Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62845
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) wordt gebruikt om de typische diffractielimiet van lichtmicroscopie te omzeilen en exosomen op nanometerschaal te bekijken. Het kan worden gebruikt in zowel twee als drie dimensies om exosomen te karakteriseren.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV's) worden door alle celtypen vrijgegeven en spelen een belangrijke rol bij celsignalering en homeostase. De visualisatie van EV's vereist vaak indirecte methoden vanwege hun kleine diameter (40-250 nm), die onder de diffractielimiet van typische lichtmicroscopie ligt. We hebben een op superresolutiemicroscopie gebaseerde visualisatie van EV's ontwikkeld om de diffractielimiet in zowel twee als drie dimensies te omzeilen. Met behulp van deze aanpak kunnen we de driedimensionale vorm van EV's oplossen tot binnen +/- 20 nm resolutie op de XY-as en +/- 50 nm resolutie langs de Z-as. Concluderend stellen we voor dat superresolutiemicroscopie wordt beschouwd als een karakteriseringsmethode van EV's, inclusief exosomen, evenals omhulde virussen.

Introduction

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn membraangebonden blaasjes die door alle celtypen worden afgegeven. Ze bevatten lipiden, eiwitten, metabolieten en nucleïnezuren en dragen deze materialen lokaal over tussen cellen en distaal tussen weefsels en organen. Er zijn drie primaire subtypen van EV's: apoptotische lichamen, microvesicles en exosomen1,2. Hier richten we onze discussie op exosomen en hun bijbehorende eiwitten.

Exosomen zijn uitgescheiden blaasjes afkomstig van de inwaartse ontluiking van vroege endosomen in het multivesiculaire lichaam (MVB). De MVB smelt vervolgens met het plasmamembraan, waardoor de exosomen in de extracellulaire ruimte vrijkomen om naar andere cellen te reizen3,4. Exosomen bestaan op een spectrum van groottes variërend van 40 tot 150 nm en zijn verrijkt met endosomale transmembraaneiwitten die bekend staan als tetraspaninen (CD9, CD63, CD81), membraangebonden endosomale sorteercomplex dat nodig is voor het transport (ESCRT) en lipide vlot-geassocieerde eiwitten1,2,5,6,7.

Het karakteriseren van de biochemische samenstelling van exosomen is een populair veld geworden voor onderzoekers om hun functionele aard beter te begrijpen. Er bestaan veel methoden voor het visualiseren en karakteriseren van exosomen, waaronder flowcytometrie op nanoschaal, nanodeeltjesvolganalyse (NTA), scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), oppervlakteplasmonresonantie, resistieve pulsdetectie en traditionele lichtmicroscopie, die elk intrinsieke voor- en nadelen bevatten8,9. TEM en cryo-EM kunnen een op nanometer gebaseerde resolutie bereiken, maar vereisen vaak uitdrogings- en vriesbreekstappen, waardoor EV's10, 11krimpen of liggen. NTA vertrouwt op lichtverstrooiing, waardoor de karakterisering van honderden EV's tegelijk mogelijk is, maar is een indirecte meting van de deeltjesgrootte en kan niet gemakkelijk onderscheid maken tussen EV's, virussen en eiwitaggregaten12,13,14,15,16. Nanoschaal flowcytometrie maakt gebruik van lichtverstrooiing van een excitatiepad, dat vervolgens kan worden vertaald in groottemetingen, maar is een opkomende technologie, en er is weinig consensus over welke grootte van deeltjes zich binnen het lineaire detectiebereik bevinden voor verschillende instrumenten12,17,18.

Traditionele lichtmicroscopie met behulp van fluorescerende eiwitten of kleurstoffen is een van de meest gebruikte technieken voor het visualiseren van subcellulaire compartimenten, eiwitcomplexen en signaleringsmachines in een cel. Hoewel deze techniek nuttig blijkt bij het visualiseren van de lokalisatie van complexen, voorkomt de diffractielimiet van traditionele lichtmicroscopie (ongeveer 250-400 nm) de duidelijke resolutie van eiwitten of structuren in het typische groottebereik van een exosoom (40-150 nm)12,19,20.

Superresolutiemicroscopie, namelijk directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM), onderscheidt zich van conventionele lichtmicroscopie door gebruik te maken van de fotoschakelbare eigenschappen van specifieke fluoroforen en deze knipperende gebeurtenissen te detecteren om beelden tot nanometerprecisie te reconstrueren21. Fotoswitchinggebeurtenissen worden verzameld met behulp van een detectiecamera met hoge framesnelheid in de loop van tienduizenden individuele belichtingen, en een puntspreidingsfunctie wordt gebruikt om met hoge betrouwbaarheid de exacte locatie van de fotoswitching fluorofoor19,20,22in kaart te brengen. Hierdoor kan dSTORM de diffractielimiet van lichtmicroscopie omzeilen. Verschillende groepen hebben het gebruik van superresolutietechnieken gemeld voor het visualiseren en volgen van exosomen en hun bijbehorende eiwitten22,23,24,25. De uiteindelijke resolutie hangt af van de biofysische eigenschappen van de fluorofoor, maar varieert vaak van +/-10-100 nm langs de XY-as, waardoor een resolutie van één molecuul mogelijk is.

Het vermogen om individuele fluoroforen op deze schaal op de XY-as op te lossen, heeft een revolutie teweeggebracht in de microscopie. Er zijn echter weinig gegevens over de driedimensionale (3D) dSTORM van een exosoom. Daarom hebben we geprobeerd een standaard operationele procedure (SOP) vast te stellen voor dSTORM-gebaseerde visualisatie en karakterisering van gezuiverde EV's, inclusief exosomen tot nanometerprecisie in 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Voortplanting en onderhoud van cellijnen

  1. Verkrijg menselijke osteosarcoomcellen (U2OS) en plaats de cellen in het groeimedium aangevuld met 10% exosoomvrij foetaal runderserum en 1x penicilline / streptomycine-oplossing.
    OPMERKING: Exosoomvrij foetaal runderserum werd gegenereerd volgens het protocol dat wordt gepresenteerd in McNamara et. al.26.
  2. Houd de U2OS-cellen in een met koper beklede incubator op 37 °C in 5% CO2 en doorgangscellen in T175-kolven26,27. De cellen moeten in het midden van de logaritmische groeifase worden gehouden om te voorkomen dat subpopulaties ontstaan of dat apoptotisch puin tijdens de stationaire fase ontstaat.

2 Exosoom isolatie en zuivering

  1. Kweek de U2OS-cellijnen tot volledige confluentie in 10 afzonderlijke T175-kolven met 50 ml media per kolf. Verwijder het celsupernatant en passeer het achtereenvolgens door een vacuümfiltratieapparaat van 0,45 μm en 0,22 μm.
  2. Onderwerp het supernatant aan crossflowfiltratie (ook bekend als tangentiële stroomfiltratie) op een filtratiesysteem uitgerust met de 750 kDa holle vezelpatroon om kleinere eiwitten of metabolieten te verwijderen28.
    1. Passeer het supernatant door de tangentiële flowfiltratieoperator met een constante voorwaartse druk van 30 psi, terwijl een retentiedruk van <20 psi wordt gehandhaafd om een Δ druk van 10 of meer psi te produceren. Plaats een magnetische roerstaaf in de retentate tank en stel in op 150 rpm26.
    2. Houd de toevoersnelheid op 40 ml/min of hoger. Verzamel het permeaat in een reservoir en gooi het weg.
  3. Concentreer het supernatant tot 30 ml en breng vervolgens in evenwicht met vier volumes van 1x PBS. Verzamel de crossflow gefilterde en gebalanceerde oplossing in een conische buis van 50 ml.
  4. Laat de EV's 's nachts neerslaan bij 4 °C in een eindconcentratie van 40 mg/ml polyethyleenglycol met een molecuulgewicht van 8.000 Da. Centrifugeer de EV's bij 1.200 x g bij 4 °C gedurende 1 uur en resuspend in 500 μL van 1x PBS.
  5. Incubeer de EV's met 50 μg/ml fotoschakelbare rode membraanintercalerende kleurstof en 50 μg/ml RNase A in 1x PBS bij 4 °C gedurende 1 uur.
  6. Verwijder overtollige kleurstof door een kolom op een eiwitzuiveringssysteem dat is bevestigd aan een fractiecollector. Identificeer EV-fracties door uv-absorptie en bundel ze in een microcentrifugebuis26.
  7. Affiniteit-selecteer in totaal 200 μL EV's met behulp van anti-CD81 magnetische kralen in evenwicht gebracht in 1x PBS.
    1. Verdun 100 μL van de anti-CD81 magnetische kralen in 1x PBS tot een totaal volume van 1 ml en laat ze binden bij 4 °C gedurende 2 uur in een microcentrifugebuis van 2 ml met continu schommelen.
  8. Was de anti-CD81 kralen en EV drie keer met 1x PBS. Elute CD81+ EV uit de oplossing met 100 mM Glycine bij pH 2,0 gedurende 30 min bij 37 °C.
  9. Pipetteer de gezuiverde CD81+ EV in een gelijk volume van 100 mM Tris-HCl bij pH 7,5 in 1x PBS.
    OPMERKING: Een aliquot van gezuiverde CD81 + EV-oplossing kan worden gereserveerd voor Nanoparticle Tracking Analysis of elektronenmicroscopie om de zuiverheid van de oplossing en de aanwezigheid van EV's te bevestigen26.

3 Fixatie en voorbereiding

  1. Plaats affiniteitsgezuiverde EV's op μ 8-putplaten met glazen bodem in een totaal volume van 200 μL (kan EV-monster verdunnen in 100 mM Tris-HCl bij pH 7,5 in 1x PBS) en laat het oppervlak 's nachts bij 4 °C hechten.
  2. Zonder de bestaande oplossing van de 8-putplaat te verwijderen, bevestigt u EV's op de platen door 200 μL 4% paraformaldehyde in 1x PBS toe te voegen aan de EV-bevattende oplossing in elke put en laat u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur21incuberen .
  3. Verwijder zorgvuldig paraformaldehyde en overtollige oplossing met een micropipette om de EV's niet te storen. Was de EV met 1x PBS om overtollig paraformaldehyde te verwijderen. Voer de wasprocedure drie keer uit. Verwijder overtollige 1x PBS.
  4. Bereid 250 μL dSTORM B-cubed bufferoplossing per monster door een oplossing van 5 mM protocatechuaatdioxygenase (deel A) verdund in beeldvormingsbuffer (deel B) te maken volgens het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: De concentratie van het enzym in de buffer kan worden verdubbeld tot 10 mM als fotobleeken optreedt.
    1. Voeg 250 μL van de voorbereide buffer toe aan elke put volgens het protocol van de fabrikant gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur voordat u zich afbeeldt om oxiderende moleculen op te ruimen.
      OPMERKING: De EV kan dan onmiddellijk worden bekeken of maximaal een week bij 4 °C worden bewaard. Vervang de buffer na opslag vóór elke visualisatie.

4 Directe stochastische optische reconstructie microscopie kalibratie

  1. Bereid de kralen voor die nodig zijn voor de kalibratie van de superresolutiemicroscoop door microsferen van 100 nm te verdunnen tot een concentratie van 0,5% in water van moleculair biologische kwaliteit en 200 μL te pipetteren in elke put van een glazen bodem μ-slide 8-well plaat.
    1. Laat de kralen 1 uur bij kamertemperatuur in de putten bezinken.
  2. Voeg zonder de bestaande oplossing te verwijderen 200 μL 4% paraformaldehyde in PBS toe aan elke put aan de kalibratiepareloplossing en laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  3. Verwijder voorzichtig de paraformaldehyde met een micropipette om de kralen niet te storen en was de kralen drie keer met 1x PBS. Bereid de buffer voor volgens stap 3.4.
  4. Verwijder 1x PBS en voeg 250 μL van de voorbereide buffer toe aan elk putje. Laat de buffer 20 minuten zitten voordat u gaat visualiseren.
  5. Voordat u iets op het podium plaatst, maakt u verbinding met de 3D-microscoop met behulp van de knop De microscoop verbinden. Voeg 100x olie toe aan het objectief en plaats het midden van de put bovenop het objectief. Schakel in de instelling Acquire de excitatielasers van 473 en 640 nm in en klik op Weergeven.
    1. Zonder dat de 3D-lens is geactiveerd, bekijkt u de kralen onder de instelling voor fotonenverzadiging door te klikken op Het aantal fotonen in de opties voor beeldweergave. Stel de initiële laservermogens in op 8,4 mW voor de 473 nm laser en op 11,6 mW voor de 640 nm laser.
    2. Verlaag de focus van de laser tot ongeveer -300 nm of het brandpuntsvlak van de kalibratieparels om een duidelijke resolutie van de afzonderlijke kralen te produceren. Zodra het Z-vlak is scherpgesteld, past u de laservermogensniveaus verder aan om rekening te houden met variatie in elk gezichtsveld.
  6. Onder de instrumentfuncties, volledige 3D-mappingkalibratie en kanaalmappingkalibratie om de fouten op de X-, Y- en Z-as te verkrijgen. Stel het maximale aantal FOV's in op 20, het doelaantal punten op 4.000, de maximale afstand tussen kanalen op 5,0 pixels en de uitsluitingsradius tussen kanalen op 10,0 pixels tijdens de kalibratie van kanaaltoewijzing.
  7. Zorg ervoor dat de kalibratie een puntdekking van >90% oplevert en een kaartkwaliteit die goed is. Sla de gegeven kalibratiegegevens op voor toekomstige beeldacquisities.

5 Visualisatie van EV in drie dimensies

  1. Voeg 100x olie toe aan het objectief en plaats de voorbereide EV's in de microscoop. Zonder de geactiveerde 3D-lens schakelt u de 640 nm excitatielaser in en verhoogt u deze in eerste instantie tot tussen 1,2 mW en 12,5 mW, afhankelijk van de intensiteit van het signaal en het gezichtsveld om het rode membraan te prikkelen dat kleurstof gekleurd EV's intercaleert.
    1. Schakel onder de opties voor beeldweergave de weergavemethode over van fotonenverzadiging naar percentielen om de EV's beter te visualiseren. Pas het laservermogen aan om ruis te minimaliseren en tegelijkertijd het signaal te maximaliseren. Onderhoud alle andere parameters.
    2. Pas de focus van het Z-vlak aan door op het pictogram omhoog of omlaag op de Z-as te klikken.
      OPMERKING: Het Z-vlak moet worden scherpgesteld tussen -200 en -350 nm, maar zal variëren afhankelijk van het gezichtsveld.
  2. Stel de belichtingstijd in op 20 ms, de frameopname op 10.000 frames en het initiële laservermogen op tussen 1,2 mW en 12,5 mW, of het laservermogen bepaald in stap 5.1, afhankelijk van de intensiteit van het signaal en het gezichtsveld.
    1. Activeer de 3D-lens met behulp van het pictogram en start de acquisitie door op de knop Verwerven te klikken.
  3. Verhoog tijdens de beeldacquisitie het laservermogen met 3 stappen van 10 om de 1000 frames, of genoeg om een hoge signaal-ruisverhouding te behouden. Pas het Z-vlak niet aan tijdens de aanschaf.
    OPMERKING: De laser mag worden verhoogd tot een laservermogen van maximaal 90 mW.

6 Modificatie na aankoop en EV-tracing

  1. Schakel na de afbeeldingsacquisitie over naar het weergavevenster Analyseren. Voer afwijkingscorrectie uit op de ongefilterde afbeelding en activeer vervolgens filters. Pas het aantal fotonen, de lokalisatieprecisie, sigma's en frame-index aan volgens tabel 1.
  2. Overlay een XYZ-vlakweergavetool langs de X-as van afzonderlijke EV's vanuit het gezichtsveld en exporteer . CSV-bestanden van fotoswitchinggebeurtenissen.
  3. Bisect individuele EV's op de XY-as in een X bij Y gezichtsveld met behulp van een lijnhistogramtool, die foto-schakelgebeurtenissen in ingestelde afstandsgroepen opslaat.
  4. Maak afbeeldingen van afzonderlijke EV's en sla ze op als .tiff bestanden.
  5. Maak 3D-video's van individuele EV's met behulp van een 3D-visualisatietool en kleur volgens plaatsing langs de Z-as.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het doel van deze studie was om de effectiviteit van superresolutiemicroscopie te evalueren bij het visualiseren van individuele EV's met nanometerresolutie in drie dimensies (3D). Om de vorm en grootte van individuele EV's te analyseren, gebruikten we fotoschakelbare kleurstof en incubeerden we de EV's met een verrode, membraanintercalerende kleurstof en verwijderden we overtollige kleurstof door middel van chromatografie29. De affiniteit-vastgelegde anti-CD81 en roodgekleurde EV's werden vervolgens bekeken in de superresolutiemicroscoop onder de 640 nm excitatielaser. Na de kalibratie van de microscoop die een gemiddelde fout van 16 nm op de XY-as en 38 nm op de Z-as(Figuur 1A, B)produceerde, werden de gezuiverde U2OS EV's met succes gevisualiseerd met een resolutie van maximaal 20 nm op de XY-as en 50 nm langs de Z-as.

Individuele EV's gevisualiseerd via dSTORM in 3D-fotogeschakeld gedurende de 10.000 frameblootstelling naarmate het laservermogen werd verhoogd en waren duidelijk zichtbaar in het verkregen beeld (figuren 2A, B). Post-acquisitie beeldcorrectie van het Z-vlak, fotonentellingen, sigma's en lokalisatieprecisie van het gereconstrueerde beeld zorgden voor de duidelijke resolutie van de EV in 3D(Figuur 2C,D). De EV in Figuur 2C fotowisselde tijdens alleen de eerste 7.000 frames, zoals te zien is door de legende in de rechterbovenhoek. Dit is een gevolg van fotobleaching die mogelijk is veroorzaakt door het te snel verhogen van het laservermogen. Het histogram bevestigt dat de meerderheid van de fotoswitching-gebeurtenissen plaatsvond binnen een straal van 100 nm(figuur 2E),wat bevestigt dat de gevisualiseerde EV een exosoom is en dat de isolatie van EV's met een kleine diameter succesvol was.

Grootteverdelingsanalyse werd uitgevoerd op andere individueel getraceerde EV's met behulp van een lijnhistogramtool en XYZ plane view tool om te bevestigen dat de meerderheid van fotoswitchinggebeurtenissen plaatsvond binnen een straal van 100 nm van het centrum(Figuur 3A,C),waardoor het vermogen van dSTORM om EV's met een kleine diameter te visualiseren verder werd gevalideerd. Zoals gezien door een 3D-visualisatietool, wordt de fout langs de Z-as verhoogd, waardoor een langwerpig eindbeeld van de EV langs de axiale as ontstaat(Figuur 3D,Video 1). Fotoswitchinggebeurtenissen waren niet gecorreleerd met de EV-grootte(figuur 3E),wat aantoont dat dSTORM-gebaseerde karakterisering kan worden gebruikt voor kleine EV's zoals exosomen en kleine omhulde virussen met een diameter van minder dan 100 nm.

De juiste parameters voor Z-plane en sigma zijn een integraal onderdeel van de juiste resolutie van het membraan in 3D. Bovendien zijn de juiste belichtingstijd, het aantal vastgelegde frames en het initiële laserniveau cruciaal voor het produceren van een beeld van een individuele EV met een opgelost membraan. Verder onderzoek moet worden gedaan naar het optimaliseren van de microscoop en het instellen van zowel pre- als postacquisitieparameters om de hoogste resolutiebeelden van EV's vast te leggen.

Figure 1
Figuur 1: Kalibratie van de superresolutiemicroscoop in drie dimensies met behulp van microsferen van 100 nm. (A) Gezichtsveld in grijstinten van kalibratie van de microscoop met microsferen na post-acquisitie beeldcorrecties. Schaalbalk rechtsonder. (B) Absolute kalibratiefouten op de XY-as en de Z-as werden verkregen door respectievelijk kanaaltoewijzingskalibratie en 3D-mappingkalibratie. N = 10 biologische replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: dSTORM van een enkele EV in drie dimensies. (A) Grijswaarden gezichtsveld van CD81+ affiniteit-gezuiverde EV's gekleurd met fotoschakelbare rode membraan intercalerende kleurstof en geëxciteerd met de 640 nm excitatielaser. Schaalbalk rechtsonder. (B) Gezichtsveld van A gelabeld op basis van kanaalkleur. (C) Enkele EV uit de ingezoomde weergave van het witte vak in A, gelabeld volgens de frame-index. De heatmap rechtsboven geeft het kader aan waarin de fotoschakelgebeurtenissen zijn vastgelegd. Schaalbalk rechtsonder. (D) EV van C gelabeld volgens kanaalkleur. (E) Grootteverdelingsanalyse werd gemaakt door de EV op de onderbroken lijn in D te snijden en de fotoswitching-gebeurtenis te scheiden in 15,4 nm-bakken met behulp van een lijnhistogramtool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Verdeling van fotoswitchinggebeurtenissen tijdens de verwerving van een enkele EV in drie dimensies. (A) Gereconstrueerd beeld van een CD81 + affiniteit-gezuiverde EV gelabeld met fotoschakelbare rode membraan intercalerende kleurstof en geëxciteerd met de 640 nm excitatielaser. Schaalbalk rechtsonder. B)Box en whisker plot van gemiddelde diameters van CD81+ affiniteit-gezuiverde EV's verkregen met behulp van de Microscoop Line Histogram Tool langs de XY-as. (gemiddelde = 104 nm, standaarddeviatie = 28 nm). (C) Locatie van individuele fotoswitchinggebeurtenissen langs de XY-dimensie van de EV in A, geregistreerd gedurende de belichting van 10.000 frames. (D) Locatie van individuele fotoswitchinggebeurtenissen langs de XZ-as van de EV in A, geregistreerd gedurende de belichting van 10.000 frames. (E) Scatterplot van het aantal fotoswitchinggebeurtenissen dat is geregistreerd op afzonderlijke EV's met verschillende diameters. R-kwadraatwaarde van 0,1065 toont geen correlatie tussen het aantal gedetecteerde fotoswitchinggebeurtenissen en de EV-diameter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: 3D-beeld van een enkele CD81+ affiniteit-gezuiverde EV gelabeld met fotoschakelbare rode membraan intercalerende kleurstof en geëxciteerd met de 640 nm excitatielaser. Het kleurenschema is gelabeld op basis van de diepte langs de Z-as. Fout langs de Z-as is langwerpig. Klik hier om deze video te downloaden.

Veranderlijk Min Max
Aantal fotonen 200 10,000,000
Z-positie (nm) -300 300
Lokalisatie Precision X (nm) 0 40
Lokalisatie Precisie Y (nm) 0 40
Precisie Sigma X (nm) 0 40
Precisie Sigma Y (nm) 0 40
Sigma X (nm) (Kanaal 0, 640 nm laser) 100 350
Sigma Y (nm) (Kanaal 0, 640 nm laser) 100 350
Sigma X (nm) (Kanaal 1, 473, 561 nm lasers) 100 350
Sigma Y (nm) (Kanaal 1, 473, 561 nm lasers) 100 350
Frame-index 0 10,000

Tabel 1: Parameters voor de superresolutiemicroscoop tijdens 3D DSTORM-acquisitie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

EV's zijn een populair studiegebied geworden vanwege hun belangrijke rol in veel intracellulaire processen en cel-naar-cel signalering1,30. Hun visualisatie blijkt echter moeilijk te zijn omdat hun kleine formaat onder de diffractielimiet van lichtmicroscopie valt. Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) is een directe visualisatiemethode die de diffractielimiet omzeilt door fotoswitchinggebeurtenissen van individuele fluoroforen in de loop van de tijd vast te leggen en een beeld te reconstrueren op basis van deze knipperende gebeurtenissen21,31. Superresolutiemicroscopie is met succes uitgevoerd in 3D op verschillende cellulaire structuren zoals actinefilamenten, microtubuli, receptoren ingebed in het plasmamembraan en virale eiwitten in geïnfecteerde cellen32,33,34,35,36. Het doel van deze studie was om de werkzaamheid van superresolutiemicroscopie, met name dSTORM, te evalueren om EV's in 3D met nanometerresolutie te visualiseren. We gebruikten fotoschakelbare membraanintercalerende kleurstof om met succes individuele EV's van U2OS-cellen via dSTORM te visualiseren in een resolutie tot +/- 20 nm op de XY-as en +/- 50 nm resolutie op de Z-as. Ons eerdere werk heeft aangetoond dat EV's van meerdere cellijnen en primaire vloeistoffen vergelijkbare grootteverdelingsprofielen hebben zoals geanalyseerd door NTA en TEM26,37. Het gebruik van een op dSTORM gebaseerde karakterisering van EV's kan dit fenomeen verder vertrouwen geven en mogelijk subpopulaties in één gezichtsveld identificeren. Verdere verfijning van deze methode is gerechtvaardigd. Een opmerkelijk voordeel van dSTORM is dat de monstervoorbereiding geen harde of schadelijke stappen vereist die de structuur van de EV's kunnen veranderen. Onze resultaten tonen verder aan dat de biochemische aard van EV's wordt gehandhaafd tijdens EV-zuivering met anti-CD81-kralen en zure glycine26,37. We hebben de EV's gefixeerd met paraformaldehyde om membraanpermeabilisaties veroorzaakt door andere fixeermiddelen zoals methanol en ethanol te voorkomen. Dit stelde ons in staat om te concluderen dat dSTORM nauwkeurig de morfologie van EV's vastlegt zoals ze in oplossing bestaan. Het gebruik van Capto Core 700 is echter noodzakelijk om de EV's effectief te zuiveren van verontreinigingen zoals albumine en polyethyleenglycol tot onder de wettelijke vereisten38. Een opvallende beperking van het protocol is dat de bindingsefficiëntie tussen de EV en dia's niet 100% is, dus sommige EV's gaan verloren tijdens de monstervoorbereiding. Er moet verder onderzoek worden gedaan naar de werkzaamheid van met lijm beklede glaasjes om EV's beter te binden.

Hoewel de voorbereiding van EV's voor visualisatie eenvoudig is, variëren de parameters tijdens acquisitie en vooral tijdens post-acquisitieve modificaties aanzienlijk van monster tot monster, afhankelijk van de intensiteit en stabiliteit van de EV's en de fluorofoor. Een gebied van variabiliteit in het experiment is de intensiteit van de excitatielasers die tijdens de belichting subtiel moet worden verhoogd om het signaal te maximaliseren, maar fotobleaching te voorkomen. Fotobleaching, of wanneer een fluorofoor zijn vermogen om te fluoresceren verliest, is een belangrijke beperking gedurende superresolutiemicroscopie12,39. Om fotobleaching te voorkomen, kan de concentratie van het enzym in de buffer worden verhoogd tot 10 mM om oxiderende moleculen beter op te ruimen en fotobleaching te voorkomen. Bovendien is het instellen van het excitatielaservermogen op een laag initieel niveau en het langzaam verhogen tijdens de blootstelling om een hoog signaal te behouden van cruciaal belang om fotobleeken te voorkomen.

We kozen voor een rode fotoschakelbare kleurstof om de EV's te bevlekken vanwege de excitatiegolflengte, duurzaamheid en het vermogen om fixatie te weerstaan29. De kleurstof die we hebben gekozen, kan echter problemen opleveren tijdens superresolutiemicroscopie wanneer deze te snel of met een te hoge intensiteit wordt opgewonden. De fluoroforen in de fotoschakelbare rode membraankleurstof kunnen fotobleken na 10.000 frames of nadat het laservermogen groter is dan 75,6 mW. Bovendien neemt de intensiteit en het vermogen van de membraankleurstof om te fluoresceren aanzienlijk af na een week opslag bij 4 °C. Ten slotte is aangetoond dat de membraanintercalerende kleurstoffen micellen vormen in een waterige oplossing, dus overtollige kleurstof die na zuivering nog steeds in het EV-monster aanwezig is, kan worden gedetecteerd en voor een EV worden aangezien als er geen andere marker is om de EV te identificeren, zoals een tetraspanine. Verder onderzoek moet worden gedaan met behulp van andere membraanintercalerende kleurstoffen om te optimaliseren voor fotostabiliteit31,40. Fluorescerende antilichamen geconjugeerd aan de EV kunnen een meer geschikte optie zijn omdat ze de neiging hebben om beter bestand te zijn tegen fotobleaching en het signaal kunnen versterken41. Het nadeel van antilichamen is echter dat het signaal van de fluorofoor enigszins wordt gecompenseerd ten opzichte van de EV vanwege de afstand tot het epitoop en fluorofoor op het antilichaam.

Bestaande methoden voor EV-visualisatie en -karakterisering, zoals NTA, flowcytometrie of EM, kunnen schadelijke voorbereidingsstappen vereisen of zijn indirecte visualisatiemethoden. dSTORM vereist weinig monstervoorbereiding, met behoud van de natuurlijke biochemische aard van EV's, en is een directe visualisatiemethode die de diffractielimiet kan omzeilen en EV's met een kleine diameter8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,21,kan visualiseren 26. Andere technieken van superresolutiemicroscopie kunnen worden geoptimaliseerd voor EV-karakterisering, zoals gestimuleerde emissiedepletie (STED), spinning disc confocale microscopie (SDCM) en foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM)42,43. De huidige studie richt zich uitsluitend op dSTORM, maar toekomstig werk aan het optimaliseren van superresolutiemicroscopie en het vergelijken / contrasteren van deze technieken is gerechtvaardigd. EV's zijn onlangs een populair onderzoeksgebied geworden omdat hun rol in virusprogressie duidelijker is geworden. Veel evolutionair verschillende virussen, zoals epstein Barr-virus, HIV en hepatitis A-virus, zijn geëvolueerd om te profiteren van de EV-signaleringsroutes om ziekteprogressie te bevorderen en de immuunrespons van het lichaam te ontwijken37,44,45,46,47,48,49,50 . Van deze virussen is aangetoond dat ze virale factoren, zoals mRNA's of virale eiwitten, opnemen in EV's die deze componenten vervolgens kunnen overbrengen naar niet-geïnfecteerde cellen, terwijl ze ontsnappen aan immuundetectie6,51,52,53. Deze exosomaal geassocieerde virale factoren kunnen worden gedetecteerd en mogelijk worden gebruikt als biomarker voor ziekteprogressie54,55. Daarom kan dSTORM-gebaseerde visualisatie van individuele EV's en hun bijbehorende eiwitten worden onderzocht als een platform voor ziektebiomarkers en, misschien, ziekteprogressie van bepaalde virussen54,55. Verder onderzoek moet worden gedaan om het nut van dSTORM te beoordelen bij het visualiseren van zowel de inhoud in een EV als eiwitten op het membraan.

Concluderend hebben we aangetoond dat superresolutiemicroscopie moet worden beschouwd als een effectieve techniek voor de visualisatie van EV's in 3D met nanometerresolutie. De resultaten verkregen door dSTORM zijn consistent met andere EV-karakteriseringstechnieken. Een duidelijk voordeel van dSTORM is de mogelijkheid om deeltjes direct te visualiseren onder de diffractielimiet van licht zonder uitdroging of bevriezingsbreukstappen die de biochemische aard van EV's kunnen veranderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.G.C. heeft geen belangenconflicten te melden. R.P.M en D.P.D. ontvangen materiële steun van Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. en Cytiva Inc. (voorheen GE Healthcare). R.P.M. en D.P.D. verklaren tegenstrijdige belangen voor de mogelijke commercialisering van een deel van de gepresenteerde informatie. Deze worden beheerd door de Universiteit van North Carolina. De financieringsbronnen waren niet betrokken bij de interpretaties of het schrijven van dit manuscript.

Acknowledgments

We willen Oxford Nanoimaging bedanken voor hun constructieve feedback en begeleiding. Dit werk werd gefinancierd door de 5UM1CA121947-10 aan R.P.M. en de 1R01DA040394 aan D.P.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Tags

Biologie Nummer 174
Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, M. G., McNamara, R. P.,… More

Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter