Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man inficerer menneskelige intestinale organoider fra enten deres apikale eller basolaterale side for at karakterisere værts /patogeninteraktioner på enkeltcelleniveau ved hjælp af encellet RNA-sekventering (scRNAseq) teknologi.
Abstract
Humane intestinale organoider udgør den bedste cellulære model til at studere patogeninfektioner i mave-tarmkanalen. Disse organoider kan udledes af alle dele af MAVE-tarmkanalen (gastrisk, jejunum, duodenum, ileum, kolon, endetarmen) og, efter differentiering, indeholder de fleste af de celletyper, der er naturligt findes i hver enkelt sektion. For eksempel indeholder intestinale organoider næringsabsorberende enterocytter, sekretoriske celler (Pokal, Paneth og enteroendokrine), stamceller samt alle slægtsspecifikke differentierings mellemprodukter (f.eks. tidlige eller umodne celletyper). Den største fordel ved at anvende mave-tarmkanalen-afledte organoider til at studere smitsomme sygdomme er muligheden for præcist at identificere, hvilken celletype der er målrettet af det enteriske patogen, og at tage fat på, om de forskellige dele af mave-tarmkanalen og deres specifikke celletyper på samme måde reagerer på patogenudfordringer. I løbet af de seneste år er gastrointestinale modeller, såvel som organoider fra andre væv, blevet anvendt til at studere viral tropofi og patogenesemekanismerne. Men at udnytte alle fordelene ved at bruge organoider, når man anvender højpatogene vira, udgør en teknisk udfordring og kræver strenge overvejelser om biosikkerhed. Derudover, som organoider ofte dyrkes i tre dimensioner, den basolaterale side af cellerne vender ydersiden af organoid, mens deres apikale side vender indersiden (lumen) af organoider. Denne organisation udgør en udfordring for enteriske patogener, da mange enteriske infektioner indleder fra den apikale / lysende side af cellerne efter indtagelse. Følgende manuskript vil give en omfattende protokol til at forberede menneskelige intestinale organoider til infektion med enteriske patogener ved at overveje infektionssiden (apikale vs basolateral) til at udføre encellet RNA sekventering for at karakterisere celle-type-specifikke vært / patogen interaktioner. Denne metode beskriver forberedelsen af organoiderne samt de overvejelser, der er nødvendige for at udføre dette arbejde under biosikkerhedsniveau 3 (BSL-3) indeslutningsbetingelser.
Introduction
At studere celletypespecifik tropoisme og celletypespecifik immunrespons på humane enteriske vira har været historisk udfordrende på grund af manglen på primære menneskelige cellulære modeller. Denne begrænsning er nu delvist udryddet med udviklingen af organoider1. I tilfælde af mave-tarmkanalen er der udviklet gastriske og intestinale organoidmodeller til mennesker og flere andre arter (f.eks.murin, kvæg, katte, flagermus)2,3,4,5,6. Tarmorganoider reproducerer den strukturelle arkitektur i det menneskelige tarmepitele og indeholder krypt- og villi-lignende strukturer, funktionelle tarmledninger og er endda blevet brugt til at identificere hidtil ukendte celleledninger. To forskellige tilgange kan bruges til at dyrke tarmorganoider. For det første isoleres tarmstamceller, der indeholder krypter, fra vævsresektioner eller biopsier og dyrkes under særlige kulturforhold (f.eks. Wnt3A, R-spondin, Noggin og EGF) for at udvide og derefter differentiere stamcellerne til de fleste tarmcellestammer (f.eks. enterocytter, Paneth-celler, Pokalceller, enteroendokrine celler)7. Denne metode giver mulighed for isolering af organoider fra alle dele af mave-tarmkanalen (f.eks.,mave, duodenum, jejunum, ileum og tyktarm). Den anden metode er afhængig af menneskeskabte pluripotente eller embryonale stamceller, som derefter differentieres i en trinvis proces i tarmepileleceller8. Disse inducerede stamcellebaserede organoider beskrives ofte som værende mere embryonale i naturen sammenlignet med patientafledte organoider. Mens alle disse organoid modeller har været afgørende for at optrævle udviklingsmæssige signaler er nødvendige for at danne tarmkanalen, deres anvendelse i infektionssygdomme forskning er stadig i sin vorden.
Enterisk virus er et bredt begreb, der dækker alle vira, som inficerer gennemmave-tarmkanalen, såsom picornavirus (f.eks. , EV-71), reovirus (f.eks. rotavirus) og calicivirus (f.eks. norovirus)9. Enteriske vira indleder deres smitsomme livscyklus gennem indtagelse af forurenet mad og vand, hvilket efterlader mennesker i udviklingslandene i høj risiko på grund af udledning af ubehandlet affald i miljøet og mangel på lægehjælp efter infektionens begyndelse10. Afhængigt af typen af patogen, infektionen kan føre til gastroenteritis, opkastning, og / eller vandig diarré på grund af lækage af tarmforing. Human norovirus er en meget udbredt og meget smitsom enterisk patogen, der fører til over 600 millioner infektioner og 15 millioner indlæggelser på verdensplan11. Organoider har været nøglen til norovirus forskning, da de understøtter infektion og replikation af human norovirus, som tidligere ikke var i stand til at blive kultiveret i standard cellekultur modeller12.
I løbet af de sidste to årtier har coronavirus vist sig som centrale menneskelige patogener13. Denne familie omfatter den højpatogene MERS, SARS-CoV-1 og SARS-CoV-2, som kræver strenge sikkerhedsniveau indeslutninger, når de udfører forskning på disse vira. Interessant nok, mens alle tre af disse patogener for det meste er anerkendt for deres inducerede luftvejssymptomer og nød, er det nu tydeligt, at disse vira ikke udelukkende inficerer luftvejene, men også andre organer. En vigtig patologi induceret hos SARS-CoV-2 inficerede patienter udover åndedrætsbesvær er tilstedeværelsen af gastrointestinale symptomer14. En brøkdel af SARS-CoV-2 inficerede patienter viser sådanne symptomer, lige fra meget mild til svær diarré. Derudover kan SARS-CoV-2 genomer påvises i afføring og mave-tarmkanalen biopsier af inficerede patienter15. Det er vigtigt, at tilstedeværelsen af mave-tarm-symptomer ikke er begrænset til SARS-CoV-2, da de også blev observeret hos MERS- og SARS-CoV-1-inficerede patienter. For at forstå, hvordan SARS-CoV-2 fremkalder mave-tarm-nød og præcist identificerer tropism af SARS-CoV-2 i mave-tarmkanalen, har menneskelige tarmorganoider været et centralt redskab og udnyttes nu til at optrævle celletypespecifikke reaktioner på dette patogen16,17.
Transskriptionel profilering af en cellepopulation (bulk RNA sekventering) har været standard praksis, når man vurderer patogeninfektioner af både udødeliggjorte cellelinjer samt med organoider. Mens dette giver os mulighed for at bestemme globale ændringer som reaktion på patogener (f.eks upregulation af cytokiner), bulk RNAseq ikke giver os mulighed for at afgøre, hvorfor specifikke celler i en befolkning er mere tilbøjelige til infektion end andre. Single-cell RNA sekventering (scRNAseq) er blevet et kraftfuldt værktøj til at optrævle celle afstamning-specifikke transskriptionsprogrammer og kan bruges til at bestemme, hvordan disse programmer understøtter eller undertrykke virusinfektion18,19. Den første beskrivelse af scRNAseq var i 2009 og blev brugt til at evaluere transskriptionsprofilerne for de forskellige celler, der findes i en muse blastomere20. Disse teknologier er nu blevet udvidet og kan implementeres gennem flere forskellige platforme. Tidlige versioner af denne teknologi anvendte fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til at adskille individuelle celler til sekventering, som ofte var begrænset til 96- eller 384-brøndplader, hvilket gav 300 individuelle celler til at analysere pr. prøve21. Disse metoder er nu blevet avanceret af enkeltcellede sekventeringsplatforme, som bruger en mikrofluidisk enhed til at indkapsle enkelte celler i individuelle dråber med stregkode indeholdende perler. Denne teknologi gør det muligt at fange op til 10.000 celler pr. prøvetilstand.
Ved at kombinere organoider teknologi med scRNAseq giver os mulighed for at studere, hvordan enteriske patogener påvirker mave-tarmkanalen på en celle type-specifik måde. Der er dog behov for flere tekniske og biosikkerhedsmæssige overvejelser. Først og fremmest udsætter klassiske organoider kulturmetoder (3-dimensionelle (3D) organoider, indlejret i en ekstracellulær matrix (ECM)) den basolaterale side af epitelcellerne for ydersiden af organoiden. Som enteriske patogener indlede deres infektion gennem indtagelse af forurenet mad / vand, infektionen oftest indleder fra den apikale side af cellerne, som ikke er tilgængelig i disse 3D intestinale organoider. Derfor skal organoider være forberedt på at gøre den apikale side tilgængelig for patogeninfektion enten gennem 2D-såning og derved direkte udsætte den apikale side af cellerne eller gennem mikroinjektion22,23. For det andet, at udføre scRNAseq af inficerede biologiske prøver, er det vigtigt at overveje deres smitsomme natur. Mens metoder til at fastsætte celler og inaktivere patogener forud for encellet isolation for efterfølgende RNAseq er blevet foreslået, fører disse metoder ofte til et fald i sekventeringskvalitet18. Nedenstående protokol vil beskrive flere tilgange til at inficere tarmorganoider med enteriske vira i betragtning af infektionssiden (apisk vs. basolateral infektion) (Figur 1). Derudover vil protokollen omfatte en arbejdsgang for at adskille og isolere enkelte celler fra organoider inficeret med højpatogene vira for scRNAseq. Protokollen vil fremhæve de vigtigste trin, der skal gennemføres, når der arbejdes under BSL-3 -indeslutningsbetingelserne (biosikkerhedsniveau-3) for at undgå generering af aerosoler og potentiel forurening.
Protocol
Humant væv blev modtaget fra kolon resektion eller ileum biopsier fra universitetshospitalet Heidelberg for følgende protokol. Denne undersøgelse blev udført i henhold til anbefalingerne fra universitetshospitalet Heidelberg med informeret skriftligt samtykke fra alle forsøgspersoner i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Alle prøver blev modtaget og vedligeholdt anonymiseret. Protokollen blev godkendt af den etiske kommission på universitetshospitalet Heidelberg i henhold til protokol S-443/2017.
1. Vedligeholdelse og passaging af tarm- og tyktarmsorganoider
FORSIGTIG: Menneskelige tarmorganoider er afledt af humant væv eller fra inducerede pluripotente/embryonale stamceller, og som sådan kræves etisk godkendelse. Landespecifikke regler skal følges. Humant materiale er generelt ikke testet og er derfor ofte betragtes BSL-2 materiale. Korrekte inddæmningsbetingelser skal bekræftes i det land, hvor forsøget finder sted.
- Tilbered tarm- og tyktarmsorganoider fra isolerede væv og/eller biopsier ved hjælp af tidligere beskrevne metoder2. Derudover kan der findes mere tekniske detaljer om, hvordan man forbereder organoider af patientafledt materiale eller fra iPSC'er i Lees et al. og Mahe et al.24,25.
- Når organoidkulturer er etableret, skal du følge nedenstående beskrevne opdelingsrutine for at forberede organoider til at udføre infektioner med enteriske patogener.
- Frø 20-100 organoider i 50 μL af 100% ECM-opløsning i 24-brønd ikke-vævskulturbehandlede plader. Tilsæt 500 μL vækstmedier (tabel 1) pr. brønd.
- Skift mediet hver anden dag ved at fjerne 250 μL af de gamle medier og tilføje 250 μL af de friske vækstmedier til hver brønd. Varm mediet til stuetemperatur, før du skifter medie.
FORSIGTIG: Kolde medier vil flydende ECM-opløsningen, der indeholder organoider. - Passage organoider en gang om ugen, når interiøret begynder at blive mørkt på grund af ophobning af døde celler. Et eksempel herpå findes i figur 2.
- På opdelingsdagen fjernes ECM-opløsningen fra -20 °C og optøs på is.
- Placer den nye tomme cellekulturplade, der skal bruges til at så organoiderne efter opdeling ved 37 °C (dette kræver mindst 1 time at være varm og kan opvarmes natten over). Varm kulturmedierne til stuetemperatur.
- Fjern vækstmediet med en P1000 pipette og tilsæt 500 μL kold 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) til hver brønd i 3 min for delvist at flydende ECM-opløsningen og adskilles fra pladen.
- For at sikre fuld afbrydelse af ECM-løsningen skal du bruge en P1000-pipette (set-up ved 450 μL). Pipette op og ned 10 gange for at genbruge PBS, ECM-opløsningen og organoiderne, overføre de opslupne organoider til et 15 mL konisk rør og placere dem på is.
- Saml flere brønde af de samme organoider i det samme koniske rør.
- Hvis flere forskellige organoider (forskellige donorer, forskellige sektioner, forskellige forbehandlinger osv.) opdeles på samme tid, skal du samle dem i forskellige koniske rør. Mens du samler, skal du vedligeholde de koniske rør på is.
- Prøverne drejes ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern forsigtigt PBS med en pipette for at opretholde organoid pellet i bunden.
- Undgå at bruge et vakuumaffaldssystem med en monteret pipette, da pellet af organoider er meget løs og let kan aspirere, når PBS fjernes for hurtigt.
- Tilsæt 1 mL af 0,05% trypsin til det koniske rør og genanvende organoider ved pipetter op og ned 10 gange med en P1000 pipette. Inkuberes det koniske rør, der indeholder organoider, ved 37 °C i 3 min.
- Tilsæt 2 mL DMEM/F12 medier, der indeholder 10% fosterkvæg serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin at stoppe fordøjelsen og genanvendes til at forstyrre organoider ved pipetter op og ned 10 gange med en P1000 pipette.
- Prøverne drejes ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern koniske rør fra centrifugen og opbevar dem på is.
- Fjern forsigtigt medier/trypsin med en 5 mL engangspipette for at opretholde organoid pelleten i bunden. Lad omkring 500 μL medier og fjern dette med en P1000 pipette.
- Når mediet/trypsin er fjernet fra alle koniske rør, skal den 24-brønds ikke-cellebehandlede plade fjernes fra inkubatoren på 37 °C og placere den under cellekulturhætten.
- Tilsæt 100% ECM-opløsning (opbevares på is) til det koniske rør med de opdelte organoider ved 1:3 til 1:5-forholdet afhængigt af vækstvaner hos de enkelte donororganoider. (Hvis en brønd indeholdende 20-100 organoider i en 50 μL dråbe ECM-opløsning f.eks. blev passager, skal organoidpillen anvendes i 150-250 μL iskold ECM-opløsning).
- Frø 50 μL ECM opløsning/organoid mix pr. brønd af den 24-brønd ikke-cellede kulturbehandlede plade forvarmet til 37 °C.
BEMÆRK: ECM-opløsningen polymeriseres meget hurtigt, når den er opvarmet. Hold ECM-opløsningen kold hele tiden (opbevares på is) under brug. Når organoider er blevet suspenderet igen, frø straks på en ny plade. For begyndere anbefales det at opbevare en kasse pipettespidser ved -20 °C for at give ekstra tid til såningen. - Inkuber 24-brøndspladen ved 37 °C i 10-15 min, så ECM-opløsningen kan polymeriseres.
- Efter polymerisering tilsættes 500 μL vækstmedier (tabel 1)26 til hver brønd og inkuberes organoiderne ved 37 °C. Kontroller organoiderne dagligt ved mikroskopi. Skift mediet hver anden dag som i trin 1.4.
2. Fremstilling af organoider i todimensioner (2D) til apikal infektion
BEMÆRK: Følgende protokol vil beskrive, hvordan man frøer tarmorganoider som en monolag af celler i en cellekulturplade for at inficere tarmepiletceller fra deres apikale side. Brug 48-brøndspladen til sekventeringsforsøgene og 8-brønds glasbundskammerslidte til at kontrollere infektion ved hjælp af immunfluorescence-tilgange.
- Vokse og vedligeholde organoider som beskrevet i afsnit 1.
- Før såning af organoider i 2D, belægge 48-brønd plader og 8-brønd glas-bund kammer dias med 200 μL på 2,5% human kollagen i vand pr brønd i 1 time ved 37 °C.
BEMÆRK: Tarmorganoider er bedst seedet i 48-brøndsplader og i 8-brønd glasbundet kammerrutschebane. Erfaringen har vist, at de ikke smitter godt i 96-brøndsplader. Transwell skær kan også bruges til at give mulighed for både apikale og basolaterale infektion i 2D. Hvis der anvendes transwells, skal du overvåge den transe epitelele elektriske modstand (TEER) før infektion for at bekræfte et sammenflydende monolag. Normalt har tarmorganoider en stram barriere med en TEER på 450-600 Ohm/cm2. - Seed 100-150 organoider i hver brønd af en 48-brønd plade eller for en brønd af en 8-brønd glas-bund kammer slide.
- For at anslå antallet af organoider tælles antallet af organoider, der er til stede i 50 μL ECM-opløsningsfaldet af den 24-brønds plade, der er fremstillet i afsnit 1. I gennemsnit er der brug for 1-2 brønde, hvilket vil give ca. 15.000-30.000 celler.
- Følg trin 1.8-1.17 for at forstyrre ECM-opløsningen og prøve organoiderne.
- Fjern menneskekollagen fra de 48-brøndsplader og 8-brønd glasbundet kammerrutschebane.
- Resuspend organoid pellet i det koniske rør i 250 μL vækstmedier /brønd og tilsæt blandingen til de kollagenbelagte brønde. Pladen placeres i en inkubator på 37 °C.
BEMÆRK: Ved udførelse af forsøgene sammenlignes flere tilstande (mock vs. inficeret +/- behandling af interesse). For at minimere variationen mellem hver brønd af 2D-seedede organoider skal du samle det samlede antal nødvendige organoider i det samme koniske rør. Indsamling af organoider fra op til 12 brønde af en 24-brønds plade kan bruge 1 mL trypsin og 2 mL neutraliserende medier. Når du bruger 12-24 brønde, øge dette til 2 mL af trypsin og 4 mL neutraliserende medier. - Efter 48 timer fjernes pladen fra inkubatoren og placeres i cellekulturhætten. Fjern vækstmediet, og udskift det med 250 μL pr. brønd af differentieringsmedier (tabel 1). Gentag denne medieændring 48 timer senere.
- Efter 48 timer skal du bekræfte differentiering (fire dage efter skift til differentieringsmedier) ved at udtrække RNA, lave cDNA med 250 ng RNA og udføre SYBR grøn baseret qPCR ved hjælp af primere til stamceller (OLFM4 og / eller SMOC2), pokalceller (MUC2), enteroendokrine celler (CHGA) og enterocytter (SI og /eller CYP3A4) (Figur 3).
BEMÆRK: Ved skift fra vækstmedier til differentieringsmedier vil organoider reducere deres udtryk for stamcellemarkører (OLFM4 og /eller SMOC2) og øge ekspressionen af bægerceller (MUC2), enteroendokrine celler (CHGA) og enterocytter (SI og /eller CYP3A4) markører med qPCR. Forbered en ekstra brønd og vedligeholde med vækstmedier for at sammenligne udtryksniveauet for hver celletypespecifik markør i vækst vs. differentieringsmedier. - Ved bekræftelse af differentiering er organoider klar til apikal infektion. Flyt organoiderne til den biosikkerhedsniveau indeslutning, der kræves for patogenet valg.
FORSIGTIG: Se instituttets lokale regler og standardprocedurer ved håndtering af patogener under BSL-2 eller BSL-3 indeslutning. - For at inficere de intestinale organoider, der dyrkes i 2D fra deres apikale side, skal du fjerne medier med en P1000-pipette og tilføje patogen fortyndet ved multiplicitet af infektion, der kræves til eksperimentet i differentieringsmedier (minimumsvolumen af patogen / mediemix er 50 μL pr. Brønd og maksimal volumen er 250 μL pr. Brønd).
- Lad infektionen fortsætte i 2 timer ved 37 °C med enten et rockerbord placeret i cellekulturinkubatoren eller ved manuelt at rokke pladen hvert 15.-20. minut. Optimer denne gang baseret på det foretrukne patogen.
- Efter 2 timer skal du fjerne mediet med en P1000-pipette og erstatte det med 250 μL pr. brønd af friske differentieringsmedier. Inkuber celler ved 37 °C indtil tidspunktet for encellet sekventering.
- Hvis du vil forberede celler til encellet sekventering, skal du fortsætte til afsnit 4.
3. Fremstilling af organoider i tredimensioner (3D) til apikal og basolateral infektion
- Dyrk organoider som beskrevet i afsnit 1 i en 24 brønd, ikke-cellekulturbehandlet plade.
- To dage efter passaging, fjern pladen fra inkubatoren og læg i en cellekulturhætte.
- Fjern vækstmediet med en P1000-pipette, udskift det med 500 μL/brønd af differentieringsmedierne, der er forvarmet til stuetemperatur, og læg pladen i 37 °C-inkubatoren.
- Efter 48 timer udskiftes med friske differentieringsmedier (500 μL/brønd).
BEMÆRK: Organoider vedligeholdes i differentieringsmedier i i alt 4 dage før infektion. - Bekræft differentiering som beskrevet i trin 2.9.
- Efter bekræftelse af, at differentiering har fundet sted, organoider er klar til infektion.
- Optø ECM på is. Varm differentieringsmedierne til stuetemperatur og varm en 24-brønds plade ved 37 °C.
- For at udføre infektioner skal du fjerne organoiderne fra ECM-opløsningen.
BEMÆRK: Fjern så meget ECM-opløsning som muligt, da vira foretrækker at holde sig til ECM-opløsningen i stedet for celler. Hvis der er for meget ECM-opløsning tilbage omkring organoiderne, vil infektionsevnen blive alvorligt påvirket. - Forstyrre ECM ved at tilsætte 500 μL kold 1x PBS og inkubation i 3 min. Brug en P1000 til at pipette op og ned 10x. Kombiner organoider i et rør og centrifuge ved 500 x g i 5 min. Fjern PBS med en P1000.
BEMÆRK: For at minimere variationen mellem hver infektionstilstand skal du kombinere organoiderne, der kommer fra flere brønde af en 24-brønds plade, i det samme koniske rør. For eksempel, hvis otte betingelser for infektion er påkrævet, otte brønde af en 24-brønd plade (indeholdende ~ 100 organoider hver) vil blive kombineret og efterfølgende opdelt i otte brønde af en ny 24-brønd plade efter nåleforstyrrelser (se trin 3.12). - Resuspend organoids i 1 mL af differentiering medier. For apisk og basolateral infektion skal du følge trin 3.10.1 og for basolateral infektion kun følge trin 3.10.2.
- Fastgør en 27 G nål til en 1 mL sprøjte og genbruge pellet seks gange for at tillade afbrydelse af organoider og for infektion at forekomme på både de apikale og basolaterale sider. Fortsæt til trin 3.11.
BEMÆRK: Organoiderne skal være de klassiske cystelignende og blæksprutte-rokkede organoider med et mørkt center, når de observeres før nåleforstyrrelser. Efter afbrydelsen vil disse organoider fremstå mindre med mindre til intet mørkt interiør. Når der udføres infektion, vil der altid være mindst to betingelser (mock og infektion), mindst to brønde af en 24-brønd plade vil i første omgang blive kombineret i en 15 mL konisk rør for nåle-baserede forstyrrelser (forklarer, hvorfor mindst 1 mL bruges til resuspension). Når du udfører mere end to betingelser, kombinere op til 10 brønde af en 24-brønd plade i en enkelt 15 mL koniske rør og resuspend i 1 mL af differentiering medier for nåleforstyrrelser. Efter afbrydelsen tilsættes 500 μL differentieringsmedier pr. n + 1 (hvis du f.eks. bruger 10 brønde, skal du fylde op med 4,5 mL for at have 5,5 mL i alt). Hvis der er behov for mere end 10 betingelser, skal du bruge flere koniske rør. En 1 mL sprøjte anbefales som organoider forstyrres bedre med denne mængde af sprøjten. Et alternativ til en sprøjte er at anvende en godt fladtrykt P1000 tip. - Resuspend organoids i 500 μL af differentiering medier pr godt. Pas på ikke at forstyrre organoiderne og sørg for, at den apikale side ikke er tilgængelig. Fortsæt til trin 3.11.
- Fastgør en 27 G nål til en 1 mL sprøjte og genbruge pellet seks gange for at tillade afbrydelse af organoider og for infektion at forekomme på både de apikale og basolaterale sider. Fortsæt til trin 3.11.
- Overfør 500 μL organoidaffjedring pr. brønd til en 24-brønds cellekulturplade ved hjælp af en P1000-pipette, og flyt pladen til den biosikkerhedsniveau, der kræves for det foretrukne patogen.
FORSIGTIG: Se de lokale regler og instituttets standarddriftsprocedurer ved håndtering af patogener under BSL-2 eller BSL-3 indeslutning. Udfør altid nåleforstyrrelsen af organoiderne uden for BSL-3 for at undgå potentielle ulykker med nålen. Lokale bestemmelser kan også forhindre brug af nåle i BSL-3. - Tilsæt patogenet fortyndet i differentiering medier for at nå mangfoldigheden af infektion, der kræves for eksperimentet. Må ikke overstige et samlet volumen på 500 μL (for at have 1 mL i alt i 24-brøndspladen).
- Lad infektionen fortsætte i 2 timer (denne gang skal tilpasses det foretrukne patogen) ved 37 °C med enten et rockerbord placeret i cellekulturinkubatoren eller ved manuelt at rokke pladen hvert 15.-20. minut.
- Efter inkubationen på 2 timer opsamles organoiderne i et 1,5 mL rør pr. tilstand og drejer ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern mediet, der indeholder patogen, med en P1000-pipette, og opbevar den på is. Vask organoider pellet én gang med PBS.
- Brug organoiderne igen i 50 μL 100% ECM-opløsning (som tidligere var optøet på is), plade i en 24-brønd ikke-cellekulturbehandlet plade forvarmet til 37 °C og inkuberer 24-brøndpladen ved 37 °C i 10-15 min, så ECM-opløsningen kan polymeriseres.
- Efter polymerisering tilsættes 500 μL differentieringsmedier ved stuetemperatur til hver brønd og inkuberes ved 37 °C, indtil høsten høstes til encellet sekventering.
BEMÆRK: Hvis høsten skal ske mere end 48 timer efter såning, skal du ændre medierne hver anden dag ved at fjerne de gamle medier og erstatte det med 500 μL friske differentieringsmedier. Erfaringen har imidlertid vist, at eftersom organoider dyrkes under differentieringsmedier, vil de ikke overleve meget længere end 48 timer.
4. Tilberedning af enkeltcelleopløsning og tilberedning af Gelperler-i-emulsion (GEMs) i biosikkerhedsniveau 3 (BSL-3) betingelser
BEMÆRK: Fuldførelse af følgende trin kræver, at enkeltcellesekvenseringsudstyret (Materialetabel) og en PCR-maskine, der kan håndtere 100 μL-reaktioner, er til stede inde i et BSL-3-anlæg. Organoider dyrkes som beskrevet i afsnit 1 og inficeret som beskrevet i afsnit 2-3 afhængigt af patogenet og indgangsruten. På et forudbestemt tidspunkt efter infektion høstes organoider. Under den metode, der anvendes til at høste intestinale organoider er beskrevet.
- Før du høster inficerede organoider, skal du fjerne enkeltcellegelperlerne (Materialetabel) fra -80 °C og varm til stuetemperatur (mindst 30 minutter tidligere).
- Derudover skal rt-reagenset, reduktionsmidlet B og RT-enzymet C (alle opbevares ved -20 °C) ekvilibrere til stuetemperatur. Brug skabelonafbryderen oligo igen som beskrevet i producentens anvisninger.
BEMÆRK: Alle følgende trin skal udføres i forbindelse med de lokale biosikkerhedsbestemmelser efter den fastsatte standardprocedure for det betragtede patogen. Som tommelfingerregel for BSL-3-arbejde skal det sikres, at ydersiden af alle fartøjer (plader, rør osv.), der forlader en cellekulturhætte, desinficeres korrekt. Det samme gælder for hænder/handsker på den person, der udfører forsøgene. - For at udføre infektioner på organoider seedet i 2D (afsnit 2) gå videre til trin 4.4. For at udføre infektioner på 3D-organoider (afsnit 3) fortsætte til afsnit 4.5.
- For infektioner af 2D organoider, bringe cellekultur plade ind i hætten og fjerne differentiering medier med en P1000 pipette.
- Tilsæt 250 μL af 1x PBS ved stuetemperatur til hver brønd.
- Fjern PBS med en P1000 pipette og tilsæt 250 μL af stuetemperatur dissociation enzym (f.eks TrypLE Express) til hver brønd af en 48-brønd plade. Skift handsker, rengør pladen, og anbring pladen med dissociationsenzymet i 37 °C-inkubatoren.
- Overhold celle dissociation ved mikroskopi hvert 5. minut.
BEMÆRK: Ca. det tager 15 minutter at adskille tarmorganoider, der dyrkes i 2D i enkelte celler. Denne gang skal justeres, da det vil afhænge af, hvor mange organoider der oprindeligt blev sået og inficeret samt på patogenet, da nogle patogener er mere cytopatiske og får organoider til at adskille meget hurtigere end andre. - Efter bekræftelse af en tilsyneladende enkeltcelleophæng skal pladen bringes tilbage i cellekulturhætten og stoppe fordøjelsen ved at tilsætte 250 μL DMEM/F12-medier, der indeholder 10% FBS pr. brønd af en 48-brønds plade.
- Saml cellerne i et 15 ML konisk rør ved hjælp af en P1000 pipette.
- Skift handsker, rengør røret, og drej prøverne ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern forsigtigt mediet/dissociationsenzymet med en P1000 for at opretholde cellepillen i bunden. Genbrug enkelte celler i et minimum volumen af PBS indeholder 0,1% BSA. For tarmorganoider genanvendes i 250 μL for hver brønd af 48-brøndspladen.
- Send celleophængene ind i et FACS-rør med et filter for at fjerne store klumper og placere FACS-røret, der indeholder celler, på is.
- Fortsæt til trin 4.6 for at fortsætte med celletælling og forberedelse af masterblandingen.
- For infektioner af 3D-organoider fjernes pladen fra inkubatoren og placerer den i cellekulturhætten.
- Fjern differentieringsmediet fra hver brønd af 24-brøndpladen med en P1000-pipette. Tilsæt 500 μL iskold 1x PBS til hver brønd og inkuber i 3 minutter på is.
- For at sikre fuld afbrydelse af ECM-opløsningen skal du bruge en P1000-pipette (indstillet til 450 μL). Pipette op og ned 10 gange for at genbruge PBS, ECM-opløsningen og organoiderne; de opslaferede organoider overføres til et 15 mL konisk rør og placeres på is. Saml hver infektion tilstand i sin egen 15 ML koniske rør.
BEMÆRK: Brug af et 15 mL konisk rør giver en bedre, mere tydelig cellepille end et 50 mL konisk rør eller et 1,5 mL rør. - Skift handsker og fjern røret fra cellekulturhætten. Rengør ydersiden af røret.
- Prøverne drejes ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Flyt røret tilbage i cellekulturhætten og fjern PBS med en P1000 pipette for at undgå at genoplive organoidernes pellet fra bunden af røret.
- Brugpillen igen i 1 mL af dissociationsenzymet (f.eks. TrypLE Express). Skift handsker, rengør røret, og inkuber prøverne ved 37 °C.
- Hver 10 min i 30 min, flytte røret tilbage i cellen kultur hætte og genbruge organoider ved pipetter op og ned med en P1000 pipette 10 gange.
BEMÆRK: Normalt kræver tarmorganoider ca. 30 min for at danne en enkelt celleophængning, når de er inficeret i 3D. - For at bestemme, hvornår organoider adskilles med enkelte celler, skal du tage 10 μL af organoidaffjedringen ved hjælp af en p10 pipette.
- Anbring affjedringen i et engangsplastcelletællerslid. Luk prøveindgangsporten med klart tape.
- Skift handsker og rengør ydersiden af celletælleren. Brug et brightfield mikroskop til at afgøre, om en enkelt celle suspension er lavet.
- Efter bekræftelse af en enkelt celle suspension, stoppe fordøjelsen ved at tilføje 1 mL af DMEM/F12 medier, der indeholder 10% FBS og pipette op og ned 10 gange med en P1000 pipette.
- Skift handsker, rengør røret, og drej prøverne ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern forsigtigt mediet/dissociationsenzymet med en P1000-pipette for at undgå at genoplive cellepillen fra bunden af røret.
- Brug de enkelte celler igen i et minimalt volumen af PBS, der indeholder 0,1% BSA. For tarmorganoider genanvendes i 250 μL.
- Send celleaffjedringerne ind i et FACS-rør med et filter for at fjerne store klumper og placere FACS-røret, der indeholder celler, på is.
- Fortsæt til trin 4.6 for at fortsætte med celletælling og forberedelse af masterblandingen.
- Bestem antallet af celler pr. μL ved at tilsætte 10 μL af celleaffjedringen til et engangsplastcelleoptællingskammer.
- Forsegl prøveinputporten med klart tape, før prøven fjernes fra cellekulturhætten, da celleaffjedringen på nuværende tidspunkt stadig er smitsom.
- Skift handsker, rengør celletællingskammeret, og tæl cellenummeret ved hjælp af et brightfield mikroskop.
- Inde i cellekulturhætten skal du forberede en masterblanding af RT Reagens, Template Switch Oligo, Reduktionsagent B og RT-enzymeT C i et 1,5 mL rør i henhold til producentens anvisninger afhængigt af antallet af prøver i eksperimentet. For hver prøve blandes 33,4 μL master i et PCR-rør og opbevares på is.
- Tilsæt cellerne og vandet til mastermikset i henhold til målcellenummeret som beskrevet i producentens anvisninger.
BEMÆRK: 50%-60% af cellerne genfindes normalt (dvs. ved indlæsning af 10.000 celler på chippen anvendes 5.000-6.000 celler til analyse). Læg derfor altid 10.000 celler. Hvis celletætheden ikke tillader dette, centrifugere cellerne og genbruges i et lavere volumen. Pas på ikke at overbelaste chippen, da dette vil resultere i tilstopning af chippen. Derudover, hvis cellerne ikke er korrekt adskilt, vil der være en øget risiko for at få flere celler pr perle, som skal fjernes i downstream bioinformatik behandling. - Skift handskerne, flyt enkeltcellecontrolleren ind i cellekulturhætten, og forbered chippen, da chippen kun er dækket af en pakning, der ikke er forseglet.
BEMÆRK: Maskinen skal være inde i emhætten for at forhindre eksponering for inficerede celleaffjedring og potentielle aerosoler. - Tilsæt encellet chip til chipholderen og fyld de ubrugte baner med 50% glycerol.
- Tilsæt master mix, perler, og partitionering olie til de baner, der anvendes til prøver som pr producentens anvisninger.
- Dæk chippen med pakningen, læg chippen i controlleren, og start programmet.
BEMÆRK: Det anbefales kun at læsse seks af de otte baner. Problemer med forkert emulsioner forekommer ofte i vognbane et og otte. Virksomheden siger, at alle baner er uafhængige, og dette bør ikke ske; hvis det er muligt, skal du dog undgå disse to baner og køre to chips, hvis der er behov for otte prøver. - Når programmet er afsluttet, skal du fjerne chippen og pakningen.
- Brug en multikanal pipette og overfør 100 μL af emulsionerne til et rent PCR-rør. Sørg for, at hver brønd har en ensartet hvid farve, der angiver en komplet emulsion er opstået.
- Skift handsker, rengør rørene, og overfør PCR-røret til en PCR-maskine, der kan understøtte 100 μL-reaktioner. Kør programmet: 53 °C i 45 min; 85 °C i 5 min.
- Når prøverne er færdige, opbevares prøverne ved 4 °C. På dette tidspunkt skal reaktionen behandles i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger eller opbevares ved 4 °C i 3 dage eller -20 °C i 1 uge.
- Efter 5 min ved 85 °C vil de fleste indhyllede vira blive inaktiveret, fjerne cDNA fra BSL-3 i henhold til den normale driftsprocedure og udføre bibliotekets forberedelser i et BSL-1 laboratorium.
BEMÆRK: Dette eksperiment skal udføres som tre biologiske kopier (f.eks. på tre forskellige dage), fordi omfanget af differentiering af hver celletype kan variere lidt mellem hvert eksperiment. De resulterende sekventeringsbiblioteker kan indekseres forskelligt og sekvenseres sammen i én rækkefølge.
Representative Results
Fremstilling af organoider til encellet sekventering
Enkeltcellede sekventeringsresultater er meget afhængige af at bruge celler af god kvalitet. For at sikre, at organoider er af god kvalitet, skal de vedligeholdes og observeres korrekt dagligt for at bestemme, hvornår de er klar til at blive delt (Figur 2). Tidspunktet for opdeling af organoider er donorafhængigt; nogle donorer vokser hurtigere og skal opdeles hver 5. dag, mens andre er langsommere og skal opdeles hver 10. dag. I gennemsnit opdeles organoider en gang om ugen, når centrene bliver mørke (Figur 2B). Hvis organoider får lov til at blive for store og akkumulere for mange døde celler i midten, vil organoiden dø.
Organoider vedligeholdes i et medie, der indeholder store mængder Wnt3A. Dette understøtter stamcelle niche og fremmer organoider til at fortsætte med at vokse og formere sig. Under disse vækstbetingelser indeholder organoiderne store mængder stamceller og transitforstærkende celler og en lavere mængde differentierede cellepopulationer som modne enterocytter, pokalceller og enteroetdokrine celler. Men for at efterligne den cellulære kompleksitet findes i den menneskelige tarm, Er det vigtigt at skubbe celledifferentiering og producere flere af disse celler. Dette opnås ved at ændre medieforholdene og fjerne Wnt3A og reducere R-Spondin og Noggin (tabel 1). Normalt kræver cellulære differentiering mod enterocytter, pokalceller og enteroendokrine celler 4 dages differentieringsmedier (Figur 3). Det er afgørende at opnå en god differentiering. Ellers vil det blive vanskeligt at evaluere patogentrofi og celletypespecifikke reaktioner.
Bekræftelse af BSL-3 patogeninaktivering
Fuld inaktivering skal bekræftes med det foretrukne patogen og valideres, at det er sikkert at fjerne cDNA fra BSL-3. For SARS-CoV-2 blev fuld inaktivering af virusset valideret ved at tage 100 μL SARS-CoV-2 og inkubere den i en PCR-maskine i 5 min ved 85 °C. Virussen blev derefter tilføjet tilbage til naive Vero-celler, og virusinfektion blev sammenlignet med ikke-varmebehandlet virus ved immunfluorescence og plaque assays ved 24 timer, 48 timer og 72 timer efter infektion for at sikre, at alle partikler ikke længere var smitsomme. Disse resultater blev sendt til det lokale regulerende organ, og efter deres godkendelse blev enkeltcellet eksperiment og cDNA-behandling udført.
Resultater af rækkefølge med enkelt celle
For at vurdere, hvordan SARS-CoV-2 inficerer menneskelige kolon og ileum organoider, encellet sekventering blev udført. Organoider blev fremstillet som beskrevet ovenfor og inficeret i et 2D-format for at give mulighed for apisk infektion med SARS-CoV-2. Inficerede celler blev høstet ved 12 timer og 24 timer efter infektion og blev behandlet til encellet sekventering som beskrevet ovenfor. Analyse af enkeltcellede sekventeringsdata gjorde det muligt for os at fastslå, at kun en underpopulation (umoden enterocyt 2) af humane tarmepileleceller understøttede infektionen af SARS-CoV-2 (Figur 4). Da ikke alle celler i en population var inficeret, blev både inficerede celler og ikke-inficerede tilskuerceller desuden analyseret (Figur 5). Disse resultater viste, at SARS-CoV-2 fremkaldte en proinflammatorisk signalkaskade i inficerede celler, mens ikke-inficerede tilskuerceller viste et interferonmedieret immunrespons. Derudover viste scRNA-Seq, at inficerede celler ikke var i stand til at fornemme interferoner på grund af virusmedieret blokering af stien (Figur 5). Det var ikke muligt at få disse oplysninger, når du bruger bulk RNA sekventering.
Figur 1: Skematisk skildrer de tre forskellige metoder til at forberede menneskelige intestinale organoider til infektion med enteriske patogener. Apisk infektion kan opnås ved såning af tarmorganoider i 2D. En apisk og basolateral infektion kan udføres ved at forstyrre 3D-organoiden. Endelig kan en basolateral kun infektion udføres ved at inficere intakte 3D intestinale organoider. Hver af disse metoder kan bruges til at generere prøver til enkelt celle sekventering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Organoid vedligeholdelse skematiske og repræsentative brightfield billeder. (A) Skematisk for vedligeholdelse og passaging af menneskelige intestinale organoider. (B). Repræsentant brightfield billeder af dag 1, 3, 5 og 7 post-opdeling. Ved dag 7 bliver organoiderne store og mørke på grund af ophobning af døde celler og er klar til at blive delt. Skalalinjen angiver 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativ qPCR af humane tarmorganoider 4 dage efter skift til differentieringsmedier. Intestinale organoider blev opretholdt i vækstmedier eller skiftede til differentieringsmedier i 4 dage. RNA blev høstet, og qPCR blev udført for markører af stamceller (OLFM4), Paneth-celler (LYZ), Pokalceller (MUC2) og enterocytter (SI). N = 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Identifikation af den cellepopulation, der er inficeret med SARS-CoV-2. Human kolon og ileum afledte organoider blev inficeret med SARS-CoV-2. Efter 12 og 24 timer efter infektion celler blev høstet og udsat for encellet RNA sekventering for at identificere, hvilke cellepopulationer støttede SARS-CoV-2 infektion. Virusinfektion viste sig at stige over tid og inficerer hovedsageligt umodne enterocyt 2. Dette tal er blevet ændret fra Triana et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Bestemmelse af iboende medfødt immunrespons. Human kolon afledte organoider blev inficeret med SARS-CoV-2. Efter 12 og 24 timer efter infektion celler blev høstet og udsat for enkelt celle RNA sekventering at bestemme den iboende medfødte immunrespons i både virusinficerede og ikke-inficerede tilskuerceller. SARS-CoV-2 inficerede celler viste en stærk proinflammatorisk respons, mens ikke-inficerede tilskuerceller viste et interferonmedieret respons. Figur modificeret fra Triana et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Vækst Medier | |
| Forbindelse | Endelig koncentration |
| Annonce DMEM/F12 | GlutaMAX (1x) |
| +GlutaMAX | HEPES 1 mM |
| +HEPES | Pen 10 U/mL |
| +P/S | Strep 10 μg/mL |
| L-WRN | 50 % efter volumen |
| B27 | 01:50 |
| N-acetyl-cystein | 1 mM |
| EGF | 50 ng/mL |
| A83-01 | 500 nM |
| IGF-1 | 100 ng/mL |
| FGF grundlæggende | 50 ng/mL |
| Gastrin | 10 mM |
| Differentieringsmedier | |
| Forbindelse | Endelig koncentration |
| Annonce DMEM/F12 | GlutaMAX (1x) |
| +GlutaMAX | HEPES 1 mM |
| +HEPES | Pen 10 U/mL |
| +P/S | Strep 10 μg/mL |
| B27 | 01:50 |
| N-acetyl-cystein | 1 mM |
| R-spondin | 5% efter volumen |
| Noggin | 50 ng/mL |
| EGF | 50 ng/mL |
| Gastrin | 10 mM |
| A83-01 | 500 nM |
Tabel 1: Mediesammensætning for vækst- og differentieringsmedier.
Discussion
Enteriske patogener starter oftest deres livscyklus ved at inficere tarmepileleceller fra deres apikale side mod tarmens lumen. Mens organoider er velkendte for at være en god model til at reproducere den cellulære kompleksitet og organisering af tarmepitele, gør deres organisation som tredimensionelle, lukkede strukturer deres apikale membran utilgængelig for patogenet. Denne protokol beskrev metoder til at inficere intestinale organoider fra deres apikale side, deres basolaterale side, eller begge med BLS-3 patogener. Disse protokoller kan nemt tilpasses til at studere ethvert enterisk patogen under BSL-2 eller BLS-3 indeslutning eller enhver anden organoid model ved at følge et par kritiske trin, der er fremhævet nedenfor. Den ovenfor beskrevne metode er til isolering og tilberedning af enkeltcellede dråber i overensstemmelse med reglerne i Tyskland. Som en ansvarsfraskrivelse beskriver denne protokol ikke de biosikkerhedshåndteringsforanstaltninger (standardprocedurer), der skal træffes, mens du arbejder under BSL-3-betingelser. Det er også vigtigt at insistere på, at reglerne kan variere i andre lande, og at de lokale myndigheder skal kontaktes for at sikre, at alle lokale bestemmelser overholdes.
Et af de kritiske trin i såning organoider i to dimensioner for apikal infektion er at kontrollere, at cellerne vil ligeledes differentiere sig i forhold til, når de dyrkes som klassiske tre-dimensionelle organoider. Afhængigt af det enteriske patogen kan tropoisme begrænses til meget sjældne celler eller til celler, der skal være meget differentierede. I dette tilfælde kan brug af en todimensionel organoid, der ikke fuldt ud differentierede, resultere i den fejlagtige aftale om, at dette enteriske patogen ikke kan inficere tarmorganoider. Det foreslås, hvis det er muligt, at udføre infektioner ved hjælp af de tre konfigurationer af denne protokol: 2D organoid til apisk infektion kun (afsnit 2), revnede åbne 3D organoider til apikal og basolateral infektion (afsnit 3) og fulde 3D organoider til basolateral infektion kun (afsnit 3). Denne tilgang vil bidrage til at skelne patogenets indgangsvej (apikal vs. basolateral) og vil også kontrollere, at der er opnået et lignende differentieringsniveau. Et alternativ til 2D-apikal infektion er mikroinjektion, som vil bruge en 3D-organoid, men levere patogenet direkte ind i den apikale side (se Bartfeld et al.27 for detaljer). Denne metode kræver en dygtig injektor for at sikre, at patogenet er korrekt placeret, og organoiderne forbliver intakte. Microinjection er almindeligt anvendt i BSL-2 indeslutning og kan ikke være egnet til BSL-3 indeslutning.
En yderligere vigtig overvejelse, når man udfører infektionsforsøg i 2D-seedede organoider, er den endelige celletæthed. Som nævnt i trin 2.3, vil 100-150 organoider blive sået i en brønd af en 48-brønd plade eller en brønd af en 8-brønd glas-bund kammer slide. Afhængigt af organoidlinjen og på den person, der håndterer organoiderne, kan størrelsen af disse organoider være betydeligt forskellig. Dette kan resultere i meget forskellige celletætheder i 48-brøndspladen eller 8-brønd glasbundet kammerrutschebane. Afhængigt af den enteriske virus foretrækker nogle vira mere sparsomme celler, mens andre også vil være i stand til at inficere sammenløbsceller. Den molekylære oprindelse af sådanne forskelle i infektionsevne for forskellige celle sammenløb er ikke klar; Pilotforsøg, der har til formål at finde den bedste celletæthed for det valgte enteriske patogen, bør derfor udføres, inden der udføres yderligere downstream-karakterisering.
Ofte FCS sortering udføres forud for udførelsen af enkeltcellet dråbe emulsion. Dette trin bruges ofte til at adskille døde fra levende celler og enkelte celler fra doublets. Når du arbejder med BSL-3 patogener, kræver det, at anlægget er udstyret med en passende FACS-sortering, hvilket ikke ofte er tilfældet. Desuden har ikke alle celler i en organoid samme størrelse, og det er ofte svært at skelne mellem en dobbelt eller en større celle, hvilket forårsager en risiko for negativt at vælge mod en bestemt celletype. Der er også stadig diskussion på området, om den tid, der er nødvendig for sortering mellem 5.000-10.000 for hver prøve, kan resultere i en betydelig ændring af udskriftsprofilen for de enkelte celler. Mens cellefikseringsmetoder, der er kompatible med encellesekvensering (f.eks. methanol og RNAassist), er blevet beskrevet, blev det observeret, at dette fører til et fald i kvaliteten af sekventering18. Endelig er der mistanke om, at sortering af celler ved hjælp af celledødsmarkører også kan føre til en bias. I betragtning af den retningsbestemt spredning og differentiering af cellerne gennem krypt-villi aksen, de mest differentierede celler, som vil blive kastet og frigivet, er placeret på spidsen af villi. Disse celler er ofte positive for forskellige markører for celledødsveje (f.eks. apoptose, nekrose og nekrose); men når man ser på rotavirus infektion i musen tarm, spidsen af villi er den mest inficerede område28. Således filtrere celler, der kan se positive for død markører ville resultere i en negativ udvælgelse af de inficerede celler, der kan repræsentere den fysiologiske infektion. I øjeblikket er der ingen god løsning til sortering og fastsættelse af organoider før enkeltcellet sekventering. Brug af levende, usorterede celler anbefales, da yderligere undersøgelser er nødvendige for at finde egnede alternative protokoller.
Sekvensering med en enkelt celle har revolutioneret, hvordan cellulære svar kan evalueres. Denne teknik giver mulighed for identifikation af celle afstamningsspecifikke reaktioner både under basale forhold og under patogeninfektioner. Denne metode har åbnet døre på mange områder, der tidligere var begrænset af masseudlæsninger. Mens denne metode er meget kraftfuld, har den sine begrænsninger. En vigtig begrænsning er den omfattende bioinformatiske analyse, der kræves nedstrøms af sekventering. Dette er især nøglen, når du analyserer væv og tildeler celletyper, hvor der i øjeblikket ikke er nogen anmærkning. At have en dygtig bioinformatiker er nødvendig for at støtte alle encellede undersøgelser.
Denne protokol beskriver, hvordan man frø og håndtere menneskelige intestinale organoider, inficere dem med enteriske patogener, og udføre scRNAseq. Tilpasning af denne tilgang til andre organer er nu mulig, da organoide modelsystemer er blevet udviklet til de fleste organer. Lunge- og leverorganoider er ligeledes organiseret i forhold til tarmorganoider, og som sådan kan ved hjælp af en analog tilgang overføres til disse organoider. Den kritiske kontrol vil være at validere, at når de dyrkes i to dimensioner eller revnet åben, opnår disse organoider lignende differentiering som deres 3D-organoide modstykker. De specifikke træk og gener, der definerer en differentieret status, er specifikke for hver organmodel. Andre organoid modeller såsom nyre og vaskulære organoider, store tætte strukturer, vil have brug for yderligere metoder til serielt at adskille disse strukturer i enkelte celler.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Megan Stanifer og Steeve Boulant blev støttet af forskningsbevillinger fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Projektnummer 240245660, 278001972, 415089553 og 272983813 til Steeve Boulant og 416072091 til Megan Stanifer), staten Baden-Württemberg og Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B til MS og 01KI20198A og (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) til SB. Skemaer blev oprettet i BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
| 24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
| 8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
| A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
| B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
| CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
| CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
| DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
| Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
| Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
| GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
| HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
| L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
| MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
| MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
| MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
| N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
| OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
| OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
| Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
| Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
| Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
| SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
| SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
| TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
| Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |
References
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection. Cells. 9, (2020).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. Human norovirus transmission and evolution in a changing world. Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).
- Leshem, E., et al. Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, Suppl 2 155-160 (2016).
- Karst, S. M. The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353, 1387-1393 (2016).
- de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).
- Scaldaferri, F., et al. The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications. Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).
- Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test. Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369, 50-54 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells. Cell Reports. 32, 107863 (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. bioRxiv. , (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Molecular Systems Biology. 17, 10232 (2021).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).
- García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection. Viruses. 12, 1288 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells. Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).
- Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478 (2019).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483 (2015).
- Fujii, M., et al. Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359 (2015).
- Hernandez, P. P., et al. Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection. Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).
