인자 역할을하여 원치 않는 산화 질소 생산을 유도 할 수 있습니다. LCM을 사용하는 또 다른 단점은 LCM이 L-929 세포에 의해 직접 분비되는 콜로니 자극 인자, 사이토카인 및 기타 부산물의 혼합물이며, 이는 모두 대식세포 생리학에 영향을 미칠 수있다6. 대식세포 증식 및 생존에 필수적인 M-CSF에서의 큰 공급에도 불구하고, 배치에서 배치로의 각 성분의 변화는 실험 전반에 걸쳐 변동성의 위험을 증가시킨다.
두 가지 문제를 해결하기 위해, 이 새로운 프로토콜은 정제된 M-CSF 및 GM-CSF의 조절된 양이 첨가되는 낮은 수준의 바이오프테린을 함유하는 잘 정의된 DMEM: F12 배지를 사용한다. 두 사이토카인 모두 대식세포의 분화와 성장을 돕는다. M-CSF는 특히 조혈모세포의 대식세포11로의 분화를 보장함으로써 골수 전구 세포로부터 BMDMs의 생성을 유도한다. 또한, GM-CSF는 자극 전에 첨가될 때 염증성 사이토카인 및 NO 생산을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 NO-레독스 생물학12,13을 연구할 때 실질적인 이점이다.
이 새로운 방법이 다루는 또 다른 주요 요인은 FBS의 것으로, 일반적으로 세포의 건강과 성장에 필수적인 영양소의 원천으로 사용됩니다. LCM과 유사하게, FBS는 상당한 수준의 바이오프테린을 함유하고 있다. 자극 전에 세포의 완전한 혈청 기아가 처음에 OptiMEM + 0.2% BSA를 사용하여 고려되었지만, 대식세포는 분리의 징후를 보였으며, 이는 Bailey et al.6에 의해 기술된 바와 같이 감소된 세포 생존율을 나타낸다. 그러나, 대식세포가 혈청에 대한 절대적인 요구조건을 입증함에 따라, 바이오웨스트로부터의 초저 내독소 FBS가 선택되었다. 배치는 바이오프테린에 대해 테스트되고 대량 구매 전에 사전 선택되어 신뢰할 수 있고 잘 정의 된 공급을 보장했습니다. 바이오 프테린의 오염 소스를 줄이기위한 목적으로 더 나아가기 위해 FBS의 농도 감소가 테스트되었습니다. 세포 배양에 일반적으로 사용되는 10% 혈청을 사용하는 대신에, FBS 수준은 골수를 대식세포로 7-일 동안 5%로 유지하고, 마지막 날에 밤새 자극하는 동안 2%로 더 감소된다. 이것은 검출 된 바이오 프테린의 무시할 수있는 수준을 보장하지만 대식세포의 건강과 순응을위한 충분한 영양소를 보장합니다. 재조합 M-CSF를 이용한 이러한 새롭게 최적화된 프로토콜이 일차 대식세포의 배양 및 활성화를 위한 보다 제어된 환경을 초래하지만, 주된 한계는 이 방법이 LCM 방법을 사용하는 것보다 더 비싸다는 것이다.
이 모든 요소를 고려하여 두 가지 방법을 직접 비교했습니다. 중요하게도, 재조합 M-CSF 및 GM-CSF를 사용하여 본원에 제시된 새롭게 변형된 프로토콜은 배지가 BH4를 오염시키지 않는 보다 재현성 있는 시스템을 초래하였다. 이것의 효과는 두 가지였습니다. BH4 결핍 세포는 진정으로 BH4가 결여되었고, 이는 LPS로 M1 상태로 자극한 후 배지에서 검출가능한 아질산염 축적을 최소화하는 결과를 가져왔다. 이는 LCM에서 배양된 동일한 BMDM 세포와는 대조적이었으며, 여기서 유의한 BH4 및 아질산염이 검출되었다.
결론적으로,이 방법의 강점은 대식세포에서 NO 및 산화 환원 신호전달에 영향을 줄 수있는 각 매개 변수를 철저히 평가하여 바이오 프테린 수준을 제어하려는 노력에 있습니다. 특히, 이는 NO-산화환원 생물학 분야에서 최대의 재현성과 표준화를 보장한다.
Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 M.J..C. (FS / 14 / 56 / 31049), British Heart Foundation Programme 보조금 (RG / 17 / 10 / 32859 및 RG / 12 / 5 / 29576), Wellcome Trust (090532 / Z / 09 / Z) 및 NIH Research (NIHR) Oxford Biomedical Research Centre에 수여 된 British Heart Foundation Intermediate Fellowship의 지원을 받았습니다. 저자는 또한 옥스포드 BHF 연구 우수 센터 (RE / 13 / 1 / 30181 및 RE / 18 / 3 / 34214)의 지원을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | 1mL 6% LUER syringe |
| 10 mL plastic syringe | Fisher scientific | 14955453 | |
| 6 well plate sterile non-treated | CytoOne | CC7672-7506 | Flat bottom |
| DMEM/F-12 (1:1) (1x) | Gibco, Life Technologies | 21331-020 | |
| DMSO sterile | Sigma-aldrich | D2650-100ML | |
| Easy flask 260 mL | Thermo Scientific | 156800 | |
| L-Glutamine Solution 200 mM | Sigma-aldrich | G7513-100ML | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-aldrich | L4391-1MG | |
| Mutlidish 12 sterile non-treated | Thermo Scientific | 150200 | Flat bottom |
| Needle 25G, 0.5 x 16 mm | BD Microlance 3 | 300600 | |
| PBS (pH7.4, 1x) | Gibco, Life Technologies | 10010-015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-aldrich | P0781-100ML | |
| petri dish 100 x15 mm sterile | Falcon, Corning incorporated | 351029 | |
| Recombinant murine GM-CSF | PEPROTECH | 315-03 | |
| Recombinant murine IFN-γ | PEPROTECH | 315-05 | |
| Recombinant murine M-CSF | PEPROTECH | 315-02 | |
| Scalpel n23 | Swann-Morton | 0510 | |
| Ultra-low endotoxin FBS | Biowest | S1860-500 | |
| VWR cell strainers 70 µm nylon | VWR | 732-2758 |
References
- Zajd, C. M., et al. Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used. Frontiers in Immunology. 11, 269 (2020).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Zhao, Y. L., et al. Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow. Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).
- Nasser, H., et al. Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages. Cell Death Discovery. 6, 63 (2020).
- Stanley, E. R., Heard, P. M. Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells. Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
- Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
- McNeill, E., et al. Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Bailey, J. D., et al. Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation. Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).
- Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization. Frontiers in Immunology. 5, 554 (2014).
- Na, Y. R., et al. GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism. Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).
- Sorgi, C. A., et al. GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands. PLoS One. 7 (7), 40523 (2012).
