Summary
直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、光顕微鏡の典型的な回折限界をバイパスし、ナノメートルスケールでエキソソームを見るために使用されます。エキソソームを特徴付けるために2次元と3次元の両方で採用することができます。
Abstract
細胞外小胞(EV)は、細胞の種類を全て放出し、細胞シグナル伝達や恒常性に重要な役割を果たす。EV の視覚化には、通常の光顕微鏡の回折限界を超える小径 (40 ~250 nm) による間接的な方法が必要な場合が多い。我々は、2次元と3次元の両方で回折限界をバイパスするEVの超解像顕微鏡ベースの視覚化を開発しました。この方法を使用すると、XY 軸での解像度 +/- 20 nm 以内、Z 軸に沿った解像度 +/- 50 nm の解像度に、EV の 3 次元の形状を解決できます。結論として、我々は、超解像顕微鏡をエキソソームを含むEVの特性評価方法として、また、エンベロープウイルスとして考慮することを提案する。
Introduction
細胞外小胞(EV)は、全ての細胞タイプによって放出される膜結合小胞である。脂質、タンパク質、代謝産物、核酸を含み、細胞間で細胞間で局所的に、組織と器官の間で遠位に移動します。EV には、アポトーシス体、微小小胞、エキソソーム1、2という 3 つの主要なサブタイプがあります。ここでは、エキソソームとその関連タンパク質に焦点を当てます。
エキソソームは、初期の子宮体の内出から多胸体(MVB)に由来する小胞を分泌する。MVBは、その後、細胞膜と融合し、エキソソームを細胞外空間に放出して、他の細胞3、4に移動する。エキソソームは40~150nmの範囲の大きさのスペクトルに存在し、テトラスパニン(CD9、CD63、CD81)、輸送に必要な膜結合性内膜選別複合体(ESCRT)、および脂質いかだ関連タンパク質1、2、5、6、7と呼ばれる内皮貫膜タンパク質で富化される。
エキソソームの生化学的構成を特徴付け、研究者が機能性をよりよく理解する人気の分野となっています。ナノスケールフローサイトメトリー、ナノ粒子追跡解析(NTA)、走査・透過電子顕微鏡(TEM)、表面プラズモン共鳴、抵抗パルスセンシング、従来の光顕微鏡など、エキソソームの視覚化と特徴付けには多くの方法があり、それぞれに本質的な長所と短所8,9が含まれています。TEMとcryo-EMはナノメートルベースの分解を達成することができるが、しばしば脱水および凍結破壊ステップを必要とし、それによってEV10、11を収縮またはライシングする。NTAは光散乱に依存し、一度に数百個のEVの特性を持たせることができますが、粒子サイズの間接的な測定であり、EV、ウイルス、およびタンパク質凝集体12、13、14、15、16を容易に区別することはできません。ナノスケールフローサイトメトリーは励起路からの光散乱を採用し、その後サイズ測定に変換することができるが、新たな技術であり、様々な機器12、17、18の検出の線形範囲内にある粒子のサイズについてはほとんどコンセンサスがない。
蛍光タンパク質や色素を用いた従来の光顕微鏡は、細胞内の細胞内コンパートメント、タンパク質複合体、およびシグナル伝達機械を可視化するために最も採用されている技術の1つであった。この技術は、複合体の局在化を可視化するのに有用であることが証明されるが、従来の光顕微鏡(250〜400nm前後)の回折限界は、エキソソーム(40-150 nm)12、19、20の典型的なサイズ範囲におけるタンパク質または構造の明確な分解能を防ぐ。
超解像顕微鏡、すなわち直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、特定の蛍光ホルの光スイッチ可能な特性を採用し、これらの点滅事象を検出してナノメートル精度21まで画像を再構築することによって、従来の光顕微鏡と区別する。光スイッチングイベントは、数万個の個別露光の過程で高フレームレート検出カメラを用いて収集され、ポイントスプレッド関数は、光スイッチング蛍光体19、20、22の正確な位置を高い信頼度でマッピングするために使用される。これにより、dSTORMは光顕微鏡の回折限界をバイパスすることができます。いくつかのグループは、エキソソームおよび関連するタンパク質22、23、24、25を視覚化および追跡するための超解像技術の使用を報告している。最終的な分解能は、フルオロフォアの生物物理学的性質に依存しますが、多くの場合、XY軸に沿って+/-10-100nmの範囲であり、単一分子分解能を可能にします。
XY軸でこのスケールで個々の蛍光体を解決する能力は、顕微鏡に革命を起こしました。しかし、エキソソームの3次元(3次元)dSTORMに関するデータはほとんどありません。そこで、3次元のエキソソームからナノメートルの精度を含む、精製EVのdSTORMベースの可視化と特性評価のための標準的な操作手順(SOP)を確立することを求めました。
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Protocol
1 細胞株の伝播と維持
- ヒト骨肉腫細胞(U2OS)を取得し、10%エキソソームフリーウシ胎児血清および1xペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加した成長培地に細胞を入れる。
注:エキソソームフリーの胎児ウシ血清は、マクナマラで提示されたプロトコルに従って生成されました。al.26. - U2OS細胞を銅被覆インキュベーターの37°Cで5%CO2、T175フラスコ26,27の通過細胞に維持する。細胞は、亜集団が生じるのを防ぐために、または静止期中にアポトーシスの破片の蓄積から、中対数成長期に維持されなければならない。
2 エキソソームの分離と精製
- U2OS細胞株を10個のT175フラスコでフルコンフルに成長させ、フラスコあたり50 mLのメディアを使用します。細胞上清を取り除き、0.45 μmおよび0.22 μmの真空ろ過装置を通して連続的に通過させる。
- より小さなタンパク質または代謝物28を除去するために、750 kDa中空繊維カートリッジを備えた濾過システム上に、上清をクロスフロー濾過(接線流ろ過量とも呼ばれる)を供する。
- 30psiの一定の前方圧力で接線流ろ過演算子を通して上清を通過し、10以上のpsiのΔ圧力を生成するために<20psiの保持圧力を維持しながら。リテンテートタンクに磁気攪拌棒を入れ、150 rpm26に設定します。
- 供給速度を40 mL/min以上に保つ。貯水池に透過物を収集し、それを処分します。
- 上清を30mLに濃縮し、4巻の1x PBSで平衡化する。50 mL円錐管で、クロスフローをフィルタして平衡化した溶液を収集します。
- 40mg/mLポリエチレングリコールの最終濃度4,000 Da.遠心分離機でEVを4°Cで1時間4°Cで1,200 x g、500 μLで再懸濁します。
- 50 μg/mLの光切り替え可能な赤膜インターカレル染料と50 μg/mLのRNase Aを4°Cで4°Cで1時間インキュベートします。
- 分画コレクターに取り付けられたタンパク質精製システム上のカラムを通して余分な染料を除去する。UV吸光度を介してEV画分を識別し、マイクロ遠心チューブ26にそれらをプールします。
- 1x PBSで平衡化されたアンチCD81磁気ビーズを使用して、合計200μLのEVをアフィニティ選択します。
- 1x PBSで100μLの抗CD81磁気ビーズを1mLの全容に希釈し、連続揺れが続く2 mLマイクロ遠心分離チューブで4°Cで2時間結合します。
- 1x PBSでアンチCD81ビーズとEVを3回洗浄します。37°Cで30分間pH 2.0で100 mMグリシンを用いた溶液からCD81+EVをエリュートします。
- 精製したCD81+EVを1x PBSのpH 7.5で等量の100 mM Tris-HClにピペットします。
注:精製されたCD81+EV溶液のアリコートは、溶液の純度およびEV26の存在を確認するために、ナノ粒子追跡分析または電子顕微鏡のために予約されてもよい。
3 固定と準備
- 全容200μLのガラス底μスライド8ウェルプレートに親和性精製EVを配置し(1x PBSでpH 7.5で100mM Tris-HClでEVサンプルを希釈することができます)、4°Cで一晩表面に付着させることができます。
- 8ウェルプレートから既存の溶液を取り除かずに、各ウェルのEV含有溶液に1x PBSに4%パラホルムアルデヒドの200 μLを加えてプレートにEVを固定し、室温21で30分間インキュベートできるようにします。
- EVを乱さないために、マイクロピペットでパラホルムアルデヒドと過剰溶液を慎重に除去します。余分なパラホルムアルデヒドを除去するために1x PBSでEVを洗浄します。洗浄手順を3回行います。余分な1倍のPBSを取り除きます。
- 250 μLのdSTORM B立方体バッファー溶液を、メーカーのプロトコルごとにイメージングバッファー(パートB)で希釈した5 mM原テクテクチエオキシゲナーゼ(パートA)の溶液を作成して、サンプルごとに調製します。
注:光の漂白が発生した場合、バッファー内の酵素の濃度は10 mMに倍増することがあります。- 調製したバッファーの 250 μL をメーカーのプロトコルごとに、室温で 20 分間ずつ追加してから、酸化分子を清掃します。
注:EVはすぐに見るか、4°Cで最大1週間保存することができます。ビジュアライゼーションの前に、ストレージに続くバッファーを交換してください。
- 調製したバッファーの 250 μL をメーカーのプロトコルごとに、室温で 20 分間ずつ追加してから、酸化分子を清掃します。
4 直接確率的光学再構成顕微鏡校正
- 100 nmマイクロスフィアを分子生物学グレードの水濃度0.5%に希釈し、ガラス底μスライド8ウェルプレートの各ウェルに200 μLをピペット化して、超解像顕微鏡のキャリブレーションに必要なビーズを準備します。
- ビーズを室温で1時間ウェルに落ち着かせる。
- 既存の溶液を取り除かずに、PBSに4%パラホルムアルデヒドを200 μL加えて、各ウェルをキャリブレーションビーズ溶液に加え、室温で30分間インキュベートします。
- 慎重にビーズを邪魔しないようにマイクロピペットでパラホルムアルデヒドを除去し、1x PBSでビーズを3回洗浄します。ステップ 3.4 に従ってバッファーを準備します。
- 1x PBSを取り出し、準備したバッファの250 μLを各ウェルに追加します。ビジュアライゼーションの前にバッファを 20 分間待機させます。
- ステージ上に何かを置く前に、顕微鏡ボタンを接続して3D 顕微鏡に接続 します。目的に100x油を加え、目的の上に井戸の中心を置きます。取得設定 で 、473 および 640 nm の励起レーザーをオンにして、[ 表示] をクリックします。
- 3-D レンズをアクティブにせずに、[イメージ表示]オプションでフォトン数をクリックして、フォトンの彩度設定の下にビーズを表示します。最初のレーザーパワーを473 nmレーザーの場合は8.4 mW、640 nmレーザーでは11.6 mWに設定します。
- レーザーの焦点を-300 nm前後、またはキャリブレーションビーズの焦点面に下げ、個々のビーズの明確な解像度を生成します。Z面が焦点を合わせられたら、レーザーパワーレベルを調整して、各視野の変動を考慮します。
- 計器機能の下で、3次元マッピングキャリブレーションとチャンネルマッピングキャリブレーションを完了して、X軸、Y軸、Z軸の誤差を取得します。FOV の最大数を 20、目標ポイント数を 4,000、チャネル間の最大距離を 5.0 ピクセルに設定し、チャネルマッピングのキャリブレーション中にチャネル間の除外半径を 10.0 ピクセルに設定します。
- キャリブレーションにより、ポイントカバレッジが>90%、マッピング品質が良好であることを確認します。将来の画像取得のために、指定されたキャリブレーションデータを保存します。
5 3次元でのEVの可視化
- 目的に100x油を加え、準備したEVを顕微鏡に入れます。3Dレンズが作動しない場合は、640 nmの励起レーザーをオンにし、信号の強度と視野に応じて1.2mWから12.5mWの間に最初に上げて、赤色膜間の色素染色されたEVを励起させます。
- [ イメージ表示 ]オプションで、表示方法をフォトン飽和からパーセンタイルに切り替えて、EV をより適切に視覚化します。信号を最大化しながら、ノイズを最小限に抑えるためにレーザーパワーを調整します。他のすべてのパラメーターを維持します。
- Z 軸の上または下のアイコンをクリックして、Z 平面のフォーカスを調整します。
注: Z 平面は -200 ~ -350 nm の間に焦点を合わせる必要がありますが、視野によって異なります。
- 露光時間を20 ms、フレームキャプチャを10,000フレームに、初期レーザーパワーを1.2 mW~12.5 mWの間に設定するか、または、信号と視野の強度に応じてステップ5.1で決定したレーザーパワーを設定します。
- アイコンを使用して3Dレンズをアクティブにし、取得ボタンをクリックして 取得 を開始します。
- 画像取得中は、1000 フレームごとに 10 ずつ、または高い信号対雑音比を維持するのに十分な単位でレーザーパワーを上げます。取得中に Z 平面を調整しないでください。
メモ:レーザーは最大90mWのレーザーパワーまで上げてもよい。
6 取得後の変更と EV トレース
- 画像の取得後、[ 分析] 表示ウィンドウに切り替えます。フィルタされていない画像に対してドリフト補正を実行し、フィルタをアクティブにします。 表 1に従って、フォトン数、ローカリゼーション精度、シグマ、およびフレームインデックスを調整します。
- XYZ 平面ビュー ツールを、ビューおよびエクスポート のフィールドから個々の EV の X 軸に沿ってオーバーレイします。写真スイッチングイベントのCSVファイル。
- X by Y 視野の XY 軸上の個々の EV を二分する場合、ライン ヒストグラム ツールを使用して、フォトスイッチング イベントを設定された距離グループにビン分割します。
- 単一のEVの画像を撮り、.tiffファイルとして保存します。
- 3-D 視覚化ツールを使用して、個々の EV の 3D ビデオを作成し、Z 軸に沿った配置に従って色を設定します。
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Representative Results
本研究の目的は、3次元(3次元)のナノメートル分解能を有する個々のEVを可視化する上での超解像顕微鏡の有効性を評価することであった。個々のEVの形状と大きさを解析するために、光切り替え可能な色素を採用し、遠赤色の膜インターカラット色素でEVをインキュベートし、クロマトグラフィー29を介して過剰な色素を除去した。アフィニティキャプチャー抗CD81および赤色染色されたEVは、640 nm励起レーザー下の超解像顕微鏡で見た。XY軸で16nm、Z軸で38nmの平均誤差を生み出した顕微鏡のキャリブレーション(図1A、B)に続き、精製されたU2OS EVはXY軸上で最大20nm、Z軸に沿って50nmの分解能で正常に視覚化されました。
レーザーパワーが増加し、取得した画像で容易に明らかであったとき、3D光交換3DフォトスイッチでdSTORMを介して視覚化された個々のEV(図2A、B)。Z平面の取得後画像補正、フォトン数、シグマ、および再構成された画像のローカリゼーション精度は、3次元でのEVの明確な解像度を可能にした(図2C、D)。図 2Cの EV は、右上隅の凡例に示すように、最初の 7,000 フレームの間だけフォトスイッチを入れました。これは、レーザーパワーをあまりにも早く上げることによって引き起こされた可能性のある光の漂白の結果です。ヒストグラムは、光スイッチングイベントの大半が半径100nm以内で発生したことを確認し(図2E)、可視化されたEVがエキソソームであり、小径のEVの分離が成功したことを検証します。
サイズ分布解析は、線ヒストグラムツールとXYZ平面図ツールを使用して、中心の半径100 nm以内で発生した光スイッチングイベントの大半(図3A、C)を使用して、小径のEVを可視化するdSTORMの能力をさらに検証して、個別にトレースされた他のEVに対して行われました。3D可視化ツールで見られるように、Z軸に沿った誤差が大きくなり、軸軸に沿ってEVの細長い最終画像が生成されます(図3D、ビデオ1)。光スイッチングイベントはEVサイズ(図3E)と相関しておらず、dSTORMベースの特性評価が、直径100nm未満のエキソソームや小型エンベロープウイルスなどの小さなEVに使用できることを実証した。
Zプレーンとシグマの正しいパラメータは、3-Dで膜の適切な解像度に不可欠です。さらに、顕微鏡を最適化し、取得前と取得後の両方のパラメータを設定して、EVの最高解像度の画像をキャプチャする方法について、さらに調査を行う必要があります。
図1:100nmマイクロスフィアを用いた超解像顕微鏡の3次元の較正(A)取得後画像補正後の顕微鏡顕微鏡のマイクロスフィアによる較正からのグレースケールの視野。右下のスケールバー。(B)XY軸およびZ軸の絶対キャリブレーション誤差は、それぞれチャネルマッピングキャリブレーションと3Dマッピングキャリブレーションを介して得られた。N = 10生物学的複製。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:3次元の単一のEVのdSTORM(A)CD81+アフィニティー精製EVのグレースケールの視野は、光切り替え可能な赤色膜インターカレーション色素で染色され、640nm励起レーザーで励起された。右下のスケールバー。(B)チャンネルカラーに従ってラベル付けされたAからの視野。(C) A の白いボックスの拡大表示から、フレームインデックスに従ってラベル付けされた単一の EV。右上のヒートマップは、フォトスイッチングイベントが記録されたフレームを示しています。右下のスケールバー。チャネルカラーに従ってラベル付けされたCからの(D)EV。(E)Dに示す破線上のEVを二分し、線ヒストグラムツールを使って15.4 nmのビンに分けることで、サイズ分布解析を作成しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単一EVの取得中の光スイッチング事象の分布を3次元で行う。 右下のスケールバー。(B)XY軸に沿った顕微鏡の線ヒストグラムツールを用いて得られたCD81+アフィニティ精製EVの平均直径の箱とウィスカプロット。(平均= 104 nm、標準偏差= 28 nm)。(C)EvのXY次元に沿った個々の光スイッチングイベントの位置をAに、10,000フレーム露出中に記録する。(D)EvのXZ軸に沿った個々の光スイッチングイベントの位置をAに、10,000フレーム露出を通して記録する。(E)直径の異なる個々のEVに記録された光スイッチングイベントの数の散布図。R-2乗値0.1065は、検出された光スイッチングイベントの数とEV径との間に相関関係がないことを示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:光切り換え可能な赤膜インターカレーション色素で標識された単一のCD81+アフィニティ精製EVの3D画像は、640 nm励起レーザーで励起した。 カラー スキームは、Z 軸に沿った奥行きに従ってラベル付けされます。Z 軸に沿ったエラーが長くなっています。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
| 変数 | 分 | マックス |
| フォトンカウント | 200 | 10,000,000 |
| Z 位置 (nm) | -300 | 300 |
| ローカリゼーション精度 X (nm) | 0 | 40 |
| ローカリゼーション精度 Y (nm) | 0 | 40 |
| 精密シグマX(nm) | 0 | 40 |
| 精密シグマY(nm) | 0 | 40 |
| シグマX(nm)(チャンネル0、640 nmレーザー) | 100 | 350 |
| シグマY(nm)(チャンネル0、640 nmレーザー) | 100 | 350 |
| シグマX(nm)(チャンネル1、473、561nmレーザー) | 100 | 350 |
| シグマ Y (nm) (チャンネル 1、 473、561 nm レーザー) | 100 | 350 |
| フレームインデックス | 0 | 10,000 |
表1:3D dSTORM取得中の超解像顕微鏡のパラメータ。
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Discussion
EVは、多くの細胞内プロセスおよび細胞間シグナル伝達1,30において重要な役割を果たしているため、研究分野として人気となっている。しかし、その小さなサイズが光顕微鏡の回折限界を下回るので、その視覚化は困難であることが判明した。直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、個々の蛍光体の光スイッチングイベントを経時に捉え、これらの点滅イベント21,31に基づいて画像を再構築することによって回折限界をバイパスする可視化の直接的な方法である。超解像顕微鏡は、アクチンフィラメント、微小管、原形質膜に埋め込まれた受容体、および感染細胞32、33、34、35、36のウイルスタンパク質などのいくつかの細胞構造に対して3-Dで正常に行われている。本研究の目的は、超解像顕微鏡、具体的にはdSTORMの有効性を評価し、ナノメートル分解能で3次元のEVを可視化することであった。光切り替え可能な膜インターカリング色素を用いて、U2OS細胞からDSTORMを通じて個々のEVをXY軸上で+/- 20 nmの解像度、Z軸上で+/- 50 nmの解像度で可視化することに成功しました。我々の前の研究では、複数の細胞株と一次流体からのEVは、NTAとTEM26、37で分析されたようなサイズ分布プロファイルを持っていることを示しています。EV の dSTORM ベースの特性評価を使用すると、この現象に対するさらなる信頼を高め、単一の視野で亜集団を識別する可能性があります。この方法のさらなる改良が保証されます。dSTORMの特大な利点は、サンプル調製にEVの構造を変更する可能性のある過酷な手順や有害な手順が不要な点です。我々の結果は、抗CD81ビーズおよび酸性グリシン26,37によるEV精製中にEVの生化学的性質が維持されることをさらに実証した。メタノールやエタノールなどの固定剤による膜透過を避けるため、パラホルムアルデヒドでEVを固定しました。これにより、dSTORMは、ソリューションに存在するEVの形態を正確に捉えていると結論付けました。しかし、アルブミンやポリエチレングリコールなどの汚染物質から規制要件38以下までEVを効果的に精製するには、Capto Core 700を使用する必要があります。プロトコルの1つの顕著な制限は、EVとスライド間の結合効率が100%ではないため、サンプル調製中に一部のEVが失われるということです。さらに、EVを結合させるために接着コーティングスライドの有効性について調査を行う必要があります。
視覚化のためのEVの準備は簡単ですが、取得時、特に取得後の変更時のパラメータは、EVとフルオロフォアの強度と安定性に応じて、サンプルごとに大きく異なります。実験の変動の1つの領域は、信号を最大化するが、光の漂白を防ぐために露出全体を通して繊細に上げなければならない励起レーザーの強度です。光漂白、または蛍光色素が蛍光を発する能力を失ったとき、超解像顕微鏡12、39全体で重大な制限である。光の切り落としを防ぐために、バッファー内の酵素の濃度を10 mMに増加させ、より良い酸化分子を清掃し、光漂白を防ぐことができます。さらに、励起レーザーパワーを低い初期レベルに設定し、高い信号を維持するために露出を通してゆっくりとそれを上げることは、光の漂白を防ぐために重要です。
我々は、その励起波長、耐久性、および固定に耐える能力のためにEVを染色するために赤い光交換可能な色素を選びました29.しかし、私たちが選んだ色素は、あまりにも速く、または強度が高すぎるとき、超解像顕微鏡の間に問題を提示する可能性があります。光切り替え可能な赤膜色素の蛍光色素は、10,000フレーム後、またはレーザーパワーが75.6mWを超えた後にフォトブリーチすることができます。さらに、膜染料の強度と蛍光を発する能力は、4°Cで1週間保存した後に大幅に減少します。 最後に、膜インターカレル染料は水溶液中にミセルを形成することが示されているので、精製後にEVサンプルに存在する余分な色素は、テトラスパニンなどのEVを同定する他のマーカーがない場合、EVと検出され、間違えられる可能性があります。さらに調査は、光安定性31、40のために最適化するために、他の膜インターカリング色素を使用して行われるべきです。EVに結合した蛍光抗体は、光漂白に対してより耐性を持つ傾向があり、シグナル41を増幅することができるため、より適切な選択肢となり得る。しかし、抗体の欠点は、蛍光色素からのシグナルが、抗体上のエピトープとフルオロフォアからの距離により、EVからわずかに相殺される点である。
NTA、フローサイトメトリー、EMなどの既存のEV可視化および特性評価の方法は、有害な準備ステップを必要とするか、間接的な視覚化方法である可能性があります。dSTORMは、小さな直径8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、21、21の小さな直径8、9、10、11、12、13、14、21の小さな自然な生化学的性質を回避し、可視化することができる可視化の直接的な方法である、ほとんどサンプル調製を必要としません。 26.超解像顕微鏡の他の技術は、刺激放出枯渇(STED)、スピニングディスク共焦点顕微鏡(SDCM)、および光活性化局在顕微鏡(PALM)42、43などのEV特性評価に対して最適化することができる。現在の研究はdSTORMのみに焦点を当てていますが、超解像顕微鏡の最適化とこれらの技術の比較/対比に関する今後の研究が保証されています。EVは最近、ウイルス進行におけるその役割がより明らかになってきたので、研究の人気分野となっています。エプスタインバーウイルス、HIV、A型肝炎ウイルスなどの多くの進化的に異なるウイルスは、病気の進行を促進し、身体の免疫応答を回避するためにEVシグナル伝達経路を利用するために進化してきました37,44,45,46,47,48,49,50.これらのウイルスは、免疫検出6、51、52、53を逃れながら、これらの成分を感染していない細胞に移すことができるEVに、mRNAまたはウイルスタンパク質などのウイルス因子を組み込むことが示されている。これらの外生関連ウイルス因子は、疾患進行54,55のバイオマーカーとして検出し、おそらく採用することができる。したがって、個々のEVおよびそれに関連するタンパク質のdSTORMベースの可視化は、疾患バイオマーカーおよび、おそらく、特定のウイルス54、55の疾患進行のためのプラットフォームとして探求することができる。EV内の内容物とその膜上のタンパク質の両方を視覚化するdSTORMの有用性を評価するために、さらなる研究を行う必要があります。
結論として、我々は超解像顕微鏡がナノメートルの分解能を用いた3次元のEVの視覚化のための有効な技術であると考えるべきであることを実証した。dSTORMによって得られた結果は他のEV特性の技術と一致している。dSTORMの明確な利点は、EVの生化学的性質を変化させる可能性のある脱水または凍結破壊ステップなしで光の回折限界の下の粒子を直接視覚化できることです。
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Disclosures
M.G..Cは宣言する利益相反はありません。R.P.MとD.P.D.は、オックスフォードナノイメージング(ONI)社とシティバ社(旧GEヘルスケア)から材料サポートを受けています。R.P..MとD.P.D.は、提示された情報の一部の商業化の可能性について競合する利益を宣言します。これらはノースカロライナ大学によって管理されています。資金源は、この原稿の解釈や執筆には関与していなかった。
Acknowledgments
オックスフォード・ナノイメージングの建設的なフィードバックと指導に感謝します。この作業は、5UM1CA121947-10からR.P.Mに、1R01DA040394からD.P.D.に資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
References
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- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
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