Summary
Denne protokollen beskriver hvordan man infiserer humane tarmorganoider fra enten deres apikale eller basolaterale side for å karakterisere verts- / patogeninteraksjoner på encellet nivå ved hjelp av encellet RNA-sekvenseringsteknologi (scRNAseq).
Abstract
Humane intestinale organoider utgjør den beste cellulære modellen for å studere patogeninfeksjoner i mage-tarmkanalen. Disse organoidene kan avledes fra alle deler av GI-kanalen (mage, jejunum, duodenum, ileum, kolon, endetarm) og, ved differensiering, inneholder de fleste celletyper som naturlig finnes i hver enkelt seksjon. For eksempel inneholder intestinale organoider næringsabsorberende enterocytter, sekretoriske celler (beger, paneth og enterokendokrine), stamceller, samt alle avstamningsspesifikke differensieringsformidlere (f.eks. tidlige eller umodne celletyper). Den største fordelen ved å bruke mage-tarmkanalen-avledede organoider for å studere smittsomme sykdommer er muligheten for nøyaktig å identifisere hvilken celletype som er målrettet av det enteriske patogenet og å adressere om de forskjellige delene av mage-tarmkanalen og deres spesifikke celletyper på samme måte reagerer på patogenutfordringer. I løpet av de siste årene har gastrointestinale modeller, så vel som organoider fra andre vev, blitt brukt til å studere viral tropisme og mekanismene for patogenese. Imidlertid representerer bruk av alle fordelene ved å bruke organoider når du bruker svært patogene virus en teknisk utfordring og krever strenge biosikkerhetshensyn. I tillegg, som organoider ofte dyrkes i tre dimensjoner, vender den basolaterale siden av cellene mot utsiden av organoiden mens deres apikale side vender mot organoidenes indre (lumen). Denne organisasjonen utgjør en utfordring for enteriske patogener ettersom mange enteriske infeksjoner initierer fra den apikale / lysende siden av cellene etter inntak. Følgende manuskript vil gi en omfattende protokoll for å forberede humane intestinale organoider for infeksjon med enteriske patogener ved å vurdere infeksjonssiden (apikal vs. basolateral) for å utføre encellet RNA-sekvensering for å karakterisere celletypespesifikke verts- / patogeninteraksjoner. Denne metoden beskriver forberedelsen av organoidene samt hensynene som trengs for å utføre dette arbeidet under biosikkerhetsnivå 3 (BSL-3) inneslutningsforhold.
Introduction
Det har vært historisk utfordrende å studere celletypespesifikk tropisme og celletypespesifikk immunrespons på humane enteriske virus på grunn av mangel på primære humane cellulære modeller. Denne begrensningen er nå delvis utryddet med utviklingen av organoider1. Når det gjelder mage-tarmkanalen, er mage- og tarmorganoidmodeller utviklet for mennesker og flere andre arter(f.eks. murin, bovin, feline, bat)2,3,4,5,6. Intestinale organoider reproduserer den strukturelle arkitekturen til det menneskelige tarmepitelet og inneholder krypt- og villi-lignende strukturer, funksjonelle tarmavstamninger og har til og med blitt brukt til å identifisere tidligere ukjente celleavstamninger. To forskjellige tilnærminger kan brukes til å vokse intestinale organoider. For det første er tarmstammer celler som inneholder krypter isolert fra vev reseksjoner eller biopsier og vokst under spesifikke kulturforhold (f.eks. Wnt3A, R-spondin, Noggin og EGF) for å utvide, og deretter skille stamcellene til de fleste tarmcelleavstamninger(f.eks. enterocytter, Paneth-celler, Goblet-celler, enterodokrine celler)7. Denne metoden tillater isolering av organoider fra alle deler avmage-tarmkanalen (f.eks. mage, tolvfingertarmen, jejunum, ileum og kolon). Den andre metoden er avhengig av menneskeskapte pluripotente eller embryonale stamceller, som deretter differensieres i en trinnvis prosess i tarmepitelceller8. Disse induserte stamcellebaserte organoidene beskrives ofte som mer embryonale i naturen sammenlignet med pasientavledede organoider. Mens alle disse organoidmodellene har vært avgjørende for å avdekke utviklingssignaler som trengs for å danne tarmkanalen, er deres bruk i smittsom sykdomsforskning fortsatt i sin spede begynnelse.
Enterisk virus er et bredt begrep som dekker alle virus, som infiserer gjennom mage-tarmkanalen, for eksempel picornavirus (f.eks. , EV-71), reovirus (f.eks. rotavirus) og calicivirus (f.eks. norovirus)9. Enteriske virus initierer sin smittsomme livssyklus gjennom inntak av forurenset mat og vann, noe som etterlater folk i utviklingsland med høy risiko på grunn av utslipp av ubehandlet avfall i miljøet og mangel på medisinsk behandling etter infeksjonsde begynnelse10. Avhengig av type patogen, kan infeksjonen føre til gastroenteritt, oppkast og / eller vannaktig diaré på grunn av lekkasje av tarmforingen. Menneskelige norovirus er et svært utbredt og svært smittsomt enterisk patogen, som fører til over 600 millioner infeksjoner og 15 millioner sykehusinnleggelser over hele verden11. Organoider har vært nøkkelen til norovirusforskning da de støtter infeksjon og replikasjon av humant norovirus, som tidligere ikke var i stand til å bli dyrket i standard cellekulturmodeller12.
I løpet av de siste to tiårene har koronavirus dukket opp som viktige menneskelige patogener13. Denne familien inkluderer den svært patogene MERS, SARS-CoV-1 og SARS-CoV-2, som krever strenge sikkerhetsnivå inneslutninger når du utfører forskning på disse virusene. Interessant, mens alle disse tre patogenene for det meste er anerkjent for sine induserte luftveissymptomer og nød, er det nå tydelig at disse virusene ikke bare smitter luftveiene, men også andre organer. En viktig patologi indusert hos SARS-CoV-2 infiserte pasienter i tillegg til luftveiene er tilstedeværelsen av gastrointestinale symptomer14. En brøkdel av SARS-CoV-2 infiserte pasienter viser slike symptomer, alt fra svært mild til alvorlig diaré. I tillegg kan SARS-CoV-2 genomer påvises i avføring og mage-tarmkanalen biopsier av infiserte pasienter15. Viktig tilstedeværelsen av gastrointestinale symptomer er ikke begrenset til SARS-CoV-2 da de også ble observert hos MERS og SARS-CoV-1 infiserte pasienter. For å forstå hvordan SARS-CoV-2 induserer gastrointestinal nød og nøyaktig identifiserer tropismen til SARS-CoV-2 i mage-tarmkanalen, har humane tarmorganoider vært et nøkkelverktøy og utnyttes nå til å avdekke celletypespesifikke responser på dette patogenet16,17.
Transkripsjonell profilering av en cellepopulasjon (bulk RNA-sekvensering) har vært standard praksis ved evaluering av patogeninfeksjoner i både udødelige cellelinjer så vel som med organoider. Selv om dette gjør det mulig for oss å bestemme globale endringer som svar på patogener (f.eks. oppregulering av cytokiner), tillater ikke bulk RNAseq oss å bestemme hvorfor spesifikke celler i en populasjon er mer utsatt for infeksjon enn andre. Encellet RNA-sekvensering (scRNAseq) har blitt et kraftig verktøy for å løse opp cellelinjespesifikke transkripsjonsprogrammer og kan brukes til å bestemme hvordan disse programmene støtter eller undertrykker virusinfeksjon18,19. Den første beskrivelsen av scRNAseq var i 2009 og ble brukt til å evaluere transkripsjonsprofilene til de forskjellige cellene som finnes i en mus blastomere20. Disse teknologiene er nå utvidet og kan implementeres gjennom flere forskjellige plattformer. Tidlige versjoner av denne teknologien brukte fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å skille individuelle celler for sekvensering, som ofte var begrenset til 96- eller 384-brønnsplater, og dermed ga 300 individuelle celler å analysere per prøve21. Disse metodene har nå blitt avansert av encellede sekvenseringsplattformer, som bruker en mikrofluidisk enhet for å innkapsle enkeltceller i individuelle dråper med strekkode som inneholder perler. Denne teknologien gjør det mulig å fange opp opptil 10 000 celler per prøvebetingelse.
Ved å kombinere organoider teknologi med scRNAseq kan vi studere hvordan enteriske patogener påvirker mage-tarmkanalen på en celletypespesifikk måte. Det må imidlertid tas flere tekniske og biosikkerhetshensyn. Først og fremst eksponerer klassiske organoider kulturmetoder (3-dimensjonale (3D) organoider, innebygd i en ekstracellulær matrise (ECM)) den basolaterale siden av epitelcellene på utsiden av organoiden. Når enteriske patogener initierer infeksjonen gjennom inntak av forurenset mat / vann, initierer infeksjonen oftest fra den apikale siden av cellene, som ikke er tilgjengelig i disse 3D-tarmorganoidene. Derfor må organoider være forberedt på å gjøre den apikale siden tilgjengelig for patogeninfeksjon enten gjennom 2D-såing, og dermed direkte utsette den apikale siden av cellene, eller gjennom mikroinjeksjon22,23. For det andre, for å utføre scRNAseq av infiserte biologiske prøver, er det viktig å vurdere deres smittsomme natur. Mens metoder for å fikse celler og inaktivere patogener før encellet isolasjon for etterfølgende RNAseq er foreslått, fører disse metodene ofte til en reduksjon i sekvenseringskvalitet18. Protokollen nedenfor vil beskrive flere tilnærminger for å infisere tarmorganoider med enteriske virus med tanke på infeksjonssiden (apikal vs. basolateral infeksjon) (Figur 1). I tillegg vil protokollen inkludere en arbeidsflyt for å dissosiere og isolere enkeltceller fra organoider infisert med svært patogene virus for scRNAseq. Protokollen vil fremheve de viktigste trinnene som må implementeres når du arbeider under biosikkerhet nivå-3 (BSL-3) inneslutningsbetingelser for å unngå generering av aerosoler og potensiell forurensning.
Protocol
Humant vev ble mottatt fra kolon reseksjon eller ileum biopsier fra Universitetssykehuset Heidelberg for følgende protokoll. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene fra Universitetssykehuset Heidelberg med informert skriftlig samtykke fra alle i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Alle prøver ble mottatt og vedlikeholdt på en anonymisert måte. Protokollen ble godkjent av Etikkkommisjonen ved Universitetssykehuset Heidelberg i henhold til protokoll S-443/2017.
1. Vedlikehold og passivisering av tarm- og kolonorganoider
FORSIKTIG: Humane tarmorganoider er avledet fra humant vev eller fra induserte pluripotente/embryonale stamceller, og det kreves derfor etisk godkjenning. Landsspesifikke forskrifter må følges. Humant materiale er generelt ikke testet og regnes derfor ofte som BSL-2-materiale. Riktige inneslutningsbetingelser må bekreftes i landet der eksperimentet finner sted.
- Forbered tarm- og kolonorganoider fra isolert vev og/eller biopsier ved hjelp av tidligere beskrevne metoder2. I tillegg kan mer tekniske detaljer om hvordan du lager organoider fra pasientavledet materiale eller fra iPSCer, finnes i Lees et al. og Mahe et al.24,25.
- Når organoidkulturer er etablert, følg den nedenfor beskrevne splittingsrutinen for å forberede organoider for å utføre infeksjoner med enteriske patogener.
- Frø 20-100 organoider i 50 μL 100% ECM-oppløsning i 24-brønns ikke-vevskulturbehandlede plater. Tilsett 500 μL vekstmedier (tabell 1) per brønn.
- Endre mediet annenhver dag ved å fjerne 250 μL av det gamle mediet og legge til 250 μL av det friske vekstmediet til hver brønn. Varm mediene til romtemperatur før du skifter media.
FORSIKTIG: Kalde medier vil flytende ECM-oppløsningen som inneholder organoider. - Passasje organoidene en gang i uken når interiøret begynner å bli mørkt på grunn av opphopning av døde celler. Du finner et eksempel på dette i figur 2.
- På dagen for splitting fjerner du ECM-oppløsningen fra -20 °C og tiner på is.
- Plasser den nye tomme cellekulturplaten som skal brukes til å frø organoidene etter splitting ved 37 °C (dette krever minimum 1 time for å være varm og kan varmes opp over natten). Varm kulturmediene til romtemperatur.
- Fjern vekstmediet med en P1000 pipette og tilsett 500 μL kald 1x fosfatbufret saltvann (PBS) til hver brønn i 3 minutter for delvis å flytende ECM-løsningen og dissosiere fra platen.
- For å sikre full forstyrrelse av ECM-løsningen, bruk en P1000 pipette (oppsett på 450 μL). Pipette opp og ned 10 ganger for å resuspendere PBS, ECM-løsningen og organoidene, overfør de resuspenderte organoidene til et 15 ml konisk rør og legg dem på is.
- Samle flere brønner av samme organoider i samme koniske rør.
- Hvis flere forskjellige organoider (forskjellige donorer, forskjellige seksjoner, forskjellig forbehandling, etc.) deles samtidig, samle dem i forskjellige koniske rør. Hold de koniske rørene på isen mens du samler.
- Snurr prøvene ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern FORSIKTIG PBS med en pipette for å opprettholde den organoide pelletsen nederst.
- Unngå å bruke et vakuumavfallssystem med en montert pipette, da pelletsen av organoider er veldig løs og lett kan aspireres når du fjerner PBS for raskt.
- Tilsett 1 ml 0,05% trypsin til det koniske røret og resuspend organoider ved å pipettere opp og ned 10 ganger med en P1000 pipette. Inkuber det koniske røret som inneholder organoider ved 37 °C i 3 minutter.
- Tilsett 2 ml DMEM/F12-medier som inneholder 10 % foster bovint serum (FBS) og 1 % penicillin/streptomycin for å stoppe fordøyelsen og resuspend for å forstyrre organoidene ved å pipettere opp og ned 10 ganger med en P1000 pipette.
- Snurr prøvene ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern koniske rør fra sentrifugen og oppbevar dem på is.
- Fjern forsiktig media/trypsin med en 5 ml engangspipette for å opprettholde den organoide pelletsen nederst. La det være rundt 500 μL medier og fjern dette med en P1000 pipette.
- Når media/trypsin er fjernet fra alle koniske rør, fjern den 24-brønns ikke-cellekulturbehandlede platen fra 37 °C inkubatoren og plasser den under cellekulturhetten.
- Tilsett 100% ECM-løsning (holdt på is) til det koniske røret med de delte organoidene ved 1:3 til 1:5-forholdet, avhengig av vekstvanene til de enkelte donororganoidene. (For eksempel, hvis en brønn som inneholder 20-100 organoider i en 50 μL dråpe ECM-oppløsning ble passasjet, resuspend den organoide pellet til 150-250 μL iskald ECM-løsning.)
- Frø 50 μL ECM-oppløsning/organoidblanding per brønn av den 24-brønns ikke-cellekulturbehandlede platen forvarmet til 37 °C.
MERK: ECM-løsningen polymeriseres veldig raskt når den er oppvarmet. Hold ECM-oppløsningen kald til enhver tid (lagret på is) under bruk. Når organoider har blitt resuspendert, frø umiddelbart på en ny plate. For nybegynnere anbefales det å lagre en eske pipettespisser ved -20 °C for å gi ekstra tid til såingen. - Inkuber 24-brønnsplaten ved 37 °C i 10–15 minutter slik at ECM-oppløsningen kan polymeriseres.
- Etter polymerisering tilsettes 500 μL vekstmedier (tabell 1)26 til hver brønn og inkuberer organoidene ved 37 °C. Kontroller organoidene daglig ved mikroskopi. Endre mediet annenhver dag som i trinn 1.4.
2. Fremstilling av organoider i to dimensjoner (2D) for apikal infeksjon
MERK: Følgende protokoll vil beskrive hvordan man sår intestinale organoider som en monolayer av celler i en cellekulturplate for å infisere intestinale epitelceller fra deres apikale side. Bruk 48-brønnsplaten til sekvenseringsforsøkene og 8-brønns glassbunnkammersklie for å kontrollere infeksjon ved hjelp av immunfluorescens tilnærminger.
- Vokse og vedlikeholde organoider som beskrevet i avsnitt 1.
- Før såing organoider i 2D, belegge 48-brønns plater og 8-brønns glassbunnkammer lysbilde med 200 μL av 2,5% menneskelig kollagen i vann per brønn i 1 time ved 37 °C.
MERK: Intestinale organoider er best frø i 48-brønnsplater og i 8-brønns glassbunnkammersklie. Erfaring har vist at de ikke smitter godt i 96-brønnsplater. Transwell innsatser kan også brukes til å tillate både apikal og basolateral infeksjon i 2D. Hvis transwells brukes, må du overvåke den transepteliale elektriske motstanden (TEER) før infeksjon for å bekrefte en samtidig monolayer. Normalt har intestinale organoider en tett barriere med en TEER på 450-600 Ohm / cm2. - Frø 100-150 organoider i hver brønn av en 48-brønns plate eller for en brønn av en 8-brønns glassbunnkammersklie.
- For å estimere antall organoider, tell antall organoider tilstede i 50 μL ECM-løsningsfall av 24-brønnsplaten som er fremstilt i avsnitt 1. I gjennomsnitt er det behov for 1-2 brønner, noe som vil gi ca. 15.000-30.000 celler.
- Følg trinn 1.8-1.17 for å forstyrre ECM-løsningen og prøve å inspisere organoidene.
- Fjern menneskelig kollagen fra 48-brønnsplatene og 8-brønns glassbunnkammersklie.
- Resuspend den organoid pellet i det koniske røret i 250 μL vekstmedier / brønn og tilsett blandingen til kollagenbelagte brønner. Plasser platen i en inkubator på 37 °C.
MERK: Når du utfører forsøkene, sammenlignes flere forhold (mock vs. infisert +/- behandling av interesse). For å minimere variasjon mellom hver brønn av 2D-frøorganoider, samle det totale antall nødvendige organoider i samme koniske rør. Innsamling av organoider fra opptil 12 brønner av en 24-brønns plate kan bruke 1 ml trypsin og 2 ml nøytraliserende medier. Ved bruk av 12-24 brønner øker du dette til 2 ml trypsin og 4 ml nøytraliserende medier. - Etter 48 timer, fjern platen fra inkubatoren og legg den i cellekulturhetten. Fjern vekstmediet og erstatt det med 250 μL per brønn med differensieringsmedier (tabell 1). Gjenta denne medieendringen 48 timer senere.
- Etter 48 timer, bekrefte differensiering (fire dager etter bytte til differensieringsmedier) ved å trekke ut RNA, lage cDNA med 250 ng RNA, og utføre SYBR grønnbasert qPCR ved hjelp av primere for stamceller (OLFM4 og/ eller SMOC2), begerceller (MUC2), enterokendokrine celler (CHGA) og enterocytter (SI og/eller CYP3A4) (Figur 3).
MERK: Ved bytte fra vekstmedier til differensieringsmedier vil organoider redusere sitt uttrykk for stamcellemarkører (OLFM4 og/eller SMOC2) og øke uttrykket for begerceller (MUC2), enterokrine celler (CHGA) og enterocytter (SI og/eller CYP3A4) markører av qPCR. Forbered en ekstra brønn og vedlikehold med vekstmedier for å sammenligne uttrykksnivået til hver celletypespesifikk markør i vekst kontra differensieringsmedier. - Ved bekreftelse av differensiering er organoider klare for apikal infeksjon. Flytt organoidene til biosikkerhetsnivået som kreves for det valgte patogenet.
FORSIKTIG: Se instituttets lokale forskrifter og standard driftsprosedyrer ved håndtering av patogener under BSL-2 eller BSL-3 inneslutning. - For å infisere tarmorganoidene som vokser i 2D fra deres apikale side, fjern medier med en P1000 pipette og tilsett patogen fortynnet ved mangfoldet av infeksjon som kreves for eksperimentet i differensieringsmedier (minimumsvolum av patogen / medieblanding er 50 μL per brønn og maksimalt volum er 250 μL per brønn).
- La infeksjonen fortsette i 2 timer ved 37 °C med enten et vippebord plassert i cellekulturinkubatoren eller ved å gynge platen manuelt hver 15-20 min. Optimaliser denne tiden basert på det valgte patogenet.
- Etter 2 timer, fjern mediet med en P1000 pipette og erstatt den med 250 μL per brønn med friske differensieringsmedier. Inkuber celler ved 37 °C til tidspunktet for sekvensering av enkeltceller.
- Hvis du vil klargjøre celler for sekvensering med én celle, går du videre til inndeling 4.
3. Fremstilling av organoider i tre dimensjoner (3D) for apikal og basolateral infeksjon
- Vokse organoider som beskrevet i avsnitt 1 i en 24 brønn, ikke-celle kulturbehandlet plate.
- To dager etter passivisering, fjern platen fra inkubatoren og legg i en cellekulturhette.
- Fjern vekstmediet med en P1000 pipette, erstatt det med 500 μL / brønn av differensieringsmedier forhåndsvarmet til romtemperatur og plasser platen i 37 ° C inkubatoren.
- Etter 48 timer, erstatt med friske differensieringsmedier (500 μL / brønn).
MERK: Organoider opprettholdes i differensieringsmedier i totalt 4 dager før infeksjon. - Bekreft differensiering som beskrevet i trinn 2.9.
- Ved bekreftelse på at differensiering har skjedd, er organoider klare for infeksjon.
- Tine ECM på is. Varm differensieringsmediet til romtemperatur og varm en 24-brønns plate ved 37 °C.
- For å utføre infeksjoner, fjern organoidene fra ECM-løsningen.
MERK: Fjern så mye ECM-løsning som mulig, da virus foretrekker å holde seg til ECM-løsningen i stedet for celler. Hvis det er for mye ECM-løsning igjen rundt organoidene, vil infektivitet bli sterkt påvirket. - Forstyrre ECM ved å tilsette 500 μL kald 1x PBS og inkubere i 3 min. Bruk en P1000 til å pipette opp og ned 10x. Kombiner organoider i et rør og sentrifuger på 500 x g i 5 min. Fjern PBS med en P1000.
MERK: For å minimere variasjon mellom hver infeksjonstilstand, kombiner organoidene som kommer fra flere brønner av en 24-brønnsplate i samme koniske rør. For eksempel, hvis åtte smittebetingelser er nødvendig, vil åtte brønner av en 24-brønnsplate (som inneholder ~ 100 organoider hver) kombineres og deretter deles inn i åtte brønner av en ny 24-brønnsplate etter nålforstyrrelser (se trinn 3.12). - Resuspend organoidene i 1 ml differensieringsmedier. For apikal og basolateral infeksjon følg trinn 3.10.1 og for basolateral infeksjon følger du bare trinn 3.10.2.
- Fest en 27 G nål til en 1 ml sprøyte og resuspender pellet seks ganger for å tillate forstyrrelse av organoider og for infeksjon på både apikale og basolaterale sider. Fortsett til trinn 3.11.
MERK: Organoidene skal være de klassiske cyste-utseende og blekksprut-budded organoider med et mørkt senter når observert før nål forstyrrelser. Etter forstyrrelsen vil disse organoidene virke mindre med mindre eller ikke mørkt interiør. Når du utfører infeksjon, vil det alltid være minst to forhold (mock og infeksjon), vil minst to brønner av en 24-brønns plate i utgangspunktet bli kombinert til et 15 ml konisk rør for nålbasert forstyrrelse (forklarer hvorfor minst 1 ml brukes til resuspension). Når du utfører mer enn to forhold, kombinerer du opptil 10 brønner av en 24-brønns plate i et enkelt 15 ml konisk rør og resuspend i 1 ml differensieringsmedier for nåleforstyrrelser. Etter forstyrrelsen legger du til 500 μL differensieringsmedier per n + 1 (for eksempel hvis du bruker 10 brønner, fyll deretter på med 4,5 ml for å ha 5,5 ml totalt). Hvis det er behov for mer enn 10 forhold, bruk flere koniske rør. En 1 ml sprøyte anbefales da organoider forstyrres bedre med dette volumet av sprøyten. Et alternativ til en sprøyte er å bruke en godt flatt P1000-spiss. - Resuspend organoidene i 500 μL differensieringsmedier per brønn. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer organoidene og sørg for at den apikale siden ikke er tilgjengelig. Fortsett til trinn 3.11.
- Fest en 27 G nål til en 1 ml sprøyte og resuspender pellet seks ganger for å tillate forstyrrelse av organoider og for infeksjon på både apikale og basolaterale sider. Fortsett til trinn 3.11.
- Overfør 500 μL organoid suspensjoner per brønn til en 24-brønns cellekulturplate ved hjelp av en P1000 pipette og flytt platen til biosikkerhetsnivået som kreves for det valgte patogenet.
FORSIKTIG: Se lokale forskrifter og instituttets standard driftsprosedyrer ved håndtering av patogener i henhold til BSL-2 eller BSL-3 inneslutning. Utfør alltid nåleforstyrrelsen av organoidene utenfor BSL-3 for å unngå potensielle ulykker med kanylen. Lokale forskrifter kan også hindre bruk av nåler i BSL-3. - Tilsett patogenet fortynnet i differensieringsmedier for å nå mangfoldet av infeksjon som kreves for eksperimentet. Ikke overskrid et totalt volum på 500 μL (for å ha 1 ml totalt i 24-brønnsplaten).
- La infeksjonen fortsette i 2 timer (denne gangen må tilpasses det valgte patogenet) ved 37 °C med enten et vippebord plassert i cellekulturinkubatoren eller ved å gynge platen manuelt hver 15-20 min.
- Etter 2 h inkubasjon, samle organoidene i ett 1,5 ml rør per tilstand og spinn ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern mediet som inneholder patogen med en P1000 pipette og lagre den på is. Vask organoidenes pellets en gang med PBS.
- Resuspend organoidene i 50 μL av 100% ECM-oppløsning (som tidligere ble tint på is), plate i en 24-brønns ikke-celle kulturbehandlet plate forvarmet til 37 °C og inkubere 24-brønnsplaten ved 37 °C i 10-15 minutter for å la ECM-løsningen polymerisere.
- Etter polymerisering, tilsett 500 μL differensieringsmedier ved romtemperatur til hver brønn og inkuber ved 37 °C til høsting for encellet sekvensering.
MERK: Hvis høsting må skje mer enn 48 timer etter sådd, bytt media hver annen dag ved å fjerne det gamle mediet og erstatte det med 500 μL ferske differensieringsmedier. Erfaring har imidlertid vist at siden organoider vokser under differensieringsmedier, vil de ikke overleve mye lenger enn 48 timer.
4. Fremstilling av enkeltcellet løsning og tilberedning av gelperler i emulsjon (GEMs) i biosikkerhetsnivå 3 (BSL-3) forhold
MERK: Fullføring av følgende trinn krever at enkeltcellesekvenseringsutstyret (Materialtabell) og en PCR-maskin som er i stand til å håndtere 100 μL-reaksjoner, er til stede inne i et BSL-3-anlegg. Organoider dyrkes som beskrevet i avsnitt 1 og smittes som beskrevet i avsnitt 2-3 avhengig av patogen og inngangsvei. På et forhåndsbestemt tidspunkt etter infeksjon høstes organoider. Under metoden som brukes til å høste intestinale organoider er beskrevet.
- Før høsting av infiserte organoider, fjern Single Cell Gel perler (Tabell over materialer) fra -80 °C og varm til romtemperatur (minst 30 min før).
- I tillegg likevekt rt reagens, redusere agent B og RT enzym C (alle lagret ved -20 °C) til romtemperatur. Bruk malbryteren oligo på nytt som beskrevet i produsentens anvisninger.
MERK: Alle følgende trinn må utføres i forhold til de lokale biosikkerhetsforskriftene etter den etablerte standard operasjonsprosedyren for det vurderte patogenet. Som en tommelfingerregel for BSL-3-arbeid må det sikres at utsiden av alle kar (plater, rør, etc.) som går ut av en cellekulturhette, desinfiseres riktig. Det samme gjelder hendene/hanskene til personen som utfører forsøkene. - For å utføre infeksjoner på organoider sådd i 2D (avsnitt 2) fortsett til trinn 4.4. For å utføre infeksjoner på 3D-organoider (avsnitt 3) fortsett til avsnitt 4.5.
- For infeksjoner av 2D-organoider, ta cellekulturplaten inn i hetten og fjern differensieringsmediet med en P1000 pipette.
- Tilsett 250 μL 1x PBS ved romtemperatur til hver brønn.
- Fjern PBS med en P1000 pipette og tilsett 250 μL romtemperaturdissosiasjonsenzym (f.eks. TrypLE Express) til hver brønn på en 48-brønns plate. Bytt hansker, rengjør platen og plasser platen med dissosiasjonsenzymet i 37 °C inkubatoren.
- Vær oppmerksom på celledissosiasjonen ved mikroskopi hvert 5.
MERK: Omtrent tar det 15 min å dissosiere tarmorganoider dyrket i 2D i enkeltceller. Denne gangen må justeres da det vil avhenge av hvor mange organoider som i utgangspunktet ble sådd og smittet, så vel som på patogenet, da noen patogener er mer cytopatiske og får organoider til å dissosiere mye raskere enn andre. - Etter bekreftelse av en tilsynelatende enkeltcellet suspensjon, ta platen tilbake i cellekulturhetten og stopp fordøyelsen ved å legge til 250 μL DMEM / F12-medier som inneholder 10% FBS per brønn av en 48-brønns plate.
- Samle cellene i et 15 ml konisk rør ved hjelp av en P1000 pipette.
- Bytt hansker, rengjør røret og snurr prøvene ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern forsiktig media / dissosiasjonsenzymet med en P1000 for å opprettholde cellepelleten nederst. Resuspend enkeltceller i et minimalt volum av PBS som inneholder 0,1% BSA. For intestinale organoider, resuspend i 250 μL for hver brønn av 48-brønnsplaten.
- Før cellesuspensjonene inn i et FACS-rør med et filter for å fjerne store klumper og plassere FACS-røret som inneholder celler på is.
- Fortsett til trinn 4.6 for å fortsette med celletelling og forberedelse av hovedblandingen.
- For infeksjoner av 3D-organoider, fjern platen fra inkubatoren og legg den i cellekulturhetten.
- Fjern differensieringsmediet fra hver brønn på 24-brønnsplaten med en P1000 pipette. Tilsett 500 μL iskald 1x PBS til hver brønn og inkuber i 3 min på is.
- For å sikre full forstyrrelse av ECM-løsningen, bruk en P1000 pipette (satt til 450 μL). Pipette opp og ned 10 ganger for å resuspendere PBS, ECM-løsningen og organoidene; overføre de resuspenderte organoidene til et 15 ml konisk rør og plassere på is. Samle hver infeksjonstilstand i sitt eget 15 ml koniske rør.
MERK: Bruk av et konisk rør på 15 ml gir en bedre, mer distinkt cellepellet enn et 50 ml konisk rør eller et 1,5 ml rør. - Bytt hansker og fjern røret fra cellekulturhetten. Rengjør utsiden av røret.
- Snurr prøvene ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Flytt røret tilbake i cellekulturhetten og fjern PBS med en P1000 pipette for å unngå å gjenopplive organoidenes pellet fra bunnen av røret.
- Snu pelletsen på nytt i 1 ml dissosiasjonsenzym (f.eks. Bytt hansker, rengjør røret og inkuber prøvene ved 37 °C.
- Hver 10 min i 30 min, flytt røret tilbake i cellekulturhetten og resuspender organoidene ved å pipettere opp og ned med en P1000 pipette 10 ganger.
MERK: Normalt krever intestinale organoider rundt 30 minutter for å danne en enkelt celle suspensjon når smittet i 3D. - For å avgjøre når organoider dissosieres til enkeltceller, ta 10 μL av den organoide suspensjonen ved hjelp av en p10 pipette.
- Plasser suspensjonen i en engangs plastcelletellersklie. Forsegle prøveinngangsporten med klart tape.
- Bytt hansker og rengjør utsiden av celletelleren. Bruk et brightfield-mikroskop for å avgjøre om en enkelt cellefjæring er laget.
- Etter bekreftelse av en enkelt celle suspensjon, stoppe fordøyelsen ved å legge til 1 ml DMEM / F12 media som inneholder 10% FBS og pipette opp og ned 10 ganger med en P1000 pipette.
- Bytt hansker, rengjør røret og snurr prøvene ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern forsiktig mediet/dissosiasjonsenzymet med en P1000 pipette for å unngå å resuspendere cellepelleten fra bunnen av røret.
- Resuspend enkeltcellene i et minimalt volum AV PBS som inneholder 0,1% BSA. For intestinale organoider resuspend i 250 μL.
- Før cellesuspensjonene inn i et FACS-rør med et filter for å fjerne store klumper og plassere FACS-røret som inneholder celler på is.
- Fortsett til trinn 4.6 for å fortsette med celletelling og forberedelse av hovedblandingen.
- Bestem antall celler per μL ved å legge til 10 μL av celleopphenget til et engangs plastcelletellingskammer.
- Forsegle prøveinngangsporten med klart tape før du fjerner prøven fra cellekulturhetten, som på dette stadiet er cellefjæringen fortsatt smittsom.
- Bytt hansker, rengjør celletellingskammeret og tell cellenummeret ved hjelp av et brightfield-mikroskop.
- Inne i cellekulturhetten forbereder du en hovedblanding av RT Reagens, Template Switch Oligo, Reduce Agent B og RT enzyme C i et 1,5 ml rør i henhold til produsentens instruksjoner, avhengig av antall prøver i eksperimentet. For hver prøve blandes aliquot 33,4 μL master i et PCR-rør og lagres på is.
- Tilsett cellene og vannet i hovedblandingen i henhold til målcellenummeret som beskrevet i produsentens instruksjoner.
MERK: 50% -60% av cellene gjenopprettes normalt (dvs. når du laster 10.000 celler på brikken, brukes 5.000-6.000 celler til analyse). Last derfor alltid inn 10 000 celler. Hvis celletettheten ikke tillater dette, sentrifugerer du cellene og bruker på nytt i et lavere volum. Pass på at du ikke overbelaster brikken, da dette vil føre til tilstopping av brikken. I tillegg, hvis celler ikke er riktig dissosiert, vil det være økt risiko for å få flere celler per per perle, som må fjernes i nedstrøms bioinformatikkbehandling. - Bytt hansker, flytt encellet kontroller inn i cellekulturhetten, og forbered brikken da brikken bare er dekket med en pakning som ikke er forseglet.
MERK: Maskinen må være inne i hetten for å forhindre eksponering for infiserte cellefjæringer og potensielle aerosoler. - Legg encellet brikke til brikkeholderen og fyll de ubrukte banene med 50% glyserol.
- Legg til hovedblandingen, perlene og partisjoneringsoljen i banene som brukes til prøver i henhold til produsentens instruksjoner.
- Dekk brikken med pakningen, last brikken inn i kontrolleren og start programmet.
MERK: Det anbefales å bare laste seks av de åtte kjørefeltene. Problemer med feil emulsjoner oppstår ofte i baner en og åtte. Selskapet sier at alle baner er uavhengige, og dette bør ikke skje; Men hvis det er mulig, unngå disse to banene og kjør to sjetonger hvis åtte prøver er nødvendig. - Etter ferdigstillelse av programmet, fjern brikken og pakningen.
- Bruk en flerkanals pipette og overfør 100 μL av emulsjonene til et rent PCR-rør. Forsikre deg om at hver brønn har en jevn hvit farge som indikerer at en fullstendig emulsjon har skjedd.
- Bytt hansker, rengjør rørene og overfør PCR-røret til en PCR-maskin som kan støtte 100 μL-reaksjoner. Kjør programmet: 53 °C i 45 minutter; 85 °C i 5 min.
- Når prøvene er fullført, oppbevar de ved 4 °C. På dette tidspunktet behandler du reaksjonen i henhold til produsentens instruksjoner eller lagrer ved 4 °C i 3 dager eller -20 °C i 1 uke.
- Etter 5 min ved 85 °C vil de fleste innkapslede virus bli inaktivert, fjerne cDNA fra BSL-3 i henhold til normal drift og utføre biblioteksforberedelsene i et BSL-1-laboratorium.
MERK: Dette eksperimentet må utføres som tre biologiske repliker (f.eks. på tre forskjellige dager) fordi omfanget av differensiering av hver celletype kan variere noe mellom hvert eksperiment. De resulterende sekvenseringsbibliotekene kan indekseres og sekvenseres sammen i én sekvenseringskjøring.
Representative Results
Fremstilling av organoider for sekvensering av enkeltceller
Enkeltcellede sekvenseringsresultater er svært avhengige av å bruke celler av god kvalitet. For å sikre at organoider er av god kvalitet, bør de vedlikeholdes og observeres på daglig basis for å bestemme når de er klare til å deles (figur 2). Tidspunktet for splitting av organoider er donoravhengig; Noen givere vokser raskere og må deles hver femte dag, mens andre er tregere og må deles hver 10. I gjennomsnitt deles organoider én gang i uken når sentrene blir mørke (Figur 2B). Hvis organoider får lov til å bli for store og akkumulere for mange døde celler i midten, vil organoiden dø.
Organoider opprettholdes i et medium som inneholder høye mengder Wnt3A. Dette støtter stamcellenisjen og fremmer organoidene for å fortsette å vokse og spre seg. Under disse vekstforholdene inneholder organoidene høye mengder stamceller og transittforsterkende celler og en lavere mengde differensierte cellepopulasjoner som modne enterocytter, begerceller og enterokendokrine celler. For å etterligne den cellulære kompleksiteten som finnes i tarmen, er det imidlertid viktig å presse celledifferensiering og produsere flere av disse cellene. Dette gjøres ved å endre medieforholdene og fjerne Wnt3A og redusere R-Spondin og Noggin (Tabell 1). Normalt krever cellulær differensiering mot enterocytter, begerceller og enterokendokrine celler 4 dager med differensieringsmedier (figur 3). Det er nøkkelen til å oppnå en god differensiering; Ellers vil evaluering av patogentropisme og celletypespesifikke responser bli vanskelig.
Bekreftelse av BSL-3 patogeninaktivering
Full inaktivering må bekreftes med det valgte patogenet og valideres at det er trygt å fjerne cDNA fra BSL-3. For SARS-CoV-2 ble full inaktivering av viruset validert ved å ta 100 μL SARS-CoV-2 og inkubere det i en PCR-maskin i 5 min ved 85 °C. Viruset ble deretter lagt tilbake til naive Vero-celler, og virusinfeksjon ble sammenlignet med ikke-varmebehandlet virus ved immunfluorescens og plakkanalyser ved 24 timer, 48 timer og 72 timer etter infeksjon for å sikre at alle partikler ikke lenger var smittsomme. Disse resultatene ble sendt til det lokale reguleringsorganet, og etter deres godkjenning ble enkeltcelleeksperimentet og cDNA-behandlingen utført.
Resultater av sekvensering i enkeltceller
For å evaluere hvordan SARS-CoV-2 infiserer human kolon og ileumorganoider, ble det utført encellet sekvensering. Organoider ble fremstilt som beskrevet ovenfor og smittet i et 2D-format for å tillate apikal infeksjon av SARS-CoV-2. Infiserte celler ble høstet ved 12 timer og 24 timer etter infeksjon og ble behandlet for encellet sekvensering som beskrevet ovenfor. Analyse av sekvenseringsdataene for enkeltceller tillot oss å fastslå at bare en subpopulation (umoden enterocytt 2) av humane intestinale epitelceller støttet infeksjonen av SARS-CoV-2 (Figur 4). I tillegg, da ikke alle celler i en populasjon ble infisert, ble både infiserte celler og ikke-infiserte tilskuerceller analysert (Figur 5). Disse resultatene viste at SARS-CoV-2 induserte et proinflammatorisk signalkaskade i infiserte celler, mens ikke-infiserte tilskuerceller viste en interferonmediert immunrespons. I tillegg viste scRNA-Seq at infiserte celler ikke kunne føle interferoner på grunn av virusmediert blokkering av banen (figur 5). Det var ikke mulig å hente denne informasjonen ved bruk av bulk RNA-sekvensering.
Figur 1: Skjematisk som skildrer de tre forskjellige metodene for å forberede humane tarmorganoider for infeksjon med enteriske patogener. Apikal infeksjon kan oppnås gjennom såing intestinale organoider i 2D. En apikal og basolateral infeksjon kan utføres ved å forstyrre 3D-organoiden. Til slutt kan en basolateral bare infeksjon utføres ved å infisere intakte 3D intestinale organoider. Hver av disse metodene kan brukes til å generere prøver for sekvensering av enkeltceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Organoid vedlikehold skjematisk og representativ brightfield bilder. (A) Skjematisk for vedlikehold og passaging av humane intestinale organoider. (B). Representative brightfield-bilder av dag 1, 3, 5 og 7 etter deling. På dag 7 blir organoidene store og mørke på grunn av opphopning av døde celler og er klare til å bli delt. Skalastang indikerer 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativ qPCR for humane tarmorganoider 4 dager etter bytte til differensieringsmedier. Intestinale organoider ble opprettholdt i vekstmedier eller byttet til differensieringsmedier i 4 dager. RNA ble høstet og qPCR ble utført for markører av stamceller (OLFM4), Paneth-celler (LYZ), Begerceller (MUC2) og enterocytter (SI). N = 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Identifikasjon av cellepopulasjonen som er infisert av SARS-CoV-2. Humane kolon- og ileumavledede organoider ble smittet med SARS-CoV-2. Etter 12 og 24 h post-infeksjon celler ble høstet og utsatt for encellet RNA sekvensering for å identifisere hvilke cellepopulasjoner som støttet SARS-CoV-2 infeksjon. Virusinfeksjon ble funnet å øke over tid og hovedsakelig infisere umoden enterocytt 2. Denne figuren er endret fra Triana et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bestemmelse av egenfødt medfødt immunrespons. Humane kolonavledede organoider ble smittet med SARS-CoV-2. Etter 12 og 24 h post-infeksjon celler ble høstet og utsatt for enkeltcellet RNA sekvensering for å bestemme den iboende medfødte immunresponsen i både viralt infiserte og ikke-infiserte tilskuerceller. SARS-CoV-2 infiserte celler viste en sterk proinflammatorisk respons mens ikke-infiserte tilskuerceller viste en interferonmediert respons. Figur endret fra Triana et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Vekstmedier | |
| Sammensatt | Endelig konsentrasjon |
| DMEM/F12 for annonse | GlutaMAX (1X) |
| +GlutaMAX | HEPES 1 mM |
| +HEPES | Penn 10 U/ml |
| +P/S | Strep 10 μg/ml |
| L-WRN | 50 % etter volum |
| B27 | 01:50 |
| N-acetyl-cystein | 1 mM |
| EGF | 50 ng/ml |
| A83-01 | 500 nM |
| IGF-1 | 100 ng/ml |
| FGF grunnleggende | 50 ng/ml |
| Gasstrin | 10 mM |
| Differensieringsmedier | |
| Sammensatt | Endelig konsentrasjon |
| DMEM/F12 for annonse | GlutaMAX (1x) |
| +GlutaMAX | HEPES 1 mM |
| +HEPES | Penn 10 U/ml |
| +P/S | Strep 10 μg/ml |
| B27 | 01:50 |
| N-acetyl-cystein | 1 mM |
| R-spondin | 5 % etter volum |
| Noggin | 50 ng/ml |
| EGF | 50 ng/ml |
| Gasstrin | 10 mM |
| A83-01 | 500 nM |
Tabell 1: Mediesammensetning for vekst- og differensieringsmedier.
Discussion
Enteriske patogener initierer oftest livssyklusen ved å infisere intestinale epitelceller fra deres apikale side vendt mot tarmens lumen. Mens organoider er godt anerkjent for å være en god modell for å reprodusere den cellulære kompleksiteten og organiseringen av tarmepitelet, gjør deres organisasjon som tredimensjonale, lukkede strukturer deres apikale membran utilgjengelig for patogenet. Denne protokollen beskrev metoder for å infisere intestinale organoider fra deres apikale side, deres basolaterale side, eller begge deler med BLS-3 patogener. Disse protokollene kan enkelt tilpasses for å studere ethvert enterisk patogen under BSL-2 eller BLS-3 inneslutning eller en annen organoidmodell ved å følge noen få kritiske trinn som er uthevet nedenfor. Metoden beskrevet ovenfor er for isolering og forberedelse av encellede dråper i samsvar med regelverket i Tyskland. Som ansvarsfraskrivelse beskriver ikke denne protokollen de biosikkerhetshåndteringstiltakene (standard driftsprosedyrer) som må tas under arbeid under BSL-3-forhold. Det er også viktig å insistere på at regelverket kan variere i andre land og at kommunene må kontaktes for å sikre at alle lokale forskrifter blir respektert.
Et av de kritiske trinnene i såing organoider i to dimensjoner for apikal infeksjon er å kontrollere at celler vil tilsvarende skille sammenlignet med når de vokser som klassiske tredimensjonale organoider. Avhengig av det enteriske patogenet, kan tropisme begrenses til svært sjeldne celler eller til celler som må være svært differensiert. I dette tilfellet kan bruk av en todimensjonal organoid som ikke helt differensierer, føre til feilslutning om at dette enteriske patogenet ikke kan infisere tarmorganoider. Det foreslås, om mulig, å utføre infeksjoner ved hjelp av de tre konfigurasjonene av denne protokollen: 2D organoid kun for apikal infeksjon (avsnitt 2), sprakk åpne 3D-organoider for apikal og basolateral infeksjon (avsnitt 3), og bare fulle 3D-organoider for basolateral infeksjon (avsnitt 3). Denne tilnærmingen vil bidra til å skjelne inngangsruten til patogenet (apikalt vs. basolateralt) og vil også kontrollere at et lignende nivå av differensiering er oppnådd. Et alternativ for 2D apikal infeksjon er mikroinjeksjon, som vil bruke en 3D organoid, men levere patogenet direkte inn i den apikale siden (se Bartfeld et al.27 for detaljer). Denne metoden krever en dyktig injektor for å sikre at patogenet er riktig plassert, og organoidene forblir intakte. Mikroinjeksjon brukes ofte i BSL-2-inneslutning og er kanskje ikke egnet for BSL-3-inneslutning.
En annen viktig vurdering når du utfører infeksjonsforsøk i 2D-frøorganoider er den endelige celletettheten. Som nevnt i trinn 2.3, vil 100-150 organoider bli sådd i en brønn av en 48-brønns plate eller en brønn av en 8-brønns glassbunnkammersklie. Avhengig av organoidlinjen og på personen som håndterer organoidene, kan størrelsen på disse organoidene være betydelig forskjellig. Dette kan resultere i svært forskjellige celletettheter i 48-brønnsplaten eller 8-brønns glassbunnkammersklie. Avhengig av enterisk virus, foretrekker noen virus mer sparsomme celler, mens andre også vil kunne infisere konfluente celler. Den molekylære opprinnelsen til slike forskjeller i infektivitet for forskjellige cellesamfluenser er ikke klart; Derfor bør pilotforsøk som tar sikte på å finne den beste celletettheten for det enteriske patogenet som er valgt, utføres før du utfører ytterligere nedstrøms karakterisering.
Ofte utføres FACS-sortering før du utfører encellet dråpeemulsjon. Dette trinnet brukes ofte til å skille død fra levende celler og enkeltceller fra dobler. Når du arbeider med BSL-3 patogener, krever det at anlegget er utstyrt med en passende FACS-sortering, noe som ikke ofte er tilfelle. Videre har ikke alle celler i en organoid samme størrelse, og det er ofte vanskelig å diskriminere mellom en dobbelt eller en større celle, og dermed forårsake risiko for negativ merking mot en bestemt celletype. Det er også fortsatt diskusjon i feltet om tiden det tar å sortere mellom 5.000-10.000 for hvert utvalg kan føre til en betydelig endring av transkripsjonsprofilen til de enkelte cellene. Mens cellefikseringsmetoder som er kompatible med encellet sekvensering (f.eks. metanol og RNAassist) er beskrevet, ble det observert at dette fører til en reduksjon i kvaliteten på sekvensering18. Til slutt mistenkes det at sortering av celler ved hjelp av celledødsmarkører også kan føre til en skjevhet. Gitt retningsmessig spredning og differensiering av cellene gjennom krypt-villi-aksen, er de mest differensierte cellene, som skal kastes og frigjøres, plassert på spissen av villi. Disse cellene er ofte positive for forskjellige markører av celledødsveier(f.eks. apoptose, nekrose og nekrose); Men når du ser på rotavirusinfeksjon i musens tarm, er spissen av villi det mest infiserte området28. Dermed vil filtrering av celler som kan se positive ut for dødsmarkører resultere i et negativt utvalg av de infiserte cellene som kan representere den fysiologiske infeksjonen. For tiden er det ingen god løsning for sortering og festing av organoider før encellet sekvensering. Bruk av levende, usorterte celler anbefales ettersom ytterligere studier er nødvendig for å finne passende alternative protokoller.
Sekvensering med én celle har revolusjonert hvordan cellulære svar kan evalueres. Denne teknikken gjør det mulig å identifisere cellelinjespesifikke responser både under basale forhold og under patogeninfeksjoner. Denne metoden har åpnet dører i mange felt som tidligere var begrenset av masseavlesninger. Selv om denne metoden er veldig kraftig, har den sine begrensninger. En viktig begrensning er den omfattende bioinformatiske analysen som kreves nedstrøms for sekvenseringen. Dette er spesielt viktig når du analyserer vev og tilordner celletyper der det for øyeblikket ikke er noen merknad. Å ha en dyktig bioinformatiker er nødvendig for å støtte alle encellede studier.
Denne protokollen beskriver hvordan man sår og håndterer humane tarmorganoider, smitter dem med enteriske patogener og utfører scRNAseq. Tilpasning av denne tilnærmingen til andre organer er nå mulig, da organoide modellsystemer er utviklet for de fleste organer. Lunge- og leverorganoider er tilsvarende organisert sammenlignet med intestinale organoider, og som sådan kan bruk av en analog tilnærming transponeres til disse organoidene. Den kritiske kontrollen vil være å validere at når de vokser i to dimensjoner eller sprakk åpne, oppnår disse organoidene lignende differensiering som deres 3D-organoide kolleger. De spesifikke egenskapene og genene som definerer en differensiert status, er spesifikke for hver organmodell. Andre organoidmodeller som nyre- og vaskulære organoider, store tette strukturer, vil trenge flere metoder for å seriell dissosiere disse strukturene i enkeltceller.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Megan Stanifer og Steeve Boulant ble støttet av forskningsstipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Prosjektnummer 240245660, 278001972, 415089553 og 272983813 til Steeve Boulant og 416072091 til Megan Stanifer), delstaten Baden-Wuerttemberg og Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B til MS og 01KI20198A og (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) til SB. Skjemaer ble opprettet i BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
| 24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
| 8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
| A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
| B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
| CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
| CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
| DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
| Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
| Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
| GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
| HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
| L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
| MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
| MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
| MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
| N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
| OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
| OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
| Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
| Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
| Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
| SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
| SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
| TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
| Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |
References
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection. Cells. 9, (2020).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. Human norovirus transmission and evolution in a changing world. Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).
- Leshem, E., et al. Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, Suppl 2 155-160 (2016).
- Karst, S. M. The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353, 1387-1393 (2016).
- de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).
- Scaldaferri, F., et al. The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications. Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).
- Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test. Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369, 50-54 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells. Cell Reports. 32, 107863 (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. bioRxiv. , (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Molecular Systems Biology. 17, 10232 (2021).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).
- García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection. Viruses. 12, 1288 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells. Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).
- Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478 (2019).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483 (2015).
- Fujii, M., et al. Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359 (2015).
- Hernandez, P. P., et al. Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection. Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).
