Summary
啮齿动物无法报告偏头痛症状。在这里，我们描述了一种可管理的测试范例（光/暗和开放场测定）来测量光厌恶，这是偏头痛患者最常见和最麻烦的症状之一。
Abstract
偏头痛是一种复杂的神经系统疾病，其特征是头痛和感觉异常，例如对光过敏，被观察到为畏光。虽然不可能确认小鼠正在经历偏头痛，但光厌恶可以用作畏光偏头痛症状的行为替代品。为了测试光厌恶，我们利用光/暗测定来测量小鼠自由选择在光明或黑暗环境中度过的时间。通过引入两个关键的修改来完善该测定：在运行测试程序之前预先暴露到腔室和可调节的腔室照明，允许使用从55勒克斯到27，000勒克斯的光强度范围。因为选择在黑暗中花更多时间也表明焦虑，所以我们也利用一种与光无关的焦虑测试，即开放场测定，来区分焦虑和光厌恶行为。在这里，我们描述了用于明场/暗场和开放场测定的改进测试范例。描述了这些测定在两种小鼠品系中腹腔内注射降钙素基因相关肽（CGRP）和光遗传学脑刺激研究的应用。
Introduction
偏头痛是一种普遍存在的神经系统疾病，影响约 17% 的美国人1 ，是全球第二大残疾原因2，3。患者会出现持续 4-72 小时的头痛，并伴有以下至少一种症状：恶心和/或呕吐，或畏光和恐音4。目前FDA批准的降钙素基因相关肽（CGRP）抗体的开发进展已经开始了偏头痛治疗的新时代5，6，7。这些抗体可阻断 CGRP 或其受体，并预防约 50% 偏头痛患者的偏头痛症状7。在过去的一年中，CGRP受体的两种小分子拮抗剂也被FDA批准用于远头痛的流产治疗，还有两种正在筹备中8。尽管取得了这种治疗进展，但偏头痛发作发生的机制仍然难以捉摸。例如，CGRP 操作的站点是未知的。不能明显穿过血脑屏障的治疗性抗体的功效表明CGRP作用于外周部位，例如脑膜和/或三叉神经节。然而，我们不能排除脑室外器官的中枢作用，这些器官缺乏血脑屏障9。至少对于畏光症，我们认为这不太可能，因为我们的结果是使用转基因巢蛋白/ hRAMP1小鼠的光厌恶，其中hRAMP1在神经组织中过度表达10。了解偏头痛病理生理学的机制将为偏头痛治疗药物的发展提供新的途径。
临床前动物模型对于了解疾病机制和新药开发至关重要。然而，动物的偏头痛评估具有挑战性，因为动物不能口头报告它们的疼痛感。鉴于 80-90% 的偏头痛患者表现出畏光11，在动物模型中，光厌恶被认为是偏头痛的指标。这导致需要开发一种测定方法来评估小鼠的光厌恶。
浅色/暗度测定包含一个亮区和一个暗区。它被广泛用于测量小鼠的焦虑，基于它们对新环境的自发探索，而它们对光的天生厌恶12。一些研究将房间的1/3设置为暗区，而另一些研究则将室的1/2设置为暗区。前一种设置通常用于检测焦虑13。虽然我们最初选择了大小相等的明暗室，但我们没有比较两种相对大小。我们可以评论说，两个腔室的整体尺寸并不是一个主要因素，因为最初的测试盒14 比随后的设备15大得多，但结果基本上是相同的。
对这种光/暗测定法的两个关键修改是评估光厌恶：测试条件和光强度（图1）。首先，将小鼠预先暴露于明/暗室以减少探索性驱动16 （图1A）。预暴露的必要性和时间取决于小鼠品系和模型。野生型C57BL / 6J小鼠通常需要两次预暴露10，而CD1小鼠只需一次预暴露就足够了17。通过这种方式，可以在这两种小鼠品系中揭开光厌恶行为的掩盖。其次，腔室照明已经过调整，包括从昏暗（55勒克斯）到明亮（27，000勒克斯）的可调节光强度范围，其中55勒克斯相当于黑暗的阴天，27，000勒克斯相当于阴凉处的晴天10。我们发现所需的光强度随菌株和遗传模型而变化。因此，个人应首先评估其实验范式的最小光强度。
即使对测定进行这些修改，可以揭示光厌恶表型，也有必要测试焦虑样行为，以区分仅由于光和由于焦虑引起的光厌恶。露天田间测定是基于对新环境的自发探索来测量焦虑的传统方法。它与光/暗测定的不同之处在于，探索性驱动力被对未受保护的开放空间的天生厌恶所抵消。腔室的中心和边缘都在光中，因此开放场测定是一种与光无关的焦虑测定。因此，光/暗和开放场测定的结合使我们能够区分由于避免光而引起的光厌恶与焦虑的整体增加。
CGRP 是一种多功能神经肽，可调节血管舒张、伤害感受和炎症18。它在周围和中枢神经系统中广泛表达。它在偏头痛病理生理学中起重要作用18。然而，偏头痛中CGRP作用的机制尚不清楚。通过利用这种改进的测试范式的亮/暗和开放场测定，我们能够在外周10，16（图2）和central14，15，16，19 CGRP给药后鉴定小鼠的光厌恶行为。除神经肽外，识别与光厌恶有关的大脑区域对于理解偏头痛病理生理学也很重要。丘脑后核是用于疼痛和光处理的脑部综合区域19，丘脑在偏头痛期间被激活20。因此，我们通过将含有通道视紫红质-2（ChR2）或eYFP的腺相关病毒（AAV）注射到该区域来靶向丘脑后核。通过将这种光遗传学方法与这两种测定相结合，我们证明了对丘脑后核中表达ChR2的神经元的光学刺激诱导了光厌恶19（图3）。在这个实验中，考虑到这些光遗传学操纵的小鼠对诱发的光厌恶的显着影响，跳过了对腔室的预暴露。
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Protocol
动物程序由爱荷华大学动物护理和使用委员会批准，并按照美国国立卫生研究院制定的标准进行。
1. 光/暗分析
- 亮/暗室装置（见 材料表）设置。本节中的所有设备均为市售设备。
- 在搁板上，放置声音衰减隔间（内部：59.7 x 38 x 35.6 厘米，宽 x 高 x 深），其中包含一个拉出式抽屉，便于进入腔室和深色插件。
- 将直流电源和直流稳压电源连接到声音衰减隔间。
- 将透明的无缝开放式场地腔室（长 x 宽 x 高 27.31 x 20.32 厘米）放在隔间的拉出式抽屉上。
- 将黑色红外 （IR） 透明塑料深色嵌件（长 x 宽 x 高 28.7 X 15 X 20.6 厘米）放入开放式现场腔室中。确保将腔室分为两个大小相等的区域：暗区和亮区。
- 通过电缆将开放式现场腔室 X、Y 和 Z 轴上的三组 16 波束红外阵列连接到红外 USB 控制器。
- 将红外 USB 控制器连接到计算机。
- 在计算机上安装跟踪软件，该软件可以记录和收集鼠标的位置和活动。
- 对于照明面板设置，首先从其原始外壳中取出发光二极管（LED）灯面板（长27.70 x 27.70厘米;360个LED，日光平衡颜色，5600K，60°泛光光束扩散）。
- 将灯面板与 LED 驱动器、散热器和电源组装在一起。多个LED灯面板可以连接到一个电源，散热器和LED驱动器，以实现均匀的光面板控制。
- 构建一个定制的亚克力平台（长x宽x高29.77 x 27.70 x 8.10厘米），由7个相同的搁板组成，间隔为0.53厘米（图1B）。将定制的亚克力搁板永久固定在房间上方隔间内的天花板上。
- 将 LED 指示灯面板插入底部两个托架之间的插槽中。如有必要，将灯板调整到不同的高度（图1B，C），例如，如果使用光遗传学小鼠。细节在第 3 节中讨论）。
- 打开散热器、LED 驱动器和电源。确认 LED 驱动器可以通过测量房间地板上的光强度来指示 LED 灯强度，并确认地板是否均匀点亮。
- 行为测试程序
注意：将小鼠置于12小时的光周期中。所有行为实验都是在光周期期间进行的。使用小鼠，包括10-20周龄的雄性和雌性。在该协议中，幼稚的野生型CD1和C57BL / 6J小鼠经历两次预暴露于明/暗室，然后进行治疗和治疗后暴露。每次暴露之间有三天的间隔，以使小鼠恢复（第1天，第4天，第7天和第10天，如下所述， 图1A）。然而，CD1小鼠不需要第二次 预暴露，可以在昏暗的光线下进行测试。- 在第1天（预处理1），打开明暗检测设备并将光强度设置为27，000勒克斯。
- 打开跟踪软件并设置新协议。在 “新建协议” 设置中，将 “持续时间” 设置为 30 分钟。在 “新建分析 ”设置中，将 “按持续时间划分的数据箱 ”设置为 300 秒。
- 在 “新建区域”设置中 ，选择 “预定义区域”。选择 2 ，然后选择 水平。检查腔室是否水平分为两个大小相等的区域以进行记录。
- 在测试前将小鼠习惯到测试室1小时。在习惯期间，保持房间灯亮着，以免扰乱小鼠的昼夜节律。确保用于光/暗分析的所有设备都已打开，使小鼠完全适应测试室环境。
- 选择“ 获取数据”。输入鼠标 ID。启动协议。
- 将抽屉拉出声音衰减隔间外，以进入亮/暗室和深色插件。轻轻地拿起尾巴底部的鼠标，将其放在腔室的光照区域，然后将抽屉推入隔间内。确保软件立即检测到鼠标并开始记录活动。
- 等待录制在30分钟后自动停止。将鼠标放回其家庭笼子。
- 使用含有55.0%异丙醇，0.25%烷基C12-18二甲基乙基苄基铵和0.25%烷基C12-18二甲基苄基氯化铵的醇味杀菌一次性湿巾清洁腔室和深色插入物作为抗菌活性成分，以消除先前小鼠留下的任何嗅觉线索。
- 在第4天（预处理2），重复步骤1.2.1至1.2.8。
- 在第7天（治疗日），重复步骤1.2.1和1.2.4。习惯化后，施用CGRP（0.1mg / kg，基于小鼠体重的10μl/ g，腹膜内注射（ip）），将小鼠的头部向前倾斜并在右下象限注射。将鼠标放回家庭笼子。
- 30分钟后，启动实验方案，并按照步骤1.2.5至1.2.7所述在明暗室中运行鼠标。注射后家用笼子的恢复时间可以缩短或延长，具体取决于治疗方案21。
- 按照步骤1.2.8中所述清洁腔室和深色插入物。
- 在第10天（治疗后一天），重复步骤1.2.1至1.2.8。在开始露天测定之前，实验可以在步骤1.2.13处暂停。
2. 露天检测
- 设备设置
- 开放式现场腔室设置：使用与亮/暗分析中使用的相同声衰减隔间和开放式现场腔室，而无需使用深色插入物。
- 浅色面板设置：使用与亮/暗分析中使用的相同设置。确保光强度与光/暗分析中使用的光强度相同。
- 行为测试程序
- 打开设备。将光强度设置为 27，000 勒克斯。
- 打开跟踪软件。
- 设置新方案，与亮/暗分析中使用的方案相同，但新区域设置除外。选择 1，然后选择“新建区域”设置中的“中心”。将外围设置为距周长 3.97 厘米，中心设置为距周边 19.05 × 19.05 厘米。
- 按照步骤1.2.4中所述将小鼠习惯到测试室。
- 给予CGRP（0.1mg / kg，10μl / g，基于小鼠体重，ip），将小鼠头部向前倾斜并在右下象限注射。将鼠标放回家庭笼子。
- 30分钟后，启动实验方案。将拉出式抽屉拉出到声音衰减隔间外，轻轻地将鼠标放在打开的场室中间。将抽屉推入隔间内。
- 跟踪行为 30 分钟。然后将老鼠放回家笼。
- 按照步骤1.2.8中所述清洁设备。
3. 光遗传学小鼠的改良光/暗检测
- 设备设置
- 对深色插入件进行两次修改。
- 将深色刀片的开口修改为 5.08 x 5.08 cm（宽 x 高），顶部和深色刀片开口之间有一个 0.95 x 10.16 cm （W X H） 的小狭缝（图 1D 左上角）。
注意：此修改允许鼠标在将鼠标头上的光纤套管连接到跳线时毫无困难地进入暗区。 - 将深色嵌件的顶部延伸到浅色区域，作为三角形门廊（H = 6.5厘米）（图1D 右上角和左下角）。从门廊上切出一个圆形孔（D = 1.7厘米），并将支架插入孔中以放置和稳定旋转接头，该接头连接激光器和光纤跳线（图1D 左上角和左下角）。
注意：修改后到达暗区底部的光强度变化很小（修改后为17勒克斯，而未经修改的光强度为14勒克斯，在27，000勒克斯下在暗区的右后角测量）。
- 将深色刀片的开口修改为 5.08 x 5.08 cm（宽 x 高），顶部和深色刀片开口之间有一个 0.95 x 10.16 cm （W X H） 的小狭缝（图 1D 左上角）。
- 将旋转接头插入深色插件上的支架。
- 将 30.5 cm 光纤跳线连接到旋转接头。确认旋转接头可以平稳旋转，以便当鼠标穿过腔室时，跳线可以毫无困难地旋转。
- 对于设置的其余部分，请使用与第1部分（亮/暗测定）中使用的相同装置。
- 对深色插入件进行两次修改。
- 行为测试程序
注意：与野生型小鼠不同，光遗传学小鼠不接受预暴露（预处理1和2）。- 在测试当天，将LED灯面板插入第二低的插槽（距离外倾角地板28.23厘米），以留出连接跳线的空间。打开亮/暗检测设备，将光强度设置为55勒克斯。
- 使用与 1.2.2 和 1.2.3 中相同的协议设置，只是在“新建分析”设置中将“数据箱按持续时间”设置为 60 秒，以便与步骤 3.2.3 中的激光刺激协议一致。
- 打开激光电源按钮。将激光脉冲控制器设置为刺激1分钟，然后在30分钟内刺激1分钟。
- 在测试之前，将小鼠习惯在开灯的情况下将小鼠带到测试室1小时。
- 启动协议。将拉出式抽屉拉出到声音衰减隔间外，以进入亮/暗室和深色插件。
- 轻轻地约束鼠标，并通过配接套将鼠标头上的光纤插管耦合到光纤跳线（图1D 右下角）。将鼠标轻轻放在光照区，然后将抽屉推入隔间内。确保协议将开始自动记录鼠标行为。
- 1 分钟后，打开脉冲控制器，然后将故障安全键转为 ON。确保每隔一分钟对目标大脑区域进行激光刺激。
- 30 分钟后，当协议自动停止时，将故障安全键设置为 OFF。然后关闭脉冲控制器。
- 断开鼠标和光纤跳线的耦合。将鼠标放回家庭笼子。
- 按照步骤1.2.8中所述清洁腔室和深色插入物。
4. 光遗传学小鼠的改良开放场测定
- 设备设置
- 使用支架和夹具将旋转接头稳定在腔室上方（图1E）。
- 将长度为 50 cm 的光纤跳线连接到旋转接头。检查旋转接头是否可以平稳旋转。
- 将旋转接头设置到支架上适当的高度：确保光纤跳线只能刚好到达腔室的每个角落，这将有助于避免对鼠标移动的任何干扰。
- 对于设置的其余部分，使用与第1部分（浅/暗测定）相同的设备设置，但没有深色插入物。
- 行为测试程序
- 打开亮/暗检测设备，将光强度设置为55勒克斯。
- 使用与修改后的明暗检测（第3节）相同的实验方案设置，但“新区域”设置除外。在新区域设置中选择 1 个“由中心跟随”。将外围设置为距周长 3.97 厘米，中心设置为距周边 19.05 × 19.05 厘米。
- 打开激光电源按钮。设置激光脉冲控制器刺激1分钟，然后在30分钟内刺激1分钟。
- 按照步骤3.2.4至3.2.10中所述执行习惯化和其余测试，除了对步骤3.2.6的两次更改：将鼠标轻轻地放在腔室的中间而不是光区;将拉出式抽屉保持在隔间外，因为跳线连接到鼠标头。
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Representative Results
此行为测试范例旨在测试光厌恶行为。它可以使用幼稚的野生型小鼠和光遗传学小鼠进行，以在刺激目标神经元群体期间实时研究光厌恶。
该程序已用于研究CD1和C57BL / 6J小鼠10，16的外周CGRP治疗以及C57BL / 6J小鼠19中丘脑后核神经元的光学刺激对光厌恶行为的影响。实验中使用小鼠，包括10-20周龄的雄性和雌性（图2A，图2B-D和图3）。结果显示，在CD1（图2A）和C57BL / 6J（图2B）小鼠的明暗测定中，i.p.注射CGRP显着降低了在光区花费的时间，但不影响小鼠在CD1（数据未显示）和C57BL / 6J小鼠（图2D）的开放野外测定中在中心花费的时间10，16.这表明外周CGRP会诱发光厌恶，但不会引起一般焦虑。用CGRP治疗还增加了CD1（数据未显示）和C57BL / 6J小鼠在黑暗区域而不是在光区休息的小鼠的时间（图2C）。
对于光遗传学方案，我们通过注射AAV2-CaMKIIa-hChR2（E123A）-eYFP或对照病毒AAV2-CaMKIIa-eYFP19，靶向丘脑后核中表达钙调蛋白激酶II α（CaMKIIa）的神经元。同时，在丘脑后核中植入光纤套管。注射后三周，为了给ChR2表达留出足够的时间，我们对丘脑后核中的神经元进行了光学刺激，并注意到与对照病毒注射小鼠（eYFP）相比，ChR2注射小鼠在明暗测定中在光区中度过的小鼠持续时间相应减少（图3A）。ChR2和对照eYFP小鼠在开放场测定的中心时间没有显着差异（图3C），表明光厌恶反应不仅仅是由焦虑驱动的19。此外，还注意到暗区的静息时间增加，但光区不增加（图3B）。当使用55勒克斯和27，000勒克斯时，获得了相同的结果（图3）。包括55勒克斯手术，因为偏头痛患者甚至对昏暗的光线也很敏感。
图1：光/暗测定时间表和设备。 （A）测试范例的时间轴：在两次预暴露于明/暗室（前1和前2）后，给予小鼠CGRP（0.1mg / kg，ip.），然后进行治疗后测量（后）。在光/暗测定后至少一天，再次给予小鼠CGRP（0.1mg / kg，ip）并在露天试验中运行。预处理：预处理;Tx：治疗;帖子：后处理（B）LED面板由亚克力搁板固定在腔室顶部，照亮测试区域。灯面板的高度可以通过使用不同高度的插槽来调节。（C）明暗室包含一个带有小开口的深色嵌件。LED灯面板位于腔室上方。（D） 修改后的深色插入物的正面、侧面和顶部视图。深色嵌件的开口用一个小切口延伸，用于移动跳线（左上角）。深色嵌件的顶部延伸到浅色区域，作为三角形门廊，带有用于旋转接头的支架（右上角和左下角）。光纤跳线通过配接套管（右下角）连接到光纤插管。（E）改良的开放场测定。支架和夹具固定旋转接头。将腔室拉出到隔间的前面，门保持打开状态，以允许鼠标自由移动，并将跳线连接到鼠标头上。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：外周CGRP给药在两种野生型小鼠品系的强光下唤起对光的厌恶。 根据 图1A中描述的时间表测试CD1和C57 / BL6J小鼠。（A）CD1小鼠在光区每5分钟间隔超过30分钟（27，000勒克斯）的时间。光照数据中的时间在测试期间随时间变化（左图）显示为单个小鼠每5分钟间隔的平均时间（右图）。在每个时间点对车辆和CGRP进行了比较，并在Tx和Pre2或Post之间进行了比较，如括号所示。 （Veh， n=19; 0.1 mg/kg CGRP， n=19）（B）C57BL / 6J小鼠在光区中度过的时间每5分钟间隔超过30分钟（27，000勒克斯）。在测试期间，光照数据随时间变化（左图）和单个小鼠每5分钟间隔的平均时间（右图）显示（Veh，n = 42;0.1 mg / kg CGRP，n = 44）。（C）还分析了来自图B的小鼠在明/暗测定期间在黑暗和浅色区域的休息行为。（D）随后在开放场测定中对来自B组的小鼠进行测试。在用载体或CGRP治疗后30分钟内每5分钟间隔在腔室中心花费的时间百分比（0.1mg / kg，ip.（Veh， n=9; 0.1 mg/kg CGRP， n=9）。中心数据中的时间百分比在测试期间随时间的变化而显示（左图），并显示为单个小鼠每5分钟间隔在中心时间的平均百分比（右图）。对于所有面板，都会显示均值±SEM，显示 *p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。此数字由 Mason 等人 201710 修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：在丘脑后核中表达CaMKIIa的神经元的光学刺激在昏暗和明亮的光线下都会引起光的厌恶。 （A）注射编码ChR2或eYFP的AAV的C57BL / 6J小鼠的后丘脑核（在55勒克斯时：eYFP n = 8，ChR2 n = 11;在27，000勒克斯时：eYFP n = 12，ChR2 n = 18）被蓝色激光（473 nm， 20 赫兹，5 毫秒脉冲宽度，10 毫瓦/毫米2）。左图显示了小鼠在55或27，000勒克斯下每5分钟间隔30分钟内在光区停留的时间。在每个时间点对eYFP组和ChR2组进行了比较。右图显示了单个小鼠每5分钟间隔的平均时间。（B）在浅/暗测定过程中，还分析了来自图A的小鼠在浅色（左图）和深色（右图）区域的静息行为。（C）随后在开放现场测定中对来自A组的小鼠进行测试。在30分钟内，每5分钟间隔在开放场室中心花费的平均时间百分比（激光：473nm，20 Hz，5 ms脉冲宽度，10 mW / mm2）。（eYFP n = 8，ChR2 n = 9）。对于所有面板，将显示均值±SEM，显示 *p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。此数字由 Sowers 等人于 202019 年修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
浅/暗检测广泛用于评估焦虑样行为12。该测定依赖于小鼠对光的先天厌恶以及当放置在新环境（光区）中时探索的驱动力。然而，正如我们在这里报道的那样，这种测定也可用于评估光厌恶行为。
在测试之前考虑预先暴露的数量和必要性至关重要。这取决于小鼠品系或型号。例如，在我们的光/暗测定方案中，朴素野生型CD1和C57BL / 6J小鼠在进行治疗测试程序之前预先暴露于明/暗室两次，而光遗传学小鼠不进行预暴露。最近的一篇出版物报道说，一次预暴露足以让CD1小鼠在ip CGRP给药后表现出光厌恶17。因此，当治疗日到达时，新颖性参数的重要性将降低10，16。预暴露可以通过减少探索驱动力来揭示光厌恶表型，从而改变探索和厌恶之间的平衡。在某些情况下，不需要预先暴露。例如，对于神经系统中CGRP受体增加的遗传改变小鼠，不需要预先暴露14。同样，对于光遗传学操纵的小鼠，其中丘脑后核中表达CaMKIIa的神经元被靶向进行光学刺激，预先暴露是不必要的，大概是因为直接刺激大脑时光厌恶反应是如此强烈19。因此，在使用不同的小鼠品系或模型时，必须仔细考虑预先暴露于腔室的数量和必要性。事实上，小鼠过度暴露于腔室可能会减少探索行为。这将导致小鼠优先占据暗区，无论治疗如何，其中观察到光厌恶反应的能力降低。相反，对测定的预暴露不足可能导致探索性行为掩盖潜在的光厌恶行为。
治疗后暴露用于确定小鼠是否已从2天前施用的CGRP注射中完全恢复。在进行露天测定或任何其他测定之前，这是必不可少的，以确认不存在会影响未来行为测试的长期治疗效果。
根据之前的观察结果，我们选择了30分钟的实验方案持续时间10。我们已经在光/暗测定中分别测试了小鼠10分钟15，20分钟16 和30分钟10 。CGRP减少了小鼠在0-30分钟之间在光下花费的时间，但超过30分钟，与0-30分钟相比，对照组小鼠更喜欢在黑暗中花费更多时间，因此决定测试30分钟。以类似的方式，可以参考不同小鼠模型的时间响应曲线来调整测试持续时间。应该注意的是，延长对明暗室的曝光时间可能会降低探索光区的动力。
我们分析了许多不同的参数来评估动物的行为。光/暗测定的一个基本特征是测量小鼠在光区停留的时间，直接反射光厌恶。休息时间的百分比，亮区或暗区中的垂直光束断裂次数（测量饲养活动）以及两个区域之间的过渡次数用于评估运动性。静止时间和垂直光束断裂被归一化为每个区域花费的时间，以避免关于运动的错误结论。我们将所有小鼠纳入分析中，除了：在整个测试30分钟内保持在光区的小鼠，总共花费超过90%时间休息的小鼠（包括亮区和暗区）以及统计异常值（>3 SDs）。被排除的小鼠数量一般小于1%。对于开放现场测定，中心时间百分比是用于评估焦虑样行为的主要测量值。
在改进的明/暗测定中，光纤套管在某些大脑区域的位置可以极大地限制小鼠的运动，并且在某些情况下，阻止小鼠到达暗区。因此，进入暗区将受到负面加强，经过多次尝试后，鼠标可能会表现出对光线的习得偏好，甚至在整个测试期间一直停留在光区。这可以通过修改深色插入件中开口的大小和形状来纠正。例如，当将光纤插管安装在野生型C57BL / 6J小鼠的小脑中时，小鼠难以穿过黑暗插入物的开口。在将开口的宽度更改为6.10厘米而不是5.08厘米后，小鼠能够自由地穿过开口。
根据开放场室的大小，在改进的明暗测定中使用30.5厘米光纤跳线，允许小鼠自由移动。较短的线长将阻止鼠标移动到角落，而较长的电缆可能会缠结并阻碍移动。用于改良开放场测定的光纤跳线的长度为50厘米。长度不像明暗测定那样严格，因为旋转接头的高度可以根据光纤跳线的长度进行调整，确保鼠标能够到达腔室的角落。
根据功率分析，每组需要10-12只小鼠用于具有ip. CGRP的CD1和C57BL / 6J小鼠，以及用于光遗传学C57BL / 6J小鼠以检测显着的光厌恶。然而，C57BL / 6J组大小比CD1组大小大得多（图2A，B），因为C57BL / 6J小鼠在测试的子集中对CGRP无反应10，这意味着进行了多次测试以解释这些小鼠中光厌恶行为的高变异性。具体而言，将CD1小鼠的两个实验与I.p. CGRP的C57BL / 6J小鼠合并四个实验（图2A，B）10。这种变异性的原因尚不清楚，但人类对CGRP和光的反应也表现出变异性。静脉注射CGRP诱导偏头痛发作约占63~75%，偏头痛发作的患者中有70~90%表现出畏光22，23，24，25。总而言之，该测定具有相当大的变异性，除了小鼠的数量外，还必须对不同的小鼠队列进行至少两个甚至三个完全独立的实验。
在明暗室中不需要垫料，实验者也不需要预先处理或习惯小鼠。作为预防措施，两种预暴露程序的目的是使小鼠适应实验者的嗅觉和身体线索;然而，Ueno H. 等人证明，重复处理后的小鼠与未处理的小鼠之间，在明暗测定中，光照时间或开放场测定中中心时间没有差异26。
开放场测定可以评估焦虑对光厌恶表型的贡献。还有其他经过充分验证的焦虑相关测定，例如升高的零迷宫和升高的加迷宫27;然而，开放场测定是与亮/暗方案在程序上最相关的对照，因为两种测定使用相同的试验室。即便如此，鉴于焦虑是一种复杂且多方面的行为，可以通过利用多种测定或在单个测试中测量多个参数来加强对焦虑的评估。重要的是，即使开放场地测定中没有焦虑表型，这也不能排除光厌恶表型的焦虑成分。例如，光可能会引发焦虑反应。开放场测定仅表明焦虑本身并不驱动对光的反应。虽然抗焦虑药物（例如苯并二氮卓类）可用于该测定，但这种方法会产生并发症，例如，抗焦虑药物会影响运动。相反，我们选择使用临床抗偏头痛药物，包括舒马普坦，来验证光厌恶表型的偏头痛样状态。舒马普坦成功地逆转了CD1和C57BL / 6J小鼠中CGRP诱导的光厌恶10。
与改良的明/暗测定不同，由于跳线连接到小鼠头部，拉出式抽屉上的腔室位于隔间外侧，在改良的开放场测定中隔间门打开。房间光线不是55勒克斯，而是以~1000勒克斯到达房间的地板。尽管光强度不同，但开放场测定是一种与光无关的测试。详细地说，在开放场测定中将光强度从55增加到27，000勒克斯导致C57BL / 6J小鼠中心时间缩短的趋势，这表明光强度可能会影响小鼠行为28。然而，对照组和实验组之间的差异在55和27，000 lux28下都不显着。此外，55至1000勒克斯之间的光强度差异远比55至27，000勒克斯之间的光强度差异要微妙得多。无线光遗传学可以解决这个问题，因为没有跳线，允许将开放的场室推入声音衰减隔间内。
此外，尽管选择了最佳长度，跳线仍会限制鼠标移动。未来，无线光遗传学将为基于电缆的光遗传学技术提供一种非侵入性的替代方案。
应该注意的是，我们使用急性注射CGRP，它只部分复制伴随偏头痛发作的延长CGRP释放。虽然我们向小鼠注射CGRP以模拟偏头痛的前提是血浆CGRP水平升高29 并且i.v CGRP诱导偏头痛患者偏头痛发作22，23，24，25，30，但这不会复制CGRP在相对较长时间内保持在高水平的患者中的状况（患者测量是在偏头痛开始后3小时的中位数上进行的29），也不会复制慢性偏头痛，据报道，即使在两次发作之间，其水平也会升高31。此外，在我们的范式中，其他疼痛诱导的介质尚未经过测试。
Mogil小组修改了升高的加迷宫来测量小鼠的光厌恶，闭合的手臂被明亮的光照亮，张开的手臂保持黑暗32。标准的升高加迷宫通常用于检测动物的焦虑相关行为。该测定基于小鼠探索新环境的天生欲望与在开放的无保护迷宫臂中被置于妥协位置之间的冲突。在修改后的协议中，小鼠被迫在用强光照亮的闭合臂和黑暗的未保护的张开臂之间进行选择。对前者的偏好表明焦虑压倒了轻度厌恶，而对后者的偏好表明轻度厌恶优先于焦虑。Mogil小组还进行了一项标准的升高加迷宫来评估焦虑样行为32。目的与我们的方案中进行开放场测定相同。 Cacna1a 突变小鼠是一种家族性偏瘫性偏头痛模型，当闭合的手臂明亮时表现出畏光。相反，当进行标准升高加迷宫时，未检测到焦虑样行为32。在大鼠中，通过使用改良的升高加迷宫和明/暗测定，证明硝酸甘油（NTG）能够诱导畏光33，34，其被舒马普坦34拯救。在闭合臂内无光的标准升高加迷宫环境中，NTG诱导大鼠34的焦虑样行为，提示NTG诱导的光厌恶伴有焦虑。据我们所知，在同一小鼠模型中没有使用亮/暗测定和改进的升高迷宫的出版物。总而言之，该方案中提出的改进的升高加迷宫和明/暗测定已被证明是小鼠光厌恶行为的有效措施。
我们使用日光平衡颜色（5600K）的日光LED面板，具有60°泛光光束，在距离房间地板约30厘米的高度（55勒克斯或27，000勒克斯）不会产生阴影。其他研究光厌恶的研究已经利用了具有不同修改的光/暗测定。例如，研究对光区使用了不同的光强度，范围从数百到数千lux35，36，37;使用不同波长的光（例如蓝色和黄色）38;或使用不同温度的光（冷和暖）39。应注意光产生的热量，因为它会影响黑暗和光照区域的温度并干扰小鼠的行为，从而可能导致对特定区域的偏好。此外，使用具有良好视角的光线也很重要，以避免阴影出现在房间的地板上。光强度对于测试也很重要。25，000 -27，000勒克斯大约相当于明亮的日光。通过在如此高的光强度下进行光/暗测定，可以放大治疗效果;然而，必须考虑视网膜损伤40 以及如此高的光强度对小鼠进入光的意愿的负面影响。一些研究报告说，暴露在直射光下的小鼠眼睛41 和暴露在强光下数小时（例如30，000勒克斯持续4小时42）的小鼠经历了视网膜损伤。在明/暗测定中，如果小鼠愿意，小鼠有一个黑暗区域可以从明亮的光线中逃脱。此外，先前的研究发现，对照组的小鼠（C57BL / 6J小鼠）在55，1000和27，000 lux28下的光区花费了相似的时间。对于CD1小鼠，对照组在27，000勒克斯10 以下的光线下花费了大约1/3的时间，未发表的数据在55勒克斯下显示出类似的结果。它表明，27，000勒克斯光本身不会使CD1和C57BL / 6J小鼠感到痛苦。尽管如此，在选择更高的光强度时应谨慎行事。
除了光线设置的差异外，研究人员还选择了多种方法来分析光明/黑暗数据。在评估光厌恶时，计算中包括了在光区关闭（或光区的红灯照明，因为小鼠眼睛不太容易接受红光）所花费的时间。例如，Gorin小组使用厌恶指数=（光照0勒克斯时间-最光照勒克斯时间）/光照0勒克斯 时间来评估光厌恶43。在这里，包括“熄灯”或“红灯”条件，以确认避免光区的条件是光存在于而不是简单的位置偏好。我们通过ip注射CGRP进行该过程，发现接受CGRP的小鼠在光照区没有熄灯的地方偏好，证实CGRP诱导的厌恶是光依赖性的16。最后，Gorin组使用小鼠在光/暗测定中在光区外围花费的时间作为焦虑的衡量标准36。我们利用传统的焦虑测试，即露天分析。无论选择哪种分析方法，都应该注意，焦虑对轻度厌恶的贡献不容忽视。该协议试图通过同时利用明/暗和开放场测定来划分焦虑样和光厌恶行为。
该协议解决了使用明场/暗场和开放场测定来检测小鼠中的反光行为。这为识别驱动畏光症的神经回路和大脑区域的机制提供了一个有用的工具。测试范式可以是偏头痛特异性的，也可以扩展到涉及畏光的其他疾病。关于偏头痛，我们已经测试了另外两种与偏头痛发病机制相关的神经肽：垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）和血管活性肠肽（VIP）。PACAP和VIP被证明在CD1小鼠中诱导光厌恶17，21。除偏头痛外，畏光症也是许多其他疾病的症状，包括失轻，急性眼损伤或炎症，创伤性脑综合征，莱姆病，白化病和锥体营养不良36。因此，该测试范式提供了一种工具来研究畏光相关疾病的潜在机制。此外，光遗传学方法与传统药理学方法的配对无疑将有助于开发针对畏光相关疾病的新疗法。
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Disclosures
作者没有利益冲突可报告。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH NS R01 NS075599和RF1 NS113839的资助。内容不代表VA或美国政府的观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activity monitor | Med Assoc. Inc | Software tracking mouse behavior | |
| Customized acrylic shelf | For adjusting the height of the LED panel | ||
| Dark box insert | Med Assoc. Inc | ENV-511 | |
| DC power supply | Med Assoc. Inc | SG-500T | |
| DC regulated power supply | Med Assoc. Inc | SG-506 | |
| Fiber-optic cannula | Doric | MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT | |
| Germicidal disposable wipes | Sani-Cloth | SKU # Q55172 | |
| Heat Sink | Wakefield | 490-6K | Connecting to LED panel |
| IR controller power cable | Med Assoc. Inc | SG-520USB-1 | |
| IR USB controller | Med Assoc. Inc | ENV-520USB | |
| Mating sleeve | Doric | SLEEVE_ZR_1.25 | |
| Modified LED light panel | Genaray Spectro | SP-E-360D | Daylight-balanced color (5600K) |
| Power supply | MEAN WELL USA | SP-320-12 | Connecting to LED panel |
| Seamless open field chamber | Med Assoc. Inc | ENV-510S | |
| Sound-attenuating cubicle | Med Assoc. Inc | ENV-022MD-027 | |
| Stand and clamp | |||
| Three 16-beam IR arrays | Med Assoc. Inc | ENV-256 |
References
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