Summary
설치류는 편두통 증상을보고 할 수 없습니다. 여기에서는 편두통 환자에서 가장 흔하고 귀찮은 증상 중 하나 인 가벼운 혐오감을 측정하기위한 관리 가능한 테스트 패러다임 (빛 / 어둠 및 개방 필드 분석)을 설명합니다.
Abstract
편두통은 광공포증으로 관찰되는 빛에 대한 과민증과 같은 두통과 감각 이상을 특징으로하는 복잡한 신경 장애입니다. 마우스가 편두통을 겪고 있는지 확인하는 것은 불가능하지만 가벼운 혐오감은 광공포증의 편두통 증상에 대한 행동 대리자로 사용될 수 있습니다. 가벼운 혐오감을 테스트하기 위해, 우리는 밝은 / 어두운 분석을 사용하여 마우스가 밝거나 어두운 환경에서 자유롭게 보내는 시간을 측정합니다. 이 분석은 테스트 절차를 실행하기 전에 챔버에 사전 노출되고 조정 가능한 챔버 조명의 두 가지 중요한 수정을 도입하여 개선되었으며 55lux에서 27,000lux까지의 다양한 광도를 사용할 수 있습니다. 어둠 속에서 더 많은 시간을 보내는 선택은 불안을 나타내기 때문에, 우리는 또한 불안과 가벼운 혐오스러운 행동을 구별하기 위해 빛에 독립적 인 불안 테스트 인 오픈 필드 분석을 사용합니다. 여기에서는 밝은/어둡고 개방된 필드 분석에 대한 수정된 테스트 패러다임을 설명합니다. 이들 분석의 적용은 두 개의 마우스 균주에서 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP)의 복강내 주사 및 광유전학적 뇌 자극 연구를 위해 기술된다.
Introduction
편두통은 널리 퍼진 신경 질환으로 미국인의 약 17 %에 영향을 미치며1 전 세계적으로 장애의 두 번째 주요 원인입니다2,3. 환자는 메스꺼움 및 / 또는 구토, 또는 광공포증 및 음파 공포증4 중 적어도 하나의 증상과 함께 4-72 시간 지속되는 두통을 경험합니다. 현재 FDA가 승인한 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 항체 개발의 최근 발전은 편두통 치료의 새로운 시대를 열었습니다5,6,7. 이 항체는 CGRP 또는 그 수용체를 차단하고 편두통 환자의 약 50 %에서 편두통 증상을 예방합니다7. 지난 한 해 동안, CGRP 수용체의 두 개의 소분자 길항제는 편두통의 중단 치료를 위해 FDA 승인을 받았으며 두 개 이상의 파이프 라인에 있습니다8. 이러한 치료 진행에도 불구하고 편두통 발작이 발생하는 메커니즘은 여전히 애매합니다. 예를 들어, CGRP 동작의 사이트는 알려져 있지 않다. 혈액 뇌 장벽을 상당히 넘지 않는 치료 항체의 효능은 CGRP가 수막 및 / 또는 삼차 신경절과 같은 말초 부위에서 작용한다는 것을 암시합니다. 그러나 우리는 혈액 - 뇌 장벽이 부족한 원주 심실 기관에서의 중심 행동을 배제 할 수 없습니다9. 적어도 광공포증의 경우, 우리는 hRAMP1이 신경 조직에서 과발현되는 트랜스제닉 네스틴/hRAMP1 마우스를 사용한 가벼운 혐오감으로 인한 결과를 고려할 때 이것이 덜 가능하다고 생각합니다10. 편두통 병리 생리학의 메커니즘을 이해하는 것은 편두통 치료제의 개발에 새로운 길을 제공 할 것입니다.
전임상 동물 모델은 질병 메커니즘과 신약 개발을 이해하는 데 중요합니다. 그러나 동물의 편두통 평가는 동물이 통증에 대한 감각을 구두로보고 할 수 없기 때문에 어렵습니다. 편두통 환자의 80-90 %가 광공포증11을 나타낸다는 사실을 감안할 때, 가벼운 혐오감은 동물 모델에서 편두통의 지표로 간주됩니다. 이로 인해 마우스의 빛 혐오감을 평가하기위한 분석법을 개발해야했습니다.
밝은/어두운 분석에는 밝은 영역과 어두운 영역이 포함되어 있습니다. 그것은 빛에 대한 타고난 혐오감에 의해 상쇄되는 새로운 환경에 대한 자발적인 탐구를 기반으로 생쥐의 불안을 측정하는 데 널리 사용됩니다12. 일부 연구는 챔버의 1/3을 어두운 영역으로 설정하고 다른 연구는 챔버의 1/2을 어두운 영역으로 설정합니다. 이전 설정은 종종 불안을 감지하는 데 사용됩니다13. 처음에는 동일한 크기의 밝은 / 어두운 챔버를 선택했지만 두 개의 상대 크기를 비교하지는 않았습니다. 우리는 초기 테스트 박스(14 )가 후속 장치15보다 상당히 컸기 때문에 두 챔버의 전체 크기가 주요 요인이 아니라는 것을 언급할 수 있지만, 결과는 본질적으로 동일하였다.
빛 혐오감을 평가하기 위한 이 밝은/어두운 분석의 두 가지 중요한 수정은 테스트 조건과 광도였습니다(그림 1). 첫째, 마우스는 탐사 구동을 줄이기 위해 밝은/어두운 챔버에 사전 노출된다(그림 1A). 사전 노출의 필요성과 시간은 마우스 균주 및 모델에 따라 다릅니다. 야생형 C57BL/6J 마우스는 보통 두 번의 사전 노출이 필요하지만10, CD1 마우스에 대한 사전 노출은 단 한 개만 있으면 충분합니다17. 이러한 방식으로, 광-혐오스러운 거동은 이들 두 마우스 균주에서 마스킹되지 않을 수 있다. 둘째, 챔버 조명은 어두운 흐린 날과 비교할 수있는 희미한 (55 럭스)에서 밝은 (27,000 럭스)까지 조정 가능한 범위의 광도를 포함하도록 조정되었으며, 27,000 럭스는 그늘에서 밝고 화창한 날과 비슷합니다10. 우리는 필요한 빛의 강도가 균주와 유전 모델에 따라 다르다는 것을 발견했습니다. 이러한 이유로 개인은 먼저 실험 패러다임에 대한 최소 광도를 평가해야합니다.
가벼운 혐오스러운 표현형을 나타낼 수있는 분석법에 대한 이러한 수정에도 불구하고, 빛만으로 인한 빛 혐오감과 불안으로 인한 빛의 혐오감을 구별하기 위해 불안과 같은 행동을 테스트 할 필요가 있습니다. 개방형 필드 분석은 새로운 환경의 자발적인 탐구를 기반으로 불안을 측정하는 전통적인 방법입니다. 그것은 탐험 드라이브가 보호되지 않은 열린 공간에 대한 타고난 혐오감에 의해 반대된다는 점에서 빛 / 어둠 분석과 다릅니다. 챔버의 중심과 가장자리는 모두 빛에 있으므로 개방 필드 분석은 빛에 독립적 인 불안 분석입니다. 따라서, 빛/어둠 및 개방장 분석의 조합은 우리가 빛의 회피로 인한 빛의 혐오감과 불안의 전반적인 증가로 인한 빛의 혐오감을 구별할 수 있게 해준다.
CGRP는 혈관 확장, nociception 및 염증을 조절하는 다기능 신경 펩티드입니다18. 그것은 말초 및 중추 신경계에서 널리 발현됩니다. 편두통 병태생리학18에서 중요한 역할을 한다. 그러나 편두통에서 CGRP 작용의 기초가되는 메커니즘은 명확하지 않습니다. 이 변형된 테스트 패러다임과 함께 밝은/어둡고 개방된 필드 분석을 활용함으로써, 우리는 peripheral10,16(그림 2) 및 central14,15,16,19 CGRP 투여 후 마우스에서 광혐오적 거동을 확인할 수 있었습니다. 신경 펩티드 이외에, 가벼운 혐오감에 관여하는 뇌 영역의 확인은 편두통 병리 생리학을 이해하는 데에도 중요합니다. 후부 시상 핵은 통증과 가벼운 처리를위한 통합 뇌 영역이며19, 시상은 편두통 동안 활성화됩니다20. 따라서, 우리는 채널로돕신-2 (ChR2) 또는 eYFP를 함유하는 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 이 영역에 주입함으로써 후부 시상 핵을 표적으로 삼았다. 이 광유전학적 접근법을 이들 두 분석법과 결합함으로써, 우리는 후부 시상 핵에서 ChR2 발현 뉴런의 광학 자극이 광 혐오감을 유도한다는 것을 입증하였다19 (도 3). 이 실험에서, 이들 광유전학적으로 조작된 마우스에서 유발된 광 혐오감에 대한 극적인 효과를 감안할 때, 챔버에 대한 사전 노출은 생략되었다.
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Protocol
동물 절차는 아이오와 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 정한 표준을 준수하여 수행되었습니다.
1. 빛/어두운 분석
- 빛/어두운 챔버 장치( 재료 표 참조) 설정. 이 섹션의 모든 장비는 상업적으로 이용 가능합니다.
- 선반에 챔버와 어두운 인서트에 쉽게 접근할 수 있도록 풀아웃 서랍이 들어있는 소음 감쇠 칸막이(내부: W x H x D에서 59.7 x 38 x 35.6cm)를 놓습니다.
- DC 전원 공급 장치와 DC 레귤레이트 전원 공급 장치를 방음 큐비클에 연결합니다.
- 투명한 이음새가 없는 오픈 필드 챔버(27.31 x 27.31 x 20.32 cm in L x W x H)를 큐비클의 풀아웃 서랍에 놓습니다.
- 검정색, 적외선(IR) 투명 플라스틱 다크 인서트(28.7 X 15 X 20.6 cm in L x Wx H)를 오픈 필드 챔버에 놓습니다. 챔버가 같은 크기의 두 구역, 즉 어두운 영역과 밝은 영역으로 나뉘어져 있는지 확인하십시오.
- 오픈 필드 챔버의 X, Y 및 Z 축에 있는 세 세트의 16빔 IR 어레이를 케이블을 통해 IR USB 컨트롤러에 연결합니다.
- IR USB 컨트롤러를 컴퓨터에 연결합니다.
- 마우스 위치 및 활동을 기록하고 수집 할 수있는 추적 소프트웨어를 컴퓨터에 설치하십시오.
- 조명 패널 설정을 위해 먼저 발광 다이오드(LED) 조명 패널(27.70 x 27.70cm(L x W, LED 360개, 일광 밸런스 컬러, 5600K, 60° 플러드 빔 확산)을 원래 하우징에서 분리합니다.
- 조명 패널을 LED 드라이버, 방열판 및 전원 공급 장치로 조립합니다. 여러 개의 LED 조명 패널을 하나의 전원 공급 장치, 방열판 및 LED 드라이버에 연결하여 균일 한 조명 패널 제어를 달성 할 수 있습니다.
- 0.53cm 간격으로 7개의 동일한 선반으로 구성된 맞춤형 아크릴 플랫폼(L x W x H에서 29.77 x 27.70 x 8.10cm)을 구성합니다(그림 1B). 맞춤형 아크릴 선반을 챔버 위의 칸막이 내부의 천장에 영구적으로 부착하십시오.
- LED 조명 패널을 하단 두 선반 사이의 슬롯에 삽입합니다. 필요한 경우 조명 패널을 다른 높이로 조정하십시오 (그림 1B, C), (예 : 광유전학 마우스를 사용하는 경우). 자세한 내용은 섹션 3)에서 설명합니다.
- 방열판, LED 드라이버 및 전원 공급 장치를 켭니다. LED 드라이버가 챔버 바닥의 광도를 측정하여 LED 광도를 지시할 수 있는지 확인하고 바닥이 고르게 켜져 있는지 확인합니다.
- 행동 테스트 절차
참고 : 마우스는 12 시간 빛주기에 보관됩니다. 모든 행동 실험은 광주기 동안 수행된다. 10-20 주 된 남성과 여성 모두를 포함한 마우스가 사용됩니다. 이 프로토콜에서, 순진한 야생형 CD1 및 C57BL/6J 마우스는 빛/어두운 챔버에 두 번의 사전 노출을 경험한 후 치료 및 치료 후 노출을 경험한다. 마우스가 회복할 수 있도록 각 노출 사이에는 3일 간격이 있다(제1일, 제4일, 제7일 및 제10일은 하기 및 도 1A에 기재된 바와 같다). 그러나, CD1 마우스는 2차 사전 노출을 필요로 하지 않으며, 희미한 빛에서 시험될 수 있다.- 1일째(전처리 1)에 밝/어두운 분석 장치를 켜고 광도를 27,000lux로 설정합니다.
- 추적 소프트웨어를 열고 새 프로토콜을 설정합니다. 새 프로토콜 설정에서 지속 시간을 30분으로 설정합니다. 새 분석 설정에서 기간별 데이터 저장소 를 300초로 설정합니다.
- 새 영역 설정에서 미리 정의된 영역을 선택합니다. 2를 선택한 다음 수평을 선택합니다. 챔버가 녹화를 위해 수평으로 두 개의 동일한 크기의 영역으로 나뉘어져 있는지 확인하십시오.
- 시험 전에 1 시간 동안 시험실에 생쥐를 습관화하십시오. 습관화하는 동안 마우스의 일주기 리듬을 방해하지 않도록 방을 밝게 유지하십시오. 빛/어두운 분석을위한 모든 장비가 켜져 있는지 확인하여 마우스가 시험실 환경에 완전히 적응할 수 있도록하십시오.
- 데이터 수집을 선택합니다. 마우스 ID를 입력합니다. 프로토콜을 시작합니다.
- 서랍을 소음 감쇠 칸막이 바깥쪽으로 당겨 밝은/어두운 챔버와 어두운 인서트에 접근합니다. 꼬리 밑으로 마우스를 부드럽게 집어 들고 챔버의 조명 영역에 놓고 서랍을 칸막이 안쪽으로 밀어 넣으십시오. 소프트웨어가 마우스를 즉시 감지하고 활동을 기록하기 시작하는지 확인하십시오.
- 30분 후에 녹화가 자동으로 중지될 때까지 기다립니다. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
- 항미생물 활성 성분으로서 55.0% 이소프로필 알코올, 0.25% 알킬 C12-18 디메틸에틸벤질암모늄 및 0.25% 알킬 C12-18 디메틸벤질암모늄 클로라이드를 함유하는 알콜-냄새 살균 일회용 물티슈를 사용하여 챔버 및 다크 인서트를 청소하여 이전 마우스에 의해 남겨진 후각 신호를 근절한다.
- 4일째(전처리 2)에 1.2.1~1.2.8단계를 반복한다.
- 7일째(치료일)에 1.2.1 및 1.2.4단계를 반복한다. 습관화 후 CGRP (0.1 mg / kg, 마우스 체중 기준 10 μl / g, 복강 내 주사 (i.p.))를 투여하고 마우스의 머리를 앞으로 기울이고 오른쪽 아래 사분면에 주사하십시오. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
- 30분 후 프로토콜을 시작하고 1.2.5~1.2.7단계에서 설명한 대로 밝은/어두운 챔버에서 마우스를 실행합니다. 주사 후 홈 케이지의 회복 시간은 치료에 따라 단축되거나 길어질 수 있습니다21.
- 챔버를 청소하고 단계 1.2.8에 설명된 대로 어두운 삽입물을 삽입하십시오.
- 10일째(치료 후 날)에 1.2.1~1.2.8단계를 반복한다. 실험은 개방 필드 분석을 시작하기 전에 단계 1.2.13에서 일시 중지될 수 있다.
2. 개방 필드 분석
- 장치 설정
- 오픈 필드 챔버 설정: 어두운 인서트를 사용하지 않고 밝은/어두운 분석에 사용된 것과 동일한 사운드 감쇠 큐비클 및 오픈 필드 챔버를 사용하십시오.
- 라이트 패널 설정: 밝은/어두운 분석에 사용된 것과 동일한 설정을 사용합니다. 광도가 광/암흑 분석에서 사용된 것과 동일한지 확인하십시오.
- 행동 테스트 절차
- 장치를 켭니다. 조명 강도를 27,000럭스로 설정합니다.
- 추적 소프트웨어를 엽니다.
- 새 영역 설정을 제외하고 밝/어두운 분석에서 사용되는 것과 동일한 새 프로토콜을 설정합니다. 새 영역 설정에서 1을 선택한 다음 중심을 선택합니다. 둘레를 둘레에서 3.97cm, 중심을 19.05cm에서 19.05cm로 설정×십시오.
- 단계 1.2.4에 기재된 바와 같이 마우스를 시험실에 습관화시킨다.
- CGRP (0.1 mg / kg, 마우스 체중 기준 10 μl / g, i.p.)를 투여하고 마우스의 머리를 앞으로 기울이고 오른쪽 아래 사분면에 주사하십시오. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
- 30분 후 프로토콜을 시작합니다. 풀아웃 서랍을 사운드 감쇠 칸막이 바깥쪽으로 당기고 마우스를 열린 필드 챔버 중앙에 부드럽게 놓습니다. 서랍을 칸막이 안쪽으로 밀어 넣습니다.
- 30 분 동안 행동을 추적하십시오. 그런 다음 생쥐를 집 새장으로 돌려 보내십시오.
- 단계 1.2.8에 설명된 대로 장치를 청소합니다.
3. 광유전학 마우스에 대한 변형된 광/어두운 분석
- 장치 설정
- 어두운 삽입물을 두 번 수정합니다.
- 어두운 삽입물의 위쪽과 구멍 사이에 0.95 x 10.16cm(W X H)의 작은 슬릿으로 어두운 삽입물의 개구부를 5.08 x 5.08cm(W x H)로 수정합니다(그림 1D 왼쪽 상단).
참고: 이 수정을 통해 마우스 헤드의 광섬유 캐뉼라가 패치 코드에 부착될 때 마우스가 어려움 없이 어두운 영역으로 이동할 수 있습니다. - 어두운 인서트의 위쪽을 삼각형 현관(H=6.5cm)으로 밝은 영역 위로 뻗습니다(그림 1D 오른쪽 상단과 왼쪽 아래). 현관에서 원형 구멍(D=1.7cm)을 잘라내고 홀더를 구멍에 삽입하여 레이저와 광섬유 패치 코드를 연결하는 회전 조인트를 배치하고 안정화합니다(그림 1D 왼쪽 상단과 왼쪽 하단).
참고: 수정을 통해 어두운 영역의 바닥에 도달하는 광도의 작은 변화가 발생합니다(수정 시 17럭스 대 수정 없이 14럭스, 27,000럭스 미만의 어두운 영역의 오른쪽 뒤쪽 모서리에서 측정됨).
- 어두운 삽입물의 위쪽과 구멍 사이에 0.95 x 10.16cm(W X H)의 작은 슬릿으로 어두운 삽입물의 개구부를 5.08 x 5.08cm(W x H)로 수정합니다(그림 1D 왼쪽 상단).
- 회전 조인트를 어두운 인서트의 홀더에 삽입합니다.
- 30.5cm 광섬유 패치 코드를 회전 조인트에 연결합니다. 마우스가 챔버를 통과할 때 패치 코드가 어려움 없이 회전할 수 있도록 회전 조인트가 부드럽게 회전할 수 있는지 확인합니다.
- 나머지 설정의 경우 섹션 1(밝은/어두운 분석)에 사용된 것과 동일한 장치 설정을 사용합니다.
- 어두운 삽입물을 두 번 수정합니다.
- 행동 테스트 절차
참고: 야생형 마우스와는 달리, 광유전학적 마우스는 사전 노출(전처리 1 및 2)을 받지 않는다.- 시험 당일, LED 조명 패널을 두 번째로 낮은 슬롯(캠버 바닥에서 28.23cm)에 삽입하여 패치 코드를 연결할 수 있는 공간을 확보하십시오. 밝은/어두운 분석 장치를 켜고 조명 강도를 55lux로 설정합니다.
- 3.2.3단계에서 레이저 자극 프로토콜과 일치하도록 새 분석 설정에서 지속 시간별 데이터 빈도가 60초로 설정된다는 점을 제외하면 1.2.2 및 1.2.3에서와 동일한 프로토콜 설정을 사용합니다.
- 레이저 전원 단추를 켭니다. 레이저 펄스 컨트롤러를 1 분 동안 자극 한 다음 30 분 동안 자극없이 1 분 동안 자극하도록 설정하십시오.
- 시험 전에 1 시간 동안 빛을 켜고 시험장에 마우스를 습관화하십시오.
- 프로토콜을 시작합니다. 사운드 감쇠 칸막이 바깥쪽으로 풀아웃 서랍을 당겨 밝은/어두운 챔버와 어두운 인서트에 접근합니다.
- 마우스를 부드럽게 억제하고 짝짓기 슬리브를 통해 마우스 헤드의 광섬유 캐뉼라를 광섬유 패치 코드에 결합합니다(그림 1D 오른쪽 아래). 마우스를 조명 영역에 부드럽게 놓고 서랍을 칸막이 안쪽으로 밀어 넣으십시오. 프로토콜이 마우스 동작을 자동으로 기록하기 시작하는지 확인합니다.
- 1분에 펄스 컨트롤러를 켠 다음 페일세이프 키를 ON으로 켭니다. 표적 뇌 영역의 레이저 자극이 격분마다 발생하는지 확인하십시오.
- 프로토콜이 자동으로 중지되면 30분 후 failsafe 키를 OFF로 돌립니다. 그런 다음 펄스 컨트롤러를 끕니다.
- 마우스와 광섬유 패치 코드를 분리합니다. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
- 챔버를 청소하고 단계 1.2.8에 설명된 대로 어두운 삽입물을 삽입하십시오.
4. 광유전학 마우스에 대한 변형된 개방장 분석
- 장치 설정
- 스탠드와 클램프를 사용하여 챔버 위의 회전 조인트를 안정화합니다(그림 1E).
- 길이가 50cm인 광섬유 패치 코드를 회전 조인트에 연결합니다. 회전 조인트가 부드럽게 회전할 수 있는지 확인합니다.
- 회전 조인트를 스탠드의 적절한 높이로 설정하십시오 : 광섬유 패치 코드가 챔버의 모든 구석에만 도달 할 수 있는지 확인하여 마우스 움직임에 대한 간섭을 피하십시오.
- 나머지 설정의 경우 섹션 1(밝은/어두운 분석)에 사용된 것과 동일한 장치 설정을 사용하되 어두운 삽입은 사용하지 마십시오.
- 행동 테스트 절차
- 밝은/어두운 분석 장치를 켜고 조명 강도를 55lux로 설정합니다.
- 새 영역 설정을 제외하고 수정된 광/어킴 분석(섹션 3)에서와 동일한 프로토콜 설정을 사용합니다. 새 영역 설정에서 중심에서 다음 1을 선택합니다. 둘레를 둘레에서 3.97cm, 중심을 19.05cm에서 19.05cm로 설정×십시오.
- 레이저 전원 단추를 켭니다. 레이저 펄스 컨트롤러를 설정하여 1 분 동안 자극 한 다음 30 분 동안 자극없이 1 분 동안 자극하십시오.
- 단계 3.2.6에 대한 두 가지 변경을 제외하고 단계 3.2.4 내지 3.2.10에 설명된 바와 같이 습관화 및 나머지 시험을 수행한다: 마우스를 조명 영역 대신 챔버의 중앙에 부드럽게 놓는 단계; 마우스의 머리에 연결되는 패치 코드 때문에 풀아웃 서랍을 칸막이 바깥쪽에 보관하십시오.
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Representative Results
이 행동 테스트 패러다임은 가벼운 혐오스러운 행동을 테스트하도록 설계되었습니다. 순진한 야생형 마우스와 광유전학 마우스 모두를 사용하여 표적 뉴런 집단의 자극 동안 실시간으로 빛 혐오감을 조사할 수 있다.
이 절차는 CD1 및 C57BL/6J 마우스10,16에서 말초 CGRP 치료의 효과와 C57BL/6J 마우스19의 후부 시상 핵에서 뉴런의 광학 자극이 빛-혐오스러운 행동에 미치는 영향을 연구하는 데 사용되었다. 10-20주령의 수컷 및 암컷 모두를 포함하는 마우스를 실험에 사용하였다(도 2A, 도 2B-D, 및 도 3). 그 결과, CGRP의 i.p. 주입은 CD1 (도 2A) 및 C57BL/6J (도 2B) 마우스의 광/암흑 분석에서 광/암흑 분석에서 광구역에서 소비된 시간의 지속기간을 유의하게 감소시켰지만, CD1 (데이터는 나타내지 않음) 및 C57BL/6J 마우스(도 2D)10에서 개방장 분석에서 마우스가 중앙에서 보낸 시간에는 영향을 미치지 않았다는 것을 밝혀냈다. 16. 이것은 주변 CGRP가 가벼운 혐오감을 유발하지만 일반적인 불안은 유도하지 않는다는 것을 암시합니다. CGRP를 사용한 치료는 또한 마우스가 암흑 구역에 쉬는 시간을 증가시켰지만 CD1(데이터는 나타내지 않음)과 C57BL/6J 마우스 둘 다에서 밝은 영역에는 쉬지 않았다(도 2C).
광유전학적 프로토콜을 위해, 우리는 AAV2-CaMKIIa-hChR2(E123A)-eYFP 또는 대조군 바이러스 AAV2-CaMKIIa-eYFP19를 주입함으로써 후부 시상 핵에서 칼모듈린 키나제 II 알파(CaMKIIa) 발현 뉴런을 표적화하였다. 동시에, 광섬유 캐뉼라가 후부 시상 핵에 이식되었습니다. ChR2 발현을 위한 충분한 시간을 허용하기 위해 주사 후 3주 후, 우리는 후부 시상 핵에서 뉴런의 광학 자극을 수행하였고, 대조군 바이러스 주입 마우스(eYFP)에 비해 ChR2 주입 마우스의 광/암흑 분석에서 광구역에서 소비된 마우스의 지속 시간의 상응하는 감소를 주목하였다(도 3A). ChR2와 대조군 eYFP 마우스 사이의 개방 필드 분석에서 중심에서의 시간에는 뚜렷한 차이가 없었으며 (도 3C), 불안에 의해서만 주도되지 않은 광혐오적 반응을 나타낸다19. 또한, 어두운 영역에서는 휴식 시간의 증가가 주목되었지만, 조명 영역에서는 그렇지 않다(도 3B). 55lux 및 27,000lux를 사용할 때도 동일한 결과가 얻어졌습니다(그림 3). 편두통 환자는 희미한 빛에도 민감하기 때문에 55-lux 절차가 포함되었습니다.
그림 1: 빛/어두운 분석 타임라인 및 장치. (A) 테스트 패러다임의 타임라인: 밝은/어두운 챔버에 두 번 사전 노출된 후(Pre 1 및 Pre 2), 마우스에 CGRP(0.1mg/kg, i.p.)를 투여한 후 치료 후 측정(Post)을 실시합니다. 빛/어둠 분석 후 적어도 하루 후, 마우스는 다시 CGRP (0.1 mg/kg, i.p.)를 투여받고 오픈 필드 분석에서 실행된다. 전: 전처리; Tx: 치료; 포스트 : 후처리 (B) LED 패널은 아크릴 선반에 의해 챔버 상단에 유지되고 테스트 영역을 조명합니다. 조명 패널의 높이는 다른 높이의 슬롯을 사용하여 조정할 수 있습니다. (C) 밝은/어두운 챔버는 작은 개구부를 가진 어두운 삽입물을 포함한다. LED 조명 패널이 챔버 위에 있습니다. (D) 수정된 다크 인서트의 전면, 측면 및 상단 뷰. 어두운 인서트의 개구부는 패치 코드의 이동을위한 작은 슬릿으로 확장됩니다 (왼쪽 상단). 어두운 인서트의 상단은 회전 조인트 용 홀더가있는 삼각형 현관으로 밝은 영역 위로 확장됩니다 (오른쪽 상단과 왼쪽 하단). 광섬유 패치 코드는 짝짓기 슬리브(오른쪽 하단)를 통해 광섬유 캐뉼라에 연결됩니다. (e) 변형된 개방장 분석. 스탠드와 클램프는 회전 조인트를 고정시킵니다. 챔버는 칸막이 앞쪽으로 당겨지고 문은 열려 있으므로 마우스 헤드에 패치 코드가 부착 된 마우스의 자유로운 움직임이 가능합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 말초 CGRP 투여는 야생형 마우스의 두 균주에서 밝은 빛에서 가벼운 혐오감을 불러일으킵니다. CD1 및 C57/BL6J 마우스를 도 1A에 기재된 타임라인에 따라 시험하였다. (a) CD1 마우스가 30분 간격(27,000 lux)에 걸쳐 5분 간격당 광 구역에서 보낸 시간. 빛에서의 시간 데이터는 시험 동안 시간에 따른 (왼쪽 패널) 및 개별 마우스 (오른쪽 패널)에 대한 5 분 간격 당 평균 시간으로 표시됩니다. 각 시점에서 차량과 CGRP를 비교하고, 괄호로 표시된 대로 Tx와 Pre2 또는 Post 사이를 비교하였다. (Veh, n = 19; 0.1 mg / kg CGRP, n = 19) (b) C57BL/6J 마우스가 30분 간격(27,000럭스)에 걸쳐 5분 간격당 광 구역에서 보낸 시간. 빛의 시간 데이터는 시험 동안 시간에 따라 (왼쪽 패널) 그리고 개별 마우스 (오른쪽 패널)에 대한 5 분 간격 당 평균 시간으로 표시됩니다 (Veh, n = 42; 0.1 mg / kg CGRP, n = 44). (C) 패널 B로부터의 마우스는 또한 광/어둠 분석 동안 어두운 영역과 밝은 영역에서의 휴식 거동에 대해 분석되었다. (d) 패널 B로부터의 마우스를 연속적으로 개방장 분석에서 시험하였다. 비히클 또는 CGRP 치료 후 30분 동안 5분 간격당 챔버 중앙에서 소요된 시간의 백분율(0.1mg/kg, i.p.) (Veh, n = 9; 0.1 mg / kg CGRP, n = 9). 중앙 데이터에서의 시간의 백분율은 시험 동안 시간에 따른 백분율(왼쪽 패널) 및 개별 마우스(오른쪽 패널)에 대한 5분 간격 당 중앙에서의 시간의 평균 백분율로서 도시된다. 모든 패널에 대해, 평균±SEM은 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001로 도시되어 있다. 이 수치는 Mason et al. 201710에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 후부 시상 핵에서 CaMKIIa-발현 뉴런의 광학 자극은 희미하고 밝은 빛 모두에서 광 혐오감을 유도한다. (A) ChR2 또는 eYFP를 인코딩하는 AAV를 주사한 C57BL/6J 마우스의 후부 시상 핵 (55 lux에서: eYFP n = 8, ChR2 n = 11; 27,000 lux에서: eYFP n = 12, ChR2 n = 18) 청색 레이저 (473 nm, 20Hz, 5ms 펄스 폭, 10mW/mm2). 왼쪽 패널은 마우스가 55 또는 27,000 lux에서 30 분에 걸쳐 5 분 간격 당 광 영역에서 보낸 시간을 보여줍니다. 각 시점에서 eYFP 및 ChR2 그룹 간의 비교가 이루어졌다. 오른쪽 패널은 개별 마우스에 대한 5분 간격당 평균 시간을 보여줍니다. (B) 패널 A로부터의 마우스는 또한 광/어둠 검정 동안 밝은 (왼쪽 패널) 및 어두운 (오른쪽 패널) 영역에서의 휴식 거동에 대해 분석되었다. (c) 패널 A로부터의 마우스를 연속적으로 개방장 분석에서 시험하였다. 30분 동안 5분 간격당 개방 필드 챔버의 중앙에서 소요된 시간의 평균 백분율(레이저: 473nm, 20Hz, 5ms 펄스 폭, 10mW/mm2). (eYFP n = 8, ChR2 n = 9). 모든 패널에 대해, 평균±SEM은 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001로 도시되어 있다. 이 수치는 Sowers et al. 202019에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
빛/어둠 분석은 불안과 같은 행동을 평가하기 위해 널리 사용됩니다12. 이 분석은 빛에 대한 생쥐의 타고난 혐오감과 새로운 환경 (조명 영역)에 배치 될 때 탐구하려는 욕구에 의존합니다. 그러나 여기에서보고 한 바와 같이이 분석은 가벼운 혐오스러운 행동을 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다.
테스트 전에 사전 노출의 수와 필요성을 고려하는 것이 중요합니다. 이것은 마우스 변형 또는 모델에 따라 다릅니다. 예를 들어, 우리의 빛/어두운 분석 프로토콜에서, 순진한 야생형 CD1 및 C57BL/6J 마우스는 치료 테스트 절차를 거치기 전에 두 번 빛/어두운 챔버에 사전 노출되는 반면, 광유전학적 마우스는 사전 노출을 겪지 않습니다. 최근의 한 간행물은 CD1 마우스가 i.p. CGRP 투여 후 가벼운 혐오감을 나타내기에 충분하다고 보고했다17. 결과적으로, 참신 파라미터의 중요성은 치료일10,16일의 도착시에 감소될 것이다. 사전 노출은 탐험 드라이브를 줄임으로써 빛에 대한 혐오감을 드러내는 표현형을 가릴 수 있으며, 따라서 탐사와 혐오감 사이의 균형을 바꿀 수 있습니다. 어떤 경우에는 사전 노출이 필요하지 않습니다. 예를 들어, 신경계에서 CGRP 수용체가 증가한 유전적으로 변경된 마우스의 경우, 사전 노출이 필요하지 않았습니다14. 마찬가지로, 후부 시상 핵에서 CaMKIIa-발현 뉴런이 광학 자극을 표적으로 삼았던 광유전학적으로 조작된 마우스에서, 사전 노출은 필요하지 않았으며, 아마도 뇌의 직접적인 자극에 대한 광혐오적 반응이 매우 강했기 때문일 것이다19. 따라서, 챔버에 대한 사전 노출의 수 및 필요성은 상이한 마우스 균주 또는 모델을 사용할 때 신중하게 고려되어야 한다. 실제로, 챔버에 마우스의 과다 노출은 탐험 행동을 감소시킬 수 있습니다. 이것은 마우스가 치료에 관계없이 암흑 영역을 우선적으로 점유하도록 유도할 것이고, 그 안에서 광혐오적 반응을 관찰하는 능력을 감소시킬 것이다. 반대로, 분석법에 대한 불충분 한 사전 노출은 잠재적 인 광혐오적 행동을 마스킹하는 탐색적 거동으로 이어질 수 있습니다.
치료 후 노출은 마우스가 2일 전에 투여된 CGRP 주사로부터 완전히 회복되었는지를 확인하는 역할을 한다. 이것은 미래의 행동 검사에 영향을 줄 장기간의 치료 효과가 존재하지 않는다는 것을 확인하기 위해 개방 필드 분석 또는 다른 분석을 실행하기 전에 필수적입니다.
우리는 이전 관측치를 기반으로 30분 프로토콜 지속 시간을 선택했습니다10. 우리는 10 min15, 20 min16 및 30 min10에 대한 빛 / 어두운 분석에서 마우스를 별도로 테스트 했습니다. CGRP는 마우스가 0-30분 사이에 빛에서 보내는 시간을 감소시켰지만, 30분이 지난 대조군 마우스는 0-30분에 비해 어둠 속에서 더 많은 시간을 보내는 것을 선호했고, 따라서 30분 동안 시험하기로 결정하였다. 유사한 방식으로, 시험 기간은 상이한 마우스 모델에 대한 시간-반응 곡선을 참조하여 조정될 수 있다. 빛/어두운 챔버에 대한 노출 시간을 길게 하면 조명 영역을 탐색하려는 동기가 줄어들 수 있습니다.
우리는 동물의 행동을 평가하기 위해 많은 다른 매개 변수를 분석했습니다. 빛/어두운 분석의 한 가지 필수적인 특징은 마우스가 빛의 혐오감을 직접 반사하여 조명 영역에서 보내는 시간을 측정하는 것입니다. 휴식 시간의 백분율, 밝은 영역 또는 어두운 영역에서의 수직 빔 브레이크 수 (양육 활동 측정) 및 두 영역 간의 전환 수는 운동성을 평가하는 데 사용됩니다. 휴식 시간과 수직 빔 브레이크는 움직임에 관한 잘못된 결론을 피하기 위해 각 영역에서 보낸 시간으로 정규화됩니다. 우리는 전체 30 분 동안 라이트 존에 남아있는 마우스, 총 (밝은 영역과 어두운 영역 모두)에서 휴식하는 시간의 90 % 이상을 소비하는 마우스 및 통계적 이상값 (평균에서 >3 SDs)을 제외한 모든 마우스를 분석에 포함합니다. 배제되는 마우스의 수는 일반적으로 1% 미만이다. 개방 필드 분석의 경우, 중심에서의 시간 비율은 불안과 같은 행동을 평가하는 데 사용되는 주요 측정입니다.
변형된 광/암흑 분석에서, 일부 뇌 영역에서 광섬유 캐뉼라의 위치는 마우스의 움직임을 크게 제한할 수 있고, 경우에 따라서는 마우스가 어두운 영역에 도달하는 것을 방지할 수 있다. 결과적으로, 어두운 영역으로의 진입은 부정적으로 강화될 것이고, 다수의 시도 후에, 마우스는 빛에 대한 학습된 선호도를 보여줄 수 있고, 심지어 전체 시험 기간 동안 라이트 존에 남아있을 수 있다. 이것은 어두운 인서트에서 개구부의 크기와 모양을 수정하여 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 야생형 C57BL/6J 마우스의 소뇌에 광섬유 캐뉼러를 설치했을 때, 마우스는 어두운 삽입물의 개구부를 가로지르는 데 어려움을 겪었다. 개구부의 폭을 5.08 cm 대신 6.10 cm로 변경한 후, 마우스는 개구부를 자유롭게 횡단할 수 있었다.
30.5cm 광섬유 패치 코드는 개방 필드 챔버의 크기에 따라 수정된 광/암흑 분석에 사용되므로 마우스가 자유롭게 움직일 수 있습니다. 코드 길이가 짧을수록 마우스가 모서리로 이동하는 것을 방지할 수 있으며, 케이블이 길수록 엉키거나 이동을 방해할 수 있습니다. 변형된 개방장 분석에 사용되는 광섬유 패치 코드의 길이는 50 cm이다. 회전식 조인트의 높이가 광섬유 패치 케이블의 길이에 따라 조정될 수 있기 때문에 길이는 광/어둠 분석에서만큼 엄격하지 않으며, 마우스가 챔버의 모서리에 도달할 수 있도록 합니다.
전력 분석에 기초하여, i.p. CGRP를 가진 CD1 및 C57BL/6J 마우스에 대해, 그리고 광유전학적 C57BL/6J 마우스가 유의한 빛 혐오감을 검출하기 위해서는 그룹당 10-12마리의 마우스가 필요하다. 그러나, C57BL/6J 군 크기는 CD1 그룹 크기보다 상당히 컸으며(도 2A,B), 이는 C57BL/6J 마우스가 테스트10의 서브세트에서 CGRP에 반응하지 않았기 때문이며, 이는 이들 마우스에서 광혐오적 거동에서 이러한 높은 변동성을 설명하기 위해 다수의 시험이 수행되었음을 의미한다. 구체적으로, CD1 마우스에 대해 두 개의 실험을 결합하였고, C57BL/6J 마우스에 대해 i.p. CGRP를 갖는 4개의 실험을 조합하였다(도 2A,B)10. 이 가변성에 대한 이유는 알려져 있지 않지만 인간은 CGRP와 빛에 대한 반응에서 가변성을 보여줍니다. CGRP의 정맥 주사는 편두통 환자의 약 63 ~ 75 %에서 편두통 발작을 유발했으며, 편두통 발작을 보인 환자의 70 ~ 90 %는 광공포증22,23,24,25을 나타냈다. 전체적으로, 상기 분석은 상당한 가변성을 가지며, 마우스의 수 이외에, 마우스의 상이한 코호트와 함께 적어도 두 개 및 바람직하게는 세 개의 완전히 독립적인 실험을 수행하는 것이 필수적이다.
밝고 어두운 챔버에서는 침구가 필요하지 않으며 실험자는 마우스를 미리 다루거나 습관화 할 필요가 없습니다. 예방 조치로서 두 가지 사전 노출 절차는 마우스를 실험자의 후각 및 물리적 단서에 순응시키는 목적을 제공합니다. 그러나, Ueno H. et al.은 반복 취급 후 마우스와 취급이 없는 마우스 사이의 개방 필드 분석에서 빛/어둠 분석에서 빛의 시간 또는 중심에서의 시간에 차이가 없음을 입증하였다26.
개방 필드 분석은 가벼운 혐오스러운 표현형에 대한 불안의 기여도를 평가할 수 있습니다. 상승 된 제로 미로 및 상승 된 플러스 maze27과 같은 다른 잘 검증 된 불안 관련 분석이 있습니다. 그러나, 개방 필드 분석은 동일한 테스트 챔버가 두 검정 모두에 사용되기 때문에 빛/어둠 프로토콜에 대해 절차적으로 가장 관련된 제어입니다. 그럼에도 불구하고 불안에 대한 평가는 여러 분석을 활용하거나 불안이 복잡하고 다각적 인 행동이라는 점을 감안할 때 단일 테스트에서 여러 매개 변수를 측정함으로써 강화 될 수 있습니다. 중요하게도, 개방 필드 분석에서 불안 표현형이 없더라도, 이것은 광혐오적 표현형에 대한 불안 성분을 배제하지 않는다. 예를 들어, 빛은 불안 반응을 유발할 수 있습니다. 개방 필드 분석은 불안만으로는 빛에 대한 반응을 유도하지 않는다는 것을 나타냅니다. 벤조디아제팜과 같은 불안 완화 약물이 이 분석에서 사용될 수 있지만, 그러한 접근법은 합병증, 예를 들어, 불안 완화 약물이 운동에 영향을 미칠 것이다. 대신, 우리는 가벼운 혐오스러운 표현형의 편두통과 같은 상태를 검증하기 위해 sumatriptan을 포함한 임상 항 편두통 약물을 사용하기로 결정했습니다. 수마트립탄은 CD1 및 C57BL/6J 마우스10 모두에서 CGRP 유발 광혐오를 성공적으로 역전시켰다.
수정된 광/어둠 분석과는 달리, 풀아웃 서랍의 챔버는 마우스의 머리에 연결되는 패치 코드로 인해 수정된 개방 필드 분석에서 큐비클 도어가 열린 큐비클 외부에 있습니다. 55 럭스 대신 실내 조명은 ~ 1000 럭스로 챔버 바닥에 도달합니다. 광도가 다르더라도 개방 필드 분석은 빛에 독립적 인 테스트입니다. 상세하게는, 개방장 분석에서 광도를 55에서 27,000 lux로 증가시키면 C57BL/6J 마우스에서 중앙의 시간이 감소하는 추세가 발생하였으며, 이는 광도가 마우스 거동에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다28. 그러나 대조군과 실험군 간의 차이는 55 또는 27,000 lux28 하에서 유의하지 않았다. 또한 55와 1000 럭스 사이의 광 강도 차이는 55와 27,000 럭스 사이의 것보다 훨씬 미묘합니다. 무선 광유전학은 패치 코드가 없기 때문에이 문제를 해결할 수 있으므로 개방 필드 챔버를 사운드 감쇠 칸막이 내부로 밀어 넣을 수 있습니다.
또한 패치 코드는 최적의 길이를 선택했음에도 불구하고 여전히 마우스 움직임을 제한합니다. 앞으로 무선 광유전학은 케이블 기반 광유전학 기술에 대한 비침습적 대안을 제공할 것이다.
우리는 편두통 발작에 수반되는 장기간의 CGRP 방출을 부분적으로 복제하는 CGRP의 급성 주사를 사용했다는 점에 유의해야합니다. 혈장 CGRP 수치가 증가했다는 전제에 따라 편두통을 모델링하기 위해 CGRP를 마우스에 주사했지만29 i.v CGRP가 편두통 환자22,23,24,25,30 에서 편두통 발작을 유발했다는 전제에 따라, 이것은 CGRP가 비교적 오랜 시간 동안 높은 수준으로 유지되는 환자의 상태를 복제하지 않을 것입니다 (편두통이 시작된 후 중앙값 3 시간에 환자 측정이 수행되었습니다29). ), 또한 공격 사이에서도 수치가 상승하는 것으로 보고되는 만성 편두통을 복제하지 않습니다31. 또한, 다른 통증 유발 매개체는 우리의 패러다임에서 테스트되지 않았습니다.
Mogil 그룹은 마우스의 가벼운 혐오감을 측정하기 위해 상승 된 플러스 미로를 수정했으며, 닫힌 팔은 밝은 빛으로 비추고 열린 팔은 어두운 채로 남아 있습니다32. 표준 상승 플러스 미로는 종종 동물의 불안 관련 행동을 감지하는 데 사용되었습니다. 이 분석은 새로운 환경을 탐험하려는 마우스의 타고난 욕망과 개방 된 보호되지 않은 미로 팔에서 타협하는 위치에 놓이는 것 사이의 갈등을 기반으로합니다. 수정 된 프로토콜에서 마우스는 밝은 빛으로 조명되는 닫힌 팔과 어두운 열린 보호되지 않은 팔 사이에서 선택해야합니다. 전자에 대한 선호는 불안이 가벼운 혐오감을 지배한다는 것을 암시하는 반면, 후자에 대한 선호는 가벼운 혐오감이 불안보다 우선한다는 것을 암시합니다. Mogil 그룹은 또한 불안과 같은 행동을 평가하기 위해 표준 상승 플러스 미로를 실시했습니다32. 목적은 우리의 프로토콜에서 오픈 필드 분석을 수행하는 것과 동일합니다. 가족성 편두통 모델인 Cacna1a 돌연변이 마우스는 닫힌 팔이 밝았을 때 광공포증을 보였다. 대조적으로, 불안과 같은 행동은 표준 상승 플러스 미로가 수행되었을 때 감지되지 않았습니다32. 쥐에서, 변형된 상승된 플러스 미로와 빛/어두운 검정을 모두 사용함으로써, 니트로글리세린(NTG)이 광공포증을 유도할 수 있다는 것이 입증되었고, 이는 수마트립탄34에 의해 구출되었다. 닫힌 팔 내에 빛이 없는 표준 상승 플러스 미로 설정에서, NTG는 쥐34에서 불안과 같은 행동을 유도했으며, 이는 NTG로 인한 가벼운 혐오감이 불안을 동반한다는 것을 암시한다. 우리가 아는 한, 동일한 마우스 모델에서 빛 / 어두운 분석과 수정 된 상승 된 미로를 사용하는 간행물은 없습니다. 대체로,이 프로토콜에서 제안 된 수정 된 상승 된 미로와 빛 / 어둠 분석은 마우스에서 빛-혐오스러운 행동의 효과적인 척도로 입증되었습니다.
우리는 일광 균형 색상 (5600K)의 일광 LED 패널을 사용하여 60 ° 홍수 빔이 퍼지고 챔버 바닥에서 ~ 30cm 높이에서 55 럭스 또는 27,000 럭스로 그림자가 드리워지지 않습니다. 빛 혐오감을 조사하는 다른 연구들은 다양한 변형으로 빛/어두운 분석을 활용했습니다. 예를 들어, 연구는 수백 개에서 수천 개의 lux35,36,37에 이르는 조명 영역에 대해 다양한 광도를 사용했습니다. 다른 파장 (예 : 파란색과 노란색)에서 사용 된 빛38; 또는 빛의 다른 온도 (차갑고 따뜻한)39를 사용했습니다. 빛에 의해 생성 된 열은 어둡고 밝은 영역의 온도에 영향을 미치고 마우스의 행동을 방해하여 잠재적으로 특정 영역을 선호 할 수 있으므로 주의해야합니다. 게다가, 챔버 바닥에 그림자를 피하기 위해 좋은 시야각을 가진 빛을 사용하는 것도 중요합니다. 빛의 강도는 테스트에도 중요합니다. 25,000 -27,000 럭스는 밝은 일광과 거의 같습니다. 이러한 높은 광도에서 광/암흑 분석을 수행함으로써, 치료 효과를 증폭시킬 수 있다; 그러나 망막 손상40과 그러한 높은 광도가 빛으로 들어가려는 마우스의 의지에 미치는 부정적인 영향을 고려하는 것이 중요합니다. 일부 연구에 따르면 직접 빛에 노출 된 마우스 눈41과 몇 시간 동안 밝은 빛에 노출 된 마우스 (예 : 4 시간 동안 30,000 럭스42)가 망막 손상을 경험했다고보고했습니다. 밝은/어두운 분석에서, 마우스가 원하는 경우 마우스가 밝은 빛으로부터 탈출할 수 있는 어두운 영역이 있습니다. 또한, 이전 연구에 따르면 대조군 (C57BL / 6J 마우스)의 마우스는 55, 1000 및 27,000 lux28 미만의 광 영역에서 비슷한 시간을 보냈습니다. CD1 마우스의 경우, 대조군은 27,000 lux10 미만의 빛에서 약 1/3의 시간을 보냈고, 공개되지 않은 데이터는 55 lux에서 유사한 결과를 보였다. 그것은 27,000 럭스 라이트가 자체적으로 CD1 및 C57BL / 6J 마우스를 괴롭 히지 않는다는 것을 암시합니다. 그럼에도 불구하고 더 높은 광도를 선택할 때는주의해야합니다.
조명 설정의 차이와 함께 연구자들은 빛/어두운 데이터를 분석하는 데 있어 다양한 접근법을 선택했습니다. 빛의 혐오감을 평가할 때, 빛이 꺼진 상태에서 조명 영역에서 보낸 시간 (또는 쥐의 눈이 적색광을 덜 받아들이는 경우 조명 영역의 적색 조명 조명)이 계산에 포함됩니다. 예를 들어, 혐오 지수=(light0 lux-time in lighttest lux)/time in light0 lux는 Gorin 그룹에 의해 빛의 혐오감을 평가하기 위해 사용되었다43. 여기서, '조명 끄기' 또는 '적색 조명' 조건은 광 영역의 회피가 단순한 장소 선호도와는 반대로 존재하는 빛에 조건적이라는 것을 확인하기 위해 포함된다. 우리는 CGRP의 i.p. 주사로이 절차를 수행했으며, CGRP를받는 마우스가 광 영역에서 빛이 꺼진 장소 선호도가 없다는 것을 발견하여 CGRP로 인한 혐오감이 빛에 의존적이라는 것을 확인했습니다16. 마지막으로, 고린 그룹은 불안의 척도로서 빛/어둠의 분석에서 밝은 영역의 주변에서 쥐가 보낸 시간을 사용했다36. 우리는 불안에 대한 전통적인 테스트, 오픈 필드 분석을 활용합니다. 어떤 분석 방법을 선택하든, 가벼운 혐오감에 대한 불안의 기여는 무시할 수 없다는 점에 유의해야합니다. 이 프로토콜은 빛/어둠 및 개방 필드 분석을 동시에 활용하여 불안과 같은 가벼운 혐오스러운 행동을 분할하려고 시도합니다.
이 프로토콜은 마우스에서 빛-혐오스러운 행동의 검출을 위한 밝은/어둡고 개방된 필드 분석의 사용을 다룹니다. 이것은 광공포증을 유발하는 신경 회로와 뇌 영역의 메커니즘을 식별하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 시험 패러다임은 편두통 특이적일 수 있거나 광공포증을 수반하는 다른 장애로 확장될 수 있다. 편두통과 관련하여, 우리는 편두통 병인과 관련된 두 가지 다른 신경 펩티드, 즉 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩티드 (PACAP)와 혈관 활성 장 펩티드 (VIP)를 테스트했습니다. PACAP 및 VIP는 CD1 마우스17,21에서 가벼운 혐오감을 유도하는 것으로 입증되었다. 편두통 외에도 광공포증은 서맥, 급성 안구 손상 또는 염증, 외상성 뇌 증후군, 라임 병, 백색증 및 원뿔 이영양증을 포함한 많은 다른 장애의 증상이기도합니다36. 따라서, 이 시험 패러다임은 광공포증 관련 장애의 기초가 되는 메카니즘을 조사하는 도구를 제공한다. 또한, 광유전학적 방법과 기존의 약리학적 접근법의 결합은 의심할 여지없이 광공포증 관련 장애에 대한 새로운 치료제의 개발에 도움이 될 것이다.
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Disclosures
저자는보고 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH NS R01 NS075599 및 RF1 NS113839의 보조금으로 지원되었습니다. 내용은 VA 또는 미국 정부의 견해를 대표하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Activity monitor | Med Assoc. Inc | Software tracking mouse behavior | |
| Customized acrylic shelf | For adjusting the height of the LED panel | ||
| Dark box insert | Med Assoc. Inc | ENV-511 | |
| DC power supply | Med Assoc. Inc | SG-500T | |
| DC regulated power supply | Med Assoc. Inc | SG-506 | |
| Fiber-optic cannula | Doric | MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT | |
| Germicidal disposable wipes | Sani-Cloth | SKU # Q55172 | |
| Heat Sink | Wakefield | 490-6K | Connecting to LED panel |
| IR controller power cable | Med Assoc. Inc | SG-520USB-1 | |
| IR USB controller | Med Assoc. Inc | ENV-520USB | |
| Mating sleeve | Doric | SLEEVE_ZR_1.25 | |
| Modified LED light panel | Genaray Spectro | SP-E-360D | Daylight-balanced color (5600K) |
| Power supply | MEAN WELL USA | SP-320-12 | Connecting to LED panel |
| Seamless open field chamber | Med Assoc. Inc | ENV-510S | |
| Sound-attenuating cubicle | Med Assoc. Inc | ENV-022MD-027 | |
| Stand and clamp | |||
| Three 16-beam IR arrays | Med Assoc. Inc | ENV-256 |
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