Summary
Detta är en anpassad metod för att identifiera kandidat insekt kolonisering faktorer i en Burkholderia fördelaktig symbiont. Skalbaggen värd är infekterad med ett slumpmässigt mutantbibliotek genereras via transposon mutagenes, och bibliotekets komplexitet efter kolonisering jämförs med en kontroll som odlas in vitro.
Abstract
Att härleda genens funktion genom att manipulera deras aktivitet är ett viktigt verktyg för att förstå de genetiska grunderna för de flesta biologiska processer. Framsteg inom molekylär mikrobiologi har sett framväxten av olika mutagenestekniker för manipulering av gener. Bland dem är transposon-insättningssekvensering (Tn-seq) ett värdefullt verktyg för att samtidigt bedöma funktionaliteten hos många kandidatgener på ett obefläckat sätt. Tekniken har varit nyckeln till att identifiera molekylära mekanismer för kolonisering av eukaryota värdar i flera patogena mikrober och några fördelaktiga symbionter.
Här är Tn-seq etablerad som en metod för att identifiera koloniseringsfaktorer i en mutualistisk Burkholderia gladioli symbiont av skalbaggen Lagria villosa. Genom konjugation utförs Tn5 transposonmedierad insättning av en antibiotikaresistenskassett på slumpmässiga genomiska platser i B. gladioli. För att identifiera effekten av genstörningar på bakteriernas förmåga att kolonisera skalbaggens värd, vaccinerar det genererade B. gladioli transposon-mutantbiblioteket på skalbaggeäggen, medan en kontroll odlas in vitro i ett flytande odlingsmedium. Efter att ha tillåtit tillräckligt med tid för kolonisering extraheras DNA från in vivo- och in vitro-odlade bibliotek. Efter ett DNA-biblioteksprepareringsprotokoll förbereds DNA-proverna för transposoninsättningssekvensering. DNA-fragment som innehåller transposon-insert kanten och flankerande bakteriellt DNA väljs, och mutationsplatserna bestäms genom sekvensering bort från transposon-insert kanten. Slutligen, genom att analysera och jämföra frekvenserna för varje mutant mellan in vivo- och in vitro-biblioteken, kan vikten av specifika symbionta gener under skalbaggekoloniseringen förutsägas.
Introduction
Burkholderia gladioli kan delta i en symbiotisk associering med Lagria villosabaggar, som spelar en viktig roll i försvaret mot mikrobiella antagonister hos insektsvärden4,5,6. Kvinnliga skalbaggar hus flera stammar av B. gladioli i specialiserade körtlar tillbehör till reproduktionssystemet. Vid äggläggning utstryker kvinnor B. gladioliceller på äggytan där antimikrobiella föreningar som produceras av B. gladioli hämmar infektioner av entomopathogenicsvampar 4,6. Under sen embryonal utveckling eller tidigt efter larvernas kläckning koloniserar bakterierna cuticular invaginations på larvernas dorsala yta. Trots denna specialiserade lokalisering och vertikala överföringsväg av symbionterna, kan L. villosa förmodligen också förvärva B. gladioli horisontellt från miljön4. Dessutom har minst tre stammar av B. gladioli hittats i samband med L. villosa4,6. Bland dessa är B. gladioli Lv-StA den enda som är mottaglig för odling in vitro.
B. gladioli (född 1977) Lv-StA har en genomstorlek på 8,56 Mb6 och innehåller 7 468 gener. Vilka av dessa gener är viktiga för B. gladioli bakterier att kolonisera skalbaggen värd? För att svara på denna fråga använde vi transposon-insättningssekvensering (Tn-seq), en explorativ metod för att identifiera villkorligt väsentliga mikrobiella gener1,2,3. Ett mutantt bibliotek av B. gladioli Lv-StA skapades med hjälp av en Tn5 transposon. Genom konjugation från Escherichia coli donatorceller till B. gladioli Lv-StA överfördes en pRL27 plasmid som bär Tn5 transposon och en antibiotikaresistenskassett flankerad av inverterade upprepningar (Figur 1). Därmed genererades en uppsättning mutanter som individuellt bär störningar av 3 736 symbionta gener (figur 2).
Mutantpoolen smittades på skalbaggeägg för att identifiera koloniseringsfaktorerna och odlades som en kontroll också in vitro i King's B (KB) medium. Efter att ha tillåtit tillräckligt med tid för kolonisering samlades kläckta larver och poolades för DNA-extraktion. Fragment av DNA som innehåller transposoninsatsen och den flankerande genomiska regionen B. gladioli Lv-StA valdes med hjälp av ett modifierat DNA-biblioteksprepareringsprotokoll för sekvensering. Läskvalitetsbearbetning följt av analys med DESeq2 utfördes för att identifiera specifika gener som är avgörande för B. gladioli Lv-StA att kolonisera L. villosa larver när de överförs via äggytan.
Protocol
1. Medie- och buffertberedning
- Förbered KB- och LB-media- och agarplattor enligt tabell 1och autoklav vid 121 °C, 15 psi, 20 min.
- Tillsätt 50 μg/ml filtersteriliserad kanamycin och 300 μM filtersteriliserad 2,6-diaminopimelsyra (DAP) till det autoklaverade LB-mediet innan du odlar E.coli WM3064 + pRL27.
- Tillsätt 50 μg/ml filtersteriliserad kanamycin till den autoklaverade KB-agarn för att hälla plattor som behövs för att välja framgångsrika B. gladioli Lv-StA-transkonjuganter.
- Bered 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att blanda följande komponenter: NaCl 8 g/L, KCl 0.201 g/L, Na2HPO4 1.42 g/L och KH2PO4 0.272 g/L. Lös salterna i destillerat vatten och autoklav blandningen vid 121 °C, 15 psi, 20 min före användning. Förvara i rumstemperatur.
- Förbered en 2x Bind- och tvättbuffert genom att lösa upp följande komponenter: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM etylendiamintetraacetsyra (EDTA) och 2 M NaCl i destillerat vatten. Filtersterilisera blandningen före användning. Förvara i rumstemperatur.
- Förbered 1x Låg-TE genom att lösa upp 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) och 0,1 mM EDTA i dubbeldestillerat vatten. Sterilisera genom autoklavering vid 121 °C, 15 psi, 20 min. Förvara i rumstemperatur.
2. Trolla fram för att generera transposonmutationbiblioteket
Bild 1: Steg i konjugationsprotokollet. Konjugationsmottagaren Burkholderia gladioli Lv-StA (röd) och donatorn Escherichia coli som innehåller pRL27-plasmiden (rosa) odlas i KB-agar respektive LB, kompletterade med kanamycin och DAP. Efter konjugativ överföring av plasmiden i 12-18 h vid 30 °C väljs transkonjugant B. gladiolicellerna på KB som innehåller kanamycin och poolas ihop. Förkortningar: DAP = 2,6-diaminopimelinsyra; Kan = kanamycin. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Under en steril huva, inokulera en färsk donatorkultur av Escherichia coli WM3064 + pRL27 i 10 ml LB medium kompletterat med kanamycin och DAP. Inokulera Burkholderia gladioli Lv-StA mottagarceller i 5 ml KB medium. Inkubera kulturerna vid 30 °C över natten på en skakapparat vid 250 varv/min.
- Efter över natten tillväxt, centrifuge 4 ml av var och en av kulturerna på 9.600 × g i 6 min för att pelleta cellerna. Kassera supernaten.
- Tvätta de pelleterade cellkulturerna i KB-medium som innehåller DAP under en steril huva och återanvänd slutligen kulturerna separat i 4 ml KB + DAP-medium.
- Blanda 250 μL av de tvättade E. coli-donatorcellerna med 1 ml av de tvättade B. gladioli Lv-StA-mottagarcellerna i ett färskt 15 ml-rör.
- Punkt 10 μL av denna konjugationscellblandning på KB-agarplattor som innehåller DAP. Låt plattan vila ostört i den sterila huven vid rumstemperatur i 1 timme. Inkubera sedan plattorna med konjugationsfläckarna vid 30 °C i 12-18 h.
OBS: Konjugationsperioden kan justeras enligt målarten. En lång konjugationsperiod ökar dock risken för dubbla infogningar eller plasmidintegration i genomet. För långsamt växande bakterier, tillåt längre konjugationstider. - Efter inkubation, tillsätt 2-4 ml 1x PBS i plattorna under en steril huva och använd en cellskrapa för att frigöra de odlade bakteriella konjugationsfläckarna från agaren. Pipetten den konjugerade cellblandningen till 2 ml mikrofugerör.
- Pellet cellerna genom att centrifugera vid 9 600 × g i 2 min. Kassera supernaten och tvätta pelleten två gånger i 1 ml 1x PBS genom att leda upp och ner. Återanvänd den slutliga pelleten i 1200 μL 1x PBS. Gör utspädningar före plätering om antalet celler i blandningen är över 1 × 104.
- Blanda väl och sprid 200 μL av cellblandningen på stora KB-agarplattor (6 eller fler, om det behövs) kompletterat med kanamycin och inkubera vid 30 °C över natten.
OBS: Målmuterade kolonier förekommer inom 30 timmar på de selektiva agarplattorna. På grund av antibiotikaresistensmarkören visas endast muterade kolonier på den selektiva agarplattan. Därför förväntas alla kolonier vara framgångsrika transkonjuganter. - Räkna det totala antalet transkonjuganta kolonier på tre plattor och extrapolera för att beräkna det ungefärliga antalet mutanter som erhållits i alla plattor. För att öka chanserna att få ett representativt bibliotek, se till att det totala antalet kolonier är flera gånger högre än det totala antalet gener i genomet. För att bekräfta konjugationens framgång utför du en PCR som riktar in sig på insättningskassetten med hjälp av 10-20 provkolonier, enligt beskrivningen i avsnitt 3.
OBS: Målet är att säkerställa att antalet kolonier är minst 10 gånger antalet gener i hela genomet, i detta fall >75 000 mutanter. Det är dock i allmänhet utmanande att exakt uppskatta antalet kolonier som skulle motsvara ett helt representativt bibliotek. Antalet unika gener som muteras är inte uppenbart vid denna tidpunkt, med tanke på att störningar i väsentliga gener inte fångas, det finns ofta flera olika mutationsplatser för samma gen, och mutationer som genereras med Tn5-transposoner är inte helt slumpmässiga. - Under en steril huva skrapa kolonier från plattorna genom att lägga till 1-2 ml 1x PBS på agaren. Slå ihop cellblandningen som skrapats bort från plattorna till 50 ml rör. Vortex biblioteket att blanda noggrant och sedan dela 4 ml av det poolade mutantbiblioteket i flera cryotubes. Tillsätt 1 ml 70% glycerol i rören och förvara vid -80 °C.
3. PCR- och gelelektrofores för att bekräfta framgångsrika införanden i B. gladioli Lv-StA
- För att bekräfta närvaron av införingen, välj enskilda mutantkolonier från urvalsplattorna i steg 2.9 och utför en PCR som riktar in sig på insättningskassetten med hjälp av primers som anges i tabell 2. Förbered PCR-huvudblandningen enligt tabell 3 och ställ in förhållandena i termiska cyklatorn enligt beskrivningen i tabell 4.
- Kör PCR-produkterna på en 1,6% agarose gel med elektrofores (250 V, 40 min) för att kontrollera om de förstärkta DNA-fragmenten är av förväntad längd på 1580 bp.
4. Mutant poolinfektion på skalbaggeägg
- Bibliotek tvättsteg
- Tina upp en alikvot av det förberedda mutantbiblioteket på is. Centrifugera vid 2 683 × g i 10 min och ta bort supernaten. Tvätta cellerna med 4 ml 1x PBS under en steril huva för att avlägsna eventuellt återstående medium från cellerna. Återanvänd cellerna i 4 ml 1x PBS.
- Räkna antalet celler i ett alikvot i biblioteket med hjälp av en cellräkningskammare. Späd en del av biblioteket till 2 × 106 celler/μL i 1x PBS.
- Virvelbiblioteket aliquot noggrant för att blanda hela biblioteket homogent innan du tar den önskade volymen.
- Äggkopplingssterilisering och in vivo-infektion
- Välj en L. villosa äggkoppling. Räkna antalet ägg och fortsätt om kopplingen innehåller mer än 100 ägg.
- Sterilisera hela äggkopplingen.
- Tillsätt 200 μL 70% etanol och tvätta försiktigt äggen i 5 minuter. Ta bort etanolen och tvätta äggen två gånger med autoklaverat vatten.
- Tillsätt 200 μL 12% blekmedel (NaOCl) och tvätta försiktigt äggen i 30 s. Ta omedelbart bort blekmedlet och tvätta äggen igen tre gånger med 200 μL autoklaverat vatten.
- Infektera 2 × 106 celler/μL av det tvättade mutantbiblioteket på den steriliserade äggkopplingen (2,5 μL per ägg).
- Två dagar efter att de infekterade skalbaggslarverna kläcker, samla 1002 nd instar larver per 1,5 mL mikrofugerör och lagra vid -80 °C.
-
In vitro-mutant bibliotekskontroll
- Under en steril huva, inokulera 250 μL 2 × 106 celler/μL av det tvättade mutantbiblioteket i 10 ml KB-medium som innehåller kanamycin.
- Inkubera in vitro-mutantkulturen vid 30 °C i 20 timmar.
OBS: Beräkna inkubationstiden så att den matchar det ungefärliga antalet generationer av WT B. gladioli Lv-StA in vivo under koloniseringen. - Efter inkubationen på 20 h, tillsätt en lika stor volym 70% glycerol till in vitro-mutantkulturen och lagra den vid -80 °C.
5. Infekterade skalbaggar och in vitro-mutantbibliotek DNA-extraktion
OBS: DNA-extraktioner utfördes med hjälp av ett DNA- och RNA-reningskit enligt tillverkarens protokoll som beskrivs kortfattat nedan.
- Homogenisera poolade larver (högst 4 mg per mikrofugerör) genom att tillsätta 1-2 ml flytande kväve och krossa med en mortel.
- Tina upp de in vitro-odlade mutantkulturerna från glycerollager på is. Pellet cellerna genom centrifugering vid 9 600 × g i 10 min före celllys.
- Tillsätt 300 μL vävnads- och celllyslösning till in vitro- och in vivo-proverna. Tillsätt 5 μL 10 mg/ml proteinas K, inkubera blandningen vid 60 °C i 15 minuter och lägg sedan på is i 3-5 minuter.
- Tillsätt 150 μL proteinutfällningsreagens till lysaterna och virveln noggrant. Pellet protein skräp genom centrifugering på 9,600 × g i 10 min.
- Överför supernaten till ett 1,5 ml mikrofugerör. Tillsätt 500 μL isopropanol till supernaten och vänd försiktigt rören minst 40 gånger innan du inkuberar vid -20 °C i 1 timme eller över natten.
- Pellet det fällda DNA genom att centrifugera vid 9 600 × g i 10 min. Kassera supernatanten och tillsätt 70% etanol till DNA-pelleten.
- Centrifuge vid ≥10 000 × g i 5 min. Kassera supernaten och låt proverna lufttorka i minst 1 timme.
- Återanvänd DNA från in vitro- och in vivo-proverna i 100 μL låg TE-buffert.
- Förvara proverna vid -20 °C.
6. Sekvensering av biblioteksförberedelser
OBS: Protokollet och reagenserna för FÖRBEREDELSE AV DNA-bibliotek anpassas och ändras från instruktionerna från tillverkaren av DNA-bibliotekets förberedelsesats.
Figur 2: Schematiska för förberedelsestegen för DNA-biblioteket. Efter savning och adapterligion innehåller det modifierade protokollet ett streptavidin pärlvalssteg för att berika DNA-fragment som innehåller insättningskassetten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Späd proverna till 20 ng/μL-koncentration och volym på 100 μL och håll dem på is.
- Shear in vivo och in vitro prov DNA med hjälp av en ultraljudspump. Ställ ultrasonicator på 70% effekt. Virvel proverna kort och skjuv i 1 min 30 s.
OBS: Inställningarna för ultraljudspumpen skiljer sig åt mellan instrumenten. I detta fall var fragmentstorleken 200–400 bp, vilket är lämpligt för denna sekvenseringsmetod på 150 bp, parad ände (se steg 9.1). Savparametrarna kan justeras enligt experimenterarens krav. - Kontrollera om DNA:t var uppstjutet till önskat storleksintervall (i det här fallet 200-400 bp). Belastning 5 μL av det obladiga och skjuvade DNA:t efter blandning med gelbelastningsfärgämne i ett 1:1-förhållande på en 1,6% agarosegel som körs vid 250 V i 40 min (Figur 3A,B).
- Förberedelse av fragmentändar som krävs för adapterligning
- Tillsätt de reagenser för slutpreparat som ges i bibliotekets beredningssats till 50 μL av det savda DNA:t: 3 μL av enzymblandningen och 7 μL reaktionsbuffert och blanda väl genom pipetting. Ställ in en termisk cyklator med ett uppvärmt lock vid ≥ 75 °C och inkubera proverna i 30 minuter vid 20 °C och 30 min vid 65 °C. Håll vid 4 °C.
- Adapter ligatur
- För adapterligering, tillsätt följande reagenser till produkterna i ändberedningssteget: 30 μL Ligation Master Mix, 1 μL Ligation Enhancer och 2,5 μL utspädd adapter. Blanda noggrant genom att pipetting och inkubera provet i 15 min vid 20 °C i termisk cyklator med det uppvärmda locket av.
- Efter 15 min tillsätt 3 μL av enzymet (uracil DNA glykosylas + DNA-glykosylas-lyas Endonuklease VIII) (se materialförteckningen). Blanda väl genom att pipetting och inkubera provet i 15 min vid 37 °C i en termisk cyklator med locket uppvärmt vid ≥47 °C.
OBS: Protokollet kan pausas i detta steg och proverna kan förvaras vid -20 °C.
- Storleksval av adapter-ligated DNA-målfragment på 250 bp
- Virvel den magnetiska pärllösningen (se materialförteckningen)och placera den i rumstemperatur i 30 minuter före användning.
- Tillsätt 0,3x pärlor till 96,5 μL av den ligaterade DNA-blandningen och blanda genom pipettering noggrant. Inkubera pärlblandningen i 5 minuter.
OBS: Förekomsten av salter och polyetylenglykol i pärlblandningen underlättar utfällningen av DNA-fragment på pärlorna. Ett lågt förhållande mellan pärlor och DNA-molekyler leder till bindning av endast större DNA-fragment till pärlorna. I detta fall är DNA-fragment över 250 bp långa bundna till pärlorna. - Placera rören på ett magnetiskt stativ för att dra ner pärlorna och ta bort DNA-fragment av oönskad storlek. Låt pärlorna nöja sig i 5 minuter och överför sedan den klara supernaten till ett nytt mikrofugerör (behåll supernaten).
- Tillsätt 0,15x färska pärlor till supernaten och blanda genom att pipetting väl. Inkubera pärlblandningen i 5 minuter och placera sedan rören på ett magnetiskt stativ för att dra ner pärlor som är bundna till mål-DNA. Vänta i 5 min och kassera sedan supernaten (behåll pärlorna).
OBS: Detta förhållande mellan pärlor och DNA leder till bindning av fragment av önskad storlek på 250 bp. - Med pärlorna på magnetstativet, tillsätt 200 μL 80% etanol (nyberedda) och vänta i 30 s. Pipetten ut och kassera etanoltvätten försiktigt utan att störa pärlorna på magnetstativet. Upprepa det här steget.
- Efter den sista tvätten, ta bort spår av etanol från pärlorna och lufttorka sedan pärlorna i 2 minuter tills de verkar blanka men inte helt torkade ut. Torka inte pärlorna för mycket.
- Ta bort rören från magnetstativet och tillsätt 17 μL 10 mM Tris-HCl eller 0,1x TE (Low-TE). Blanda genom att pipetting ~ 10 gånger och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 2 min.
- Placera rören tillbaka på magnetstativet och vänta i 5 minuter. När pärlor har slagit sig ner, överför DNA-supernaten till ett nytt rör.
- PCR I för att lägga till biotintaggar till DNA-fragment som innehåller insättningskassetten
- Tillsätt en biotinylerad primer-tagg till DNA-fragmenten som innehåller Tn5-insättningskassetten med hjälp av den transposonspecifika biotinylerade primern (tabell 5) och en indexprimer. Förbered PCR-huvudblandningen enligt tabell 6 och följ PCR-villkoren för den termiska cyklatorn som anges i tabell 7.
- Rensning av PCR I utan storleksval
- Virvel 0,9x pärlor och placera dem i rumstemperatur i minst 30 min före sanering.
- Tillsätt 0,9x pärlor till PCR-produkterna och blanda noggrant.
- Placera pärlorna på ett magnetiskt stativ för att dra ner pärlorna.
- Ta bort det klara supernatanten och tvätta pärlbundet DNA med 200 μL nylagad 80% etanol två gånger.
- Ta bort etanolen efter tvättstegen och lufttorka pärlorna tills de ser blanka ut men inte för torra.
- Tillsätt 32 μL 10 mM Tris-HCl eller 0,1X TE (Low-TE) och inkubera pärlorna i 5 minuter. Placera blandningen tillbaka på magnetstativet och överför supernaten till ett nytt mikrofugerör.
- Bindning av biotinylerade DNA-fragment till streptavidinpärlor
- Återanvänd 32 μL streptavidinpärlor i 1x Bind- och tvättbuffert. Tvätta pärlorna med bufferten tre gånger medan de placeras på ett magnetiskt stativ.
- Tillsätt 32 μL 2x bind- och tvättbuffert och sätt tillbaka pärlorna. Lägg till 32 μL av de rengjorda PCR 1-produkterna. Blanda noggrant och inkubera i rumstemperatur i 30 min.
- Placera pärl-DNA-blandningen på ett magnetiskt stativ i 2 minuter. Pipetten ut supernatanten som biotin-märkt DNA som innehåller insättningskanten binder till streptavidin på pärlorna.
- Tvätta pärlorna med 500 μL 1x Bind- och tvättbuffert och tvätta sedan pärlorna med 200 μL låg TE. Återanvänd de DNA-bundna pärlor i 17 μL låg-TE.
- PCR II för att lägga till adaptrar i fragmenten som innehåller insättningskassettkanten
- Förbered en huvudmix, som visas i tabell 8, med hjälp av indexprimrarna och modifierade universella PCR-primers som anges i tabell 5. Tillsätt 15 μL av de DNA-bundna streptavidinpärlorna från föregående steg till PCR-blandningen. Se tabell 7 för termiska cyklatorförhållanden.
- Rensa PCR-produkterna utan storleksval enligt steg 6.8 i detta protokoll. Eluera de slutliga DNA-produkterna i 30 μL molekylvatten.
- Förvara proverna vid -20 °C och använd dem för sekvensering.
7. Sekvensering och analys
- Sekvensera biblioteket med hjälp av sekvenseringsteknik med hög genomströmning. Justera sekvenseringsdjupet beroende på transposonbibliotekets storlek, som anges nedan. Utvärdera läskvaliteten med FastQC7. Välj läsningar som innehåller Tn5-insättningskanten på 5' slutet av läsningen och ta bort insättningskantsekvensen med Cutadapt8 och/eller Trimmomatic9.
OBS: Här användes en parparad sekvenseringsmetod för att rikta in sig på 150 bp per läsning och totalt 8 Mio läser. För att erhålla en representativ datauppsättning, se till att det totala antalet sekvenserade läsningar överstiger det maximala antalet mutanter i biblioteket, dvs. Som referens syftade detta protokoll till 40 gånger av maximal biblioteksstorlek. Andra framgångsrika studier med Tn-seq för ett liknande ändamål sekvenserade ett totalt antal läsningar nära 25 gånger av det faktiska antalet unika infogningar i motsvarande mutantbibliotek22,23. - Med tanke på att mutationer i ändarna av gener inte är funktionellt störande, trimma 5% av båda ändarna av genanteckningar av referensgenomet GFF fil. Mappa de trimmade läsningarna till referensgenomet med Bowtie210.
- Beräkna antalet infogningar från antalet unika 5- positioner i justeringsfilen BAM.
- Använd FeatureCounts11och få antalet träffgener för varje replikatprov.
- Använd DESeq212-paketet i RStudio, beräkna skillnaden i mutanta överflöd mellan olika förhållanden.
Representative Results
Värdrelaterade bakterier kan använda flera faktorer för att upprätta en association, inklusive de medlande vidhäftning, motilitet, kemotaxis, stressresponser eller specifika transportörer. Medan faktorer som är viktiga för patogen-värd interaktioner har rapporterats för flera bakterier13,14,15,16,17,18, inklusive medlemmar av släktet Burkholderia19,20, färre studier har utforskat de molekylära mekanismerna som används av fördelaktiga symbionter för kolonisering21,22,23 . Med hjälp av transposon insättningssekvensering, syftet var att identifiera molekylära faktorer som gör det möjligt för B. gladioli att kolonisera L. villosa skalbaggar.
Transposon-medierad mutagenes utfördes med pRL27 plasmid, som bär en Tn5 transposon och en kanamycin motstånd kassett flankerad av inverterade repetition platser. Plasmiden introducerades i mål B. gladioli Lv-StA-cellerna genom konjugation med plasmiddonatorn E. coli WM3064-stammen (som visas i figur 1). Efter konjugation, konjugation blandning som innehåller B. gladioli mottagare och E. coli givaren celler pläterades på selektiva agar plattor som innehåller kanamycin. Frånvaron av DAP på plattorna eliminerade givaren E. coli celler, och förekomsten av kanamycin valt för framgångsrika B. gladioli Lv-StA transconjugants. Det poolade B. gladioli Lv-StA mutantbiblioteket som erhållits genom att skörda de 100 000 transkonjuganta kolonierna förbereddes för sekvensering med hjälp av ett modifierat DNA-biblioteksberedningskit och anpassade primers. Figur 2 belyser förberedelsestegen för DNA-biblioteket. Sekvensering gav 4 Mio parade läsningar; 3 736 gener av 7 468 gener i B. gladioli Lv-StA stördes.
För att identifiera mutanter som var koloniserings-defekta i värden smittades B. gladioli Lv-StA mutantbiblioteket på skalbaggeäggen och odlades in vitro i KB medium som en kontroll. Flaskhalsstorleken in vivo-koloniseringen beräknades före experimentet. Ett känt antal B. gladioli Lv-StA celler smittades på skalbagge ägg, och antalet koloniserande celler i nykläckta första instar larver erhölls genom plätering en suspension från varje larva och räkna kolonibildande enheter per individ. Dessa beräkningar gjordes för att säkerställa att antalet koloniserande celler är tillräckligt för att bedöma hela eller en hög andel av mutanterna i biblioteket för deras förmåga att kolonisera värden. Dessutom normaliserades tillväxttiden mellan in vitro- och in vivo-tillstånd baserat på antalet bakteriegenerationer för att göra dessa prover jämförbara.
Efter att äggen kläckts samlades 1 296 larver i 13 pooler. Motsvarande in vitro-mutantkulturer odlades och lagrades som glycerolbestånd. DNA från in vivo och in vitro odlade mutant bibliotek extraherades och fragmenteras i en ultraljudsbehandling. Figur 3 visar storleksfördelningen av det savda DNA:t, där majoriteten av fragmenten sträcker sig mellan 100 och 400 bp, som förväntat. Detta steg följdes av det modifierade DNA-bibliotekets förberedelseprotokoll för sekvensering. Vid varje steg i protokollet kontrollerades koncentrationen av återstående DNA för att säkerställa att stegen utfördes korrekt och för att spåra förluster av DNA. En kvalitetskontroll (se materialförteckningen)före sekvenseringen visade att DNA-biblioteken innehöll oväntat stora (>800 bp) DNA-fragment, och detta var mer uttalat i in vivo-biblioteken. Med tanke på svårigheten att optimera klustring av fragment i sekvenseringsbanorna var det nödvändigt att öka sekvenseringsdjupet till 10 Mio-parade läsningar i in vivo-biblioteken för att uppnå önskat antal läsningar. Analysen av sekvenseringsresultaten visade att i genomsnitt 4 miljoner läser i in vivo-biblioteken och 3,1 Mio läser i in vitro-biblioteken innehöll Transposon-kanten i 5' slutet av Läs-1 (Tabell 9), vilket var tillfredsställande för detta experiment. Fördelningen av de 24 224 unika insättningarna över B. gladioligenomet i det ursprungliga biblioteket visas i figur 4. En analys utförd med DESeq2 visade att överflöd av 271 mutanter var betydligt olika mellan in vivo- och in vitro-förhållandena.
Figur 3:Agarosageler från en mutant-och DNA-bibliotek. Gelmedavsjuvt DNA-bibliotek. Stegens bandstorlekar i det första körfältet anges på vänster sida. De tre första körfälten a, b och c innehåller uppsaxade DNA-fragment från in vivobiblioteken . Körfält d, e, f och g innehåller uppsjutna DNA-fragment av in vitro-biblioteken. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Placering av unika insättningsplatser i det ursprungliga biblioteket över de fyra repliconerna i Burkholderia gladioli Lv-StA-genomet. Varje stapel längs x-axeln finns på en insättningsplats. Höjden på en stapel längs y-axeln motsvarar antalet läsningar som är associerade med den platsen. Observera att de två kromosomerna och två plasmiderna visas i full längd och därmed har olika skalor på x-axeln. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Kungens B-medium/ agar | |
| Peptone (sojaböna) | 20 g/L |
| K2HPO4 | 1,5 g/L |
| MgSO4.7H2O | 1,5 g/L |
| Agar | 15 g/L |
| Upplöst i destillerat vatten | |
| LB medium/agar | |
| Tryptone (olika) | 10 g/L |
| Jästextrakt | 5 g/L |
| NaCl (NaCl) | 10 g/L |
| Upplöst i destillerat vatten | |
Tabell 1: Mediekomponenter.
| Nej. | Grundfärger | Sekvens | PCR glödgningstemperatur. (°C) | |
| 1 | tpnRL17–1RC | 5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3' | 58.2 | |
| 2 | tpnRL13–2RC | 5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3' | ||
Tabell 2: Primers för att bekräfta framgången med konjugation.
| Komponent | Volym (μL) |
| HPLC-renat vatten | 4.92 |
| 10x buffert S (hög specificitet) | 1 |
| MgCl2 (25 mM) | 0.2 |
| dNTP (2 mM) | 1.2 |
| Primer 1 (10 pmol/μL) | 0.8 |
| Primer 2 (10 pmol/μL) | 0.8 |
| Taq (5 U/μL) | 0.08 |
| Mastermix totalt | 9 |
| Mall | 1 |
Tabell 3: PCR master mix för att bekräfta framgången med konjugation. Förkortningar: HPLC = högpresterande vätskekromatografi; dNTPs = deoxynucleoside triphosphate.
| Trappsteg | Temperatur °C | Tid | Cykler |
| Inledande denaturering | 95 | 3 min | 1 |
| Denaturering | 95 | 40-talet | |
| Glödgning | 58.2 | 40-talet | 30 till 35 |
| Förlängning | 72 | 1-2 min | |
| Slutlig förlängning | 72 | 4 min | 1 |
| Hålla | 4 | ∞ | |
Tabell 4: PCR-villkor för att bekräfta konjugeringens framgång.
| Grundfärger | Sekvens | Tm °C | Använda | Källa | |
| Transposonspecifik biotinylerad primer | 5'-Biotin-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3' |
63.5 | 6.7.1. PCR I | Sed | |
| Modifierad universell PCR-primer | 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3' |
62 | 6.10.1. PCR II | Sed | |
| Index primer | Se tillverkarens handbok | 6.7.1. PCR I & 6.10.1. PCR II | NEBNext Multiplex Oligos för Illumina (Indexprimrar set 1) | ||
| Adapter | Se tillverkarens handbok | 6.5. Adapter ligatur | NEBNext Ultra II DNA-biblioteksförberedelsesats för Illumina | ||
Tabell 5: Primers och adapter för PCR I och II under FÖRBEREDELSE AV DNA-bibliotek.
| PCR-blandning | (μL) |
| Adapter-ligated DNA-fragment | 15 |
| NEBNext Ultra II Q5 master mix | 25 |
| Indexprimer (10 pmol/ μL) | 5 |
| Transposonspecifik biotinylerad primer (10 pmol/ μL) | 5 |
| Total volym | 50 |
Tabell 6: FÖRBEREDELSE AV DNA-bibliotek-PCR I master mix.
| Trappsteg | Temperatur | Tid | Cykler |
| Inledande denaturering | 98 °C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 °C | 10 s | 6 till 12 |
| Glödgning | 65 °C | 30 s | |
| Förlängning | 72 °C | 30 s | |
| Slutlig förlängning | 72 °C | 2 min | 1 |
| Hålla | 16 °C | ∞ | |
Tabell 7: FÖRBEREDELSE AV DNA-bibliotek-PCR I- och II-förhållanden.
| PCR-blandning | (μL) |
| Pärlvalt DNA | 15 |
| NEBNext Ultra II Q5 master mix | 25 |
| Index primer | 5 |
| Modifierad universell PCR-primer | 5 |
| Total volym | 50 |
Tabell 8: FÖRBEREDELSE AV DNA-bibliotek-PCR II master mix.
| Bibliotek | Invivo-1 | Invivo-2 | Invivo-3 | Invitro-1 (olika) | Invitro-2 (olika) | Invitro-3 (olika) | Ursprungligt bibliotek | |
| Nej. av läsningar (PE) | 56,57,710 | 39,19,051 | 30,65,849 | 35,73,494 | 28,83,440 | 36,61,956 | 46,09,410 | |
| Nej. av läsningar som innehåller Tn – kant i 5' slutet av Läs-1 | 54,15,880 | 37,31,169 | 29,36,247 | 33,00,499 | 27,35,705 | 33,50,402 | 41,53,270 | |
| Bowtie2 total inriktningshastighet (%) (endast skriv-1) | 95.53% | 83.71% | 89.87% | 80.79% | 78.00% | 73.06% | 74.92% | |
| Antal unika infogningar | 8,539 | 4,134 | 7,183 | 18,930 | 18,421 | 20,438 | 24,224 | |
| Antal gener som drabbats | 1575 | 993 | 1450 | 2793 | 2597 | 3037 | 3736 | |
Tabell 9: Sammanfattning av sekvenseringsutgång och transposoninsättningsfrekvens per bibliotek. Förkortning: PE = paired-end.
Discussion
Ett B. gladioli transposon mutant bibliotek genererades för att identifiera viktiga värd kolonisering faktorer i symbiotiska interaktionen mellan L. villosa skalbaggar och B. gladioli bakterier. De viktigaste stegen i protokollet var konjugation, värdinfektion, DNA-biblioteksförberedelse och sekvensering.
Eftersom många stammar av Burkholderia är mottagliga för genetisk modifiering genom konjugation24,25, plasmiden som bär transposon och antibiotikainsättningskassett konjugerades framgångsrikt i mål B. gladioli Lv-StA stam från E. coli. Tidigare försök till omvandling genom elektroporation gav mycket låg till nästan inga B. gladioli transformanter. Det är lämpligt att optimera omvandlingstekniken för målorganismen för att effektivt ge ett stort antal transformatorer.
En omgång konjugation och 40 konjugationsfläckar störde 3 736 gener i B. gladioli Lv-StA. Med facit i hand skulle flera konjugationsrundor vara nödvändiga för att störa de flesta av de 7 468 generna och få ett mättat bibliotek. Särskilt fick inkubationstiden under konjugation inte överstiga 12-18 h, vilket är slutet på den exponentiella tillväxtfasen av B. gladioli. Att tillåta konjugation bortom bakteriecellernas exponentiella tillväxtfas minskar chanserna att lyckas få transkonjuganter26. Därför bör konjugationsperioden justeras efter bakteriearternas tillväxt.
För att framgångsrikt utföra ett experiment som involverar infektion av mutantbibliotek i en värd är det viktigt att bedöma bakteriepopulationens flaskhalsstorlek under koloniseringen och mångfalden av mutanter i biblioteket före infektion1,2,27. Som förberedelse för experimentet uppskattade vi det minsta antalet skalbaggar som måste infekteras för att ha en hög chans att varje mutant i biblioteket provtas och får kolonisera. Den ungefärliga bakteriegenereringstiden in vivo och antalet generationer under experimentets varaktighet beräknades också. In vitro-kulturen växte sedan upp till ett jämförbart antal generationer genom att justera inkubationstiden. För ett liknande infektionsexperiment hos andra icke-modellvärdar är förmågan att upprätthålla en laboratoriekultur och en konstant källa till värdorganismerna önskvärd.
Efter tillväxten av mutanta biblioteket in vivo och in vitro och prov samling, genomfördes ett modifierat DNA bibliotek förberedelse protokoll för transposon insättning sekvensering. Ändringen i protokollet innebar att designa anpassade PCR-primers och lägga till PCR-steg för att välja för DNA-fragment som innehåller insättningskassetten. Eftersom protokollet har anpassats ökade ytterligare PCR-cykler i protokollet risken för överamplifiering och erhållande av hybridiserade nätverkskortsfragment i slutbiblioteken. Därför rekommenderas ett slutligt rensningssteg (utan storleksval) efter de två PCR: erna, eftersom det hjälper till att ta bort dessa fragment. Storleksfördelningen av DNA-biblioteken var fortfarande bredare än väntat. Att öka sekvenseringsdjupet gav dock tillräckliga data som filtrerades under bioinformatikanalysen, vilket gav tillfredsställande resultat.
Eftersom transposonmedierad mutagenes genererar tusentals slumpmässiga införanden i ett enda experiment är det möjligt att generera ett mättat bibliotek av mutanter som innehåller alla utom de mutanter där gener som är väsentliga för bakterietillväxt har störts. Vi fungerade troligen inte med ett mättat mutantbibliotek, med tanke på uppskattningarna av väsentliga gener i andra studier på Burkholderia sp. 28,29. Ett icke-mättat bibliotek hjälper ändå till att utforska olika kandidatgener för ytterligare studier med hjälp av riktad mutagenes. Före experimenten är det också viktigt att komma ihåg att vissa transposoner har specifika insättningsmålplatser som ökar överflödet av mutanter vid vissa lokus igenomet 30. Mariner transpoons är kända för att rikta in sig på AT-platser för insättning31, och Tn5 transposoner har en GC bias32,33. Att inkludera steg under bioinformatikanalys för att känna igen hotspots för transposoninfogningar hjälper till att bedöma eventuella distributionsfördomar.
Även om det är utsatt för bakslag kan ett väl utformat transposoninsättningssekvenseringsexperiment vara ett kraftfullt verktyg för att identifiera många villkorligt viktiga gener i bakterier inom ett enda experiment. Till exempel identifierades ett dussin gener i Burkholderia seminalis viktigt för undertryckandet av orkidéblad nekros genom att kombinera transposon mutagenes och genomik34. Bortom Burkholderiahar flera vidhäftnings- och motilitetsgener och transportörer identifierats som viktiga koloniseringsfaktorer i Snodgrassella alvi symbionter av Apis mellifera (Honeybee)22, och i Vibrio fischerii symbionts av Euprymna scolopes (Hawaiian bobtail squid)23 med hjälp av transposon-insertion mutagenesis strategi.
Som ett alternativt tillvägagångssätt kan transposon mutagenesis följas av screening för enskilda mutanter med selektiva medier istället för sekvensering. Fenotypisk screening eller bioassays för att identifiera brister, såsom motility, produktion av bioaktiva sekundära metaboliter, eller specifika auxotrophies, är genomförbara. Till exempel har screening av en Burkholderia insecticola (omplacerad till släktet Caballeronia35) transposon mutantbibliotek varit nyckeln till att identifiera att symbionterna använder motilitetsgener för att kolonisera Riptortus piedestris, deras insekt värd36. Med hjälp av transposon mutagenes och fenotypisk screening identifierades dessutom det biosyntetiska genklustret för den bioaktiva sekundära metaboliten caryoynencin i Burkholderia caryophylli37. En auxotrophic mutant av Burkholderia pseudomallei identifierades efter transposon mutagenes och screening och är en möjlig försvagad vaccin kandidat mot melioidosis, en farlig sjukdom hos människor och djur38. Således är transposon mutagenes och sekvensering ett värdefullt tillvägagångssätt för att studera de molekylära egenskaperna hos bakterier som är viktiga för interaktionerna med sina respektive värdar i patogena eller mutualistiska associationer.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt i avseende studien.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Junbeom Lee för att ha tillhandahållit E. coli WM3064 +pRL27-stammen för konjugation och vägledning i förfarandet, Kathrin Hüffmeier för att ha hjälpt till med felsökning under mutantbiblioteksgenerering och prof. André Rodrigues för att stödja insektsinsamling och tillståndsförvärv. Vi tackar också Rebekka Janke och Dagmar Klebsch för stödet vid insamling och uppfödning av insekterna. Vi bekräftar de brasilianska myndigheterna för att bevilja följande tillstånd för tillgång, insamling och export av insektsprover: SISBIO-tillstånd nr 45742-1, 45742-7 och 45742-10, CNPq process nº 01300.004320/2014-21 och 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF och 20BR035212/DF). Denna forskning stöddes av finansiering från German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 och KA2846/6-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,6- Diaminopimelic Acid | Alfa Aesar | B22391 | For E.coli WM3064+ pRL27 |
| Agar - Agar | Roth | 5210 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| AMPure beads XP (magentic beads + polyethylene glycol + salts) | Beckman Coulter | A63880 | Size selection in step 6.6 |
| Bleach (NaOCl) 12% | Roth | 9062 | |
| Bowtie2 v.2.4.2 | Bioinfromatic tool for read mapping. Reference 10 in main manuscript. | ||
| Buffer-S | Peqlab | PEQL01-1020 | For PCRs |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.1830 | |
| Cutadapt v.2.10 | Bioinformatic tool for removing specific adapter sequences from the reads. Reference 8 in main manuscript. | ||
| DESeq2 | RStudio package for assessing differential mutant abundance. Usually used for RNAseq analysis. Reference 12 in main manuscript. | ||
| DNA ladder 100 bp | Roth | T834.1 | |
| dNTPs | Life Technology | R0182 | PCR for confirming success of conjugation |
| EDTA, Di-Sodium salt | Roth | 8043 | |
| Epicentre MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit | Lucigen | MC85200 | |
| Ethidium bromide | Roth | 2218.1 | |
| FastQC v.0.11.8 | Bioinformatic tool for assessing the quality of sequencing data. Reference 7 in main manuscript. | ||
| FeatureCounts v.2.0.1 | Bioinformatic tool to obtain read counts per genomic feature. Reference 11 in main manuscript. | ||
| Glycerol | Roth | 7530 | |
| K2HPO4 | Roth | P749 | |
| Kanamycin sulfate | Serva | 26899 | |
| KCl | Merck | 4936 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904 | |
| MgSO4.7H2O | Roth | PO27 | |
| Na2HPO4 | Roth | P030 | |
| NaCl | Merck | 6404 | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index primers set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | New England Biolabs | E7645S | |
| Peptone (soybean) | Roth | 2365 | For Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium |
| peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase | VWR | PEQL01-1020 | PCR for confirming success of conjugation |
| Petri plates - 145 x 20 mm | Roth | XH90.1 | For selecting transconjugants |
| Petri plates - 90 x 16 mm | Roth | N221.2 | |
| Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Germany) | Quality check after DNA library preparation | ||
| Streptavidin beads | Roth | HP57.1 | |
| Taq DNA polymerase | VWR | 01-1020 | |
| Trimmomatic v.0.36 | Bioinformatic tool for trimming low quality reads and also adapter sequences. Reference 9 in main manuscript. | ||
| Tris -HCl | Roth | 9090.1 | |
| Tryptone | Roth | 2366 | For Escherichia coli WM3064+pRL27 LB medium |
| Ultrasonicator | Bandelin | GM 70 HD | For shearing |
| USER enzyme (uracil DNA glycosylase + DNA glycosylase- lyase Endonuclease VIII) | New England Biolabs | E7645S | Ligation step 6.5.2 |
| Yeast extract | Roth | 2363 |
References
- Cain, A. K., et al. A decade of advances in transposon-insertion sequencing. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 526-540 (2020).
- Chao, M. C., Abel, S., Davis, B. M., Waldor, M. K. The design and analysis of transposon insertion sequencing experiments. Nature Reviews Microbiology. 14 (2), 119-128 (2016).
- Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
- Flórez, L. V., et al. Antibiotic-producing symbionts dynamically transition between plant pathogenicity and insect-defensive mutualism. Nature Communications. 8 (1), 15172 (2017).
- Flórez, L. V., Kaltenpoth, M. Symbiont dynamics and strain diversity in the defensive mutualism between Lagria beetles and Burkholderia. Environmental Microbiology. 19 (9), 3674-3688 (2017).
- Flórez, L. V., et al. An antifungal polyketide associated with horizontally acquired genes supports symbiont-mediated defense in Lagria villosa beetles. Nature Communications. 9 (1), 2478 (2018).
- Andrews, S. FastQC A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. FeatureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Gaytán, M. O., Martínez-Santos, V. I., Soto, E., González-Pedrajo, B. Type three secretion system in attaching and effacing pathogens. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 129 (2016).
- Hachani, A., Wood, T. E., Filloux, A. Type VI secretion and anti-host effectors. Current Opinion in Microbiology. 29, 81-93 (2016).
- Deep, A., Chaudhary, U., Gupta, V. Quorum sensing and bacterial pathogenicity: From molecules to disease. Journal of Laboratory Physicians. 3 (1), 4-11 (2011).
- Silva, A. J., Benitez, J. A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), 0004330 (2016).
- Navarro-Garcia, F., Ruiz-Perez, F., Cataldi, Á, Larzábal, M. Type VI secretion system in pathogenic Escherichia coli: structure, role in virulence, and acquisition. Frontiers in Microbiology. 10, 1965 (2019).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia Type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001068 (2010).
- Jones, C., et al. Kill and cure: genomic phylogeny and bioactivity of Burkholderia gladioli bacteria capable of pathogenic and beneficial lifestyles. Microbial Genomics. 7 (1), 000515 (2021).
- Takeshita, K., Kikuchi, Y. Riptortuspedestris and Burkholderia symbiont: an ideal model system for insect-microbe symbiotic associations. Research in Microbiology. 168 (3), 175-187 (2017).
- Powell, J. E., et al. Genome-wide screen identifies host colonization determinants in a bacterial gut symbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (48), 13887-13892 (2016).
- Brooks, J. F., et al. Global discovery of colonization determinants in the squid symbiont Vibrio fischeri. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17284-17289 (2014).
- Somprasong, N., McMillan, I., Karkhoff-Schweizer, R. R., Mongkolsuk, S., Schweizer, H. P. Methods for genetic manipulation of Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans. BMC Research Notes. 3 (308), (2010).
- Garcia, E. C.
- Headd, B., Bradford, S. A. The conjugation window in an Escherichia coli K-12 strain with an IncFII plasmid. Applied and Environmental Microbiology. 86 (17), 00948 (2020).
- Van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: A new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 435-442 (2013).
- Gallagher, L. A., Ramage, E., Patrapuvich, R., Weiss, E., Brittnacher, M., Manoil, C. Sequence-defined transposon mutant library of Burkholderia thailandensis. mBio. 4 (6), 00604-00613 (2013).
- Wong, Y. -C., et al. Candidate essential genes in Burkholderia cenocepacia J2315 identified by genome-wide TraDIS. Frontiers in Microbiology. 7, 1288 (2016).
- Moule, M. G., et al. Genome-wide saturation mutagenesis of Burkholderia pseudomallei K96243 predicts essential genes and novel targets for antimicrobial development. mBio. 5 (1), 00926 (2014).
- Ding, Q., Tan, K. S. Himar1 transposon for efficient random mutagenesis in Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Frontiers in Microbiology. 8, 1842 (2017).
- Green, B., Bouchier, C., Fairhead, C., Craig, N. L., Cormack, B. P. Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons. Mobile DNA. 3, 3 (2012).
- Lodge, J. K., Weston-Hafer, K., Berg, D. E. Transposon Tn5 target specificity: Preference for insertion at G/C pairs. Genetics. 120 (3), 645-650 (1988).
- Ará Ujo, W. L., et al. Genome sequencing and transposon mutagenesis of Burkholderia seminalis TC3.4.2R3 identify genes contributing to suppression of orchid necrosis caused by B. gladioli. Molecular Plant-microbe Interactions: MPMI. 29 (6), 435-446 (2016).
- Dobritsa, A. P., Samadpour, M. Reclassification of Burkholderiainsecticola as Caballeroniainsecticola comb. nov. and reliability of conserved signature indels as molecular synapomorphies. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 69 (7), 2057-2063 (2019).
- Ohbayashi, T., et al. Insect's intestinal organ for symbiont sorting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 5179-5188 (2015).
- Ross, C., Scherlach, K., Kloss, F., Hertweck, C. The molecular basis of conjugated polyyne biosynthesis in phytopathogenic bacteria. Angewandte Chemie International Edition. 53 (30), 7794-7798 (2014).
- Atkins, T., et al. A mutant of Burkholderia pseudomallei, auxotrophic in the branched chain amino acid biosynthetic pathway, is attenuated and protective in a murine model of melioidosis. Infection and Immunity. 70 (9), 5290-5294 (2002).
