Summary
Los roedores no pueden reportar síntomas de migraña. Aquí, describimos un paradigma de prueba manejable (ensayos de luz / oscuridad y campo abierto) para medir la aversión a la luz, uno de los síntomas más comunes y molestos en pacientes con migrañas.
Abstract
La migraña es un trastorno neurológico complejo caracterizado por dolor de cabeza y anomalías sensoriales, como la hipersensibilidad a la luz, observada como fotofobia. Si bien es imposible confirmar que un ratón está experimentando migraña, la aversión a la luz se puede utilizar como un sustituto conductual para el síntoma de migraña de la fotofobia. Para probar la aversión a la luz, utilizamos el ensayo de luz / oscuridad para medir el tiempo que los ratones eligen pasar libremente en un entorno claro u oscuro. El ensayo se ha perfeccionado mediante la introducción de dos modificaciones críticas: preexposiciones a la cámara antes de ejecutar el procedimiento de prueba y la iluminación ajustable de la cámara, lo que permite el uso de un rango de intensidades de luz de 55 lux a 27.000 lux. Debido a que la elección de pasar más tiempo en la oscuridad también es indicativa de ansiedad, también utilizamos una prueba de ansiedad independiente de la luz, el ensayo de campo abierto, para distinguir la ansiedad del comportamiento aversivo a la luz. Aquí, describimos un paradigma de prueba modificado para los ensayos de campo abierto y claro/oscuro. La aplicación de estos ensayos se describe para la inyección intraperitoneal de péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) en dos cepas de ratón y para estudios de estimulación cerebral optogenética.
Introduction
La migraña es una enfermedad neurológica prevalente, que afecta aproximadamente al 17% de los estadounidenses1 y es la segunda causa de discapacidad a nivel mundial2,3. Los pacientes experimentan cefalea que dura de 4 a 72 horas acompañada de al menos uno de los siguientes síntomas: náuseas y/o vómitos, o fotofobia y fonofobia4. Los recientes avances en el desarrollo de anticuerpos péptidos relacionados con el gen de la calcitonina (CGRP) que ahora están aprobados por la FDA han comenzado una nueva era para el tratamiento de la migraña5,6,7. Estos anticuerpos bloquean la CGRP o su receptor y previenen los síntomas de migraña en aproximadamente el 50% de los pacientes con migraña7. En el último año, dos antagonistas de moléculas pequeñas del receptor CGRP también han sido aprobados por la FDA para el tratamiento abortivo de la migraña, y dos más están en proceso8. A pesar de este progreso terapéutico, los mecanismos por los cuales ocurren los ataques de migraña siguen siendo esquivos. Por ejemplo, no se conocen los sitios de acción de CGRP. La eficacia de los anticuerpos terapéuticos que no cruzan apreciablemente la barrera hematoencefálica sugiere que el CGRP actúa en sitios periféricos, como las meninges y/o los ganglios del trigémino. Sin embargo, no podemos descartar acciones centrales en los órganos circunventriculares, que carecen de barrera hematoencefálica9. Al menos para la fotofobia, creemos que esto es menos probable dados nuestros resultados con aversión a la luz utilizando ratones transgénicos nestin/hRAMP1 en los que hRAMP1 está sobreexpresado en el tejido nervioso10. La comprensión de los mecanismos de la fisiopatología de la migraña proporcionará nuevas vías para el desarrollo de la terapéutica de la migraña.
Los modelos animales preclínicos son fundamentales para comprender los mecanismos de la enfermedad y el desarrollo de nuevos fármacos. Sin embargo, la evaluación de la migraña en animales es un desafío ya que los animales no pueden informar verbalmente sus sensaciones de dolor. Dado que el 80-90% de los pacientes con migraña exhiben fotofobia11, la aversión a la luz se considera un indicador de migraña en modelos animales. Esto llevó a la necesidad de desarrollar un ensayo para evaluar la aversión a la luz en ratones.
El ensayo de luz/oscuridad contiene una zona clara y una zona oscura. Es ampliamente utilizado para medir la ansiedad en ratones en base a su exploración espontánea de entornos novedosos que se contrarresta con su aversión innata a la luz12. Algunos estudios establecen 1/3 de la cámara como la zona oscura, mientras que otros establecen 1/2 de la cámara como la zona oscura. El primer ajuste se utiliza a menudo para detectar la ansiedad13. Si bien inicialmente elegimos cámaras claras / oscuras de igual tamaño, no hemos comparado los dos tamaños relativos. Podemos comentar que el tamaño total de ambas cámaras no es un factor importante, ya que la caja de prueba inicial14 era considerablemente más grande que el aparato posterior15, sin embargo, los resultados fueron esencialmente los mismos.
Dos modificaciones críticas a este ensayo de luz/oscuridad para evaluar la aversión a la luz fueron: la condición de prueba y la intensidad de la luz (Figura 1). En primer lugar, los ratones están preexpuestos a la cámara de luz/oscuridad para reducir el impulso exploratorio16 (Figura 1A). La necesidad y los tiempos de preexposición dependen de las cepas y modelos de ratón. Los ratones Wildtype C57BL/6J suelen requerir dos preexposiciones10, mientras que solo una preexposición para ratones CD1 es suficiente17. De esta manera, el comportamiento aversivo de la luz se puede desenmascarar en estas dos cepas de ratón. En segundo lugar, la iluminación de la cámara se ha adaptado para incluir un rango ajustable de intensidades de luz desde tenue (55 lux) hasta brillante (27,000 lux) donde 55 lux es comparable a un día nublado oscuro, y 27,000 lux es comparable a un día soleado brillante a la sombra10. Hemos encontrado que la intensidad de luz requerida varía con la cepa y el modelo genético. Por esta razón, los individuos primero deben evaluar la intensidad mínima de luz para su paradigma experimental.
Incluso con estas modificaciones en el ensayo, que pueden revelar un fenotipo aversivo a la luz, es necesario probar el comportamiento similar a la ansiedad para distinguir entre la aversión a la luz debido a la luz sola y debido a la ansiedad. El ensayo de campo abierto es una forma tradicional de medir la ansiedad basada en la exploración espontánea de entornos novedosos. Se diferencia del ensayo de luz / oscuridad en que el impulso exploratorio es contrarrestado por la aversión innata a los espacios abiertos desprotegidos. Tanto el centro como los bordes de la cámara están en la luz, por lo que el ensayo de campo abierto es un ensayo de ansiedad independiente de la luz. Por lo tanto, la combinación de los ensayos de luz / oscuridad y campo abierto nos permite distinguir entre la aversión a la luz debido a una evitación de la luz frente a un aumento general de la ansiedad.
La CGRP es un neuropéptido multifuncional que regula la vasodilatación, la nocicepción y la inflamación18. Se expresa ampliamente en los sistemas nerviosos periférico y central. Juega un papel importante en la fisiopatología de la migraña18. Sin embargo, el mecanismo subyacente a la acción de CGRP en la migraña no está claro. Al utilizar los ensayos de campo abierto y claro/oscuro con este paradigma de prueba modificado, pudimos identificar el comportamiento aversivo a la luz en ratones después de la administración de CGRP periférica10,16 (Figura 2) y central14,15,16,19. Además de los neuropéptidos, la identificación de las regiones cerebrales involucradas en la aversión a la luz también es importante para comprender la fisiopatología de la migraña. Los núcleos talámicos posteriores son una región cerebral integradora para el dolor y el procesamiento de la luz19, y el tálamo se activa durante la migraña20. Por lo tanto, nos dirigimos a los núcleos talámicos posteriores inyectando virus adenoasociados (AAV) que contienen canalrodopsina-2 (ChR2) o eYFP en esta región. Al combinar este enfoque optogenético con estos dos ensayos, demostramos que la estimulación óptica de las neuronas que expresan ChR2 en los núcleos talámicos posteriores indujo aversión a la luz19 (Figura 3). En este experimento, dado el efecto dramático en la aversión a la luz evocada en estos ratones manipulados optogenéticamente, se omitieron las preexposiciones a la cámara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Iowa y se realizaron de conformidad con los estándares establecidos por los Institutos Nacionales de Salud.
1. Ensayo de luz/oscuridad
- Configuración del aparato de cámara clara/oscura (ver Tabla de Materiales). Todo el equipo de esta sección está disponible comercialmente.
- En un estante, coloque el cubículo atenuante de sonido (interior: 59,7 x 38 x 35,6 cm en W x H x D) que contiene un cajón extraíble para facilitar el acceso a la cámara y el inserto oscuro.
- Conecte la fuente de alimentación de CC y una fuente de alimentación regulada por CC al cubículo atenuante de sonido.
- Coloque la cámara transparente de campo abierto sin costuras (27,31 x 27,31 x 20,32 cm en L x W x H) en el cajón extraíble del cubículo.
- Coloque el inserto oscuro de plástico negro e infrarrojo (IR) transparente (28,7 X 15 X 20,6 cm en L x W x H) en la cámara de campo abierto. Asegúrese de que la cámara esté dividida en dos zonas de igual tamaño: una zona oscura y una zona clara.
- Conecte tres conjuntos de matrices IR de 16 haces en los ejes X, Y y Z de la cámara de campo abierto al controlador USB IR a través de cables.
- Conecte el controlador IR USB a una computadora.
- Instale el software de seguimiento en la computadora que puede registrar y recopilar la ubicación y la actividad del mouse.
- Para la configuración del panel de luz, primero retire el panel de luz de diodo emisor de luz (LED) (27,70 x 27,70 cm en L x W; 360 LED, color equilibrado a la luz del día, 5600K, 60 ° de propagación del haz de inundación) de su carcasa original.
- Ensamble el panel de luz con el controlador LED, el disipador de calor y la fuente de alimentación. Se pueden conectar múltiples paneles de luz LED a una fuente de alimentación, disipador de calor y controlador LED para lograr un control uniforme del panel de luz.
- Construya una plataforma acrílica personalizada (29.77 x 27.70 x 8.10 cm en L x W x H) que comprende 7 estantes idénticos a intervalos de 0.53 cm (Figura 1B). Coloque permanentemente el estante de acrílico personalizado en el techo dentro del cubículo sobre la cámara.
- Inserte el panel de luz LED en la ranura entre los dos estantes inferiores. Ajuste el panel de luz a diferentes alturas (Figura 1B, C), si es necesario (por ejemplo, si usa ratones optogenéticos. Los detalles se discuten en la Sección 3).
- Encienda el disipador de calor, el controlador LED y la fuente de alimentación. Confirme que el controlador LED puede dictar la intensidad de la luz LED midiendo la intensidad de la luz en el piso de la cámara y confirme que el piso está iluminado de manera uniforme.
- Procedimiento de prueba de comportamiento
NOTA: Los ratones están alojados en un ciclo de luz de 12 h. Todos los experimentos de comportamiento se realizan durante el ciclo de luz. Se utilizan ratones, incluidos machos y hembras, de 10 a 20 semanas de edad. En este protocolo, los ratones cd1 y C57BL/6J de tipo salvaje ingenuo experimentan dos pre-exposiciones a la cámara de luz/oscuridad seguidas de exposición con tratamiento y una exposición post-tratamiento. Hay un intervalo de tres días entre cada exposición para permitir que los ratones se recuperen (Día 1, 4, 7 y 10 como se describe a continuación y figura 1A). Sin embargo, los ratones CD1 no requieren la 2ª preexposición y se pueden probar con poca luz.- El día 1 (pretratamiento 1), encienda el aparato de ensayo de luz/oscuridad y ajuste la intensidad de la luz a 27.000 lux.
- Abra el software de seguimiento y configure un nuevo protocolo. En la configuración Nuevo protocolo , establezca la duración en 30 min. En la configuración Nuevo análisis , establezca Bandejas de datos por Duración en 300 s.
- En la configuración Nueva zona , elija Zonas predefinidas. Elija 2 y luego Horizontal. Compruebe si la cámara está dividida en dos zonas de igual tamaño horizontalmente para la grabación.
- Habitúe a los ratones a la sala de pruebas durante 1 h antes de la prueba. Durante la habituación, mantenga la luz de la habitación encendida para no interrumpir el ritmo circadiano del ratón. Asegúrese de que todo el equipo para el ensayo de luz / oscuridad esté encendido, lo que permite que los ratones se aclimaten completamente al entorno de la sala de pruebas.
- Seleccione Adquirir datos. Introduzca los ID de ratón. Inicie el protocolo.
- Tire del cajón fuera del cubículo atenuante del sonido para acceder a la cámara de luz/oscuridad y al inserto oscuro. Levante suavemente el mouse por la base de la cola, colóquelo en la zona de luz de la cámara y empuje el cajón dentro del cubículo. Asegúrese de que el software detecte el mouse inmediatamente y comience a registrar la actividad.
- Espere a que la grabación se detenga automáticamente después de 30 minutos. Devuelva el ratón a su jaula de origen.
- Limpie la cámara y el inserto oscuro con toallitas desechables germicidas con olor a alcohol que contengan alcohol isopropílico al 55.0%, cloruro de amonio de dimetil bencil C12-18 alquilo C12-18 dimetilbencilmonio y cloruro de amonio de dimetil bencil al 0.25% de alquilo C12-18 como ingredientes activos antimicrobianos para erradicar cualquier señal olfativa dejada por el ratón anterior.
- El día 4 (pretratamiento 2), repita los pasos 1.2.1 a 1.2.8.
- El día 7 (el día del tratamiento), repita los pasos 1.2.1 y 1.2.4. Después de la habituación, administrar CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g en función del peso corporal del ratón, inyección intraperitoneal (i.p.)), inclinando la cabeza del ratón hacia adelante e inyectando en el cuadrante inferior derecho. Devuelva el ratón a la jaula de casa.
- Después de 30 minutos, inicie el protocolo y ejecute el mouse en la cámara clara / oscura como se menciona en los pasos 1.2.5 a 1.2.7. El tiempo de recuperación en jaulas domiciliarias después de las inyecciones puede acortarse o alargarse dependiendo del tratamiento21.
- Limpie la cámara y el inserto oscuro como se describe en el paso 1.2.8.
- El día 10 (día posterior al tratamiento), repita los pasos 1.2.1 a 1.2.8. El experimento se puede pausar en el paso 1.2.13 antes de comenzar el ensayo de campo abierto.
2. Ensayo de campo abierto
- La configuración del aparato
- Configuración de la cámara de campo abierto: Use el mismo cubículo atenuante de sonido y la misma cámara de campo abierto utilizados en el ensayo de luz / oscuridad, sin usar el inserto oscuro.
- Configuración del panel de luz: Utilice la misma configuración utilizada en el ensayo de luz/oscuridad. Asegúrese de que la intensidad de la luz sea la misma que la utilizada en el ensayo de luz/oscuridad.
- Procedimiento de prueba de comportamiento
- Encienda el aparato. Ajuste la intensidad de la luz a 27.000 lux.
- Abra el software de seguimiento.
- Configure un nuevo protocolo, el mismo que se usa en el ensayo de luz/oscuridad, excepto para la configuración de Nueva zona . Elija 1 seguido del Centro en la configuración de Nueva zona . Establezca la periferia a 3,97 cm del perímetro y el centro como 19,05 × 19,05 cm.
- Habitúe a los ratones a la sala de pruebas como se describe en el paso 1.2.4.
- Administrar CGRP (0,1 mg/kg, 10 μl/g en función del peso corporal del ratón, i.p.), inclinando la cabeza del ratón hacia adelante e inyectando en el cuadrante inferior derecho. Devuelva el ratón a la jaula de casa.
- Después de 30 minutos, inicie el protocolo. Tire del cajón extraíble fuera del cubículo atenuante del sonido y coloque suavemente el ratón en el centro de la cámara de campo abierto. Empuje el cajón dentro del cubículo.
- Seguimiento del comportamiento durante 30 min. Luego devuelva a los ratones a sus jaulas domésticas.
- Limpie el aparato como se describe en el paso 1.2.8.
3. Ensayo de luz/oscuridad modificado para ratones optogenéticos
- La configuración del aparato
- Realice dos modificaciones en el inserto oscuro.
- Modifique la abertura del inserto oscuro a 5,08 x 5,08 cm (ancho x alto) con una pequeña hendidura de 0,95 x 10,16 cm (ancho x alto) entre la parte superior y la abertura del inserto oscuro (Figura 1D superior izquierda).
NOTA: Esta modificación permite que un ratón vaya a la zona oscura sin dificultad cuando la cánula de fibra óptica en la cabeza del ratón está unida al cable de conexión. - Extienda la parte superior del inserto oscuro sobre el área de luz como un porche triangular (H = 6,5 cm) (Figura 1D arriba a la derecha e abajo a la izquierda). Corte un orificio circular (D = 1,7 cm) fuera del porche e inserte un soporte en el orificio para colocar y estabilizar la junta rotativa, que conecta el láser y los cables de conexión de fibra óptica (Figura 1D arriba a la izquierda e abajo a la izquierda).
NOTA: Las modificaciones resultan en un pequeño cambio en la intensidad de la luz que llega al piso de la zona oscura (17 lux con modificaciones vs 14 lux sin modificaciones, medidos en la esquina posterior derecha de la zona oscura por debajo de 27,000 lux).
- Modifique la abertura del inserto oscuro a 5,08 x 5,08 cm (ancho x alto) con una pequeña hendidura de 0,95 x 10,16 cm (ancho x alto) entre la parte superior y la abertura del inserto oscuro (Figura 1D superior izquierda).
- Inserte la junta giratoria en el soporte del inserto oscuro.
- Conecte el cable de conexión de fibra óptica de 30,5 cm a la articulación rotativa. Confirme que la articulación giratoria puede girar suavemente para que el cable de conexión pueda girar sin dificultad a medida que el ratón atraviesa la cámara.
- Para el resto de la configuración, utilice la misma configuración del aparato que se utiliza en la sección 1 (ensayo de luz/oscuridad).
- Realice dos modificaciones en el inserto oscuro.
- Procedimiento de prueba de comportamiento
NOTA: A diferencia de los ratones de tipo salvaje, los ratones optogenéticos no reciben preexposiciones (pretratamiento 1 y 2).- El día de la prueba, inserte el panel de luz LED en la segunda ranura más baja (a 28,23 cm del piso de la cámara) para dejar espacio para conectar el cable de conexión. Encienda el aparato de ensayo de luz/oscuridad y ajuste la intensidad de la luz a 55 lux.
- Utilice la misma configuración de protocolo que la de 1.2.2 y 1.2.3, excepto que las bandejas de datos por duración se establecen en 60 s en la configuración Nuevo análisis para que sean congruentes con el protocolo de estimulación láser del paso 3.2.3.
- Encienda el botón de encendido del láser. Ajuste el controlador de pulso láser para estimular durante 1 minuto seguido de 1 minuto sin estimulación durante 30 minutos.
- Habitúe a los ratones a la sala de pruebas con la luz encendida durante 1 h antes de la prueba.
- Inicie el protocolo. Tire del cajón extraíble fuera del cubículo atenuante del sonido para acceder a la cámara de luz/oscuridad y al inserto oscuro.
- Sujete suavemente el ratón y acople la cánula de fibra óptica de la cabeza del ratón al cable de conexión de fibra óptica a través de una funda de acoplamiento (Figura 1D abajo a la derecha). Coloque el ratón suavemente en la zona de luz y empuje el cajón dentro del cubículo. Asegúrese de que el protocolo comenzará a registrar el comportamiento del mouse automáticamente.
- A 1 minuto, encienda el controlador de pulso y luego gire la tecla a prueba de fallos a ON. Asegúrese de que la estimulación con láser de la región cerebral objetivo se produzca cada dos minutos.
- Después de 30 minutos, cuando el protocolo se detiene automáticamente, gire la tecla a prueba de fallos a OFF. A continuación, apague el controlador de pulsos.
- Desacople el ratón y el cable de conexión de fibra óptica. Devuelva el ratón a la jaula de casa.
- Limpie la cámara y el inserto oscuro como se describe en el paso 1.2.8.
4. Ensayo de campo abierto modificado para ratones optogenéticos
- La configuración del aparato
- Estabilice la junta giratoria por encima de la cámara utilizando un soporte y una abrazadera (Figura 1E).
- Conecte el cable de conexión de fibra óptica con una longitud de 50 cm a la articulación rotativa. Compruebe si la articulación giratoria puede girar suavemente.
- Ajuste la junta giratoria a la altura adecuada en el soporte: asegúrese de que el cable de conexión de fibra óptica solo pueda llegar a todos los rincones de la cámara, lo que ayudará a evitar cualquier interferencia con el movimiento del mouse.
- Para el resto de la configuración, utilice la misma configuración del aparato que se utiliza en la sección 1 (ensayo de luz/oscuridad), pero sin el inserto oscuro.
- Procedimiento de prueba de comportamiento
- Encienda el aparato de ensayo de luz/oscuridad y ajuste la intensidad de la luz a 55 lux.
- Utilice la misma configuración de protocolo que la del ensayo de luz/oscuridad modificado (sección 3), excepto para la configuración de Nueva zona . Elija 1 siguiendo por Centro en la configuración de Nueva zona . Establezca la periferia a 3,97 cm del perímetro y el centro como 19,05 × 19,05 cm.
- Encienda el botón de encendido del láser. Ajuste el controlador de pulso láser para estimular durante 1 minuto seguido de 1 minuto sin estimulación durante 30 minutos.
- Realizar la habituación y el resto de la prueba como se describe en los pasos 3.2.4 a 3.2.10 excepto por dos cambios en el paso 3.2.6: coloque el ratón suavemente en el centro de la cámara en lugar de la zona de luz; Mantenga el cajón extraíble fuera del cubículo debido a que el cable de conexión se conecta a la cabeza del mouse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este paradigma de prueba de comportamiento está diseñado para probar el comportamiento aversivo de la luz. Se puede realizar utilizando ratones de tipo salvaje ingenuos y ratones optogenéticos para investigar la aversión a la luz en tiempo real durante la estimulación de una población neuronal objetivo.
Este procedimiento se ha utilizado para estudiar el efecto del tratamiento periférico con CGRP en ratones CD1 y C57BL/6J10,16 y la estimulación óptica de las neuronas en los núcleos talámicos posteriores en ratones C57BL/6J19 sobre el comportamiento aversivo a la luz. En los experimentos se utilizaron ratones, incluidos machos y hembras, de 10 a 20 semanas de edad (Figura 2A, Figura 2B-D y Figura 3). Los resultados revelaron que la inyección i.p. de CGRP disminuyó significativamente la duración del tiempo pasado en la zona clara en el ensayo de luz/oscuridad en ratones CD1 (Figura 2A) y C57BL/6J (Figura 2B), pero no afectó el tiempo que los ratones pasaron en el centro en el ensayo de campo abierto en ratones CD1 (datos no mostrados) y C57BL/6J (Figura 2D)10, 16. Esto sugiere que el CGRP periférico induce aversión a la luz, pero no ansiedad general. El tratamiento con CGRP también aumentó la cantidad de tiempo que los ratones descansaron en la zona oscura, pero no en la zona clara, tanto en los ratones CD1 (datos no mostrados) como en los C57BL/6J (Figura 2C).
Para el protocolo optogenético, nos dirigimos a las neuronas que expresan la calmodulina quinasa II alfa (CaMKIIa) en los núcleos talámicos posteriores mediante la inyección de AAV2-CaMKIIa-hChR2(E123A)-eYFP o el virus de control AAV2-CaMKIIa-eYFP19. Al mismo tiempo, se implantó una cánula de fibra óptica en los núcleos talámicos posteriores. Tres semanas después de la inyección para permitir suficiente tiempo para la expresión de ChR2, realizamos estimulación óptica de neuronas en los núcleos talámicos posteriores y observamos una disminución correspondiente en la duración que los ratones pasaron en la zona clara en el ensayo de luz / oscuridad en ratones inyectados con ChR2 en comparación con ratones inyectados con virus de control (eYFP) (Figura 3A). No se observaron diferencias en el tiempo en el centro en el ensayo de campo abierto entre ChR2 y ratones eYFP de control (Figura 3C), indicativo de una respuesta aversiva a la luz que no fue impulsada únicamente por la ansiedad19. Además, también se observó un aumento en el tiempo de descanso en la zona oscura, pero no en la zona clara (Figura 3B). Los mismos resultados se obtuvieron al utilizar 55 lux y 27.000 lux (Figura 3). El procedimiento de 55 lux se incluyó porque los pacientes con migraña son sensibles incluso a la luz tenue.
Figura 1: La línea de tiempo y el aparato del ensayo de luz/oscuridad. (A) Línea de tiempo del paradigma de prueba: Después de dos preexposiciones a la cámara de luz/oscuridad (Pre 1 y Pre 2), a los ratones se les administra CGRP (0,1 mg/kg, i.p.) seguido de una medición posterior al tratamiento (Post). Al menos un día después del ensayo de luz / oscuridad, los ratones reciben CGRP (0.1 mg / kg, i.p.) nuevamente y se ejecutan en el ensayo de campo abierto. Pre: pretratamiento; Tx: tratamiento; Post: post-tratamiento (B) El panel LED se mantiene en la parte superior de la cámara por un estante de acrílico e ilumina el área de prueba. La altura del panel de luz se puede ajustar mediante el uso de ranuras a diferentes alturas. (C) La cámara clara/oscura contiene un inserto oscuro con una pequeña abertura. Un panel de luz LED está sobre la cámara. (D) Vistas frontal, lateral y superior del inserto oscuro modificado. La abertura en el inserto oscuro se extiende con una pequeña hendidura para el movimiento del cable de conexión (arriba a la izquierda). La parte superior del inserto oscuro se extiende sobre el área de luz como un porche triangular con un soporte para la articulación rotatoria (arriba a la derecha e abajo a la izquierda). El cable de conexión de fibra óptica está conectado a la cánula de fibra óptica a través de una funda de acoplamiento (abajo a la derecha). (E) El ensayo de campo abierto modificado. El soporte y la abrazadera sujetan la articulación rotatoria. La cámara se extrae hacia la parte delantera del cubículo con las puertas abiertas para permitir el libre movimiento del ratón con el cable de conexión conectado a la cabeza del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La administración periférica de CGRP evoca la aversión a la luz en la luz brillante en dos cepas de ratones de tipo salvaje. Los ratones CD1 y C57/BL6J se probaron de acuerdo con la línea de tiempo descrita en la Figura 1A. (A) El tiempo que los ratones CD1 pasaron en la zona de luz por intervalo de 5 minutos durante 30 minutos (27,000 lux). Los datos de tiempo en luz se muestran a lo largo del tiempo durante la prueba (panel izquierdo) y como el tiempo promedio por intervalo de 5 minutos para ratones individuales (panel derecho). Se realizaron comparaciones entre el vehículo y el CGRP en cada punto temporal, y entre Tx y Pre2 o Post según lo indicado por los corchetes. (Veh, n=19; 0,1 mg/kg CGRP, n=19) (B) Tiempo que los ratones C57BL / 6J pasaron en la zona de luz por intervalo de 5 minutos durante 30 minutos (27,000 lux). Los datos de tiempo en luz se muestran a lo largo del tiempo durante la prueba (panel izquierdo) y como el tiempo promedio por intervalo de 5 minutos para ratones individuales (panel derecho) (Veh, n = 42; 0.1 mg / kg CGRP, n = 44). (C) Los ratones del panel B también fueron analizados para el comportamiento de reposo en las zonas oscura y clara durante el ensayo de luz / oscuridad. (D) Los ratones del panel B fueron probados posteriormente en el ensayo de campo abierto. El porcentaje de tiempo pasado en el centro de la cámara por intervalo de 5 minutos durante 30 minutos después del tratamiento con vehículo o CGRP (0,1 mg/kg, i.p.) (Veh, n=9; 0,1 mg/kg CGRP, n=9). El porcentaje de tiempo en los datos del centro se muestra a lo largo del tiempo durante la prueba (panel izquierdo) y como el porcentaje promedio del tiempo en el centro por intervalo de 5 minutos para ratones individuales (panel derecho). Para todos los paneles, se muestra la media±SEM, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Esta cifra está modificada de Mason et al. 201710. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La estimulación óptica de las neuronas que expresan CaMKIIa en los núcleos talámicos posteriores induce la aversión a la luz tanto en la luz tenue como en la brillante. (A) Los núcleos talámicos posteriores de ratones C57BL/6J inyectados con AAV que codifica ChR2 o eYFP (a 55 lux: eYFP n = 8, ChR2 n = 11; a 27.000 lux: eYFP n = 12, ChR2 n = 18) fueron estimulados por láser azul (473 nm, 20 Hz, ancho de pulso de 5 ms, 10 mW/mm2). El panel izquierdo muestra el tiempo que los ratones pasaron en la zona de luz por intervalo de 5 minutos durante 30 minutos a 55 o 27,000 lux. Se realizaron comparaciones entre los grupos de eYFP y ChR2 en cada punto temporal. El panel derecho muestra el tiempo promedio por intervalo de 5 minutos para ratones individuales. (B) Los ratones del panel A también se analizaron para determinar el comportamiento de reposo en las zonas de luz (panel izquierdo) y oscuridad (panel derecho) durante el ensayo de luz / oscuridad. (C) Los ratones del panel A fueron probados posteriormente en el ensayo de campo abierto. Porcentaje promedio del tiempo pasado en el centro de la cámara de campo abierto por intervalo de 5 minutos durante 30 min (Láser: 473 nm, 20 Hz, ancho de pulso de 5 ms, 10 mW/mm2). (eYFP n = 8, ChR2 n = 9). Para todos los paneles, se muestra la media±SEM, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Esta cifra se modifica a partir de Sowers et al. 202019. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El ensayo de luz/oscuridad es ampliamente utilizado para evaluar el comportamiento similar a la ansiedad12. El ensayo se basa en la aversión innata de los ratones a la luz y su impulso para explorar cuando se colocan en un entorno novedoso (zona de luz). Sin embargo, como informamos aquí, este ensayo también se puede utilizar para evaluar el comportamiento aversivo de la luz.
Es fundamental considerar el número y la necesidad de preexposiciones antes de las pruebas. Esto depende de la tensión o modelo del ratón. Por ejemplo, en nuestro protocolo de ensayo de luz/oscuridad, los ratones cd1 y C57BL/6J de tipo salvaje ingenuos están preexpuestos a la cámara de luz/oscuridad dos veces antes de someterse al procedimiento de prueba de tratamiento, mientras que los ratones optogenéticos no se someten a una exposición previa. Una publicación reciente informó que una preexposición es suficiente para que los ratones CD1 muestren aversión a la luz después de la administración de CGRP i.p.17. En consecuencia, la importancia del parámetro de novedad habrá disminuido a la llegada del día de tratamiento10,16. Las preexposiciones pueden desenmascarar los fenotipos aversivos a la luz al reducir el impulso exploratorio y, por lo tanto, alterar el equilibrio entre la exploración y la aversión. En algunos casos, la preexposición no es necesaria. Por ejemplo, con ratones genéticamente alterados con aumento de los receptores CGRP en el sistema nervioso, no fue necesaria la preexposición14. Del mismo modo, con ratones manipulados optogenéticamente, en los que las neuronas que expresan CaMKIIa en los núcleos talámicos posteriores fueron dirigidas para la estimulación óptica, la preexposición no fue necesaria, presumiblemente porque la respuesta aversiva a la luz fue tan robusta tras la estimulación directa del cerebro19. Por lo tanto, el número y la necesidad de preexposiciones a la cámara deben considerarse cuidadosamente cuando se utilizan diferentes cepas o modelos de ratón. De hecho, la sobreexposición de ratones a la cámara puede reducir el comportamiento exploratorio. Esto llevará a que los ratones ocupen preferentemente la zona oscura, independientemente del tratamiento, reduciendo así la capacidad de observar una respuesta aversiva a la luz. Por el contrario, la preexposición insuficiente al ensayo puede conducir a un comportamiento exploratorio que enmascara el comportamiento potencial de aversividad a la luz.
Una exposición posterior al tratamiento sirve para identificar si un ratón se ha recuperado completamente de la inyección de CGRP administrada 2 días antes. Esto es esencial antes de ejecutar el ensayo de campo abierto o cualquier otro ensayo para confirmar que no hay un efecto de tratamiento prolongado presente que afecte las pruebas de comportamiento futuras.
Se optó por una duración del protocolo de 30 minutos basada en observaciones previas10. Hemos probado ratones en el ensayo de luz / oscuridad durante 10 min15, 20 min16 y 30 min10 por separado. CGRP disminuyó la cantidad de tiempo que los ratones pasaron en la luz entre 0-30 min, pero después de 30 min los ratones de control prefirieron pasar más tiempo en la oscuridad en comparación con 0-30 min, lo que llevó a la decisión de probar durante 30 min. De manera similar, la duración de la prueba se puede ajustar con referencia a la curva de tiempo-respuesta para diferentes modelos de ratón. Cabe señalar que alargar el tiempo de exposición a la cámara de luz / oscuridad puede reducir la motivación para explorar la zona de luz.
Analizamos muchos parámetros diferentes para evaluar el comportamiento animal. Una característica esencial del ensayo de luz / oscuridad es una medición del tiempo que un ratón pasa en la zona de luz, reflejando directamente la aversión a la luz. El porcentaje de tiempo dedicado al descanso, el número de roturas verticales del haz (para medir la actividad de cría) en zonas claras u oscuras, y el número de transiciones entre las dos zonas se utilizan para evaluar la motilidad. El tiempo de reposo y las roturas verticales de la viga se normalizan al tiempo empleado en cada zona para evitar conclusiones falsas con respecto al movimiento. Incluimos a todos los ratones en los análisis excepto: ratones que permanecen en la zona clara durante los 30 minutos completos de prueba, ratones que pasan más del 90% del tiempo descansando en total (zonas claras y oscuras) y valores atípicos estadísticos (>3 DE de la media). El número de ratones que se excluyen es generalmente inferior al 1%. Para el ensayo de campo abierto, el porcentaje de tiempo en el centro es la principal medida utilizada para evaluar el comportamiento similar a la ansiedad.
En el ensayo de luz / oscuridad modificado, el posicionamiento de la cánula de fibra óptica en algunas regiones del cerebro puede restringir en gran medida el movimiento del ratón y, en algunos casos, evitar que el ratón llegue a la zona oscura. En consecuencia, la entrada en la zona oscura se reforzará negativamente y, después de múltiples intentos, el ratón puede mostrar una preferencia aprendida por la luz, incluso permaneciendo en la zona de luz durante todo el período de prueba. Esto se puede rectificar modificando el tamaño y la forma de la abertura en el inserto oscuro. Como ejemplo, cuando se instalaron cánulas de fibra óptica en el cerebelo de ratones de tipo salvaje C57BL / 6J, los ratones tuvieron dificultades para cruzar la abertura del inserto oscuro. Después de alterar el ancho de la abertura a 6,10 cm en lugar de 5,08 cm, los ratones pudieron atravesar la abertura libremente.
Se utiliza un cable de conexión de fibra óptica de 30,5 cm en el ensayo de luz / oscuridad modificado, según el tamaño de la cámara de campo abierto, lo que permite que el mouse se mueva libremente. Una longitud de cable más corta evitará que un ratón se mueva a las esquinas, mientras que un cable más largo puede enredarse y dificultar el movimiento. La longitud del cable de conexión de fibra óptica utilizado para el ensayo de campo abierto modificado es de 50 cm. La longitud no es tan estricta como la del ensayo de luz / oscuridad, ya que la altura de la junta giratoria se puede ajustar de acuerdo con la longitud del cable de conexión de fibra óptica, lo que garantiza que el mouse pueda llegar a las esquinas de la cámara.
Según los análisis de potencia, se necesitan 10-12 ratones por grupo para ratones CD1 y C57BL / 6J con i.p. CGRP, y para ratones optogenéticos C57BL / 6J para detectar una aversión significativa a la luz. Sin embargo, el tamaño del grupo C57BL/6J fue considerablemente mayor que el tamaño del grupo CD1 (Figura 2A, B) porque los ratones C57BL/6J no respondieron a CGRP en un subconjunto de las pruebas10, lo que significa que se realizaron múltiples pruebas para explicar esta alta variabilidad en el comportamiento aversivo a la luz en estos ratones. Específicamente, se combinaron dos experimentos para los ratones CD1 y cuatro experimentos para ratones C57BL/6J con i.p. CGRP (Figura 2A, B)10. La razón de esta variabilidad no se conoce, pero los humanos también muestran variabilidad en sus respuestas a CGRP y la luz. La inyección intravenosa (i.v.) de CGRP indujo ataques de migraña en alrededor del 63 ~ 75% de los pacientes con migraña, con el 70 ~ 90% de los pacientes que mostraron ataques de migraña que exhibieron fotofobia22,23,24,25. En conjunto, el ensayo tiene una variabilidad considerable y, además del número de ratones, es esencial hacer al menos dos y preferiblemente tres experimentos totalmente independientes con diferentes cohortes de ratones.
No se requiere ropa de cama en la cámara de luz / oscuridad y el experimentador no está obligado a pre-manipular o habituar a los ratones. Como medida de precaución, los dos procedimientos previos a la exposición sirven para aclimatar a los ratones a las señales olfativas y físicas del experimentador; sin embargo, Ueno H. et al. demostraron que no hay diferencia en el tiempo en la luz en el ensayo luz/oscuridad o tiempo en el centro en el ensayo de campo abierto entre ratones después de un manejo repetido y ratones sin manejo26.
El ensayo de campo abierto puede evaluar la contribución de la ansiedad hacia un fenotipo aversivo de luz. Existen otros ensayos bien validados relacionados con la ansiedad, como el laberinto cero elevado y el laberinto elevado plus27; sin embargo, el ensayo de campo abierto es el control más relevante desde el punto de vista del procedimiento para el protocolo de luz/oscuridad, ya que se utiliza la misma cámara de prueba para ambos ensayos. Aun así, una evaluación de la ansiedad se puede fortalecer mediante la utilización de múltiples ensayos o mediante la medición de múltiples parámetros en una sola prueba, dado que la ansiedad es un comportamiento complicado y multifacético. Es importante destacar que, incluso si no hay fenotipo de ansiedad en el ensayo de campo abierto, esto no descarta un componente de ansiedad en el fenotipo aversivo de la luz. Por ejemplo, la luz podría estar desencadenando una respuesta de ansiedad. El ensayo de campo abierto solo indica que la ansiedad por sí sola no está impulsando la respuesta a la luz. Si bien un medicamento ansiolítico, como el benzodiazepame, podría usarse en este ensayo, tal enfoque tendría complicaciones, por ejemplo, los medicamentos ansiolíticos afectan la locomoción. En su lugar, optamos por usar medicamentos clínicos contra la migraña, incluido el sumatriptán, para validar el estado similar a la migraña del fenotipo aversivo ligero. Sumatriptán revirtió con éxito la aversión a la luz inducida por CGRP en ratones CD1 y C57BL/6J10.
A diferencia del ensayo de luz / oscuridad modificado, la cámara en el cajón extraíble está fuera del cubículo con las puertas del cubículo abiertas en el ensayo de campo abierto modificado debido al cable de conexión que se conecta a la cabeza del mouse. En lugar de 55 lux, la luz de la habitación llega al piso de la cámara a ~ 1000 lux. Aunque la intensidad de la luz es diferente, el ensayo de campo abierto es una prueba independiente de la luz. En detalle, el aumento de la intensidad de la luz de 55 a 27.000 lux en el ensayo de campo abierto dio lugar a una tendencia de disminución del tiempo en el centro en ratones C57BL/6J, lo que sugiere que la intensidad de la luz puede influir en el comportamiento del ratón28. Sin embargo, la diferencia entre los grupos control y experimental no fue significativa por debajo de ni 55 ni 27.000 lux28. Además, la diferencia en la intensidad de la luz entre 55 y 1000 lux es mucho más sutil que entre 55 y 27,000 lux. La optogenética inalámbrica puede resolver este problema, ya que no habría un cable de conexión, lo que permite que la cámara de campo abierto se empuje dentro del cubículo atenuante del sonido.
Además, el cable de conexión aún limita el movimiento del mouse a pesar de seleccionar una longitud óptima. En el futuro, la optogenética inalámbrica ofrecerá una alternativa no invasiva a las técnicas optogenéticas basadas en cables.
Cabe señalar que utilizamos la inyección aguda de CGRP, que solo replica en parte la liberación prolongada de CGRP que acompaña a los ataques de migraña. Si bien inyectamos CGRP en ratones para modelar la migraña basándonos en la premisa de que los niveles plasmáticos de CGRP aumentaron29 y que la CGRP i.v indujo ataques de migraña en pacientes con migraña22,23,24,25,30, esto no replicará la condición en el paciente donde CGRP se mantiene en niveles altos durante un tiempo relativamente largo (las mediciones del paciente se tomaron a una mediana de 3 horas después de que comenzó la migraña29 ), ni replica la migraña crónica donde se reportan niveles elevados incluso entre ataques31. Además, otros mediadores inducidos por el dolor no han sido probados en nuestro paradigma.
El grupo Mogil modificó el laberinto elevado plus para medir la aversión a la luz en ratones, con los brazos cerrados iluminados por la luz brillante y los brazos abiertos permaneciendo oscuros32. El laberinto estándar elevado plus se ha utilizado a menudo para detectar el comportamiento relacionado con la ansiedad en animales. Este ensayo se basa en el conflicto entre el deseo innato de un ratón de explorar un entorno novedoso y ser colocado en una posición comprometedora en los brazos abiertos del laberinto desprotegidos. En el protocolo modificado, los ratones se ven obligados a seleccionar entre los brazos cerrados, que están iluminados con luz brillante, y los brazos abiertos desprotegidos, que son oscuros. La preferencia por la primera sugiere que la ansiedad anula la aversión a la luz, mientras que la preferencia por la segunda sugiere que la aversión a la luz tiene prioridad sobre la ansiedad. El grupo de Mogil también realizó un laberinto estándar elevado plus para evaluar el comportamiento similar a la ansiedad32. El propósito es el mismo que realizar el ensayo de campo abierto en nuestro protocolo. Los ratones mutantes Cacna1a, un modelo familiar de migraña hemipléjica, mostraron fotofobia cuando los brazos cerrados eran brillantes. Por el contrario, no se detectó una conducta angésica cuando se realizó el laberinto estándar elevado plus32. En ratas, utilizando tanto el laberinto elevado modificado como el ensayo luz/oscuridad, se demostró que la nitroglicerina (NTG) era capaz de inducir fotofobia33,34, que fue rescatada por sumatriptán34. En el entorno estándar elevado más laberinto donde la luz está ausente dentro de los brazos cerrados, NTG indujo un comportamiento similar a la ansiedad en ratas34, lo que sugiere que la aversión a la luz inducida por NTG se acompaña de ansiedad. Hasta donde sabemos, no hay publicaciones que utilicen el ensayo de luz/oscuridad y el laberinto elevado modificado en el mismo modelo de ratón. Con todo, tanto el laberinto elevado plus modificado como el ensayo de luz/oscuridad propuesto en este protocolo se han demostrado como medidas efectivas del comportamiento aversivo a la luz en ratones.
Utilizamos el panel LED de luz diurna con un color equilibrado a la luz del día (5600K), con una extensión de haz de inundación de 60 °, sin sombras a una altura de ~ 30 cm del piso de la cámara a 55 lux o 27,000 lux. Otros estudios que investigan la aversión a la luz han utilizado el ensayo de luz / oscuridad con diversas modificaciones. Por ejemplo, los estudios han utilizado diferentes intensidades de luz para la zona de luz, que van desde cientos hasta miles de lux35,36,37; luz utilizada en diferentes longitudes de onda (por ejemplo, azul y amarillo)38; o utilizar diferentes temperaturas de luz (fría y cálida)39. Se debe tener precaución con el calor producido por la luz, ya que puede afectar la temperatura de las zonas oscuras y claras e interferir con el comportamiento de los ratones, lo que podría causar una preferencia por una zona específica. Además, también es importante utilizar la luz con un buen ángulo de visión para evitar sombras en el suelo de la cámara. La intensidad de la luz también es importante para la prueba. 25,000 -27,000 lux es aproximadamente equivalente a la luz del día brillante. Al realizar el ensayo de luz / oscuridad a una intensidad de luz tan alta, es posible amplificar el efecto del tratamiento; sin embargo, es esencial considerar el daño retiniano40 y el efecto negativo de una intensidad de luz tan alta en la disposición de un ratón a salir a la luz. Algunos estudios informaron que los ojos de ratón expuestos a la luz directa41 y los ratones expuestos a la luz brillante durante varias horas (por ejemplo, 30.000 lux durante 4 horas42) experimentaron daño en la retina. En el ensayo de luz / oscuridad, hay una zona oscura para que el ratón escape de la luz brillante si el ratón lo desea. Además, estudios previos encontraron que los ratones en el grupo de control (ratones C57BL / 6J) pasaron una cantidad similar de tiempo en la zona de luz por debajo de 55, 1000 y 27,000 lux28. Para los ratones CD1, el grupo de control pasó aproximadamente 1/3 del tiempo en la luz por debajo de 27,000 lux10 y los datos no publicados habían mostrado resultados similares a 55 lux. Sugiere que la luz de 27,000 lux por sí sola no hace que los ratones CD1 y C57BL / 6J se angustien. No obstante, se debe tener precaución al optar por una mayor intensidad de luz.
Junto con las diferencias en la configuración de la luz, los investigadores han optado por una variedad de enfoques en el análisis de los datos de luz / oscuridad. Al evaluar la aversión a la luz, la cantidad de tiempo que se pasa en la zona de luz con la luz apagada (o con la iluminación de luz roja de la zona de luz, dado que los ojos de los ratones son menos receptivos a la luz roja) se incluyen en el cálculo. Por ejemplo, el grupo de Gorin utilizó el índice de aversión= (tiempo en light0 lux-time in lighttest lux)/time in light0 lux para evaluar la aversión a la luz43. Aquí, se incluyen las condiciones de "luz apagada" o "luz roja" para confirmar que la evitación de la zona de luz está condicionada a que la luz esté presente en lugar de la simple preferencia de lugar. Realizamos este procedimiento con inyección i.p. de CGRP y encontramos que los ratones que recibieron CGRP no tenían preferencia de lugar con la luz apagada en la zona de luz, lo que confirma que la aversión inducida por CGRP es dependiente de la luz16. Por último, el grupo Gorin utilizó el tiempo que los ratones pasaron en la periferia de la zona clara en el ensayo luz/oscuridad como medida de ansiedad36. Utilizamos una prueba tradicional para la ansiedad, el ensayo de campo abierto. No importa qué método de análisis se elija, debe tenerse en cuenta que la contribución de la ansiedad a la aversión a la luz no puede ser ignorada. Este protocolo intenta dividir el comportamiento similar a la ansiedad y el comportamiento aversivo a la luz mediante la utilización de los ensayos de luz / oscuridad y campo abierto en tándem.
Este protocolo aborda el uso de los ensayos de campo abierto y claro/oscuro para la detección del comportamiento aversivo a la luz en ratones. Esto proporciona una herramienta útil para identificar los mecanismos de los circuitos neuronales y las regiones cerebrales que impulsan la fotofobia. El paradigma de la prueba puede ser específico de la migraña o puede expandirse a otros trastornos que involucran fotofobia. Con respecto a la migraña, hemos probado otros dos neuropéptidos asociados con la patogénesis de la migraña: el polipéptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria (PACAP) y el péptido intestinal vasoactivo (VIP). Se demostró que PACAP y VIP inducen aversión a la luz en ratones CD117,21. Además de la migraña, la fotofobia también es un síntoma de muchos otros trastornos, incluyendo bradopsia, lesión ocular aguda o inflamación, síndromes cerebrales traumáticos, enfermedad de Lyme, albinismo y distrofia de conos36. Por lo tanto, este paradigma de prueba proporciona una herramienta para investigar los mecanismos subyacentes a los trastornos relacionados con la fotofobia. Además, el emparejamiento de los métodos optogenéticos con los enfoques farmacológicos convencionales sin duda ayudará en el desarrollo de nuevas terapias para los trastornos relacionados con la fotofobia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que informar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de nih NS R01 NS075599 y RF1 NS113839. El contenido no representa los puntos de vista de VA o del Gobierno de los Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activity monitor | Med Assoc. Inc | Software tracking mouse behavior | |
| Customized acrylic shelf | For adjusting the height of the LED panel | ||
| Dark box insert | Med Assoc. Inc | ENV-511 | |
| DC power supply | Med Assoc. Inc | SG-500T | |
| DC regulated power supply | Med Assoc. Inc | SG-506 | |
| Fiber-optic cannula | Doric | MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT | |
| Germicidal disposable wipes | Sani-Cloth | SKU # Q55172 | |
| Heat Sink | Wakefield | 490-6K | Connecting to LED panel |
| IR controller power cable | Med Assoc. Inc | SG-520USB-1 | |
| IR USB controller | Med Assoc. Inc | ENV-520USB | |
| Mating sleeve | Doric | SLEEVE_ZR_1.25 | |
| Modified LED light panel | Genaray Spectro | SP-E-360D | Daylight-balanced color (5600K) |
| Power supply | MEAN WELL USA | SP-320-12 | Connecting to LED panel |
| Seamless open field chamber | Med Assoc. Inc | ENV-510S | |
| Sound-attenuating cubicle | Med Assoc. Inc | ENV-022MD-027 | |
| Stand and clamp | |||
| Three 16-beam IR arrays | Med Assoc. Inc | ENV-256 |
References
- Loder, S., Sheikh, H. U., Loder, E. The prevalence, burden, and treatment of severe, frequent, and migraine headaches in US minority populations: statistics from National Survey studies. Headache. 55 (2), 214-228 (2015).
- Collaborators, G. B. D. H. Global, regional, and national burden of migraine and tension-type headache, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 954-976 (2018).
- GBD 2017 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- international headache society. Headache classification committee of the international headache society (IHS). The international classification of headache disorders, 3rd edition. Cephalalgia. 38 (1), 1 (2018).
- Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338-350 (2018).
- Rapoport, A. M., McAllister, P. The headache pipeline: Excitement and uncertainty. Headache. 60 (1), 190-199 (2020).
- Maasumi, K., Michael, R. L., Rapoport, A. M. CGRP and Migraine: The role of blocking calcitonin gene-related peptide ligand and receptor in the management of Migraine. Drugs. 78 (9), 913-928 (2018).
- Caronna, E., Starling, A. J. Update on calcitonin gene-related peptide antagonism in the treatment of migraine. Neurologic Clinics. 39 (1), 1-19 (2021).
- Eftekhari, S., Edvinsson, L. Possible sites of action of the new calcitonin gene-related peptide receptor antagonists. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 3 (6), 369-378 (2010).
- Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central cgrp mechanisms. Journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
- Russell, M. B., Rasmussen, B. K., Fenger, K., Olesen, J. Migraine without aura and migraine with aura are distinct clinical entities: A study of four hundred and eighty-four male and female migraineurs from the general population. Cephalalgia. 16 (4), 239-245 (1996).
- Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 9 (1), 37-44 (1985).
- Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 13 (2), 167-170 (1980).
- Recober, A., et al. Role of calcitonin gene-related peptide in light-aversive behavior: implications for migraine. Journal of Neuroscience. 29 (27), 8798-8804 (2009).
- Recober, A., Kaiser, E. A., Kuburas, A., Russo, A. F. Induction of multiple photophobic behaviors in a transgenic mouse sensitized to CGRP. Neuropharmacology. 58 (1), 156-165 (2010).
- Kaiser, E. A., Kuburas, A., Recober, A., Russo, A. F. Modulation of CGRP-induced light aversion in wild-type mice by a 5-HT(1B/D) agonist. Journal of Neuroscience. 32 (44), 15439-15449 (2012).
- Kuburas, A., et al. PACAP induces light aversion in mice by an inheritable mechanism independent of CGRP. Journal of Neuroscience. , (2021).
- Russo, A. F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): a new target for migraine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 533-552 (2015).
- Sowers, L. P., et al. Stimulation of Posterior Thalamic Nuclei Induces Photophobic Behavior in Mice. Headache. 60 (9), 1961-1981 (2020).
- Afridi, S. K., et al. A positron emission tomographic study in spontaneous migraine. Archives of Neurology. 62 (8), 1270-1275 (2005).
- Mason, B. N., et al. Vascular actions of peripheral CGRP in migraine-like photophobia in mice. Cephalalgia. 40 (14), 1585-1604 (2020).
- Guo, S., Vollesen, A. L. H., Olesen, J., Ashina, M. Premonitory and nonheadache symptoms induced by CGRP and PACAP38 in patients with migraine. Pain. 157 (12), 2773-2781 (2016).
- Christensen, C. E., et al. Migraine induction with calcitonin gene-related peptide in patients from erenumab trials. Journal of Headache and Pain. 19 (1), 105 (2018).
- Younis, S., et al. Investigation of distinct molecular pathways in migraine induction using calcitonin gene-related peptide and sildenafil. Cephalalgia. 39 (14), 1776-1788 (2019).
- Asghar, M. S., et al. Evidence for a vascular factor in migraine. Annals of Neurology. 69 (4), 635-645 (2011).
- Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Scientific Reports. 10 (1), 3509 (2020).
- Campos, A. C., Fogaca, M. V., Aguiar, D. C., Guimaraes, F. S. Animal models of anxiety disorders and stress. Revista Brasileira De Psiquiatria. 35, 101-111 (2013).
- Kuburas, A., Thompson, S., Artemyev, N. O., Kardon, R. H., Russo, A. F. Photophobia and abnormally sustained pupil responses in a mouse model of bradyopsia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (10), 6878-6885 (2014).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cernuda-Morollon, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Chanda, M. L., et al. Behavioral evidence for photophobia and stress-related ipsilateral head pain in transgenic Cacna1a mutant mice. Pain. 154 (8), 1254-1262 (2013).
- Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
- Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
- Jacob, W., et al. Endocannabinoids render exploratory behaviour largely independent of the test aversiveness: Role of glutamatergic transmission. Genes, Brain, and Behavior. 8 (7), 685-698 (2009).
- Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
- Ramachandran, R., et al. Role of Toll-like receptor 4 signaling in mast cell-mediated migraine pain pathway. Molecular Pain. 15, 1744806919867842 (2019).
- Marek, V., et al. Implication of Melanopsin and Trigeminal Neural Pathways in Blue Light Photosensitivity in vivo. Frontiers in Neuroscience. 13, 497 (2019).
- Christensen, S. L. T., Petersen, S., Sorensen, D. B., Olesena, J., Jansen-Olesen, I. Infusion of low dose glyceryl trinitrate has no consistent effect on burrowing behavior, running wheel activity and light sensitivity in female rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 80, 43-50 (2016).
- De Vera Mudry, M. C., Kronenberg, S., Komatsu, S., Aguirre, G. D. Blinded by the light: retinal phototoxicity in the context of safety studies. Toxicologic Pathology. 41 (6), 813-825 (2013).
- White, D. A., Fritz, J. J., Hauswirth, W. W., Kaushal, S., Lewin, A. S. Increased sensitivity to light-induced damage in a mouse model of autosomal dominant retinal disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (5), 1942-1951 (2007).
- Song, D., et al. Retinal pre-conditioning by CD59a knockout protects against light-induced photoreceptor degeneration. PloS One. 11 (11), 0166348 (2016).
- Matynia, A., et al. Light aversion and corneal mechanical sensitivity are altered by intrinscally photosensitive retinal ganglion cells in a mouse model of corneal surface damage. Experimental Eye Research. 137, 57-62 (2015).
