Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Direkte stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi av ekstracellulære vesicles i tre dimensjoner

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62845
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

Direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM) brukes til å omgå den typiske diffraksjonsgrensen for lysmikroskopi og for å se eksosomer på nanometerskalaen. Det kan brukes i både to og tre dimensjoner for å karakterisere eksosomer.

Abstract

Ekstracellulære vesicles (ELBILER) frigjøres av alle celletyper og spiller en viktig rolle i cellesignalering og homeostase. Visualiseringen av elbiler krever ofte indirekte metoder på grunn av deres lille diameter (40-250 nm), som er under diffraksjonsgrensen for typisk lysmikroskopi. Vi har utviklet en mikroskopibasert visualisering av elbiler med superoppløsning for å omgå diffraksjonsgrensen i både to og tre dimensjoner. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan vi løse den tredimensjonale formen på elbiler til innenfor +/- 20 nm oppløsning på XY-aksen og +/- 50 nm oppløsning langs Z-aksen. Til slutt foreslår vi at mikroskopi med superoppløsning betraktes som en karakteriseringsmetode for elbiler, inkludert eksosomer, samt innkapslede virus.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er membranbundne vesikler utgitt av alle celletyper. De inneholder lipider, proteiner, metabolitter og nukleinsyrer og overfører disse materialene lokalt mellom celler og distalt mellom vev og organer. Det finnes tre primære undertyper av elbiler: apoptotiske legemer, mikrovesikler og eksosomer1,2. Her fokuserer vi vår diskusjon på eksosomer og deres tilknyttede proteiner.

Eksosomer utskilles vesicles som stammer fra innadvendt spirende tidlige endosomer inn i multivesicular kroppen (MVB). MVB smelter deretter sammen med plasmamembranen, og frigjør eksosomene i det ekstracellulære rommet for å reise til andre celler3,4. Eksosomer finnes på et spekter av størrelser fra 40 til 150 nm og er beriket med endosomale transmembraneproteiner kjent som tetraspaniner (CD9, CD63, CD81), membranbundet endosomal sorteringskompleks som kreves for transport (ESCRT) og lipidflåterelaterte proteiner1,2,5,6,7.

Karakterisering av den biokjemiske sammensetningen av eksosomer har blitt et populært felt for forskere å bedre forstå deres funksjonelle natur. Det finnes mange metoder for visualisering og karakterisering av eksosomer, inkludert nanoskala strømningscytometri, nanopartikkelsporingsanalyse (NTA), skanning og overføringselektronmikroskopi (TEM), overflateplasmonresonans, resistiv pulssensor og tradisjonell lysmikroskopi, som hver inneholder egen fordeler og ulemper8,9. TEM og cryo-EM kan oppnå nanometerbasert oppløsning, men krever ofte dehydrerings- og frysebruddtrinn, og dermed krympe eller lyse elbiler10,11. NTA er avhengig av lysspredning, noe som gjør det mulig å karakterisere hundrevis av elbiler om gangen, men er en indirekte måling av partikkelstørrelse og kan ikke enkelt skille mellom elbiler, virus og proteinmengder12,13,14,15,16. Nanoskala strømningscytometri bruker lysspredning fra en eksitasjonsbane, som deretter kan oversettes til størrelsesmålinger, men er en fremvoksende teknologi, og det er liten konsensus om hvilken størrelse partikler er innenfor det lineære deteksjonsområdet for ulike instrumenter12,17,18.

Tradisjonell lysmikroskopi ved hjelp av fluorescerende proteiner eller fargestoffer har vært en av de mest brukte teknikkene for visualisering av subcellulære rom, proteinkomplekser og signalmaskiner i en celle. Selv om denne teknikken viser seg nyttig for å visualisere lokaliseringen av komplekser, forhindrer diffraksjonsgrensen for tradisjonell lysmikroskopi (rundt 250-400 nm) den klare oppløsningen av proteiner eller strukturer i det typiske størrelsesområdet til et eksosom (40-150 nm)12,19,20.

Superoppløselig mikroskopi, nemlig direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM), skiller seg fra konvensjonell lysmikroskopi ved å bruke de fotobryterbare egenskapene til spesifikke fluoroforer og oppdage disse blinkende hendelsene for å rekonstruere bilder ned til nanometerpresisjon21. Photoswitching-hendelser samles inn ved hjelp av et høyt bildefrekvensdeteksjonskamera i løpet av titusenvis av individuelle eksponeringer, og en punktspredningsfunksjon brukes til å kartlegge med høy tillit den nøyaktige plasseringen av den fotobryter fluoroforen19,20,22. Dette gjør at dSTORM kan omgå diffraksjonsgrensen for lysmikroskopi. Flere grupper har rapportert bruk av superoppløsningsteknikker for visualisering og sporing av eksosomer og tilhørende proteiner22,23,24,25. Den endelige oppløsningen avhenger av fluoroforens biofysiske egenskaper, men varierer ofte fra +/-10-100 nm langs XY-aksen, noe som tillater enkeltmolekyloppløsning.

Evnen til å løse individuelle fluoroforer i denne skalaen på XY-aksen har revolusjonert mikroskopi. Det er imidlertid lite data om den tredimensjonale (3D) dSTORM av et eksosom. Derfor forsøkte vi å etablere en standard operasjonsprosedyre (SOP) for dSTORM-basert visualisering og karakterisering av rensede elbiler, inkludert eksosomer til nanometerpresisjon i 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Overføring og vedlikehold av cellelinjer

  1. Skaff deg humane osteosarkomceller (U2OS) og plasser cellene i vekstmediet supplert med 10% exosome-fri Fetal Bovine Serum og 1x Penicillin / Streptomycin løsning.
    MERK: Exosome-free Fetal Bovine Serum ble generert etter protokollen presentert i McNamara et. al.26.
  2. Vedlikehold U2OS-cellene i en kobberbelagt inkubator ved 37 °C i 5 % CO2 og passasjeceller i T175-kolber26,27. Cellene må opprettholdes i midten av logaritmisk vekstfase for å forhindre at subpopulasjoner oppstår, eller fra opphopning av apoptotisk rusk i den stasjonære fasen.

2 Exosome isolasjon og rensing

  1. Utvid U2OS-cellelinjene til full sammenløp i 10 separate T175-kolber med 50 ml medier per kolbe. Fjern cellen supernatant og etterfølgende passasje den gjennom en 0,45 μm og 0,22 μm vakuumfiltreringsapparat.
  2. Underkast supernatanten til crossflow-filtrering (også kjent som tangentiell strømningsfiltrering) på et filtreringssystem utstyrt med 750 kDa hulfiberpatron for å fjerne mindre proteiner eller metabolitter28.
    1. Før supernatanten gjennom den tangentielle strømningsfiltreringsoperatøren med et konstant forovertrykk på 30 psi, samtidig som du opprettholder et oppbevaringstrykk på <20 psi for å produsere et Δ-trykk på 10 eller mer psi. Plasser en magnetisk rørestang i retentate-tanken og sett den til 150 rpm26.
    2. Oppretthold matehastigheten ved 40 ml/min eller høyere. Samle permeatet i et reservoar og kast det.
  3. Konsentrer supernatanten til 30 ml, og likevekt med fire volumer 1x PBS. Samle kryssstrømmen filtrert og likevektsløsning i et 50 ml konisk rør.
  4. Utfell elbilene ved 4 °C over natten i en endelig konsentrasjon på 40 mg/ml polyetylenglykol med en molekylvekt på 8000 Da. Sentrifuger ELBIL-ene ved 1200 x g ved 4 °C i 1 time og resuspend i 500 μL 1x PBS.
  5. Inkuber ELBILene med 50 μg/ml fotoswitchable rødmembran interkalerende fargestoff og 50 μg/ml RNase A i 1x PBS ved 4 °C i 1 time.
  6. Fjern overflødig fargestoff gjennom en kolonne på et proteinrensingssystem festet til en brøkdelsamler. Identifiser EV-brøker gjennom UV-absorbans og samle dem i et mikrosenterrør26.
  7. Affinitet-velg totalt 200 μL elbiler ved hjelp av anti-CD81 magnetiske perler likevektet i 1x PBS.
    1. Fortynn 100 μL av de anti-CD81 magnetiske perlene i 1x PBS til et totalt volum på 1 ml og la dem binde seg ved 4 °C i 2 timer i et 2 ml mikrosenterrør med kontinuerlig gynge.
  8. Vask anti-CD81 perler og EV tre ganger med 1x PBS. Elute CD81+ EV fra oppløsningen med 100 mM Glycin ved pH 2.0 i 30 min ved 37 °C.
  9. Pipette den rensede CD81+ EV til et likt volum på 100 mM Tris-HCl ved pH 7,5 i 1x PBS.
    MERK: En aliquot av renset CD81+ EV-løsning kan reserveres for nanopartikkelsporingsanalyse eller elektronmikroskopi for å bekrefte renheten til løsningen og tilstedeværelsen av elbiler26.

3 Fiksering og forberedelse

  1. Plasser affinitetsrensede elbiler på glassbunnen μ skyve 8-brønnsplater i et totalt volum på 200 μL (kan fortynne EV-prøven i 100 mM Tris-HCl ved pH 7,5 i 1x PBS) og la den feste seg til overflaten over natten ved 4 °C.
  2. Uten å fjerne den eksisterende løsningen fra 8-brønnsplaten, fest elbiler på platene ved å tilsette 200 μL 4% paraformaldehyd i 1x PBS til den EV-inneholdende løsningen i hver brønn og la den inkubere i 30 minutter ved romtemperatur21.
  3. Fjern forsiktig paraformaldehyd og overflødig løsning med en mikropipette for ikke å forstyrre ELBIL-ene. Vask EV med 1x PBS for å fjerne overflødig paraformaldehyd. Utfør vaskeprosedyren tre ganger. Fjern overflødig 1x PBS.
  4. Forbered 250 μL dSTORM B-kubet bufferløsning per prøve ved å lage en løsning på 5 mM protocatechuate dioksygenase (del A) fortynnet i bildebuffer (del B) i henhold til produsentens protokoll.
    MERK: Konsentrasjonen av enzymet i bufferen kan dobles til 10 mM hvis fotobleaching oppstår.
    1. Tilsett 250 μL av den forberedte bufferen til hver brønn per produsents protokoll i 20 minutter ved romtemperatur før avbildning for å scavenge oksidasjonsmolekyler.
      MERK: EV kan deretter enten vises umiddelbart eller oppbevares ved 4 °C i opptil en uke. Erstatt bufferen etter lagring før hver visualisering.

4 Direkte stokastisk kalibrering av optisk rekonstruksjonsmikroskopi

  1. Forbered perlene som kreves for kalibrering av superoppløselig mikroskop ved å fortynne 100 nm mikrosfærer til en konsentrasjon på 0,5% i molekylærbiologisk klasse vann og pipettering 200 μL i hver brønn av en glassbunn μ-skyv 8-brønns plate.
    1. La perlene bosette seg i brønnene i 1 time ved romtemperatur.
  2. Uten å fjerne den eksisterende løsningen, tilsett 200 μL 4% paraformaldehyd i PBS til hver brønn til kalibreringsperleløsningen og la den inkubere i 30 minutter ved romtemperatur.
  3. Fjern forsiktig paraformaldehyden med en mikropipette for ikke å forstyrre perlene og vask perlene tre ganger med 1x PBS. Klargjør bufferen i henhold til trinn 3.4.
  4. Fjern 1x PBS og tilsett 250 μL av den forberedte bufferen til hver brønn. La bufferen sitte i 20 minutter før visualisering.
  5. Før du plasserer noe på scenen, kobler du til 3D-mikroskopet ved hjelp av knappen Koble til mikroskopet. Tilsett 100x olje til målet og plasser midten av brønnen på toppen av målet. I Acquire -innstillingen slår du på eksitasjonslaserne på 473 og 640 nm og klikker Vis.
    1. Uten at 3D-objektivet er aktivert, kan du se perlene under foto metningsinnstillingen ved å klikke på Fotonantall i bildevisningsalternativene. Sett de første laserkraftene til 8,4 mW for 473 nm laser og til 11,6 mW for 640 nm laser.
    2. Reduser fokuset på laseren til rundt -300 nm eller fokusplanet til kalibreringsperlene for å produsere en klar oppløsning av de enkelte perlene. Når Z-flyet er fokusert, justerer du lasereffektnivåene ytterligere for å ta høyde for variasjon i hvert synsfelt.
  6. Under instrumentfunksjonene fullfører du kalibrering av 3D-kartlegging og kanalkartlegging for å få feilene på X-, Y- og Z-aksen. Sett maksimalt antall FOVer til 20, måltallet for punkt til 4 000, maksimal avstand mellom kanaler til 5,0 piksler og ekskluderingsradiusen mellom kanaler til 10,0 piksler under kanaltilordningskalibrering.
  7. Sørg for at kalibreringen gir en punktdekning på >90 % og at kartkvaliteten er god. Lagre de gitte kalibreringsdataene for fremtidige bildeanskaffelser.

5 Visualisering av EV i tre dimensjoner

  1. Tilsett 100x olje på målet og plasser de forberedte ELBIL-ene i mikroskopet. Uten 3D-objektivet aktivert, slå på 640 nm eksitasjonslaseren og hev den først til mellom 1,2 mW og 12,5 mW avhengig av intensiteten til signalet og synsfeltet for å begeistre de røde membranene som interkalerer farget elbiler.
    1. Under alternativene for bildevisning bytter du visningsmetoden fra fotometning til persentiler for å visualisere EVene bedre. Juster laserkraften for å minimere støy, samtidig som du maksimerer signalet. Oppretthold alle de andre parameterne.
    2. Juster fokuset på Z-planet ved å klikke opp- eller nedikonet på Z-aksen.
      MERK: Z-flyet skal være fokusert mellom -200 og -350 nm, men vil variere avhengig av synsfeltet.
  2. Sett eksponeringstiden til 20 ms, bildeopptaket til 10 000 bilder og den første lasereffekten til mellom 1,2 mW og 12,5 mW, eller lasereffekten som bestemmes i trinn 5.1, avhengig av intensiteten til signalet og synsfeltet.
    1. Aktiver 3D-objektivet ved hjelp av ikonet og start oppkjøpet ved å klikke på Hent-knappen.
  3. Gjennom bildeanskaffelse øker du laserkraften med 3 trinn på 10 hver 1000 bilder, eller nok til å opprettholde et høyt signal-til-støy-forhold. Z-flyet må ikke justeres under oppkjøpet.
    MERK: Laseren kan heves til maksimalt 90 mW lasereffekt.

6 Endring etter anskaffelse og EV-sporing

  1. Når du har anskaffet bildet, bytter du til visningsvinduet Analyser. Utfør driftkorrigering på det ufiltrerte bildet, og aktiver deretter filtre. Juster antall fotoner, lokaliseringspresisjon, sigmaer og rammeindeks i henhold til tabell 1.
  2. Overlegg et XYZ-planvisningsverktøy langs X-aksen til individuelle ELBILER fra synsfeltet og eksporter . CSV-filer av photoswitching hendelser.
  3. Bisect individuelle elbiler på XY-aksen i et X by Y synsfelt ved hjelp av et linjehistogramverktøy, som bins photoswitching hendelser i angitte avstandsgrupper.
  4. Ta bilder av enkelt-ELBILER og lagre dem som .tiff filer.
  5. Lag 3D-videoer av individuelle ELBILER ved hjelp av et 3D-visualiseringsverktøy og farge i henhold til plassering langs Z-aksen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med denne studien var å evaluere effektiviteten av superoppløsningsmikroskopi ved visualisering av individuelle elbiler med nanometeroppløsning i tre dimensjoner (3D). For å analysere formen og størrelsen på individuelle elbiler, brukte vi fotoswitchable fargestoff og inkuberte ELBIL-ene med et fjernt rødt, membraninterkalerende fargestoff, og fjernet overflødig fargestoff gjennom kromatografi29. De affinitetsfangede anti-CD81 og rødfargede ELBILER ble deretter sett i superoppløsningsmikroskopet under eksitasjonslaseren på 640 nm. Etter kalibreringen av mikroskopet som produserte en gjennomsnittlig feil på 16 nm på XY-aksen og 38 nm på Z-aksen (Figur 1A,B), ble de rensede U2OS-EVene vellykket visualisert med en oppløsning på opptil 20 nm på XY-aksen og 50 nm langs Z-aksen.

Individuelle elbiler visualisert gjennom dSTORM i 3D-bilder som ble forhekset gjennom hele 10 000 rammeeksponeringen da lasereffekten ble økt og var lett synlig i det oppkjøpte bildet (Figur 2A, B). Bildekorrigering etter anskaffelse av Z-planet, antall fotoner, sigmaer og lokaliseringspresisjon for det rekonstruerte bildet som er tillatt for den klare oppløsningen til EV i 3D (Figur 2C, D). EV i figur 2C-bilder ble bare tatt i løpet av de første 7000 rammene, sett av legenden øverst til høyre. Dette er et resultat av fotobleaching som kan ha vært forårsaket av å øke laserkraften for raskt. Histogrammet bekrefter at de fleste photoswitching-hendelsene skjedde innenfor en radius på 100 nm (figur 2E), som bekrefter at den visualiserte EV er et eksosom og at isolering av elbiler med liten diameter var vellykket.

Størrelsesfordelingsanalyse ble utført på andre individuelt sporede elbiler ved hjelp av et linjehistogramverktøy og XYZ-planvisningsverktøy for å bekrefte at de fleste photoswitching-hendelsene skjedde innenfor en radius på 100 nm fra midten (Figur 3A,C), noe som ytterligere validerte DSTORM's evne til å visualisere elbiler med liten diameter. Som det fremgår av et 3D-visualiseringsverktøy, økes feilen langs Z-aksen, noe som gir et langstrakt sluttbilde av EV langs aksialaksen (Figur 3D, Video 1). Photoswitching-hendelser var ikke korrelert med EV-størrelse (figur 3E), noe som viser at dSTORM-basert karakterisering kan brukes til små elbiler som eksosomer og små innkapslede virus mindre enn 100 nm i diameter.

De riktige parametrene for Z-plan og sigma er integrert i riktig oppløsning av membranen i 3D. I tillegg er riktig eksponeringstid, antall bilder fanget og innledende lasernivå avgjørende for å produsere et bilde av en individuell EV med en løst membran. Videre undersøkelser bør gjøres om hvordan du optimaliserer mikroskopet og setter både pre- og post-oppkjøpsparametere for å fange opp bilder med høyest oppløsning av elbiler.

Figure 1
Figur 1: Kalibrering av mikroskopet med superoppløsning i tre dimensjoner ved hjelp av 100 nm mikrosfærer. (A) Synsfelt i gråtoner fra kalibrering av mikroskopet med mikrosfærer etter anskaffelse av bildekorrigeringer. Skalalinjen nederst til høyre. (B) Absolutte kalibreringsfeil på XY-aksen og Z-aksen ble oppnådd gjennom henholdsvis kanalkartleggingskalibrering og 3D-kartkalibrering. N = 10 biologiske replikerer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: dSTORM for en enkelt EV i tre dimensjoner. (A) Gråtone synsfelt på CD81+ affinitetsrensede elbiler farget med fotoswitchable rød membran interkalerende fargestoff og begeistret med 640 nm eksitasjonslaser. Skalalinjen nederst til høyre. (B) Synsfelt fra A merket i henhold til kanalfarge. (C) Enkel EV fra den zoomede visningen av den hvite boksen i A, merket i henhold til rammeindeksen. Varmekartet øverst til høyre angir rammen der fotobryterhendelsene ble registrert. Skalalinjen nederst til høyre. (D) EV fra C merket i henhold til kanalfarge. (E) Størrelsesfordelingsanalyse ble opprettet ved å krysse EV på den stiplede linjen vist i D og skille photoswitching-hendelsen i 15,4 nm skuffer ved hjelp av et linjehistogramverktøy. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Distribusjon av fotobryterhendelser under oppkjøpet av en enkelt EV i tre dimensjoner. (A) Rekonstruert bilde av en CD81+ affinitetsrenset EV merket med fotoseitchbar rød membran interkalerende fargestoff og begeistret med 640 nm eksitasjonslaser. Skalalinjen nederst til høyre. (B) Boks- og whisker-plott med gjennomsnittlig diameter på CD81+ affinitetsrensede ELBILER oppnådd ved hjelp av mikroskopets Line Histogram Tool langs XY-aksen. (gjennomsnitt = 104 nm, standardavvik = 28 nm). (C) Plassering av individuelle fotobryterhendelser langs XY-dimensjonen til EV i A, registrert gjennom 10 000 rammeeksponering. (D) Plassering av individuelle fotobryterhendelser langs XZ-aksen til EV i A, registrert gjennom 10,000 rammeeksponering. (E) Scatterplot av antall fotoswitching hendelser registrert på individuelle elbiler med varierende diametre. R-kvadrert verdi på 0,1065 viser ingen sammenheng mellom antall oppdagede fotobryterhendelser og EV-diameter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: 3D-bilde av en enkelt CD81+ affinitetsrenset EV merket med fotoswitchable rød membran interkalerende fargestoff og begeistret med 640 nm eksitasjonslaser. Fargevalget er merket i henhold til dybden langs Z-aksen. Feilen langs Z-aksen er langstrakt. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Variabel Min. Maks
Antall foton 200 10,000,000
Z-posisjon (nm) -300 300
Lokalisering Precision X (nm) 0 40
Lokalisering Precision Y (nm) 0 40
Precision Sigma X (nm) 0 40
Presisjon Sigma Y (nm) 0 40
Sigma X (nm) (Kanal 0, 640 nm laser) 100 350
Sigma Y (nm) (Kanal 0, 640 nm laser) 100 350
Sigma X (nm) (Kanal 1, 473, 561 nm lasere) 100 350
Sigma Y (nm) (Kanal 1, 473, 561 nm lasere) 100 350
Rammeindeks 0 10,000

Tabell 1: Parametere for mikroskopet med superoppløsning under 3D dSTORM-anskaffelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Elbiler har blitt et populært studieområde på grunn av deres viktige rolle i mange intracellulære prosesser og celle-til-celle-signalering1,30. Imidlertid viser visualiseringen seg å være vanskelig ettersom deres lille størrelse faller under diffraksjonsgrensen for lysmikroskopi. Direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM) er en direkte visualiseringsmetode som omgår diffraksjonsgrensen ved å fange fotobryterhendelser av individuelle fluoroforer over tid og rekonstruere et bilde basert på disse blinkende hendelsene21,31. Superoppløselig mikroskopi har blitt utført i 3D på flere cellulære strukturer som aktinfilamenter, mikrotubuler, reseptorer innebygd i plasmamembranen og virusproteiner i infiserte celler32,33,34,35,36. Hensikten med denne studien var å evaluere effekten av mikroskopi med superoppløsning, spesielt dSTORM, for å visualisere elbiler i 3D med nanometeroppløsning. Vi brukte fotoswitchable membran interkalerende fargestoff for å visualisere individuelle elbiler fra U2OS-celler gjennom dSTORM i opptil +/- 20 nm oppløsning på XY-aksen og +/- 50 nm oppløsning på Z-aksen. Vårt tidligere arbeid har vist at elbiler fra flere cellelinjer og primærvæsker har lignende størrelsesfordelingsprofiler som analysert av NTA og TEM26,37. Bruken av en dSTORM-basert karakterisering av elbiler kan gi ytterligere tillit til dette fenomenet, samt potensielt identifisere delbefolkninger i ett enkelt synsfelt. Videre forbedring av denne metoden er berettiget. En bemerkelsesverdig fordel med dSTORM er at prøveforberedelsene ikke krever harde eller skadelige trinn som kan endre strukturen til ELBIL-ene. Våre resultater viser videre at EVs biokjemiske natur opprettholdes under EV-rensing med anti-CD81 perler og sur glycin26,37. Vi fikset elbilene med paraformaldehyd for å unngå membranpermeabiliseringer forårsaket av andre fikseringer som metanol og etanol. Dette tillot oss å konkludere med at dSTORM nøyaktig fanger morfologien til elbiler slik de eksisterer i løsningen. Bruken av Capto Core 700 er imidlertid nødvendig for å rense ELBIL-ene effektivt vekk fra forurensninger som albumin og polyetylenglykol til under forskriftsmessige krav38. En bemerkelsesverdig begrensning i protokollen er at bindingseffektiviteten mellom EV og lysbilder ikke er 100%, så noen elbiler går tapt under prøveforberedelse. Videre undersøkelser bør gjøres på effekten av limbelagte lysbilder for bedre å binde elbiler.

Selv om forberedelsen av elbiler for visualisering er grei, varierer parametrene under oppkjøpet og spesielt under etteranskaffelsesendringer vesentlig fra prøve til prøve, avhengig av intensiteten og stabiliteten til ELBIL-ene og fluoroforen. Et område av variasjon i eksperimentet er intensiteten til eksitasjonslasere som må heves delikat gjennom eksponering for å maksimere signalet, men forhindre fotobleaching. Fotobleaching, eller når en fluorofor mister sin evne til fluoresce, er en betydelig begrensning gjennom super-oppløsning mikroskopi12,39. For å forhindre fotobleking kan konsentrasjonen av enzymet i bufferen økes til 10 mM for bedre å samle oksidasjonsmolekyler og forhindre fotobleking. I tillegg er det viktig å sette eksitasjonslaserkraften til et lavt startnivå og sakte øke den gjennom eksponeringen for å opprettholde et høyt signal for å forhindre fotobleaching.

Vi valgte et rødt fotoswitchable fargestoff for å flekke ELBIL-ene på grunn av eksitasjonsbølgelengden, holdbarheten og evnen til å motstå fiksering29. Fargen vi valgte kan imidlertid presentere problemer under superoppløsningsmikroskopi når den er spent for raskt eller med for høy intensitet. Fluoroforene i det fotosewitchable røde membranfargen kan fotobleach etter 10.000 rammer eller etter laserkraften overstiger 75,6 mW. I tillegg reduseres membranfargens intensitet og evne til fluoresce betydelig etter en ukes lagring ved 4 °C. Til slutt har membranen interkalerende fargestoffer vist seg å danne micelles i en vandig løsning, slik at overflødig fargestoff som fortsatt er tilstede i EV-prøven etter rensing, kan oppdages og forveksles med en EV hvis det ikke er noen annen markør for å identifisere EV, for eksempel en tetraspanin. Videre undersøkelse bør gjøres ved hjelp av andre membran interkalerende fargestoffer for å optimalisere for fotostabilitet31,40. Fluorescerende antistoffer konjugert til EV kan være et mer passende alternativ, da de pleier å være mer motstandsdyktige mot fotobleaching og kan forsterke signalet41. Ulempen med antistoffer er imidlertid at signalet fra fluoroforen er litt forskjøvet fra EV på grunn av avstanden fra epitopen og fluoroforen på antistoffet.

Eksisterende metoder for EV-visualisering og karakterisering, for eksempel NTA, flowcytometri eller EM, kan kreve skadelige forberedelsestrinn eller er indirekte visualiseringsmetoder. dSTORM krever lite prøvepreparering, bevaring av EVs naturlige biokjemiske natur, og er en direkte visualiseringsmetode som kan omgå diffraksjonsgrensen og visualisere elbiler med liten diameter8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,21, 26. Andre teknikker for superoppløsningsmikroskopi kan optimaliseres for EV-karakterisering som stimulert utslippsuttømming (STED), spinnende skivekontrokokk (SDCM) og fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM)42,43. Den nåværende studien fokuserer utelukkende på dSTORM, men fremtidig arbeid med å optimalisere mikroskopi med superoppløsning og sammenligne / kontrastere disse teknikkene er berettiget. Elbiler har nylig blitt et populært forskningsområde ettersom deres rolle i virusprogresjon har blitt tydeligere. Mange evolusjonært distinkte virus, som Epstein Barr Virus, HIV og Hepatitt A Virus, har utviklet seg til å dra nytte av EV-signalveiene for å fremme sykdomsprogresjon og unngå kroppens immunrespons37,44,45,46,47,48,49,50 . Disse virusene har vist seg å inneholde virusfaktorer, for eksempel mRNAer eller virusproteiner, til elbiler som deretter kan overføre disse komponentene til uinfiserte celler, mens du unnslipper immundeteksjon6,51,52,53. Disse eksosomale virusfaktorene kan oppdages og muligens brukes som biomarkør for sykdomsprogresjon54,55. Derfor kan dSTORM-basert visualisering av individuelle elbiler og deres tilknyttede proteiner utforskes som en plattform for sykdomsbiomarkører og kanskje sykdomsprogresjon av visse virus54,55. Videre forskning bør gjøres for å vurdere dSTORM's nytte i visualisering av både innhold i en EV og proteiner på membranen.

Til slutt har vi vist at mikroskopi med superoppløsning bør betraktes som en effektiv teknikk for visualisering av elbiler i 3D med nanometeroppløsning. Resultatene oppnådd av dSTORM er i samsvar med andre EV-karakteriseringsteknikker. En tydelig fordel med dSTORM er evnen til å visualisere partikler direkte under diffraksjonsgrensen for lys uten dehydrering eller fryse bruddtrinn som kan endre den biokjemiske naturen til elbiler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.G.C. har ingen interessekonflikter å erklære. R.P.M og D.P.D. mottar materiell støtte fra Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. og Cytiva Inc. (tidligere GE Healthcare). R.P.M. og D.P.D. erklærer konkurrerende interesser for mulig kommersialisering av noe av informasjonen som presenteres. Disse administreres av University of North Carolina. Finansieringskildene var ikke involvert i tolkningene eller skrivingen av dette manuskriptet.

Acknowledgments

Vi vil takke Oxford Nanoimaging for deres konstruktive tilbakemeldinger og veiledning. Dette arbeidet ble finansiert av 5UM1CA121947-10 til R.P.M. og 1R01DA040394 til D.P.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Tags

Biologi utgave 174
Direkte stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi av ekstracellulære vesicles i tre dimensjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, M. G., McNamara, R. P.,… More

Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter