Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

लाग्रिया विल्लोसा बीटल के बर्कहोल्डरिया ग्लेडिओली सिम्बिओंट में बैक्टीरियल कॉलोनाइजेशन कारकों को स्पष्ट करने के लिए एक उपकरण के रूप में ट्रांसपोसन-प्रविष्टि अनुक्रमण

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62843
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3
1Department of Evolutionary Ecology, Institute of Organismic and Molecular Evolution, Johannes Gutenberg University, 2Department of Insect Symbiosis, Max Planck Institute for Chemical Ecology, 3Department of Plant and Environmental Sciences, Section for Organismal Biology, University of Copenhagen

Summary

यह एक बर्कहोल्डरिया लाभकारी सहजीवी में उम्मीदवार कीट उपनिवेशीकरण कारकों की पहचान करने के लिए एक अनुकूलित तरीका है। बीटल होस्ट ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस के माध्यम से उत्पन्न एक यादृच्छिक उत्परिवर्ती पुस्तकालय से संक्रमित है, और उपनिवेशीकरण के बाद पुस्तकालय जटिलता विट्रो मेंउगाए गए नियंत्रण की तुलना में होती है।

Abstract

उनकी गतिविधि में हेरफेर करके जीन के कार्य का अनुमान लगाना अधिकांश जैविक प्रक्रियाओं के आनुवंशिक आधार को समझने के लिए एक आवश्यक उपकरण है। आणविक माइक्रोबायोलॉजी में प्रगति ने जीन के हेरफेर के लिए विविध म्यूटेनेसिस तकनीकों का उद्भव देखा है। उनमें से, ट्रांसपोसन-सम्मिलन अनुक्रमण (टीएन-एसईक्यू) एक साथ कई उम्मीदवार जीन की कार्यक्षमता का एक अलक्षित तरीके से आकलन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। यह तकनीक कई रोगजनक रोगाणुओं और कुछ लाभकारी सहजियों में यूकेरियोटिक मेजबानों के उपनिवेशीकरण के लिए आणविक तंत्र की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण रही है।

यहां, टीएन-सेक्यू को बीटल लाग्रिया विल्लोसाके पारस्परिक बुर्कहोल्डरिया ग्लेडिओन्ट में उपनिवेशीकरण कारकों की पहचान करने के लिए एक विधि के रूप में स्थापित किया गया है। संयुग्मण द्वारा, टीएन5 ट्रांसपोसन-मध्यस्थता में एंटीबायोटिक-प्रतिरोध कैसेट का सम्मिलन बी ग्लेडिओलीमें यादृच्छिक जीनोमिक स्थानों पर किया जाता है। बीटल होस्ट को उपनिवेश बनाने के लिए बैक्टीरिया की क्षमता पर जीन अवरोधों के प्रभाव की पहचान करने के लिए, उत्पन्न बी ग्लेडिओली ट्रांसपोसन-उत्परिवर्ती पुस्तकालय बीटल अंडे पर टीका लगाया जाता है, जबकि एक तरल संस्कृति माध्यम में विट्रो में एक नियंत्रण उगाया जाता है। उपनिवेशीकरण के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देने के बाद, डीएनए वीवो और इन विट्रो विकसित पुस्तकालयों से निकाला जाता है। डीएनए लाइब्रेरी तैयार करने के प्रोटोकॉल के बाद, डीएनए नमूने ट्रांसपोसन-सम्मिलन अनुक्रमण के लिए तैयार किए जाते हैं। डीएनए के टुकड़े जिनमें ट्रांसपोसन-डालने वाले किनारे और फ्लैंकिंग बैक्टीरियल डीएनए होते हैं, का चयन किया जाता है, और उत्परिवर्तन साइटों को ट्रांसपोसन-डालने के किनारे से दूर अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया जाता है। अंत में, वीवो और इन विट्रो पुस्तकालयों के बीच प्रत्येक उत्परिवर्ती की आवृत्तियों का विश्लेषण और तुलना करके, बीटल उपनिवेशीकरण के दौरान विशिष्ट सहजीवी जीन के महत्व की भविष्यवाणी की जा सकती है।

Introduction

बर्कहोल्डरिया ग्लेडिओली लेग्रिया विलोसा बीटल के साथ एक सहजीवी संबंध में संलग्न हो सकता है, जोकीट मेजबान4,5, 6के माइक्रोबियल विरोधी के खिलाफ रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है। मादा बीटल प्रजनन प्रणाली के सहायक विशेष ग्रंथियों में बी ग्लेडिओली के कई उपभेदों को घर करती है। अंडे बिछाने पर, मादाएं अंडे की सतह पर बी ग्लेडिओली कोशिकाओं को धुंधला करती हैं जहां बी ग्लेडिओली द्वारा उत्पादित एंटीमाइक्रोबियल यौगिक एंटोमोपैथिक कवक4, 6द्वारा संक्रमण कोरोकतेहैं। देर से भ्रूणीय विकास के दौरान या लार्वा हैच के तुरंत बाद, बैक्टीरिया लार्वा की पृष्ठीय सतह पर क्यूटिकुलर इनवेजिनेशन को उपनिवेश करते हैं। इस विशेष स्थानीयकरण और सहजियों के ऊर्ध्वाधर पारेषण मार्ग के बावजूद, एल विल्लोसा संभवतः पर्यावरण4से बी ग्लेडिओली क्षैतिज रूप से भी प्राप्त कर सकता है। इसके अलावा, एल विल्लिसा4, 6के सहयोग से बी ग्लेडिओली के कम से कम तीन उपभेद पाए गएहैं। इनमें से बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए ही विट्रो मेंखेती करने योग्य है ।

बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए का जीनोम आकार 8.56 एमबी6 है और इसमें 7,468 जीन हैं। इनमें से कौन सा जीन बी ग्लेडिओली बैक्टीरिया के लिए बीटल होस्ट को उपनिवेश बनाने के लिए महत्वपूर्ण है? इस सवाल का जवाब देने के लिए, हमने ट्रांसपोसन-सम्मिलन अनुक्रमण (टीएन-एसईक्यू) का उपयोग किया, जो सशर्त आवश्यक माइक्रोबियल जीन1,2,3की पहचान करने के लिए एक अन्वेषणात्मक विधि है। बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए की एक उत्परिवर्ती पुस्तकालय एक Tn5 ट्रांसपोसन का उपयोग करके बनाया गया था। एशेरिचिया कोलाई दाता कोशिकाओं से बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए तक, टीएन5 ट्रांसपोसन और उल्टे दोहराता द्वारा फ्लैंक किए गए एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट को ले जाने वाला एक pRL27 प्लाज्मिड स्थानांतरित कर दिया गया था(चित्र 1)। इस प्रकार, म्यूटेंट का एक सेट जो व्यक्तिगत रूप से 3,736 सहजीवी जीन के अवरोधों को ले जाता है(चित्र 2)उत्पन्न हुआ था।

उत्परिवर्ती पूल उपनिवेशन कारकों की पहचान करने के लिए बीटल अंडे पर संक्रमित था और, एक नियंत्रण के रूप में, राजा के बी (केबी) माध्यम में विट्रो में भी उगाया गया था। उपनिवेशीकरण के लिए पर्याप्त समय देने के बाद, रची लार्वा एकत्र किए गए और डीएनए निष्कर्षण के लिए एकत्र किए गए। ट्रांसपोसन डालने युक्त डीएनए के टुकड़े और बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए के पार्श्व जीनोमिक क्षेत्र अनुक्रमण के लिए एक संशोधित डीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग करके चुना गया था । पढ़ें गुणवत्ता प्रसंस्करण DESeq2 के साथ विश्लेषण के बाद बी ग्लेडिओली एलवी-StA के लिए महत्वपूर्ण विशिष्ट जीन की पहचान करने के लिए एल villosa लार्वा उपनिवेश जब अंडे की सतह के माध्यम से प्रेषित किया गया था ।

Protocol

1. मीडिया और बफर तैयारी

  1. टेबल 1में दिए गए केबी और एलबी मीडिया और एगर प्लेट्स तैयार करें, और 121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई, 20 मिनट पर ऑटोक्लेव करें।
    1. ई.कोलाई WMM3064 + pRL27 को बनाने से पहले ऑटोक्लेवेड एलबी माध्यम में 50 माइक्रोन/एमएल फिल्टर-स्टरलाइज्ड कानमाइसिन और 300 माइक्रोन फिल्टर-स्टरलाइज्ड 2,6-डायमिनोपीलिक एसिड (डीएपी) जोड़ें।
    2. सफल बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए ट्रांसकोनजुगंट्स के चयन के लिए आवश्यक प्लेटें डालने के लिए ऑटोक्लेवेड केबी एगर में 50 μg/एमएल फिल्टर-निष्फल कानामाइसिन जोड़ें।
  2. निम्नलिखित घटकों को मिलाकर 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) तैयार करें: एनएसीएल 8 जी/एल, केसीएल 0.201 जी/एल,एनए 2एचपीओ4 1.42 जी/एल, और केएच2पीओ4 0.272 ग्राम/एल. डिस्टिल्ड पानी में साल्ट को घोलकर मिश्रण को 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआई, 20 मिनट पहले उपयोग से पहले ऑटोक्लेव करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  3. निम्नलिखित घटकों को भंग करके 2x बाइंड-एंड-वॉश बफर तैयार करें: 10 mM Tris-HCl (पीएच 7.5), 1 m ethylenediamine टेट्राएसेटिक एसिड (EDTA), और 2 एम एनएसीएल आसुत पानी में। उपयोग से पहले मिश्रण को फ़िल्टर-स्टरलाइज करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  4. डबल-डिस्टिल्ड पानी में 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) और 0.1 एमएम ईडीटीए को भंग करके 1x लो-टी तैयार करें। 121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई, 20 मिनट पर ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।

2. ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए Conjugation

Figure 1
चित्रा 1:संयोजित प्रोटोकॉल चरण। conjugation प्राप्तकर्ता बर्कहोल्डरिया ग्लेडिओली एलवी-एसटीए (लाल) और पीआरएल27 प्लाज्मिड (गुलाबी) युक्त दाता एस्चेरिचिया कोलाई क्रमशः केबी एगर और एलबी में उगाए जाते हैं, जो कानामाइसिन और डीएपी के साथ पूरक होते हैं। 30 डिग्री सेल्सियस पर 12-18 घंटे के लिए प्लाज्मिड के संयोजित हस्तांतरण के बाद, ट्रांसकोनजगेंट बी ग्लेडिओली कोशिकाओं का चयन केबी पर किया जाता है जिसमें कानामाइसिन होता है और एक साथ पूल किया जाता है। संक्षिप्त: डीएपी = 2,6-डायमिनोपिमिलिक एसिड; कान = कानमाइसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. एक बाँझ हुड के तहत, एलबी माध्यम के 10 एमएल में एस्चेरिचिया कोलाई WM3064 + pRL27 की एक ताजा दाता संस्कृति टीका kanamycin और डीएपी के साथ पूरक । केबी माध्यम के 5 एमएल में बर्कहोल्डरिया ग्लेडिओली एलवी-एसटीए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को टीका लगाएं। 250 आरपीएम पर एक शेखर पर रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
  2. रात भर के विकास के बाद, कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 6 मिनट के लिए 9,600 × जी पर प्रत्येक संस्कृतियों का अपकेंद्रित्र 4 एमसीएल। सुपरनेट को त्याग दें।
  3. एक बाँझ हुड के तहत, डीएपी युक्त केबी माध्यम में पेल्ड सेल संस्कृतियों को धोएं और अंत में केबी + डीएपी माध्यम के 4 एमएल में अलग-अलग संस्कृतियों को फिर से ढिंढाएं।
  4. एक ताजा 15 एमएल ट्यूब में, धुले हुए ई कोलाई दाता कोशिकाओं के 250 माइक्रोन को धोया बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के 1 एमएल के साथ मिलाएं।
  5. डीएपी युक्त केबी आगर प्लेटों पर इस संयुग्मण कोशिका मिश्रण के 10 माइक्रोन को स्पॉट करें। प्लेट को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बाँझ हुड में अशान्त आराम करने की अनुमति दें। फिर, 12-18 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर संवग्गेशन स्पॉट के साथ प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: संयोजित अवधि को लक्षित प्रजातियों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, एक लंबी संजीदशन अवधि जीनोम में डबल सम्मिलन या प्लाज्मिड एकीकरण के लिए जोखिम को बढ़ाती है। धीमी गति से बढ़ते बैक्टीरिया के लिए, लंबे समय तक संजीदब अवधि के लिए अनुमति दें।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, एक बाँझ हुड के नीचे प्लेटों में 1x पीबीएस के 2-4 एमएल जोड़ें और एगर से उगाए गए बैक्टीरियल कंजूगेशन स्पॉट को जारी करने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में संयुग्मित-सेल-मिक्स को पिपेट करें।
  7. 2 मिनट के लिए 9,600 × जी पर अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली मार। सुपरनेट को त्यागें और 1x पीबीएस के 1 एमसीएल में दो बार गोली को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धोएं। 1x पीबीएस के 1200 माइक्रोन में अंतिम गोली को फिर से खर्च करें। यदि मिश्रण में कोशिकाओं की संख्या 1 × 104से ऊपर है तो चढ़ाना से पहले कमजोर पड़ें ।
  8. अच्छी तरह से मिलाएं और बड़े केबी आगर प्लेटों (6 या अधिक, यदि आवश्यक हो) पर सेल मिश्रण के 200 माइक्रोन फैलाएं और रात 30 डिग्री सेल्सियस पर कनमाइसिन और इनक्यूबेट के साथ पूरक हो।
    नोट: लक्ष्य उत्परिवर्ती कालोनियों चयनात्मक आगर प्लेटों पर 30 घंटे के भीतर दिखाई देते हैं । एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर के कारण, चयनात्मक आगर प्लेट पर केवल उत्परिवर्तित उपनिवेश दिखाई देते हैं। इसलिए सभी कॉलोनियों के सफल होने की उम्मीद है।
  9. सभी प्लेटों में प्राप्त म्यूटेंट की अनुमानित संख्या की गणना करने के लिए तीन प्लेटों और एक्सट्रपलेशन पर ट्रांसकोंजुगंत कॉलोनियों की कुल संख्या की गणना करें। प्रतिनिधि पुस्तकालय प्राप्त करने की संभावनाओं को बढ़ाने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि कालोनियों की कुल संख्या जीनोम में जीन की कुल संख्या से कई गुना अधिक है। संजीदशन की सफलता की पुष्टि करने के लिए, धारा 3 में वर्णित 10-20 नमूना कॉलोनियों का उपयोग करके प्रविष्टि कैसेट को लक्षित करने वाली पीसीआर करें।
    नोट: इसका उद्देश्य यह सुनिश्चित करना है कि कालोनियों की संख्या कम से 10 गुना पूरे जीनोम में जीन की संख्या गुना है, इस मामले में, >७५,००० म्यूटेंट । हालांकि, आम तौर पर पूरी तरह से प्रतिनिधि पुस्तकालय के अनुरूप उपनिवेशों की संख्या का सटीक अनुमान लगाना चुनौतीपूर्ण होता है। अद्वितीय जीन उत्परिवर्तित की संख्या इस बिंदु पर स्पष्ट नहीं है, यह देखते हुए कि आवश्यक जीन में अवरोधों पर कब्जा नहीं कर रहे हैं, वहां अक्सर एक ही जीन के लिए कई अलग उत्परिवर्तन साइटों रहे हैं, और Tn5 ट्रांसपोसंस के साथ उत्पन्न उत्परिवर्तन पूरी तरह से बेतरतीब नहीं हैं ।
  10. एक बाँझ हुड के तहत, आगर पर 1x पीबीएस के 1-2 एमएल जोड़कर प्लेटों से कालोनियों को परिमार्जन करें। पूल सेल मिश्रण प्लेटों से 50 एमएल ट्यूबों में बंद स्क्रैप। भंवर पुस्तकालय को अच्छी तरह से मिलाने के लिए और फिर कई क्रायोट्यूब में पूल किए गए उत्परिवर्ती पुस्तकालय के 4 एमएल को विभाजित करें। ट्यूबों में 70% ग्लाइस्रोल का 1 मिलियन जोड़ें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए में सफल सम्मिलन की पुष्टि करने के लिए पीसीआर और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस

  1. प्रविष्टि की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, चरण 2.9 में चयन प्लेटों से व्यक्तिगत उत्परिवर्ती कालोनियों को चुनें और तालिका 2में सूचीबद्ध प्राइमर का उपयोग करके प्रविष्टि कैसेट को लक्षित करने वाली पीसीआर प्रदर्शन करें। टेबल 3 के अनुसार पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें और टेबल 4में वर्णित थर्मल साइकिलर में शर्तें निर्धारित करें।
  2. इलेक्ट्रोफोरेसिस (250 वी, 40 मिनट) द्वारा 1.6% एगरल्ड जेल पर पीसीआर उत्पादों को चलाने के लिए जांच करने के लिए कि क्या प्रवर्धित डीएनए टुकड़े 1580 बीपी की अपेक्षित लंबाई के हैं।

4. बीटल अंडे पर उत्परिवर्ती पूल संक्रमण

  1. पुस्तकालय धोने के कदम
    1. बर्फ पर तैयार उत्परिवर्ती पुस्तकालय का एक aliquot गल । 10 मिनट के लिए 2,683 × जी पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें। एक बाँझ हुड के तहत, कोशिकाओं से किसी भी शेष माध्यम को हटाने के लिए 1x पीबीएस के 4 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं। 1x पीबीएस के 4 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
    2. एक सेल गिनती कक्ष का उपयोग कर पुस्तकालय के एक aliquot में कोशिकाओं की संख्या गिनती। 1x PBS में 2 ×10 6 कोशिकाओं/μL के लिए पुस्तकालय का एक हिस्सा पतला ।
    3. भंवर आवश्यक मात्रा लेने से पहले पूरी लाइब्रेरी को समरूप रूप से मिलाने के लिए पुस्तकालय को अच्छी तरह से एलिकोट करें।
  2. अंडा क्लच नसबंदी और वीवो संक्रमण में
    1. एक एल विल्लोसा अंडे क्लच का चयन करें। अंडे की संख्या गिनें और जारी रखें यदि क्लच में 100 से अधिक अंडे होते हैं।
    2. पूरे अंडे क्लच को स्टरलाइज करें।
      1. 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें और धीरे से 5 मिनट के लिए अंडे धोते हैं। इथेनॉल निकालें और अंडों को ऑटोक्लेवेड पानी से दो बार धोएं।
      2. 12% ब्लीच (नाओसीएल) के 200 माइक्रोन जोड़ें और धीरे से 30 एस के लिए अंडे धोते हैं। ब्लीच को तुरंत निकालें और अंडों को फिर से तीन बार 200 माइक्रोन ऑटोक्लेव्ड पानी से धोएं।
    3. निष्फल अंडे क्लच (अंडे प्रति 2.5μL) पर धोया उत्परिवर्ती पुस्तकालय के 2 × 106 कोशिकाओं/μL संक्रमित ।
    4. संक्रमित बीटल लार्वा हैच के दो दिन बाद, प्रति1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब 100 2 इंच स्टार लार्वा एकत्र करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. इन विट्रो उत्परिवर्ती पुस्तकालय नियंत्रण
    1. एक बाँझ हुड के तहत, केबी माध्यम के 10 एमएल में धोए गए उत्परिवर्ती पुस्तकालय के 2 ×10 6 कोशिकाओं/μL के 250 माइक्रोन को टीका लगाते हैं जिसमें कानामाइसिन होता है।
    2. 20 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इन विट्रो उत्परिवर्ती संस्कृति इनक्यूबेट।
      नोट: उपनिवेशीकरण के दौरान वीवो में डब्ल्यूटी बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए की पीढ़ियों की अनुमानित संख्या से मेल खाने के लिए इनक्यूबेशन की अवधि की गणना करें।
    3. 20 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, इन विट्रो उत्परिवर्ती संस्कृति में 70% ग्लाइसरोल की बराबर मात्रा जोड़ें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. संक्रमित बीटल और इन विट्रो उत्परिवर्ती पुस्तकालय डीएनए निष्कर्षण

नोट: डीएनए निष्कर्षण निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक डीएनए और आरएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया संक्षेप में नीचे उल्लिखित ।

  1. तरल नाइट्रोजन के 1-2 मिलील जोड़कर और मूसल के साथ कुचलने से पूल्ड लार्वा (अधिकतम 4 मिलीग्राम प्रति माइक्रोफ्यूज ट्यूब) हो सकता है।
  2. बर्फ पर ग्लिसरोल स्टॉक से इन विट्रो उगाया उत्परिवर्ती संस्कृतियों गल । कोशिका लाइसिस से पहले 10 मिनट के लिए 9,600 × जी पर अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली मार।
  3. इन विट्रो और वीवो नमूनों में ऊतक और सेल लाइसिस समाधान के 300 माइक्रोन जोड़ें। 10 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीनेज के 5 माइक्रोन जोड़ें, 15 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें, और फिर 3-5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  4. lysates और भंवर के लिए अच्छी तरह से प्रोटीन वर्षा अभिकर्ण के 150 μL जोड़ें। 10 मिनट के लिए 9,600 × जी पर अपकेंद्री द्वारा प्रोटीन मलबे गोली।
  5. सुपरनेट को 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। सुपरनेट में आइसोप्रोपनॉल के 500 माइक्रोन जोड़ें और 1 घंटे या रात भर के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करने से पहले धीरे-धीरे ट्यूबों को कम से कम 40 बार उलटा करें।
  6. 10 मिनट के लिए ९,६०० × जी पर अपकेंद्री द्वारा उपजी डीएनए गोली । सुपरनेट को त्यागें और डीएनए पेलेट में बर्फ-ठंड 70% इथेनॉल जोड़ें।
  7. 5 मिनट के लिए ≥10,000 × जी पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्यागें और नमूनों को कम से कम 1 घंटे के लिए हवा-सूखी छोड़ दें।
  8. इन विट्रो से डीएनए को फिर से आता है और वीवो नमूनों में कम-टीई बफर के 100 माइक्रोल में।
  9. नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी

नोट: डीएनए पुस्तकालय तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल और अभिकर् कओं को डीएनए पुस्तकालय तैयारी किट के निर्माता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों से अनुकूलित और संशोधित किया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2:डीएनए पुस्तकालय तैयार करने के चरणों की योजनाबद्ध। कतरनी और एडाप्टर लिगेशन के बाद, संशोधित प्रोटोकॉल में सम्मिलन कैसेट युक्त डीएनए टुकड़ों को समृद्ध करने के लिए एक स्ट्रेप्टाविडिन मनका-चयन कदम शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. नमूनों को 20 एनजी/μL एकाग्रता और १०० μL की मात्रा को पतला करें और उन्हें बर्फ पर रखें ।
  2. वीवो में कतरनी और इन विट्रो सैंपल डीएनए अल्ट्रासोनिकेटर का उपयोग करके। अल्ट्रासोनिकेटर को 70% बिजली पर सेट करें। भंवर नमूनों संक्षेप में और 1 मिनट 30 एस के लिए कतरनी ।
    नोट: अल्ट्रासोनिकेटर के लिए सेटिंग्स उपकरणों के बीच अलग होगा। इस मामले में, टुकड़ा आकार 200-400 बीपी था, जो 150 बीपी, युग्मित-अंत (चरण देखें) के इस अनुक्रमण दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त है। कतरनी मापदंडों को प्रयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  3. जांच करें कि डीएनए वांछित आकार सीमा (इस मामले में, 200-400 बीपी) के लिए कतरनी था। 1.6% एगर उठे जेल पर 1.6% एगर्लाग जेल 40 मिनट(चित्रा 3 ए,बी)के लिए 250 वी पर चलाने पर 1:1 अनुपात में जेल लोडिंग डाई के साथ मिश्रण करने के बाद अनशीर और कतरनी डीएनए का 5 माइक्रोन लोड करें।
  4. एडाप्टर लिगेशन के लिए आवश्यक खंड समाप्त होता है की तैयारी
    1. कतरनी डीएनए के 50 माइक्रोन करने के लिए, पुस्तकालय तैयारी किट में दिए गए अंत तैयारी रिएजेंट्स जोड़ें: एंजाइम मिश्रण के 3 माइक्रोन और प्रतिक्रिया बफर के 7 माइक्रोन और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण करें। ≥ 75 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ढक्कन के साथ एक थर्मल साइकिल सेट करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 65 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
  5. एडाप्टर लिगेशन
    1. एडाप्टर लिगेशन के लिए, निम्नलिखित अभिकर् ती को अंतिम तैयारी चरण के उत्पादों में जोड़ें: 30 माइक्रोन लिगेशन मास्टर मिक्स, 1 माइक्रोल लिगेशन एन्हांसर, और 2.5 माइक्रोन पतला एडाप्टर। गर्म ढक्कन के साथ थर्मल साइकिल में 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूने को पाइपिंग और इनक्यूबेट करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. 15 मिनट के बाद, एंजाइम के 3 माइक्रोन जोड़ें (उरासिल डीएनए ग्लाइकोसिलेज + डीएनए ग्लाइकोसिलेज-lyase Endonuclease VIII) (सामग्री की तालिकादेखें)। एक थर्मल साइकिलर में 15 मिनट के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं और ≥47 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन गर्म करें।
      नोट: प्रोटोकॉल इस कदम पर रोका जा सकता है, और नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. 250 बीपी के टुकड़ों को लक्षित करने वाले एडाप्टर-लिटेड डीएनए का आकार चयन
    1. भंवर चुंबकीय मनका समाधान (सामग्री की मेजदेखें) और उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जगह है ।
    2. लिगाटेड डीएनए मिश्रण के 96.5 माइक्रोन में 0.3x मोतियों को जोड़ें और अच्छी तरह से पाइपिंग करके मिलाएं। मनका मिश्रण को 5 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
      नोट: मनका मिश्रण में लवण और पॉलीथीन ग्लाइकोल की उपस्थिति मोतियों पर डीएनए के टुकड़ों की वर्षा की सुविधा प्रदान करती है। डीएनए अणुओं के लिए मोतियों का एक कम अनुपात मोतियों के लिए केवल बड़े डीएनए टुकड़े के बाध्यकारी की ओर जाता है । इस मामले में, लंबाई में 250 बीपी से ऊपर डीएनए टुकड़े मोतियों से बंधे होते हैं।
    3. मोतियों को नीचे खींचने और अवांछित आकार के डीएनए टुकड़ों को हटाने के लिए ट्यूबों को चुंबकीय स्टैंड पर रखें। मोतियों को 5 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें और फिर स्पष्ट सुपरनिटेंट को एक नई माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें (सुपरनैंट रखें)।
    4. सुपरनेट में 0.15x ताजा मोतियों को जोड़ें और अच्छी तरह से पाइपिंग करके मिलाएं। मनका मिश्रण को 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और फिर ट्यूबों को चुंबकीय स्टैंड पर रखें ताकि लक्ष्य डीएनए से बंधे मोतियों को नीचे खींचा जा सके । 5 मिनट तक रुकें और फिर सुपरनिटेंट (मोतियों को रखें) को त्याग दें।
      नोट: डीएनए के लिए मोतियों का यह अनुपात वांछित 250 बीपी आकार के टुकड़ों के बंधन की ओर जाता है।
    5. चुंबकीय स्टैंड पर मोतियों के साथ, 80% इथेनॉल (हौसले से तैयार) के 200 माइक्रोन जोड़ें और 30 एस के लिए प्रतीक्षा करें। पिपेट बाहर और चुंबकीय स्टैंड पर मोती परेशान किए बिना सावधानी से इथेनॉल धोने त्यागें। इस कदम को दोहराएं।
    6. अंतिम धोने के बाद, मोतियों से इथेनॉल के निशान हटा दें और फिर मोतियों को 2 मिनट तक हवा में सुखा लें जब तक कि वे चमकदार दिखाई न दें लेकिन पूरी तरह से सूख न जाएं। मोतियों को अधिक सुखाएं नहीं।
    7. चुंबकीय स्टैंड से ट्यूबों को हटा दें और 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल या 0.1x ते (लो-टीई) के 17 माइक्रोन जोड़ें। ~ 10 बार पाइपिंग करके मिलाएं और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    8. ट्यूबों को वापस चुंबकीय स्टैंड पर रखें और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। एक बार मोती नीचे बसे हैं, एक नई ट्यूब के लिए डीएनए सुपरनिटेंट हस्तांतरण ।
  7. पीसीआर मैं सम्मिलन कैसेट युक्त डीएनए टुकड़े करने के लिए बायोटिन टैग जोड़ने के लिए
    1. ट्रांसपोसन-विशिष्ट बायोटिनाइलेटेड प्राइमर(टेबल 5)और एक इंडेक्स प्राइमर का उपयोग करके Tn5-प्रविष्टि कैसेट युक्त डीएनए टुकड़ों में एक बायोटिनाइलेटेड प्राइमर टैग जोड़ें। टेबल 6 के अनुसार पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें और टेबल 7में सूचीबद्ध थर्मल साइकिलर के लिए पीसीआर शर्तों का पालन करें।
  8. बिना साइज चयन के पीसीआर आई की सफाई
    1. भंवर 0.9x मोती और उन्हें साफ करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
    2. पीसीआर उत्पादों में 0.9x मोती जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. मोतियों को नीचे खींचने के लिए मोतियों को चुंबकीय स्टैंड पर रखें।
    4. स्पष्ट सुपरनेट निकालें और दो बार तैयार 80% इथेनॉल के 200 माइक्रोन के साथ मनका-बाध्य-डीएनए धोएं।
    5. धोने के कदम के बाद इथेनॉल निकालें और हवा मोतियों को तब तक सुखाएं जब तक कि वे चमकदार न दिखें लेकिन बहुत सूखे न हों।
    6. 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल या 0.1X TE (लो-टीई) के 32 माइक्रोन जोड़ें और 5 मिनट के लिए मोतियों को इनक्यूबेट करें। मिश्रण को वापस चुंबकीय स्टैंड पर रखें और सुपरनिटेंट को एक ताजा माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  9. स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के लिए बाइंडिंग बायोटिनाइलेटेड डीएनए के टुकड़े
    1. 1x बाइंड-एंड-वॉश बफर में स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के 32 माइक्रोन को फिर से पेंड करें। चुंबकीय स्टैंड पर रखे हुए तीन बार बफर से मोतियों को धोएं।
    2. 2x बांध और धोने बफर के 32 μL जोड़ें और मोतियों को फिर से खर्च करें। इसके लिए साफ किए गए पीसीआर 1 प्रोडक्ट्स के 32 माइक्रोल डालें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
    3. मनका-डीएनए मिश्रण को 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें। बायोटिन-टैग किए गए डीएनए के रूप में सुपरनेट बाहर पिपेट मोतियों पर स्ट्रेप्टाविडिन को बांधता है।
    4. मोतियों को 1x बाइंड-एंड-वॉश बफर के 500 माइक्रोन से धोएं और फिर मोतियों को कम-टी के 200 माइक्रोन से धोएं। कम ते के 17 माइक्रोन में डीएनए से बंधे मोतियों को फिर से आता है ।
  10. पीसीआर II सम्मिलन कैसेट किनारे वाले टुकड़ों में एडाप्टर जोड़ने के लिए
    1. तालिका 5में सूचीबद्ध इंडेक्स प्राइमर और संशोधित यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर का उपयोग करके तालिका 8 मेंदिखाए गए मास्टर मिक्स तैयार करें। पिछले चरण से पीसीआर मिश्रण करने के लिए डीएनए-बाउंड स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के 15 माइक्रोन जोड़ें। थर्मल साइकिलर स्थितियों के लिए तालिका 7 देखें।
  11. इस प्रोटोकॉल के चरण 6.8 में दिए गए आकार चयन के बिना पीसीआर उत्पादों को साफ करें। आणविक ग्रेड पानी के 30 μL में अंतिम डीएनए उत्पादों Elute ।
  12. नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और अनुक्रमण के लिए उनका उपयोग करें।

7. अनुक्रमण और विश्लेषण

  1. उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग करके पुस्तकालय अनुक्रम। ट्रांसपोसन लाइब्रेरी आकार के आधार पर अनुक्रमण गहराई को समायोजित करें, जैसा कि नीचे उल्लेख किया गया है। फास्टक्यूसी7के साथ पढ़ने की गुणवत्ता का आकलन करें । का चयन करें पढ़ें पढ़ने के 5 ' अंत पर Tn5-प्रविष्टि बढ़त युक्त और Cutadapt8 और/या Trimmomatic9का उपयोग कर प्रविष्टि एज अनुक्रम को हटा दें ।
    नोट: यहां, एक युग्मित अंत अनुक्रमण दृष्टिकोण के लिए १५० बीपी प्रति पढ़ा लक्ष्य और 8 Mio पढ़ता है की कुल इस्तेमाल किया गया था । प्रतिनिधि डेटासेट प्राप्त करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि अनुक्रमित रीड्स की कुल संख्या पुस्तकालय में म्यूटेंट की अधिकतम संभव संख्या से अधिक है, यानी, चरण 2.9 से उपनिवेशों की कुल अनुमानित संख्या। एक संदर्भ के रूप में, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अधिकतम संभव पुस्तकालय आकार के 40 गुना के लिए है। इसी तरह के उद्देश्य के लिए टीएन-सेक़ का उपयोग करने वाले अन्य सफल अध्ययनों ने इसी उत्परिवर्ती पुस्तकालय 22,23में अद्वितीय सम्मिलनों की वास्तविक संख्या के25गुना के करीब पढ़ता है।
  2. यह देखते हुए कि जीन के सिरों पर उत्परिवर्तन कार्यात्मक रूप से विघटनकारी नहीं हैं, संदर्भ जीनोम जीएफएफ फ़ाइल के जीन एनोटेशन के दोनों सिरों से 5% ट्रिम करें। मानचित्र छंटनी की गई बोटाई2 10का उपयोग करके संदर्भ जीनोम को पढ़ता है।
  3. संरेखण बीएएम फ़ाइल में अद्वितीय 5'पदों की संख्या से सम्मिलन की संख्या की गणना करें।
  4. फीचरकाउंट्स11का उपयोग करके, प्रत्येक दोहराने के नमूने के लिए हिट जीन की संख्या प्राप्त करें।
  5. RStudio में DESeq212 पैकेज का उपयोग करना, विभिन्न परिस्थितियों के बीच उत्परिवर्ती बहुतायत में अंतर की गणना करें।

Representative Results

मेजबान से जुड़े बैक्टीरिया एक संघ स्थापित करने के लिए कई कारकों को नियोजित कर सकते हैं, जिनमें आसंजन, गतिशीलता, केमोटैक्सिस, तनाव प्रतिक्रियाएं या विशिष्ट ट्रांसपोर्टर शामिल हैं। जबकि रोगजनक-मेजबान बातचीत के लिए महत्वपूर्ण कारकों को कई बैक्टीरिया13, 14, 15,16,17,18के लिए सूचित किया गया है, जिसमें बर्कहोल्डरिया19, 20जीनस के सदस्य शामिल हैं, कम अध्ययनों ने उपनिवेशीकरण21, 22,23के लिए लाभकारी सहजियों द्वारा उपयोग किए जाने वाले आणविक तंत्र का पता लगाया है। . ट्रांसपोसन प्रविष्टि अनुक्रमण का उपयोग करना, इसका उद्देश्य आणविक कारकों की पहचान करना था जो बी ग्लेडिओली को एल विलोसा बीटल को उपनिवेश बनाने में सक्षम बनाते हैं।

ट्रांसपोसन-मध्यस्थता वाले म्यूटेगेनिस को pRL27 प्लाज्मिड का उपयोग करके किया गया था, जिसमें एक Tn5 ट्रांसपोसन और एक कानमाइसिन प्रतिरोध कैसेट को उलटा दोहराने वाली साइटों द्वारा घिरा हुआ किया जाता है। प्लाज्मिड को प्लाज्मिड डोनर ई. कोलाई WM3064 स्ट्रेन (जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है) के साथ संविलियन द्वारा लक्ष्य बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए कोशिकाओं में पेश किया गया था। संयोजिति के बाद, बी ग्लेडिओली प्राप्तकर्ता और ई. कोलाई दाता कोशिकाओं वाले संविलियन मिश्रण को चुनिंदा एगर प्लेटों पर चढ़ाया गया जिसमें कानामाइसिन होता था । प्लेटों पर डीएपी की अनुपस्थिति ने दाता ई कोलाई कोशिकाओं को समाप्त कर दिया, और सफल बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए ट्रांसकॉन्जूगेंट्स के लिए चयनित कानमाइसिन की उपस्थिति । 100,000 ट्रांसकोजुगेंट कॉलोनियों की कटाई से प्राप्त पूल्ड बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए उत्परिवर्ती पुस्तकालय को संशोधित डीएनए पुस्तकालय तैयारी किट और कस्टम प्राइमर का उपयोग करके अनुक्रमण के लिए तैयार किया गया था। चित्रा 2 डीएनए पुस्तकालय तैयार करने के चरणों पर प्रकाश डाला गया । अनुक्रमण मिले 4 Mio बनती पढ़ता है; बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए में 7,468 जीन में से 3,736 जीन बाधित हुए।

मेजबान में उपनिवेशीकरण-दोषपूर्ण म्यूटेंट की पहचान करने के लिए, बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए उत्परिवर्ती पुस्तकालय बीटल अंडे पर संक्रमित था और नियंत्रण के रूप में केबी माध्यम में विट्रो में उगाया गया था। प्रयोग से पहले वीवो उपनिवेशीकरण अड़चन आकार की गणना की गई थी। बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए कोशिकाओं की एक ज्ञात संख्या बीटल अंडे पर संक्रमित थी, और हौसले से रची गई पहले इंस्टार लार्वा में उपनिवेश कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक लार्वा से निलंबन चढ़ाना और प्रति व्यक्ति कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गिनती करके प्राप्त की गई थी। ये गणनाएं यह सुनिश्चित करने के लिए की गई थीं कि उपनिवेश कोशिकाओं की संख्या मेजबान को उपनिवेश बनाने की उनकी क्षमता के लिए पुस्तकालय में म्यूटेंट के सभी या उच्च प्रतिशत का आकलन करने के लिए पर्याप्त है। इसके अतिरिक्त, इन नमूनों को तुलनीय बनाने के लिए जीवाणु पीढ़ियों की संख्या के आधार पर इन विट्रो और वीवो स्थितियों के बीच विकास समय को सामान्य बनाया गया था ।

अंडे रची जाने के बाद 13 पूल में 1,296 लार्वा एकत्र किए गए। विट्रो उत्परिवर्ती संस्कृतियों में इसी को ग्लिसरोल स्टॉक के रूप में उगाया और संग्रहीत किया गया। वीवो में और इन विट्रो विकसित उत्परिवर्ती पुस्तकालयों का डीएनए निकाला गया और एक अल्ट्रासोनिकेटर में खंडित किया गया था। चित्रा 3 कतरनी डीएनए के आकार वितरण से पता चलता है, जहां टुकड़े के बहुमत १०० और ४०० बीपी के बीच अवधि, के रूप में उंमीद है । इस कदम के बाद अनुक्रमण के लिए संशोधित डीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल था । प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण में, शेष डीएनए की एकाग्रता की जांच की गई ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कदम सही ढंग से किए गए और डीएनए के नुकसान को ट्रैक करने के लिए । अनुक्रमण से पहले एक गुणवत्ता की जांच (सामग्री की तालिकादेखें) से पता चला है कि डीएनए पुस्तकालयों में अप्रत्याशित रूप से बड़े (>८०० बीपी) डीएनए टुकड़े थे, और यह वीवो पुस्तकालयों में अधिक स्पष्ट था । अनुक्रमण गलियों में टुकड़ों के क्लस्टरिंग को अनुकूलित करने में कठिनाई को देखते हुए, यह पढ़ता है की वांछित संख्या प्राप्त करने के लिए वीवो पुस्तकालयों में 10 Mio बनती पढ़ता है के लिए अनुक्रमण गहराई बढ़ाने के लिए आवश्यक था । अनुक्रमण परिणामों के विश्लेषण से पता चला है कि वीवो पुस्तकालयों में औसतन 4 एमआईओ पढ़ता है और 3.1 एमआईओ इन विट्रो पुस्तकालयों में पढ़ता है, जिसमें रीड-1(तालिका 9)के 5 अंत में ट्रांसपोसन एज निहित था, जो इस प्रयोग के लिए संतोषजनक था। मूल पुस्तकालय में बी ग्लेडिओली जीनोम में 24,224 अद्वितीय सम्मिलनों का वितरण चित्र 4में दिखाया गया है। DESeq2 का उपयोग करके किए गए एक विश्लेषण से पता चला है कि वीवो और इन विट्रो स्थितियों के बीच 271 म्यूटेंट की बहुतायत काफी अलग थी।

Figure 3
चित्र 3:एक उत्परिवर्ती और डीएनए पुस्तकालयों के एगर उठे जैल। (A)लेन एक्स में एक उत्परिवर्ती के unsheared डीएनए और पैमाने के लिए एक 1 केबीपी सीढ़ी के साथ जेल उठी । (ख)कतरनी डीएनए लाइब्रेरी के साथ जेल । पहली लेन में सीढ़ी के बैंड आकार बाईं ओर इंगित कर रहे हैं। पहले तीन लेन ए, बी, और सी में वीवो पुस्तकालयों में कतरनी डीएनए के टुकड़े होतेहैं। लेन डी, ई, एफ, और जी में इन विट्रो पुस्तकालयों के कतरनी डीएनए टुकड़े होते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: बुर्कहोल्डरिया ग्लेडिओली एलवी-एसटीए जीनोम में चार रिप्लियोन में मूल पुस्तकालय में अद्वितीय प्रविष्टि स्थलों का स्थान। एक्स-अक्ष के साथ प्रत्येक बार प्रविष्टि की एक साइट पर स्थित है। वाई-एक्सिस के साथ एक बार की ऊंचाई उस साइट से जुड़े रीड्स की संख्या से मेल खाती है। ध्यान दें कि दो गुणसूत्रों और दो प्लाज्मिड को पूरी लंबाई में दिखाया गया है और इस प्रकार एक्स-एक्सिस पर अलग-अलग पैमाने होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

राजा बी मध्यम/आगर
पेप्टोन (सोयाबीन) 20 ग्राम/एल
कश्मीर2एचपीओ4 1.5 ग्राम/एल
MgSO4.7H2O 1.5 ग्राम/एल
आगर 15 ग्राम/एल
आसुत पानी में घुला
पौंड मीडियम/एगर
ट्राइप्टोन 10 ग्राम/एल
खमीर निकालने 5 जी/एल
नैक 10 ग्राम/एल
आसुत पानी में घुला

तालिका 1: मीडिया घटक।

नहीं। प्राइमरों अनुक्रम पीसीआर एनीलिंग टेम्प. (डिग्री सेल्सियस)
1 टीपीएनआरएल17-1आरसी 5'-CGTTACATCCCTCTTTTTTT-3' 58.2
2 टीपीएनआरएल13-2आरसी 5'-TCGTAGAAGAAGAGTGTTTTGCTG-3'

तालिका 2: Conjugation की सफलता की पुष्टि करने के लिए प्राइमर।

घटक वॉल्यूम (माइक्रोन)
एचपीएलसी-शुद्ध पानी 4.92
10x बफर एस (उच्च विशिष्टता) 1
एमजीसीएल2 (25 mM) 0.2
डीएनटीपी (2 mM) 1.2
प्राइमर 1 (10 pmol/μL) 0.8
प्राइमर 2 (10 pmol/μL) 0.8
Taq (5 U/μL) 0.08
मास्टरमिक्स कुल 9
साँचा 1

तालिका 3: पीसीआर मास्टर मिश्रण संजीदशन की सफलता की पुष्टि करने के लिए। संक्षिप्त रूप: एचपीएलसी = उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी; dNTPs = deoxynucleoside triphosphate।

सीढ़ी तापमान डिग्री सेल्सियस समय चक्र
प्रारंभिक डेनैचेशन 95 3 मिनट 1
डेनैचेशन 95 40 एस
एनीलिंग 58.2 40 एस 30 से 35
विस्तार 72 1-2 मिनट
अंतिम विस्तार 72 4 मिनट 1
पकड 4 ∞

तालिका 4: संयोजिका की सफलता की पुष्टि करने के लिए पीसीआर की स्थिति।

प्राइमरों अनुक्रम टीएम डिग्री सेल्सियस प्रयोग स्रोत
ट्रांसपोसन-विशिष्ट बायोटिनाइलेटेड प्राइमर 5'-बायोटिन-अकागाएसीएक्टाएसजीजीसीजीएटीजीएटी
-3'		 63.5 6.7.1. पीसीआर I परम्परा
संशोधित यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATC
टैक्टक्टैटटीसीसीसीएसीजीसीटीसी
टीटीसीसीसीटीजीएटीकैटसीGATGAT
GGTTGAGATGTTT - 3'		 62 6.10.1. पीसीआर द्वितीय परम्परा
इंडेक्स प्राइमर निर्माता के मैनुअल को देखें 6.7.1. पीसीआर I और 6.10.1. पीसीआर द्वितीय इलुमिना के लिए एनईबीनेक्स्ट मल्टीप्लेक्स ओलिगोस (इंडेक्स प्राइमर सेट 1)
अडाप्टर निर्माता के मैनुअल को देखें 6.5. एडाप्टर लिगेशन Illumina के लिए NEBNext अल्ट्रा द्वितीय डीएनए पुस्तकालय तैयारी किट

तालिका 5: डीएनए पुस्तकालय की तैयारी के दौरान पीसीआर I और II के लिए प्राइमर और एडाप्टर।

पीसीआर मिक्स (μL)
एडाप्टर-लिगाटेड डीएनए के टुकड़े 15
NEBNext अल्ट्रा II Q5 मास्टर मिक्स 25
इंडेक्स प्राइमर (10 pmol/ 5
ट्रांसपोसन विशिष्ट बायोटिनाइलेटेड प्राइमर (10 पीएमओएल/ 5
कुल मात्रा 50

तालिका 6: डीएनए लाइब्रेरी तैयारी-पीसीआर आई मास्टर मिक्स।

सीढ़ी तापमान समय चक्र
प्रारंभिक डेनैचेशन 98 डिग्री सेल्सियस 30 एस 1
डेनैचेशन 98 डिग्री सेल्सियस 10 एस 6 से 12
एनीलिंग 65 डिग्री सेल्सियस 30 एस
विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 30 एस
अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट 1
पकड 16 डिग्री सेल्सियस ∞

तालिका 7: डीएनए पुस्तकालय तैयारी-पीसीआर I और II की स्थिति।

पीसीआर मिक्स (μL)
मनका चयनित डीएनए 15
NEBNext अल्ट्रा II Q5 मास्टर मिक्स 25
इंडेक्स प्राइमर 5
संशोधित यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर 5
कुल मात्रा 50

तालिका 8: डीएनए पुस्तकालय तैयारी-पीसीआर द्वितीय मास्टर मिक्स।

लायब्रेरीज़ इनविवो-1 इनविवो-2 इनविवो-3 इनविट्रो-1 इनविट्रो-2 इनविट्रो-3 मूल पुस्तकालय
नहीं। पढ़ता है (पीई) 56,57,710 39,19,051 30,65,849 35,73,494 28,83,440 36,61,956 46,09,410
नहीं। पढ़ें-1 के 5 ' अंत पर टीएन युक्त पढ़ता है-1 54,15,880 37,31,169 29,36,247 33,00,499 27,35,705 33,50,402 41,53,270
Bowtie2 समग्र संरेखण दर (%) (पढ़ें-1 ही) 95.53% 83.71% 89.87% 80.79% 78.00% 73.06% 74.92%
अद्वितीय सम्मिलन की संख्या 8,539 4,134 7,183 18,930 18,421 20,438 24,224
जीन हिट की संख्या 1575 993 1450 2793 2597 3037 3736

तालिका 9: प्रति पुस्तकालय अनुक्रमण आउटपुट और ट्रांसपोसन प्रविष्टि आवृत्ति का सारांश। संक्षिप्त नाम: पीई = युग्मित-अंत।

Discussion

एल विल्लोसा बीटल और बी ग्लेडिओली बैक्टीरिया के बीच सहजीवी बातचीत में महत्वपूर्ण मेजबान उपनिवेशीकरण कारकों की पहचान करने के लिए एक बी ग्लेडिओली ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालय उत्पन्न किया गया था। प्रोटोकॉल में प्रमुख कदम संाधीनता, मेजबान-संक्रमण, डीएनए पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण थे।

बर्कहोल्डरिया के कई उपभेदों को24,25को संयुग्मन द्वारा आनुवंशिक संशोधन के लिए उत्तरदायी है, ट्रांसपोसन और एंटीबायोटिक प्रविष्टि कैसेट को ले जाने वाले प्लाज्मिड को ई कोलाईसे लक्ष्य बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए तनाव में सफलतापूर्वक संयोजित किया गया था। इलेक्ट्रोपाउशन द्वारा परिवर्तन के पिछले प्रयासों में लगभग बी ग्लेडिओली ट्रांसफॉर्मेंट बहुत कम नहीं हुआ। लक्ष्य जीव के लिए परिवर्तन तकनीक को कुशलतापूर्वक बड़ी संख्या में ट्रांसफॉर्मेंट प्राप्त करने के लिए अनुकूलित करने की सलाह दी जाती है।

संयोजिका और ४० संविलियन स्पॉट के एक दौर ने बी ग्लेडिओली एलवी-एसटीए में ३,७३६ जीन को बाधित किया । मसा में, ७,४६८ जीन के अधिकांश को बाधित करने और एक संतृप्त पुस्तकालय प्राप्त करने के लिए conjugation के कई दौर आवश्यक होगा । विशेष रूप से, संविधि के दौरान इनक्यूबेशन समय को 12-18 घंटे से अधिक की अनुमति नहीं थी, जो बी ग्लेडिओलीके घातीय विकास चरण का अंत है। जीवाणु कोशिकाओं के घातीय विकास चरण से परे संयोजित करने की अनुमति देने से ट्रांसकोंजुगैंट26प्राप्त करने में सफलता की संभावना कम हो जाती है । इसलिए, संजीदब अवधि को बैक्टीरियल प्रजातियों के विकास के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।

एक मेजबान में उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के संक्रमण से जुड़े एक प्रयोग को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए, उपनिवेशीकरण के दौरान बैक्टीरियल जनसंख्या अड़चनआकार और संक्रमण1,2, 27से पहले पुस्तकालय में म्यूटेंट की विविधता का आकलन करना महत्वपूर्ण है। प्रयोग की तैयारी में, हमने बीटल की न्यूनतम संख्या का अनुमान लगाया है जिसे उच्च संभावना के लिए संक्रमित किया जाना चाहिए कि पुस्तकालय में प्रत्येक उत्परिवर्ती का नमूना लिया जाता है और उपनिवेश बनाने की अनुमति दी जाती है। वीवो बैक्टीरियल जनरेशन समय में अनुमानित और प्रयोग की अवधि के लिए पीढ़ियों की संख्या की भी गणना की गई थी। इसके बाद इन विट्रो कल्चर को इनक्यूबेशन बार एडजस्ट करके पीढ़ियों की तुलनात्मक संख्या में बड़ा हो गया । अन्य गैर-मॉडल मेजबानों में इसी तरह के संक्रमण प्रयोग के लिए, प्रयोगशाला संस्कृति और मेजबान जीवों के निरंतर स्रोत को बनाए रखने की क्षमता वांछनीय है।

वीवो और इन विट्रो और नमूना संग्रह में उत्परिवर्ती पुस्तकालय के विकास के बाद, ट्रांसपोसन प्रविष्टि अनुक्रमण के लिए एक संशोधित डीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल किया गया था। प्रोटोकॉल में संशोधन कस्टम पीसीआर प्राइमर डिजाइन और सम्मिलन कैसेट युक्त डीएनए टुकड़ों के लिए चयन करने के लिए पीसीआर कदम जोड़ने शामिल थे । क्योंकि प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था, प्रोटोकॉल में अतिरिक्त पीसीआर चक्रों ने ओवरएम्पलिफिकेशन का जोखिम बढ़ा दिया और अंत पुस्तकालयों में हाइब्रिड एडाप्टर-एडाप्टर टुकड़े प्राप्त किए। इसलिए, दो पीसीआर की सिफारिश के बाद एक अंतिम सफाई कदम (आकार चयन के बिना) की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह इन टुकड़ों को हटाने में मदद करता है। डीएनए पुस्तकालयों का आकार वितरण अभी भी उम्मीद से व्यापक था । हालांकि, अनुक्रमण गहराई बढ़ाने से पर्याप्त डेटा प्रदान किया गया जो जैव सूचना विश्लेषण के दौरान फ़िल्टर किए गए थे, संतोषजनक परिणाम प्राप्त करते थे।

चूंकि ट्रांसपोसन-मध्यस्थता वाले म्यूटेनेसिस एक ही प्रयोग में हजारों यादृच्छिक सम्मिलन उत्पन्न करता है, इसलिए म्यूटेंट की संतृप्त पुस्तकालय उत्पन्न करना संभव है जिसमें उन म्यूटेंट को छोड़कर सभी शामिल हैं जहां जीवाणु विकास के लिए आवश्यक जीन बाधित किए गए हैं। हम सबसे अधिक संभावना एक संतृप्त उत्परिवर्ती पुस्तकालय के साथ काम नहीं किया, Burkholderia सपा पर अंय अध्ययनों में आवश्यक जीन के अनुमानों को देखते हुए । 28,29. एक गैर संतृप्त पुस्तकालय फिर भी लक्षित म्यूटाजेनिसिस का उपयोग करके आगे के अध्ययनों के लिए विभिन्न उम्मीदवार जीन की खोज करने में मदद करता है। प्रयोगों से पहले, यह याद रखना भी महत्वपूर्ण है कि कुछ ट्रांसपोसंस में विशिष्ट सम्मिलन लक्ष्य साइटें हैं जो जीनोम30में कुछ लोकी पर म्यूटेंट की बहुतायत को बढ़ाती हैं। मेरिनर ट्रांसपोसंस को 31 और टीएन5 ट्रांसपोसंस में जीसी पूर्वाग्रह 32,33के लिए एटी साइटों को लक्षित करने के लिए जानाजाताहै। ट्रांसपोसन सम्मिलन के लिए हॉटस्पॉट को पहचानने के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण के दौरान कदम शामिल करने से किसी भी वितरण पूर्वाग्रह का आकलन करने में मदद मिलेगी।

हालांकि असफलताओं के लिए प्रवण, एक अच्छी तरह से डिजाइन ट्रांसपोसन प्रविष्टि अनुक्रमण प्रयोग एक ही प्रयोग के भीतर बैक्टीरिया में कई सशर्त महत्वपूर्ण जीन की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है । उदाहरण के लिए, आर्किड लीफ नेक्रोसिस के दमन के लिए महत्वपूर्ण बर्कहोल्डरिया सेमिनालिस में एक दर्जन जीनों की पहचान ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस और जीनोमिक्स34के संयोजन से की गई थी। बर्कहोल्डरियासे परे, कई आसंजन और गतिशीलता जीन और ट्रांसपोर्टरों को एपिस मेलिफेरा (मधुमक्खी) 22के स्नूडग्रासेला अल्वी सिंबियोन्ट्स में महत्वपूर्ण उपनिवेशीकरण कारकों के रूप में पहचाना गया है, और यूप्रिमना स्कोलोप्स (हवाई बॉबटेल स्क्विप्ड)23 में ट्रांसपोसन-सम्मिलन म्यूटेनेज़िस दृष्टिकोण का उपयोग करके विब्रियो फिशरी सिम्बाइवोट्स में।

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस को अनुक्रमण के बजाय चयनात्मक मीडिया का उपयोग करके व्यक्तिगत म्यूटेंट के लिए स्क्रीनिंग के बाद किया जा सकता है। फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग या बायोएसाइड्स में कमियों की पहचान करने के लिए कहा गया है, जैसे कि गतिशीलता, बायोएक्टिव सेकेंडरी मेटाबोलाइट्स का उत्पादन, या विशिष्ट ऑक्सोट्रोफियों, संभव हैं। उदाहरण के लिए, एक बुर्केटेरिया कीटनाशक (जीनस Caballeronia35)ट्रांसपोसन उत्परिवर्ती पुस्तकालय को पुनः असाइन की स्क्रीनिंग की पहचान करने में महत्वपूर्ण है कि सहजियों का उपनिवेश रिप्टोरटस पेडेस्ट्रिस,उनके कीट मेजबान36के लिए गतिशीलता जीन को नियोजित करते हैं। इसके अलावा, ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस और फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग का उपयोग करके, बायोएक्टिव माध्यमिक मेटाबोलाइट कारियोयनेन्सिन के लिए बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर की पहचान बर्कहोल्डेरिया कारियोफिली37में की गई थी। बर्कहोल्डरिया छद्ममलेई के एक ऑक्सोट्रोफिक उत्परिवर्ती की पहचान ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस और स्क्रीनिंग के बाद की गई थी और यह मेलिओइडोसिस के खिलाफ एक संभावित क्षीण टीका उम्मीदवार है, जो मनुष्यों और जानवरों में एक खतरनाक बीमारीहै। इस प्रकार, ट्रांसपोसन म्यूटेनेसिस और अनुक्रमण बैक्टीरिया के आणविक लक्षणों का अध्ययन करने में एक मूल्यवान दृष्टिकोण है जो रोगजनक या पारस्परिक संघों में अपने संबंधित मेजबानों के साथ बातचीत के लिए महत्वपूर्ण हैं।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका अध्ययन से संबंधित हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रक्रिया में conjugation और मार्गदर्शन के लिए ई. कोलाई WM3064 + pRL27 तनाव प्रदान करने के लिए जंबेम ली के आभारी हैं, उत्परिवर्ती पुस्तकालय उत्पादन के दौरान समस्या निवारण के साथ मदद करने के लिए कैथरिन Hüffmeier, और कीट संग्रह और परमिट अधिग्रहण का समर्थन करने के लिए प्रो आंद्रे रॉड्रिग्स । हम कीड़ों के संग्रह और पालन में समर्थन के लिए रिबेका जानकी और डैगमार क्लेबश को भी धन्यवाद देते हैं। हम कीट नमूनों के उपयोग, संग्रह और निर्यात के लिए निम्नलिखित परमिट प्रदान करने के लिए ब्राजील के अधिकारियों को स्वीकार करते हैं: SISBIO प्राधिकरण एनआर 45742-1, 45742-7 और 45742-10, सीएनपीक्यू प्रक्रिया nº 01300.004320/2014-21 और 01300.0013848/2017-33, IBAMA एनआर 14BR016151DF और 20BR035212/DF) । इस शोध को जर्मन साइंस फाउंडेशन (डीएफजी) रिसर्च ग्रांट FL1051/1-1 और KA2846/6-1 से फंडिंग ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,6- Diaminopimelic Acid Alfa Aesar B22391 For E.coli WM3064+ pRL27
Agar - Agar Roth 5210
Agarose Biozym 840004
AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) Beckman Coulter A63880 Size selection in step 6.6
Bleach (NaOCl) 12% Roth 9062
Bowtie2 v.2.4.2 Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript.
Buffer-S Peqlab PEQL01-1020 For PCRs
Cell scraper Sarstedt 83.1830
Cutadapt v.2.10 Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript.
DESeq2 RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript.
DNA ladder 100 bp Roth T834.1
dNTPs Life Technology R0182 PCR for confirming success of conjugation
EDTA, Di-Sodium salt Roth 8043
Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit Lucigen MC85200
Ethidium bromide Roth 2218.1
FastQC v.0.11.8 Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript.
FeatureCounts v.2.0.1 Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript.
Glycerol Roth 7530
K2HPO4 Roth P749
Kanamycin sulfate Serva 26899
KCl Merck 4936
KH2PO4 Roth 3904
MgSO4.7H2O Roth PO27
Na2HPO4 Roth P030
NaCl Merck 6404
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) New England Biolabs E7335S
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina New England Biolabs E7645S
Peptone (soybean) Roth 2365 For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium
peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase VWR PEQL01-1020 PCR for confirming success of conjugation
Petri plates - 145 x 20 mm Roth XH90.1 For selecting transconjugants
Petri plates - 90 x 16 mm Roth N221.2
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) Quality check after DNA library preparation
Streptavidin beads Roth HP57.1
Taq DNA polymerase VWR 01-1020
Trimmomatic v.0.36 Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript.
Tris -HCl Roth 9090.1
Tryptone Roth 2366 For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium
Ultrasonicator Bandelin GM 70 HD For shearing
USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) New England Biolabs E7645S Ligation step 6.5.2
Yeast extract Roth 2363

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cain, A. K., et al. A decade of advances in transposon-insertion sequencing. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).
  2. Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments. Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).
  3. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  4. Flórez, L. V., et al. Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism. Nature Communications. 8 (1), 15172 (2017).
  5. Flórez, L. V., Kaltenpoth, M. Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia. Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).
  6. Flórez, L. V., et al. An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles. Nature Communications. 9 (1), 2478 (2018).
  7. Andrews, S. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2012).
  8. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  9. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  10. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  11. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  12. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
  13. Gaytán, M. O., Martínez-Santos, V. I., Soto, E., González-Pedrajo, B. Type three secretion system in attaching and effacing pathogens. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129 (2016).
  14. Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. Type VI secretion and anti-host effectors. Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).
  15. Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease. Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).
  16. Silva, A. J., Benitez, J. A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330 (2016).
  17. Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, Á, Larzábal, M. Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition. Frontiers in Microbiology. 10, 1965 (2019).
  18. Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
  19. Schwarz, S., et al. Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068 (2010).
  20. Jones, C., et al. Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles. Microbial Genomics. 7 (1), 000515 (2021).
  21. Takeshita, K., Kikuchi, Y. Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations. Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).
  22. Powell, J. E., et al. Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).
  23. Brooks, J. F., et al. Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).
  24. Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans. BMC Research Notes. 3 (308), (2010).
  25. Garcia, E. C. Burkholderia thailandensis: Genetic manipulation. Current Protocols in Microbiology. 45, 1-15 (2017).
  26. Headd, B., Bradford, S. A. The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid. Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948 (2020).
  27. Van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).
  28. Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis. mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).
  29. Wong, Y. -C., et al. Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS. Frontiers in Microbiology. 7, 1288 (2016).
  30. Moule, M. G., et al. Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development. mBio. 5 (1), 00926 (2014).
  31. Ding, Q., Tan, K. S. Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Frontiers in Microbiology. 8, 1842 (2017).
  32. Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons. Mobile DNA. 3, 3 (2012).
  33. Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs. Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).
  34. Ará Ujo, W. L., et al. Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli. Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).
  35. Dobritsa, A. P., Samadpour, M. Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).
  36. Ohbayashi, T., et al. Insect's intestinal organ for symbiont sorting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).
  37. Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria. Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).
  38. Atkins, T., et al. A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis. Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).

Tags

जीव विज्ञान अंक 174 बर्कहोल्डरिया,सिंबियोंट होस्ट उपनिवेशीकरण ट्रांसपोसन अनुक्रमण टीएन5 ट्रांसपोसन लागरिया विलोसा
<em>लाग्रिया विल्लोसा</em> बीटल के <em>बर्कहोल्डरिया ग्लेडिओली</em> सिम्बिओंट में बैक्टीरियल कॉलोनाइजेशन कारकों को स्पष्ट करने के लिए एक उपकरण के रूप में ट्रांसपोसन-प्रविष्टि अनुक्रमण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ganesan, R., Kaltenpoth, M.,… More

Ganesan, R., Kaltenpoth, M., Flórez, L. V. Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles. J. Vis. Exp. (174), e62843, doi:10.3791/62843 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter