Summary
Этот протокол описывает, как заразить органоиды кишечника человека с их апикальной или базолатеральной стороны, чтобы охарактеризовать взаимодействия хозяина / патогена на уровне одной клетки с использованием технологии секвенирования одноклеточной РНК (scRNAseq).
Abstract
Органоиды кишечника человека представляют собой лучшую клеточную модель для изучения патогенных инфекций желудочно-кишечного тракта. Эти органоиды могут быть получены из всех отделов желудочно-кишечного тракта (желудочный, тощий кишечник, двенадцатиперстная кишка, подвздошная кишка, толстая кишка, прямая кишка) и, при дифференцировке, содержат большинство типов клеток, которые естественным образом встречаются в каждом отдельном отделе. Например, кишечные органоиды содержат поглощающие питательные вещества энтероциты, секреторные клетки (Goblet, Paneth и энтероэндокрин), стволовые клетки, а также все специфические для линии промежуточные дифференцировки (например, ранние или незрелые типы клеток). Наибольшим преимуществом использования органоидов желудочно-кишечного тракта для изучения инфекционных заболеваний является возможность точно определить, на какой тип клеток нацелен кишечный патоген, и решить, одинаково ли различные участки желудочно-кишечного тракта и их конкретные типы клеток реагируют на проблемы патогенов. За последние годы для изучения вирусного тропизма и механизмов патогенеза были использованы модели желудочно-кишечного тракта, а также органоиды из других тканей. Однако использование всех преимуществ использования органоидов при использовании высокопатогенных вирусов представляет собой техническую проблему и требует строгих соображений биобезопасности. Кроме того, поскольку органоиды часто выращиваются в трех измерениях, базолатеральная сторона клеток обращена к внешней стороне органоида, в то время как их апикальная сторона обращена к внутренней (просвету) органоидов. Эта организация представляет собой проблему для кишечных патогенов, поскольку многие кишечные инфекции инициируются с апикальной / просветной стороны клеток после приема внутрь. Следующая рукопись предоставит комплексный протокол для подготовки кишечных органоидов человека к инфекции кишечными патогенами путем рассмотрения стороны инфекции (апикальной и базолатеральной) для выполнения секвенирования одноклеточной РНК для характеристики взаимодействия хозяина / патогена, специфичного для клеточного типа. Этот метод детализирует подготовку органоидов, а также соображения, необходимые для выполнения этой работы в условиях сдерживания уровня биобезопасности 3 (BSL-3).
Introduction
Изучение клеточного тип-специфического тропизма и клеточного тип-специфического иммунного ответа на кишечные вирусы человека было исторически сложным из-за отсутствия первичных клеточных моделей человека. Это ограничение в настоящее время частично устранено с развитием органоидов1. В случае желудочно-кишечного тракта были разработаны желудочные и кишечные органоидные модели для человека и ряда других видов (например,мыши, крупного рогатого скота, кошки, летучих мышей)2,3,4,5,6. Кишечные органоиды воспроизводят структурную архитектуру кишечного эпителия человека и содержат криптообразные и ворсинчатые структуры, функциональные кишечные линии и даже использовались для идентификации ранее неизвестных клеточных линий. Два разных подхода могут быть использованы для выращивания кишечных органоидов. Во-первых, кишечные стволовые клетки, содержащие крипты, выделяют из тканевых резекций или биопсий и выращивают в определенных условиях культивирования (например, Wnt3A, R-спондин, Ноггин и EGF) для расширения, а затем дифференцируют стволовые клетки к большинству клеточных линий кишечника(например, энтероциты, клетки Панета, клетки Кубка, энтероэндокринные клетки)7. Этот метод позволяет выделить органоиды из всех отделов желудочно-кишечноготракта (например, желудка, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки и толстой кишки). Второй способ опирается на индуцированные человеком плюрипотентные или эмбриональные стволовые клетки, которые затем дифференцируются в ступенчатом процессе в эпителиальные клетки кишечника8. Эти индуцированные органоиды на основе стволовых клеток часто описываются как более эмбриональные по своей природе по сравнению с органоидами, полученными от пациентов. Хотя все эти органоидные модели имеют решающее значение для разгадки сигналов развития, необходимых для формирования кишечного тракта, их использование в исследованиях инфекционных заболеваний все еще находится в зачаточном состоянии.
Кишечный вирус - это широкий термин, охватывающий все вирусы, которые заражаются через желудочно-кишечный тракт, такие как пикорнавирусы(например,EV-71), реовирусы (например, ротавирус) и калицивирусы (например, норовирус)9. Энтеросолюбильные вирусы инициируют свой инфекционный жизненный цикл через проглатывание зараженной пищи и воды, что подвергает людей в развивающихся странах высокому риску из-за сброса необработанных отходов в окружающую среду и отсутствия медицинской помощи после начала инфекции10. В зависимости от типа патогена, инфекция может привести к гастроэнтериту, рвоте и / или водянистой диарее из-за утечки кишечной оболочки. Норовирусы человека являются широко распространенным и высокоинфекционным кишечным патогеном, который приводит к более чем 600 миллионам инфекций и 15 миллионам госпитализаций во всем мире11. Органоиды были ключом к исследованиям норовируса, поскольку они поддерживают инфекцию и репликацию норовируса человека, который ранее нельзя было культивировать в стандартных моделях клеточных культур12.
За последние два десятилетия коронавирусы стали ключевыми патогенами человека13. Это семейство включает высокопатогенные БВРС, SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2, которые требуют строгого уровня безопасности при проведении исследований этих вирусов. Интересно, что, хотя все три из этих патогенов в основном признаны за их индуцированные респираторные симптомы и дистресс, теперь очевидно, что эти вирусы заражают не только дыхательные пути, но и другие органы. Важной патологией, индуцированной у пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, помимо респираторного дистресса, является наличие желудочно-кишечных симптомов14. У части пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, проявляются такие симптомы, начиная от очень легкой до тяжелой диареи. Кроме того, геномы SARS-CoV-2 могут быть обнаружены в биопсии стула и желудочно-кишечного тракта инфицированных пациентов15. Важно отметить, что наличие желудочно-кишечных симптомов не ограничивается SARS-CoV-2, поскольку они также наблюдались у пациентов, инфицированных БВРС и SARS-CoV-1. Чтобы понять, как SARS-CoV-2 вызывает желудочно-кишечный дистресс и точно определить тропизм SARS-CoV-2 в желудочно-кишечном тракте, органоиды кишечника человека были ключевым инструментом и в настоящее время используются для разгадки специфических для типа клеток реакций на этот патоген16,17.
Транскрипционное профилирование клеточной популяции (объемное секвенирование РНК) было стандартной практикой при оценке патогенных инфекций как увековеченных клеточных линий, так и с органоидами. Хотя это позволяет нам определять глобальные изменения в ответ на патогены (например, повышение регуляции цитокинов), объемный RNAseq не позволяет нам определить, почему конкретные клетки в популяции более склонны к инфекции, чем другие. Секвенирование одноклеточной РНК (scRNAseq) стало мощным инструментом для разгадки транскрипционных программ клеточной линии и может быть использовано для определения того, как эти программы поддерживают или подавляют вирусную инфекцию18,19. Первое описание scRNAseq было в 2009 году и использовалось для оценки профилей транскрипции различных клеток, обнаруженных в мышином бластомере20. Эти технологии в настоящее время расширены и могут быть реализованы через несколько различных платформ. Ранние версии этой технологии применяли флуоресцентно-активированный сортировщик клеток (FACS) для разделения отдельных ячеек для секвенирования, которое часто ограничивалось пластинами с 96 или 384 лунками, тем самым давая 300 отдельных ячеек для анализа на образец21. Эти методы в настоящее время были усовершенствованы платформами секвенирования с одной ячейкой, которые используют микрофлюидное устройство для инкапсуляции отдельных клеток в отдельные капли со штрих-кодом, содержащим шарики. Эта технология позволяет захватывать до 10 000 клеток на каждое условие образца.
Сочетание технологии органоидов с scRNAseq позволяет нам изучить, как кишечные патогены влияют на желудочно-кишечный тракт специфическим для типа клеток образом. Вместе с тем необходимо учесть ряд технических соображений и соображений биобезопасности. В первую очередь, классические методы культивирования органоидов (3-мерные (3D) органоиды, встроенные во внеклеточный матрикс (ECM)) подвергают базолатеральную сторону эпителиальных клеток внешней стороне органоида. Поскольку кишечные патогены инициируют свою инфекцию через прием загрязненной пищи / воды, инфекция чаще всего инициируется с апикальной стороны клеток, которая недоступна в этих 3D-органоидах кишечника. Поэтому органоиды должны быть подготовлены к тому, чтобы сделать апикальную сторону доступной для патогенной инфекции либо через 2D-посев, тем самым непосредственно обнажая апикальную сторону клеток, либо через микроинъекцию22,23. Во-вторых, для выполнения scRNAseq инфицированных биологических образцов важно учитывать их инфекционную природу. Хотя были предложены методы фиксации клеток и инактивации патогенов до выделения одной клетки для последующего RNAseq, эти методы часто приводят к снижению качества секвенирования18. В приведенном ниже протоколе будет описано несколько подходов к заражению кишечных органоидов кишечными вирусами с учетом инфекционной стороны (апикальная и базолатеральная инфекция)(рисунок 1). Кроме того, протокол будет включать в себя рабочий процесс для диссоциации и изоляции отдельных клеток от органоидов, инфицированных высокопатогенными вирусами для scRNAseq. В протоколе будут освещены ключевые шаги, которые необходимо осуществить при работе в условиях сдерживания уровня биобезопасности 3 (BSL-3), чтобы избежать образования аэрозолей и потенциального загрязнения.
Protocol
Человеческая ткань была получена из резекции толстой кишки или биопсии подвздошной кишки из университетской клиники Гейдельберга по следующему протоколу. Данное исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Университетской клиники Гейдельберга с информированного письменного согласия всех испытуемых в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все образцы были получены и сохранены в анонимной манере. Протокол был утвержден комиссией по этике университетской клиники Гейдельберга по протоколу S-443/2017.
1. Поддержание и пассаж органоидов кишечника и толстой кишки
ВНИМАНИЕ: Органоиды кишечника человека получены из тканей человека или из индуцированных плюрипотентных / эмбриональных стволовых клеток, и поэтому требуется этическое одобрение. Необходимо соблюдать правила, касающиеся конкретных стран. Человеческий материал, как правило, не тестируется и поэтому часто считается материалом BSL-2. Надлежащие условия локализации должны быть подтверждены в стране, в которой проводится эксперимент.
- Получают органоиды кишечника и толстой кишки из изолированных тканей и/или биопсии с использованием ранее описанных способов2. Кроме того, более подробную техническую информацию о том, как получать органоиды из материала, полученного от пациента, или из iPSCs, можно найти в Lees et al. и Mahe et al.24,25.
- Как только органоидные культуры установлены, следуйте описанной ниже процедуре расщепления, чтобы подготовить органоиды для выполнения инфекций с кишечными патогенами.
- Семена 20-100 органоидов в 50 мкл 100% раствора ECM в 24-луночных нетканных обработанных культурой пластинах. Добавьте 500 мкл питательной среды(таблица 1)на лунку.
- Меняйте носитель каждые 2 дня, удаляя 250 мкл старой среды и добавляя 250 мкл свежих питательных сред в каждую лунку. Прогрейте среду до комнатной температуры перед заменой среды.
ВНИМАНИЕ: Холодные среды будут разжижать раствор ECM, содержащий органоиды. - Прохождение органоидов раз в неделю, когда внутренняя часть начинает темнеть из-за скопления отмерших клеток. Пример этого можно найти на рисунке 2.
- В день расщепления удалите раствор ECM от -20 °C и разморозьте на льду.
- Поместите новую пластину для посева пустых клеток, которая будет использоваться для посева органоидов после расщепления при 37 °C (для этого требуется минимум 1 час, чтобы быть теплым и может быть нагрета в течение ночи). Прогрейте питательные среды до комнатной температуры.
- Удалите питательную среду пипеткой P1000 и добавьте 500 мкл холодного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в каждую лунку в течение 3 мин, чтобы частично разжижать раствор ECM и диссоциировать от пластины.
- Чтобы обеспечить полное нарушение работы ECM-решения, используйте пипетку P1000 (установленную на 450 мкл). Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы повторно суспендировать PBS, раствор ECM и органоиды, перенести повторно суспендированные органоиды в коническую трубку объемом 15 мл и поместить их на лед.
- Соберите несколько лунок одних и тех же органоидов в одну коническую трубку.
- Если несколько разных органоидов (разные доноры, разные участки, разное предварительное лечение и т.д.) расщепляются одновременно, соберите их в разные конические трубки. Во время сбора поддерживайте конические трубки на льду.
- Вращайте образцы при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно удалите PBS пипеткой, чтобы сохранить органоидную гранулу на дне.
- Избегайте использования вакуумной системы отходов со встроенной пипеткой, так как гранулы органоидов очень рыхлые и могут быть легко аспирированы при слишком быстром удалении PBS.
- Добавьте 1 мл 0,05% трипсина в коническую трубку и повторно суспендируйте органоиды, пипеткой вверх и вниз 10 раз пипеткой P1000. Инкубируют коническую трубку, содержащую органоиды при 37 °C, в течение 3 мин.
- Добавьте 2 мл среды DMEM/F12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина, чтобы остановить пищеварение и повторно суспендировать, чтобы разрушить органоиды путем пипетки вверх и вниз 10 раз пипеткой P1000.
- Вращайте образцы при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Извлеките конические трубки из центрифуги и храните их на льду.
- Осторожно удалите среду / трипсин с помощью одноразовой пипетки 5 мл, чтобы сохранить органоидную гранулу на дне. Оставьте около 500 мкл носителя и удалите его с помощью пипетки P1000.
- После того, как среда/трипсин были удалены из всех конических трубок, удалите 24-луночную пластину, обработанную неклеточной культурой, из инкубатора с температурой 37 °C и поместите ее под капот клеточной культуры.
- Добавьте 100% раствор ECM (хранящийся на льду) в коническую трубку с расщепленными органоидами в соотношении от 1:3 до 1:5 в зависимости от привычек роста отдельных донорских органоидов. (Например, если была пропущена одна скважина, содержащая 20-100 органоидов в 50 мкл капли раствора ECM, повторно суспендировать органоидную гранулу в 150-250 мкл ледяного раствора ECM.)
- Семена 50 мкл раствора ECM/органоидной смеси на лунку 24-луночной неклеточной обработанной культурой пластины, предварительно нагретой до 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ECM будет полимеризоваться очень быстро после нагревания. Держите раствор ECM холодным в любое время (хранится на льду) во время использования. Когда органоиды будут повторно суспендированы, сразу же посейте на новую пластину. Для новичков рекомендуется хранить коробку с наконечниками пипеток при -20 °C, чтобы дать дополнительное время для посева. - Инкубируйте 24-луночную пластину при 37 °C в течение 10-15 мин, чтобы дать раствору ECM полимеризоваться.
- После полимеризации добавляют 500 мкл питательной среды(таблица 1)26 к каждой лунке и инкубируют органоиды при 37 °C. Ежедневно проверяйте органоиды с помощью микроскопии. Меняйте носитель каждые 2 дня, как показано в шаге 1.4.
2. Подготовка органоидов в двух измерениях (2D) к апикальной инфекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол будет описывать, как засеять кишечные органоиды в качестве монослоя клеток в пластине клеточной культуры для заражения клеток эпителия кишечника с их апикальной стороны. Используйте 48-луночную пластину для экспериментов по секвенированию и слайд камеры со стеклянным дном из 8 скважин для борьбы с инфекцией с использованием иммунофлуоресцентных подходов.
- Выращивайте и поддерживайте органоиды, как описано в разделе 1.
- Перед посевом органоидов в 2D покройте 48-луночные пластины и 8-луночную стеклянную нижнюю камеру 200 мкл 2,5% человеческого коллагена в воде на скважину в течение 1 ч при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кишечные органоиды лучше всего разменять в 48-луночных пластинах и в 8-луночной камере со стеклянным дном. Опыт показал, что они плохо заражаются в 96-луночных пластинах. Трансвелл-вставки также могут быть использованы для устранения как апикальной, так и базолатеральной инфекции в 2D. Если используются трансвеллы, контролируйте трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) до заражения, чтобы подтвердить сливающийся монослой. В норме кишечные органоиды имеют плотный барьер с TEER 450-600Ом/см2. - Посейте 100-150 органоидов в каждую скважину из 48-луночной пластины или в одну лунку из 8-луночной камеры со стеклянным дном.
- Чтобы оценить количество органоидов, подсчитайте количество органоидов, присутствующих в 50 мкл раствора ECM капли 24-луночной пластины, приготовленной в разделе 1. В среднем необходимо 1-2 скважины, которые дадут примерно 15 000-30 000 клеток.
- Чтобы нарушить работу раствора ECM и трипсинизировать органоиды, выполните шаги 1.8-1.17.
- Удалите человеческий коллаген с 48-луночных пластин и слайда камеры со стеклянным дном из 8 лунок.
- Повторно суспендировать органоидную гранулу в конической трубке в 250 мкл питательной среды/лунку и добавить смесь в колодцы, покрытые коллагеном. Поместите пластину в инкубатор при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении экспериментов сравниваются множественные состояния (имитация и инфицированное +/- лечение, представляющее интерес). Чтобы свести к минимуму изменчивость между каждой лункой 2D-засеянных органоидов, соберите общее количество необходимых органоидов в одной конической трубке. При сборе органоидов из 12 лунок 24-луночной пластины можно использовать 1 мл трипсина и 2 мл нейтрализующей среды. При использовании 12-24 скважин увеличьте это до 2 мл трипсина и 4 мл нейтрализующих сред. - Через 48 ч снимите пластину с инкубатора и поместите ее в вытяжку для культивирования клеток. Удалить питательную среду и заменить ее 250 мкл на лунку дифференцировочной среды(табл. 1). Повторите это изменение носителя через 48 часов.
- Через 48 ч подтвердить дифференцировку (через четыре дня после перехода на дифференцировочные среды) путем извлечения РНК, получения кДНК с 250 нг РНК и выполнения qPCR на основе SYBR на зеленой основе с использованием праймеров для стволовых клеток (OLFM4 и / или SMOC2), бокаловидных клеток (MUC2), энтероэндокринных клеток (CHGA) и энтероцитов (SI и / или CYP3A4)(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: При переходе от питательной среды к дифференцировочным средам органоиды уменьшат экспрессию маркеров стволовых клеток (OLFM4 и/или SMOC2) и увеличат экспрессию бокаловидных клеток (MUC2), энтероэндокринных клеток (CHGA) и энтероцитов (SI и/или CYP3A4) маркеров qPCR. Подготовьте дополнительный колодец и поддерживайте с помощью питательных сред, чтобы сравнить уровень экспрессии каждого маркера, специфичного для типа клетки, в среде роста и дифференцировки. - При подтверждении дифференцировки органоиды готовы к апикальному инфицированию. Переместите органоиды на уровень биобезопасности, необходимый для патогена выбора.
ВНИМАНИЕ: Обратитесь к местным правилам института и стандартным рабочим процедурам при обращении с патогенами в изоляции BSL-2 или BSL-3. - Для заражения кишечных органоидов, выращенных в 2D, с их апикальной стороны удаляют среду пипеткой Р1000 и добавляют патоген, разбавленный при кратности инфекции, необходимой для эксперимента, в дифференцирующих средах (минимальный объем смеси патоген/среда составляет 50 мкл на лунку, а максимальный объем - 250 мкл на лунку).
- Дайте инфекции продолжаться в течение 2 ч при 37 °C либо с коромыслом, расположенным в инкубаторе клеточной культуры, либо вручную раскачивая пластину каждые 15-20 минут. Оптимизируйте это время в зависимости от выбранного патогена.
- Через 2 ч удалите носитель пипеткой P1000 и замените его 250 мкл на лунку свежей дифференцирующей среды. Инкубировать клетки при 37 °C до точки времени секвенирования одиночных клеток.
- Чтобы подготовить клетки к секвенированию одиночных клеток, перейдите к разделу 4.
3. Подготовка органоидов в трехмерном виде (3D) для апикальной и базолатеральной инфекции
- Выращивайте органоиды, как описано в разделе 1, в 24 лунке, обработанной неклеточной культурой пластине.
- Через два дня после прохождения извлеките пластину из инкубатора и поместите в вытяжку для культивирования клеток.
- Удалите питательную среду пипеткой P1000, замените ее 500 мкл/лунку дифференциационной среды, предварительно нагретой до комнатной температуры, и поместите пластину в инкубатор при температуре 37 °C.
- Через 48 ч заменить свежими дифференцирующими средами (500 мкл/лунка).
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды поддерживаются в дифференцирующих средах в общей сложности за 4 дня до заражения. - Подтвердите дифференциацию, как описано в шаге 2.9.
- После подтверждения того, что дифференциация произошла, органоиды готовы к заражению.
- Оттаивание ECM на льду. Нагрейте дифференциаторную среду до комнатной температуры и прогрейте 24-луночную пластину при 37 °C.
- Для выполнения инфекций удаляют органоиды из раствора ECM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите как можно больше раствора ECM, так как вирусы предпочитают придерживаться раствора ECM, а не клеток. Если вокруг органоидов остается слишком много раствора ECM, то инфекционность будет серьезно затронута. - Нарушайте ECM, добавляя 500 мкл холодного 1x PBS и инкубируя в течение 3 минут. Используйте P1000 для пипетки вверх и вниз в 10 раз. Органоиды соединить в пробирке и центрифуге по 500 х г в течение 5 мин. Удалите PBS с помощью P1000.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму изменчивость между каждым инфекционным состоянием, объедините органоиды, поступающие из нескольких скважин 24-луночной пластины, в одну коническую трубу. Например, если требуется восемь условий для заражения, восемь скважин из 24-луночной пластины (содержащей ~ 100 органоидов каждая) будут объединены и впоследствии разделены на восемь скважин новой 24-луночной пластины после разрушения иглой (см. шаг 3.12). - Повторное суспендирование органоидов в 1 мл дифференцирующих сред. Для апикальной и базолатеральной инфекции следуйте шагу 3.10.1, а для базолатеральной инфекции следуйте только шагу 3.10.2.
- Прикрепите иглу весом 27 г к шприцу объемом 1 мл и повторно суспендируйте гранулу шесть раз, чтобы обеспечить нарушение работ органоидов и инфекцию как на апикальной, так и на базолатеральной сторонах. Перейдите к шагу 3.11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды должны быть классическими органоидами, похожими на кисты и осьминогом, с темным центром, когда они наблюдаются до разрушения иглы. После разрушения эти органоиды будут казаться меньше с меньшим или нулевым темным интерьером. При выполнении инфекции всегда будет минимум два условия (имитация и инфекция), минимум две скважины из 24-луночной пластины будут первоначально объединены в коническую трубку объемом 15 мл для разрушения на основе иглы (объясняя, почему для повторного суспендирования используется минимум 1 мл). При выполнении более двух условий объединяют до 10 скважин 24-луночной пластины в одну коническую трубку объемом 15 мл и повторно суспендируют в 1 мл дифференцировочной среды для разрушения иглы. После разрушения добавьте 500 мкл дифференцировочной среды на n + 1 (например, если используется 10 скважин, то доливайте 4,5 мл, чтобы получить 5,5 мл всего). Если требуется более 10 условий, используйте несколько конических трубок. Рекомендуется шприц объемом 1 мл, так как органоиды лучше разрушаются с этим объемом шприца. Альтернативой шприцу является использование хорошо сплющенного наконечника P1000. - Повторное суспендирование органоидов в 500 мкл дифференцировочных сред на лунку. Будьте осторожны, чтобы не нарушить органоиды и убедиться, что апикальная сторона недоступна. Перейдите к шагу 3.11.
- Прикрепите иглу весом 27 г к шприцу объемом 1 мл и повторно суспендируйте гранулу шесть раз, чтобы обеспечить нарушение работ органоидов и инфекцию как на апикальной, так и на базолатеральной сторонах. Перейдите к шагу 3.11.
- Перенесите 500 мкл органоидных суспензий на скважину на 24-луночную пластину для культивирования клеток с помощью пипетки P1000 и переместите пластину на уровень биобезопасности, необходимый для патогена выбора.
ВНИМАНИЕ: Обратитесь к местным правилам и стандартным рабочим процедурам института при обращении с патогенами в изоляции BSL-2 или BSL-3. Всегда выполняйте разрушение иглой органоидов вне BSL-3, чтобы избежать потенциальных несчастных случаев с иглой. Местные правила могут также препятствовать использованию игл в BSL-3. - Добавьте патоген, разбавленный в дифференцировочных средах, чтобы достичь множественности инфекции, необходимой для эксперимента. Не превышать общий объем 500 мкл (иметь 1 мл всего в 24-луночной плите).
- Дайте инфекции продолжаться в течение 2 ч (это время нужно будет адаптировать к патогену по выбору) при 37 °C либо с коромыслом, расположенным в инкубаторе клеточной культуры, либо вручную раскачивая пластину каждые 15-20 минут.
- После 2-часовой инкубации соберите органоиды в одну трубку объемом 1,5 мл для каждого условия и вращайте при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите среду, содержащую патоген, пипеткой P1000 и храните ее на льду. Вымойте гранулы органоидов один раз с PBS.
- Повторно суспендируют органоиды в 50 мкл 100% раствора ECM (который ранее размораживали на льду), пластину в 24-луночную неклеточную обработанную культурой пластину предварительно нагреют до 37 °C и инкубируют 24-луночную пластину при 37 °C в течение 10-15 мин, чтобы позволить раствору ECM полимеризоваться.
- После полимеризации добавляют 500 мкл дифференцировочной среды при комнатной температуре в каждую лунку и инкубируют при 37 °C до сбора урожая для секвенирования одной клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сбор урожая должен происходить более 48 часов после посева, меняйте носитель каждые 2 дня, удаляя старый носитель и заменяя его 500 мкл свежих дифференцирующих сред. Однако опыт показал, что, поскольку органоиды выращиваются под дифференцировочными средами, они не выживают намного дольше 48 ч.
4. Приготовление одноклеточного раствора и приготовление гелевых шариков в эмульсии (ГЭМ) в условиях уровня биобезопасности 3 (BSL-3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения следующих этапов необходимо, чтобы внутри установки BSL-3 присутствовали оборудование для секвенирования однойклетки (Таблица материалов)и машина ПЦР, способная обрабатывать реакции 100 мкл. Органоиды выращивают, как описано в разделе 1, и заражают, как описано в разделах 2-3, в зависимости от патогена и пути проникновения. В заранее определенное время после заражения органоиды извлекаются. Ниже описан метод, используемый для извлечения кишечных органоидов.
- Перед извлечением инфицированных органоидов удалите шарики одноклеточного геля(Таблица материалов)от -80 °C и прогрейте до комнатной температуры (не менее чем за 30 мин до этого).
- Кроме того, уравновешивайте реагент RT, восстановитель B и фермент RT C (все они хранятся при -20 °C) до комнатной температуры. Повторное суспендирование шаблона переключателя олиго, как описано в инструкции производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги должны быть выполнены в отношении местных правил биобезопасности в соответствии с установленной стандартной операционной процедурой для рассматриваемого патогена. Как правило, для работы BSL-3 необходимо обеспечить надлежащую дезинфекцию внешней стороны всех сосудов (пластин, трубок и т. Д.), Выходящих из вытяжки клеточной культуры. То же самое относится и к рукам/перчаткам человека, проводящего эксперименты. - Для выполнения инфекций на органоидах, посеянных в 2D (раздел 2), перейдите к шагу 4.4. Для выполнения инфекций на 3D органоидах (раздел 3) перейдите к разделам 4.5.
- При инфекциях 2D-органоидов внесите пластину клеточной культуры в капот и удалите дифференцирующую среду с помощью пипетки P1000.
- Добавьте 250 мкл 1x PBS при комнатной температуре в каждую лунку.
- Удалите PBS с помощью пипетки P1000 и добавьте 250 мкл фермента диссоциации комнатной температуры (например, TrypLE Express) в каждую лунку 48-луночной пластины. Смените перчатки, очистите пластину и поместите пластину с ферментом диссоциации в инкубатор с температурой 37 °C.
- Наблюдают диссоциацию клеток с помощью микроскопии каждые 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно, требуется 15 минут, чтобы диссоциировать кишечные органоиды, культивируемые в 2D, в отдельные клетки. Это время необходимо будет скорректировать, так как оно будет зависеть от того, сколько органоидов было первоначально посеяно и инфицировано, а также от патогена, поскольку некоторые патогены являются более цитопатическими и заставляют органоиды диссоциировать намного быстрее, чем другие. - После подтверждения очевидной одноклеточной суспензии верните пластину обратно в вытяжку клеточной культуры и остановите пищеварение путем добавления 250 мкл среды DMEM/F12, содержащей 10% FBS на лунку 48-луночной пластины.
- Соберите клетки в коническую трубку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000.
- Смените перчатки, очистите трубку и раскрутите образцы при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Осторожно удалите среду / фермент диссоциации с помощью P1000 для поддержания клеточной гранулы на дне. Повторное суспендирование одиночных клеток в минимальном объеме PBS, содержащем 0,1% BSA. Для кишечных органоидов повторно суспендировать в 250 мкл на каждую лунку 48-луночной пластины.
- Передайте суспензии клеток в трубку FACS с фильтром, чтобы удалить все большие скопления и поместить трубку FACS, содержащую ячейки, на лед.
- Перейдите к шагу 4.6, чтобы продолжить подсчет клеток и подготовку мастер-микса.
- При инфекциях 3D органоидов извлеките пластину из инкубатора и поместите ее в вытяжку клеточной культуры.
- Удалите дифференцирующую среду из каждой лунки 24-луночной пластины пипеткой P1000. Добавьте 500 мкл ледяного 1x PBS в каждую лунку и высиживайте в течение 3 минут на льду.
- Чтобы обеспечить полное нарушение работы ECM-решения, используйте пипетку P1000 (450 мкл). Пипетка вверх и вниз 10 раз для повторного суспендирования PBS, раствора ECM и органоидов; переложить ресуспендированные органоиды в коническую трубку объемом 15 мл и поместить на лед. Соберите каждое инфекционное состояние в свою собственную коническую трубку объемом 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование конической трубки объемом 15 мл дает лучшую, более отчетливую ячейку гранулы, чем коническая трубка объемом 50 мл или трубка объемом 1,5 мл. - Смените перчатки и снимите трубку с вытяжки клеточной культуры. Очистите внешнюю часть трубки.
- Вращайте образцы при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Переместите трубку обратно в вытяжку клеточной культуры и удалите PBS с помощью пипетки P1000, чтобы избежать повторного использования гранул органоидов со дна трубки.
- Повторно суспендировать гранулу в 1 мл фермента диссоциации (например, TrypLE Express). Смените перчатки, очистите трубку и инкубируйте образцы при температуре 37 °C.
- Каждые 10 мин в течение 30 мин перемещайте трубку обратно в вытяжку клеточной культуры и повторно суспендируйте органоиды, пипеткой вверх и вниз пипеткой P1000 10 раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно кишечным органоидам требуется около 30 минут, чтобы сформировать одноклеточную суспензию при заражении в 3D. - Чтобы определить, когда органоиды диссоциируют на отдельные клетки, возьмите 10 мкл органоидной суспензии с помощью пипетки p10.
- Поместите суспензию в одноразовый пластиковый затвор счетчика ячеек. Запечатайте входной порт образца прозрачной лентой.
- Смените перчатки и очистите внешнюю часть счетчика клеток. Используйте микроскоп brightfield, чтобы определить, сделана ли одноклеточная суспензия.
- После подтверждения одноклеточной суспензии остановите пищеварение, добавив 1 мл среды DMEM/F12, содержащей 10% FBS, и пипетку вверх и вниз 10 раз пипеткой P1000.
- Смените перчатки, очистите трубку и раскрутите образцы при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Осторожно удалите фермент медиа/диссоциации пипеткой P1000, чтобы избежать повторного использования клеточной гранулы со дна трубки.
- Повторное суспендирование одиночных клеток в минимальном объеме PBS, содержащем 0,1% BSA. Для кишечных органоидов повторно суспендируют в 250 мкл.
- Передайте суспензии клеток в трубку FACS с фильтром, чтобы удалить любые большие скопления и поместить трубку FACS, содержащую ячейки, на лед.
- Перейдите к шагу 4.6, чтобы продолжить подсчет клеток и подготовку мастер-микса.
- Определите количество ячеек на мкл, добавив 10 мкл клеточной суспензии в одноразовую пластиковую камеру подсчета клеток.
- Запечатайте входной порт образца прозрачной лентой перед извлечением образца из вытяжки клеточной культуры, так как на этом этапе клеточная суспензия все еще заразна.
- Смените перчатки, очистите камеру подсчета клеток и подсчитайте номер ячейки с помощью микроскопа Brightfield.
- Внутри капюшона клеточной культуры подготовьте мастер-смесь реагента RT, template Switch Oligo, восстановителя B и фермента RT C в пробирке объемом 1,5 мл в соответствии с инструкциями производителя в зависимости от количества образцов в эксперименте. Для каждого образца аликвот 33,4 мкл мастер-микса в ПЦР-трубку и хранят на льду.
- Добавьте клетки и воду в мастер-микс в соответствии с номером целевой ячейки, как описано в инструкции производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: 50%-60% клеток обычно восстанавливаются (т.е. при загрузке 10 000 клеток на чип для анализа используется 5000-6000 клеток). Поэтому всегда загружайте 10 000 ячеек. Если плотность клеток не позволяет этого, центрифугируют клетки и повторно суспендируют в меньшем объеме. Позаботьтесь о том, чтобы не перегружать чип, так как это приведет к засорению чипа. Кроме того, если клетки не диссоциированы должным образом, будет повышенный риск получения нескольких клеток на бусину, которые необходимо будет удалить при последующей обработке биоинформатики. - Смените перчатки, переместите одноэлементный контроллер в вытяжку для культивирования клеток и подготовьте чип, поскольку чип покрыт только прокладкой, которая не запечатана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Машина должна находиться внутри капота, чтобы предотвратить воздействие инфицированных клеточных суспензий и потенциальных аэрозолей. - Добавьте одноэлементный чип в держатель чипа и заполните неиспользуемые полосы 50% глицерина.
- Добавьте основную смесь, бусины и масло для перегородок в полосы, используемые для образцов, в соответствии с инструкциями производителя.
- Накройте чип прокладкой, загрузите чип в контроллер и запустите программу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется загружать только шесть из восьми полос. Проблемы с неправильными эмульсиями часто возникают в первой и восьмой полосах. В компании говорят, что все полосы движения независимы, и этого происходить не должно; однако, если возможно, избегайте этих двух полос и запускайте две фишки, если требуется восемь образцов. - По завершении программы снимите стружку и прокладку.
- Используйте многоканальную пипетку и перенесите 100 мкл эмульсий в чистую ПЦР-трубку. Убедитесь, что каждая скважина имеет однородный белый цвет, указывающий на то, что произошла полная эмульсия.
- Смените перчатки, очистите трубки и перенесите трубку ПЦР в аппарат ПЦР, который может поддерживать реакции 100 мкл. Запуск программы: 53 °C в течение 45 мин; 85 °C в течение 5 мин.
- По завершении храните образцы при температуре 4 °C. В этот момент обрабатывайте реакцию в соответствии с инструкциями производителя или храните при 4 °C в течение 3 дней или -20 °C в течение 1 недели.
- Через 5 мин при 85 °C большинство оболочек вирусов инактивируются, удаляют кДНК из BSL-3 в соответствии с обычной рабочей процедурой и выполняют библиотечные препараты в лаборатории BSL-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент должен быть выполнен в виде трех биологических реплик (например, в три разных дня), потому что степень дифференциации каждого типа клеток может незначительно варьироваться между каждым экспериментом. Результирующие библиотеки виртуализации могут быть по-разному проиндексированы и секвенированы вместе за один запуск виртуализации.
Representative Results
Подготовка органоидов для одноклеточного секвенирования
Результаты секвенирования одиночных клеток сильно зависят от использования клеток хорошего качества. Чтобы гарантировать, что органоиды имеют хорошее качество, их следует правильно поддерживать и ежедневно наблюдать, чтобы определить, когда они готовы к расщеплению(рисунок 2). Сроки расщепления органоидов зависят от доноров; некоторые доноры растут быстрее и должны быть разделены каждые 5 дней, в то время как другие медленнее и должны быть разделены каждые 10 дней. В среднем, органоиды расщепляются один раз в неделю, когда центры становятся темными(рисунок 2B). Если органоидам позволить стать слишком большими и накапливать слишком много мертвых клеток в центре, органоид умрет.
Органоиды поддерживаются в среде, содержащей большое количество Wnt3A. Это поддерживает нишу стволовых клеток и способствует тому, чтобы органоиды продолжали расти и размножаться. В этих условиях роста органоиды содержат большое количество стволовых клеток и транзитно-амплифицирующих клеток и меньшее количество дифференцированных клеточных популяций, таких как зрелые энтероциты, бокаловидные клетки и энтероэндокринные клетки. Однако, чтобы имитировать клеточную сложность, обнаруженную в кишечнике человека, важно подтолкнуть дифференцировку клеток и произвести больше этих клеток. Это достигается путем изменения условий среды и удаления Wnt3A, а также уменьшения R-спондина и Ноггина(таблица 1). В норме клеточная дифференцировка в сторону энтероцитов, бокаловидных клеток и энтероэндокринных клеток требует 4 дней дифференцировочной среды(рисунок 3). Это ключ к получению хорошей дифференциации; в противном случае оценка тропизма патогена и специфических для типа клеток реакций станет затруднительной.
Подтверждение инактивации возбудителя BSL-3
Полная инактивация должна быть подтверждена патогеном выбора и подтверждена, что безопасно удалять кДНК из BSL-3. Для SARS-CoV-2 полная инактивация вируса была подтверждена путем взятия 100 мкл SARS-CoV-2 и инкубации его в аппарате ПЦР в течение 5 мин при 85 °C. Затем вирус добавляли обратно в наивные клетки Vero, и вирусную инфекцию сравнивали с нетермически обработанным вирусом путем иммунофлуоресценции и анализа бляшек через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения, чтобы гарантировать, что все частицы больше не являются инфекционными. Эти результаты были направлены в местный регулирующий орган, и после их одобрения был проведен одноклеточный эксперимент и обработка кДНК.
Результаты секвенирования одной ячейки
Чтобы оценить, как SARS-CoV-2 заражает органоиды толстой и подвздошной кишки человека, было проведено секвенирование одиночных клеток. Органоиды были получены, как описано выше, и инфицированы в 2D-формате, чтобы обеспечить апикальную инфекцию SARS-CoV-2. Инфицированные клетки собирали через 12 ч и 24 ч после заражения и обрабатывали для секвенирования одиночных клеток, как описано выше. Анализ данных секвенирования одноклеточных клеток позволил определить, что только субпопуляция (незрелый энтероцит 2) эпителиальных клеток кишечника человека поддерживала инфекцию SARS-CoV-2(рисунок 4). Кроме того, поскольку не все клетки в популяции были инфицированы, были проанализированы как инфицированные клетки, так и неинфицированные клетки свидетеля(рисунок 5). Эти результаты показали, что SARS-CoV-2 индуцировал провоспалительный сигнальный каскад в инфицированных клетках, в то время как неинфицированные клетки свидетеля показали интерферон-опосредованный иммунный ответ. Кроме того, scRNA-Seq показал, что инфицированные клетки не могут ощущать интерфероны из-за опосредованной вирусом блокировки пути(рисунок 5). Получить эту информацию при использовании массового секвенирования РНК не удалось.
Рисунок 1:Схема, изображающая три различных метода подготовки кишечных органоидов человека к заражению кишечными патогенами. Апикальная инфекция может быть достигнута путем посева кишечных органоидов в 2D. Апикальная и базолатеральная инфекция может быть выполнена путем нарушения 3D органоида. Наконец, базолатеральная инфекция может быть выполнена путем заражения неповрежденных 3D-органоидов кишечника. Каждый из этих методов может быть использован для генерации образцов для секвенирования одиночных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Схематические схемы поддержания органоидов и репрезентативные изображения яркого поля. (A) Схема поддержания и пропускания органоидов кишечника человека. (B). Репрезентативные изображения ярких полей дней 1, 3, 5 и 7 после разделения. К 7 дню органоиды становятся большими и темными из-за скопления мертвых клеток и готовы к расщеплению. Шкала шкалы указывает на 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Репрезентативная qPCR органоидов кишечника человека через 4 дня после перехода на дифференцировочные среды. Кишечные органоиды поддерживали в средах роста или переключали на дифференцировальные среды в течение 4 дней. РНК собирали и проводили qPCR для маркеров стволовых клеток (OLFM4), клеток Панета (LYZ), бокаловидных клеток (MUC2) и энтероцитов (SI). N = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Идентификация клеточной популяции, инфицированной SARS-CoV-2. Органоиды, полученные из толстой кишки и подвздошной кишки человека, были инфицированы SARS-CoV-2. Через 12 и 24 ч после заражения клетки собирали и подвергали секвенированию одноклеточной РНК, чтобы определить, какие клеточные популяции поддерживали инфекцию SARS-CoV-2. Было обнаружено, что вирусная инфекция увеличивается с течением времени и в основном заражает незрелые энтероциты 2. Эта цифра была изменена по сравнению с Triana et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Определение внутреннего врожденного иммунного ответа. Органоиды, полученные из толстой кишки человека, были инфицированы SARS-CoV-2. Через 12 и 24 ч постинфекционные клетки собирали и подвергали секвенированию одноклеточной РНК для определения внутреннего врожденного иммунного ответа как в вирусно инфицированных, так и в неинфицированных клетках-наблюдателях. Инфицированные SARS-CoV-2 клетки демонстрировали сильную провоспалительную реакцию, в то время как неинфицированные клетки сторонних наблюдателей демонстрировали реакцию, опосредованную интерфероном. Рисунок изменен по сравнению с Triana et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Питательные среды | |
| Соединение | Конечная концентрация |
| Ад ДМЕМ/F12 | ГлутаМАКС (1X) |
| +ГлутаМАКС | HEPES 1 мМ |
| +ХЕПЕС | Ручка 10 U/мл |
| +П/С | Стрептококк 10 мкг/мл |
| Л-ВРН | 50% по объему |
| В27 | 01:50 |
| N-ацетил-цистеин | 1 мМ |
| ЭГФ | 50 нг/мл |
| А83-01 | 500 нМ |
| ИФР-1 | 100 нг/мл |
| FGF базовый | 50 нг/мл |
| Гастрин | 10 мМ |
| Средства дифференциации | |
| Соединение | Конечная концентрация |
| Ад ДМЕМ/F12 | ГлутаМАКС (1x) |
| +ГлутаМАКС | HEPES 1 мМ |
| +ХЕПЕС | Ручка 10 U/мл |
| +П/С | Стрептококк 10 мкг/мл |
| В27 | 01:50 |
| N-ацетил-цистеин | 1 мМ |
| R-спондин | 5% по объему |
| Башка | 50 нг/мл |
| ЭГФ | 50 нг/мл |
| Гастрин | 10 мМ |
| А83-01 | 500 нМ |
Таблица 1: Композиция сред для роста и дифференциации сред.
Discussion
Энтеральные патогены чаще всего инициируют свой жизненный цикл, заражая эпителиальные клетки кишечника с их апикальной стороны, обращенной к просвету кишечника. В то время как органоиды хорошо известны как хорошая модель для воспроизведения клеточной сложности и организации кишечного эпителия, их организация в виде трехмерных, закрытых структур делает их апикальную мембрану недоступной для патогена. Этот протокол описывал способы заражения кишечных органоидов с их апикальной стороны, базолатеральной стороны или обоих патогенами BLS-3. Эти протоколы могут быть легко адаптированы для изучения любого кишечного патогена в оболочке BSL-2 или BLS-3 или любой другой органоидной модели, выполнив несколько критических шагов, которые выделены ниже. Метод, описанный выше, предназначен для выделения и приготовления одноклеточных капель в соответствии с правилами Германии. В качестве отказа от ответственности этот протокол не описывает меры по обращению с биобезопасностью (стандартные операционные процедуры), которые должны быть приняты при работе в условиях BSL-3. Также важно настаивать на том, что правила могут отличаться в других странах и что необходимо связаться с местными властями, чтобы убедиться, что все местные правила соблюдаются.
Одним из важнейших шагов в посеве органоидов в двух измерениях для апикальной инфекции является контроль того, что клетки будут аналогично дифференцироваться по сравнению с выращиванием в качестве классических трехмерных органоидов. В зависимости от кишечного патогена, тропизм может быть ограничен очень редкими клетками или клетками, которые должны быть высокодифференцированными. В этом случае использование двумерного органоида, который не полностью дифференцировался, может привести к неправильному пониманию того, что этот кишечный патоген не может инфицировать кишечные органоиды. Рекомендуется, если это возможно, выполнять инфекции с использованием трех конфигураций этого протокола: 2D-органоид только для апикальной инфекции (раздел 2), треснувшие открытые 3D-органоиды для апикальной и базолатеральной инфекции (раздел 3) и полные 3D-органоиды только для базолатеральной инфекции (раздел 3). Такой подход поможет различить путь проникновения патогена (апикальный и базолатеральный), а также будет контролировать, что был достигнут аналогичный уровень дифференцировки. Альтернативой 2D-апикальной инфекции является микроинъекция, которая будет использовать 3D-органоид, но доставлять патоген непосредственно в апикальную сторону (см. Bartfeld et al.27 для деталей). Этот метод требует квалифицированного инъектора, чтобы гарантировать, что патоген правильно размещен, а органоиды остаются нетронутыми. Микроинъекция обычно используется в сдерживании BSL-2 и может не подходить для сдерживания BSL-3.
Дополнительным важным соображением при проведении экспериментов по заражению 2D-засеянными органоидами является конечная плотность клеток. Как упоминалось на этапе 2.3, 100-150 органоидов будут посеяны в одну лунку из 48-луночной пластины или в одну скважину из 8-луночной камеры со стеклянным дном. В зависимости от органоидной линии и от человека, работающего с органоидами, размер этих органоидов может значительно отличаться. Это может привести к очень разной плотности ячеек в пластине с 48 лунками или 8-луночной стеклянной нижней камере. В зависимости от кишечнорастворимого вируса, некоторые вирусы предпочитают более разреженные клетки, в то время как другие также смогут инфицировать сливающиеся клетки. Молекулярное происхождение таких различий в инфекционности для разных слияний клеток не ясно; поэтому пилотные эксперименты, направленные на поиск наилучшей плотности клеток для кишечнорастворимого патогена по выбору, должны быть выполнены до выполнения дальнейшей характеристики ниже по течению.
Часто сортировка FACS выполняется перед выполнением одноклеточной капельной эмульсии. Этот шаг часто используется для отделения мертвых от живых клеток и одиночных клеток от дублетов. При работе с патогенами BSL-3 требуется, чтобы объект был оснащен соответствующим сортировщиком FACS, что случается не часто. Кроме того, не все клетки в органоиде имеют одинаковый размер, и часто трудно различить дублет или более крупную клетку, тем самым вызывая риск негативного выбора по отношению к определенному типу клеток. Кроме того, в этой области все еще обсуждается вопрос о том, может ли время, необходимое для сортировки между 5000-10000 для каждого образца, привести к значительному изменению профиля расшифровки отдельных клеток. Хотя были описаны методы клеточной фиксации, совместимые с одноклеточным секвенированием (например, метанол и РНКАассист), было отмечено, что это приводит к снижению качества секвенирования18. Наконец, предполагается, что сортировка клеток с использованием маркеров гибели клеток также может привести к смещению. Учитывая направленную пролиферацию и дифференцировку клеток через ось крипто-ворсинок, наиболее дифференцированные клетки, которые будут сбрасываться и высвобождаться, расположены на кончике ворсинок. Эти клетки часто положительны для различных маркеров путей гибели клеток(например, апоптоз, некроз и некроптоз); однако при взгляде на ротавирусную инфекцию кишечника мыши, кончик ворсинок является наиболее инфицированной областью28. Таким образом, фильтрация клеток, которые могут выглядеть положительными для маркеров смерти, приведет к отрицательному отбору инфицированных клеток, которые могут представлять физиологическую инфекцию. В настоящее время не существует хорошего решения для сортировки и фиксации органоидов перед секвенированием одиночных клеток. Рекомендуется использовать живые, несортированные клетки, поскольку необходимы дальнейшие исследования для поиска подходящих альтернативных протоколов.
Секвенирование одной клетки произвело революцию в оценке клеточных реакций. Этот метод позволяет идентифицировать специфические для клеточной линии реакции как в базальных условиях, так и при патогенных инфекциях. Этот метод открыл двери во многих областях, которые ранее были ограничены массовыми показаниями. Хотя этот метод очень мощный, он имеет свои ограничения. Ключевым ограничением является обширный биоинформационный анализ, который требуется после секвенирования. Это особенно важно при анализе тканей и назначении типов клеток там, где в настоящее время нет аннотации. Наличие квалифицированного биоинформатика требуется для поддержки всех одноклеточных исследований.
Этот протокол описывает, как сеять и обрабатывать кишечные органоиды человека, заражать их кишечными патогенами и выполнять scRNAseq. Адаптация этого подхода к другим органам теперь возможна, так как органоидные модельные системы были разработаны для большинства органов. Органоиды легких и печени одинаково организованы по сравнению с кишечными органоидами, и поэтому использование аналогичного подхода может быть перенесено на эти органоиды. Критический контроль будет заключаться в том, чтобы подтвердить, что при выращивании в двух измерениях или вскрытии эти органоиды достигают такой же дифференциации, как и их 3D-органоидные аналоги. Специфические особенности и гены, определяющие дифференцированный статус, специфичны для каждой модели органа. Другие органоидные модели, такие как почечные и сосудистые органоиды, большие плотные структуры, потребуют дополнительных методов для последовательной диссоциации этих структур на отдельные клетки.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Меган Станифер и Стив Булант были поддержаны исследовательскими грантами от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (номер проекта 240245660, 278001972, 415089553 и 272983813 Стива Буланта и 416072091 Меган Станифер), штата Баден-Вюртемберг и Бундесминистериума für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B до MS и 01KI20198A и (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) до SB. Схемы были созданы в BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
| 24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
| 8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
| A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
| B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
| CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
| CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
| DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
| Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
| Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
| GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
| HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
| L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
| MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
| MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
| MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
| N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
| OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
| OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
| Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
| Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
| Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
| SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
| SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
| TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
| Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |
References
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection. Cells. 9, (2020).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. Human norovirus transmission and evolution in a changing world. Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).
- Leshem, E., et al. Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, Suppl 2 155-160 (2016).
- Karst, S. M. The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353, 1387-1393 (2016).
- de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).
- Scaldaferri, F., et al. The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications. Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).
- Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test. Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369, 50-54 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells. Cell Reports. 32, 107863 (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. bioRxiv. , (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Molecular Systems Biology. 17, 10232 (2021).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).
- García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection. Viruses. 12, 1288 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells. Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).
- Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478 (2019).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483 (2015).
- Fujii, M., et al. Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359 (2015).
- Hernandez, P. P., et al. Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection. Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).
