Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En tredimensjonal sfæroidmodell for å undersøke tumor-stromal interaksjon i hepatocellulært karsinom

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62868
Automatic Translation
*1,2, *2, 2, 2, *3, *4,5
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Minia University, 2National Institute for Health Research Birmingham Liver Biomedical Research Unit and Centre for Liver and Gastrointestinal Research, Institute of Immunology and Immunotherapy, University of Birmingham, 3Newcastle Fibrosis Research Group, Biosciences Institute, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 4Newcastle University Translational and Clinical Research Institute, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 5The Liver Unit, Department of Medicine, Freeman Hospital, Newcastle-upon-Tyne Hospitals NHS Foundation Trust
* These authors contributed equally

Summary

Omfattende in vitro-modeller som trofast rekapitulerer den aktuelle menneskelige sykdommen mangler. Den nåværende studien presenterer tredimensjonal (3D) tumor sfæroid skapelse og kultur, et pålitelig in vitro verktøy for å studere tumor-stromal interaksjon i humant hepatocellulært karsinom.

Abstract

Aggressiviteten og mangelen på godt tolererte og allment effektive behandlinger for avansert hepatocellulært karsinom (HCC), den dominerende formen for leverkreft, rasjonaliserer sin rang som den nest vanligste årsaken til kreftrelatert død. Prekliniske modeller må tilpasses for å rekapitulere de menneskelige forholdene for å velge de beste terapeutiske kandidatene for klinisk utvikling og hjelpe til med levering av personlig medisin. Tredimensjonale (3D) cellulære sfæroidmodeller viser løfte som et fremvoksende in vitro-alternativ til todimensjonale (2D) monolayerkulturer. Her beskriver vi en 3D tumor sfæroid modell som utnytter individuelle cellers evne til å aggregere når de opprettholdes i hengende dråper, og er mer representativ for et in vivo-miljø enn standard monolayers. Videre kan 3D-sfæroider produseres ved å kombinere homotypiske eller heterotypiske celler, mer reflekterende av cellulær heterogenitet in vivo, noe som potensielt muliggjør studiet av miljøinteraksjoner som kan påvirke progresjon og behandlingsresponser. Den nåværende forskningen optimaliserte celletettheten for å danne 3D-homotypiske og heterotypiske tumorsfæroider ved å immobilisere cellesuspensjoner på lokkene til standard 10 cm3 Petri-retter. Langsgående analyse ble utført for å generere vekstkurver for homotypisk versus heterotypisk tumor / fibroblaster sfæroider. Til slutt ble den proliferative effekten av fibroblaster (COS7-celler) og lever myofibroblaster (LX2) på homotypisk svulst (Hep3B) sfæroider undersøkt. En såddtetthet på 3000 celler (i 20 μL media) ga vellykket Huh7 / COS7 heterotypiske sfæroider, som viste en jevn økning i størrelse opp til kultur dag 8, etterfulgt av vekstretardasjon. Dette funnet ble bekreftet ved hjelp av Hep3B homotypiske sfæroider dyrket i LX2 (humant lever stellate cellelinje) betinget medium (CM). LX2 CM utløste spredning av Hep3B sfæroider sammenlignet med kontrolltumor sfæroider. Til slutt har denne protokollen vist at 3D tumor sfæroider kan brukes som et enkelt, økonomisk og prescreen in vitro-verktøy for å studere tumor-stromale interaksjoner mer omfattende.

Introduction

Den globale forekomsten og dødeligheten av leverkreft har fortsatt å øke, til tross for fremskritt i behandlinger for leversykdom og de fleste andre typer kreft. I 2018 overgikk leverkreft kolorektal og magekreft for å bli den nest vanligste årsaken til kreftrelatert død globalt1. I 2020 var det mer enn 9.00.000 nye diagnoser, som utgjorde 4,7% av de totale krefttilfellene over hele verden1. Dette er spesielt skuffende, gitt at de betydelige risikofaktorene for utvikling av HCC, den vanligste formen for leverkreft, er godt karakterisert2. Cirrhose er den vanligste risikofaktoren for utvikling av HCC, med 80% av tilfellene som utvikler seg på bakgrunn av etablert skrumplever2. Kroniske leversykdommer, som utvikler seg til skrumplever, og følgelig HCC, inkluderer Hepatitt B-virus (HBV), Hepatitt C-virus (HCV), alkoholrelatert leversykdom (ARLD), alkoholfrie fettleversykdommer (NAFLD) - sistnevnte tilskrives fedme og type 2 diabetes mellitus (T2DM)2,3. Dagens styringsprotokoller for HCC er sceneavhengige og begrenset for de med avansert kreft, som oftest har dårlig utfall4. Det har vært betydelige fremskritt ved bruk av kinasehemmere og, mer nylig, immun-onkologi behandlinger, men realistisk, nytte bare et mindretall av pasienter med avansert leverkreft5. Videre er det bekymring for at HCC-er som oppstår hos pasienter med NAFLD - den raskest voksende underliggende årsaken, som står for mer enn 50% av nylig diagnostiserte HCC-tilfeller i vestlige nasjoner, kan være mer motstandsdyktige mot programmert død 1 (PD1) sjekkpunkthemmerbehandling6.

Det har vært en massiv investering i kliniske studier for pasienter med HCC, inkludert betydelige forbedringer i kliniske studier og deres endepunkter7. Etter et tiår med feil har disse investeringene begynt å endre mulighetene for pasienter. Realiteten er imidlertid at den totale andelen respondere forblir relativt dårlig, med pasienter rekruttert til studier som ofte representerer de som er tatt vare på på klinikkene. Faren er at fremskrittene er kostbare og kommer de få til gode i stedet for de mange. Etter hvert som flere kandidatterapier dukker opp for engangsbruk eller kombinasjon, er det viktig å ha prekliniske modeller som er mer prediktive for in vivo-svar. Dette vil sannsynligvis være modeller som inneholder ytterligere faktorer som bidrar til variasjonen sett i pasientresponser som bedre gjenspeiler menneskelig HCC-heterogenitet og patologisk kompleksitet8. Systemer som gjenskaper de in vivo patofysiologiske forholdene til HCC er nødvendig for å forstå biologien til tumorutvikling, vekst og progresjon. De eksisterende eksperimentelle modellene av kroniske leversykdommer og HCC faller vanligvis inn under tre hovedkategorier: in vivo dyrebaserte modeller (gjennomgått i9), in vitrokulturer10 og ex vivo11,12 modeller. Dyrebaserte tilnærminger brukes mye til å studere kroniske leversykdommer, inkludert HCC; Imidlertid er den genetiske variasjonen, høye driftskostnader og de forskjellige immunsystemene mellom arter blant de viktigste begrensningene for å bruke slike modeller9. Mens noen ex vivo-modeller gir et utmerket verktøy for å fokusere på menneskelig vev sammenlignet med andre in vitro-cellelinjemodeller, hindrer vevstilgjengelighet og det begrensede eksperimentelle tidsforløpet deres utnyttelse i stor skala.

På den annen side er in vitro-cellelinjemodellene fortsatt et godt alternativ for forskere som jobber med begrensede ressurser, med et mindre behov for å ha en konstant tilførsel av friskt menneskelig vev10. Disse modellene gir også et verktøy som kan brukes som en første skjerm for å hjelpe med målvalidering av legemiddelvalg før du går videre til mer komplekse in vivo-modeller. Den nylige modifikasjonen av de tradisjonelle 2D-monolayerkulturene i 3D-kulturer har forbedret effekten av disse in vitro-modellene13,14.

3D in vitro-modeller kan rekapitulere kritiske trekk sett under menneskelige normale og patologiske forhold. Under fysiologiske forhold initieres signaltransduksjon gjennom cellulær krysstale og interaksjon med andre bindevevsmolekyler, nemlig de ekstracellulære matriseproteinene (ECM), som danner et 3D-interaksjonsnettverk15,16. Svulsten utvikler seg i en 3D sfærisk form under ondartet transformasjon, for hvilke oksygen og næringsstoffer er lett rikelig i ikke-tumor / tumor interfase. Samtidig dominerer hypoksiske forhold ved tumorkjernen. Denne heterogeniteten i næringstilgjengelighet resulterer i aktivering av romlig distinkte signalering og metabolske veier som regulerer tumorigenesis. Disse forholdene er dårlig rekapitulert i de konvensjonelle 2D-monolayerkulturene14, der celler vokser på stiv kulturplast på en fysiologisk irrelevant måte. Kreftceller kommuniserer også med andre ikke-parenchymale celler, den primære kilden til ECM, vekst og invasjonssignalering i tumormikromiljøet. I motsetning til 2D-kulturer kan 3D in vitro-modeller gi en mer passende plattform for å studere denne tumor-stromale interaksjonen17.

3D-modeller er mye brukt i HCC-feltet, og de varierer i måten mikrovevet dannes på18,19,20,21,22,23. De fleste av disse modellene brukte enten de ultra-lave bindingsplatene18,19,20,21,22 eller trans-wells23 i prosessen med sfæroiddannelse. Protokollen som er beskrevet introduserer hengende dråpeteknikk som en alternativ, plastfri og kostnadseffektiv in vitro 3D tumor sfæroid modell. Dette kan lette vurderingen av parakrine- og autocrine-rollene til fibroblaster på spredningen av tumorcellene i et 3D-format.

Protocol

1. Celleforberedelse

  1. Utfør alle forsøkene under sterile forhold i klasse II laminær strømningsmikrobiologisk sikkerhetsskap (se materialfortegnelse).
    1. Slå på hetten og la det stabilisere luftstrømmen.
    2. Spray den innvendige hetteoverflaten grundig med 70% etanol for å eliminere eventuell forurensning fra tidligere brukere.
    3. Forbered 5% av en desinfiserende løsning i et 500 ml glassbeger. Kast celle supernatant eller cellerester inne i løsningen.
    4. Rengjør alle mikropipetter og spissbokser grundig med 70% etanol.
  2. Forbered ferske cellekulturmedier ved å supplere Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) høye glukosemedier med 10% varme deaktivert foster bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (100 enhet/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin) og 2 mM L-glutamin. For LX2 lever stellate celle linje, redusere konsentrasjonen av FBS supplement til 2%.
  3. Varme kulturmedier før eksperimentet startes.
  4. Ta Huh7 og Hep3B HCC tumorcellelinjer og COS7 og LX2 fibroblastcellelinjer fra lagringsstativet i flytende nitrogen. Raskt tine kryopreserverte celler.
  5. Fortynn opptinte celler med 2 ml ferske kulturmedier. Sentrifuger celler ved 200 x g i 4 min ved romtemperatur. Kast den supernatante og resuspend cellepellet i 1 ml friske varme kulturmedier.
  6. Frøceller i T75 cellekulturflaske. Inkuber cellene i en cellekulturinkubator i 5% CO2 ved 37 °C i 95 % fuktige tilstander til cellene når 60 %-70 % samløp.

2. Cellesamling

  1. Aspirer kulturmedier og vask celler tre ganger med fosfatbuffers saltvann (PBS).
  2. Tilsett 2 ml forvarmet 1x Trypsin for å løsne tilhengerceller fra bunnen av T75-kolbe. Inkuber ved 37 °C i en inkubator i 4 minutter.
  3. Deaktiver trypsin ved å legge til 4 ml komplette kulturmedier. Samle cellefjæring og sentrifugeceller ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspend cellene i 4 ml friske kulturmedier.

3. Celletelling

  1. Virvel cellefjæringen forsiktig for å sikre homogen fordeling av celler i sentrifugerøret.
  2. Bruk en 10 μL pipette, bland 10 μL celleoppheng med 10 μL Trypan blå. Rør blandingen forsiktig opp og ned fire ganger for å sikre fullstendig farging av den ytre celleoverflaten med fargestoffet.
  3. Tell antall celler ved hjelp av et hemocytometer.
    1. Først plasserer du en deksle over hemocytometertellingsområdet før du laster inn den fargede cellefjæringen.
    2. Plasser pipettespissen som inneholder cellefjæringen, i V-sporet på hemocytometeret. Trekk forsiktig ut spissinnholdet i telleskuffen.
    3. La slurry å bosette seg i et par minutter før du fikser det på mikroskopstadiet for celletelling.
      MERK: For å unngå dobbelttelling teller du bare cellene på de to sidene av den store firkanten.
    4. Tell i celler som overlapper den øverste eller høyre avgjørelsen, og unngå de som overlapper den nederste eller venstre kjennelsen.
  4. Beregne totalt antall celler.
    MERK: Cellenummer per ml = Equation 1

4. Innsamling av fibroblastkondisjonerte medier (CM)

  1. Aspirer kulturmedier og vask LX2-cellene tre ganger med PBS.
  2. Tilsett 2 ml forvarmet 1x Trypsin for å løsne tilhengerceller fra bunnen av T75-kolbe. Inkuber kolben ved 37 °C i en inkubator i 4 minutter.
  3. Deaktiver trypsin ved å legge til 4 ml komplette kulturmedier. Samle cellefjæring og sentrifugeceller ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur. Tell cellene i henhold til trinn 3.
  4. Frø 1 x 106 LX2 celler i 10 cm3 retter for 48 timer ved 37 °C.
  5. Samle fibroblast CM etter 48 timer. Sentrifuge ved 200 x g i 4 min ved romtemperatur for å pellets noen flytende celler. Sterilfilter CM ved hjelp av et 0,22 μm filter festet på bunnen av 20 ml sprøyter.
  6. Samle den supernatante CM. Aliquot CM i 2 ml rør og lagre ved -80 °C for videre bruk.
    MERK: Oppløsningen kan oppbevares i 6 måneder ved -80 °C.

5. Validering av celletetthet for perfekte sfæroider

  1. Aspirer kulturmedier og vask HCC-cellelinjene tre ganger med PBS.
  2. Tilsett 2 ml forvarmet 1x Trypsin for å løsne tilhengerceller fra bunnen av T75-kolbe. Inkuber ved 37 °C i en inkubator i 4 minutter.
  3. Deaktiver trypsin ved å legge til 4 ml komplette kulturmedier. Samle cellefjæring og sentrifugeceller ved 200 x g i 4 minutter ved romtemperatur.
  4. Tell cellene i henhold til trinn 3.
  5. Pipette forskjellige tettheter fra tumorcellelinjene (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 og 125 celler) i 20 μL medier på den indre overflaten av et 10 cm3 lokk på en Petri-tallerken.
  6. Tilsett 10 ml steril PBS på bunnen av parabolen for å gi fuktige forhold for prosessen med sfæroiddannelse.
  7. Snu lokket på 10 cm3-parabolen slik at mediet, inkludert celleopphenget, kan henge over et fuktig miljø. La de hengende dråpene stå i 3 dager.
  8. Ta bilder av sfæroidene ved 50x forstørrelse ved hjelp av et invertert mikroskop 3 dager etter å ha hengt de originale dråpene.

6. Heterotypisk svulst / stromale sfæroider

  1. Suspender 1500 Huh7 HCC-celler med 1500 COS7 pattedyrfibroblastceller (1:1-forhold) i hengende dråper for å danne sfærer. Tilsett 10 ml steril PBS på bunnen av parabolen for å gi fuktige forhold for sfæroidene.
  2. Snu lokket på 10 cm3-parabolen slik at mediet, inkludert celleopphenget, kan henge over et fuktig miljø. La de hengende dråpene stå i 3 dager.
  3. Ta bilder av sfæroidene ved hjelp av et omvendt mikroskop fra dag 3 til dag 10 av kulturen.
    1. Sett 10 cm3 parabolen på mikroskopstadiet. Juster forstørrelsen av mikroskopet ved 50x for alle sfæroider.
    2. Åpne mikroskopprogramvaren på den tilkoblede datamaskinen og juster fokuset for å ha et klart bilde av hver sfæroid. Bruk opptaksverktøyet på mikroskopprogramvaren til å lagre de oppkjøpte bildene.

7. Homotypiske Hep3B sfæroider i LX2 CM

  1. Suspender 3000 Hep3B HCC-celler i de hengende dråpene for å danne sfærer. Tilsett 10 ml steril PBS på bunnen av parabolen for å gi fuktige forhold for sfæroidene.
  2. Snu lokket på 10 cm3-parabolen slik at mediet, inkludert celleopphenget, kan henge over et fuktig miljø. La de hengende dråpene stå i 3 dager.
  3. Overfør Hep3B sfæroider til 20 μL fersk CM fra LX2-celler i hengende dråper.
    MERK: Bruk sterile autoklavede ufiltrerte 200 μL pipettespisser i prosessen med sfæroidoverføring for å unngå forstyrrelser eller skader på de dannede sfæroidene. Dette er også for å eliminere eventuelle gjenværende celler som forblir uattrist festet til hovedsfæroiden.
    1. Bruk en autoklavert 20 μL pipette for overføringsprosessen. Juster pipettevolumet til 2 μL. Fest pipettespissen til pipetten.
    2. Snu lokket på den 10 cm3 parabolen som sfæroidene ble dannet på. Fest lokket på scenen til et lysmikroskop. Juster mikroskopets fine fokus for å gjøre hver sfæroid synlig.
    3. Tøm luften forsiktig fra mikropipetten ved å trykke på stempelknappen. Sett pipettespissen inn i dråpen, inkludert sfæroiden, som skal overføres. Kom veldig nær sfæroiden uten å berøre den med spissen.
    4. Slipp trykket forsiktig på stempelknappen for å la sfæroidens sug komme inn i mikropipettespissen i 2 μL-medier.
    5. Overfør sfæroiden til en ny dråpe som henger på en ny 10 cm3 tallerken, med nye medier / betingede medier / behandling.
      MERK: Sørg for at alle sfæroidene overføres til den nye 10 cm3-retten ved hjelp av lysmikroskopet.
  4. Ta bilder av sfæroidene ved 50x forstørrelse ved hjelp av et invertert mikroskop fra overføringsdagen (dag 3) til dag 7 av kulturen i LX2 CM.

8. Beregning av sfæroidvolum

  1. Tilordne en unik numerisk identifikator for hver sfæroid slik at bilder fra samsvarende sfæroider kan tas daglig.
  2. Analyser bilder av de voksende sfæroidene ved hjelp av en programvarepakke for bildeanalyse.
    1. Åpne hvert sfæroidbilde i programvarepakken. Bruk markeringsverktøyet Frihånd og kontur hver sfæroid. Velg Angi måling på rullegardinmenyen Analyse, og velg deretter Område. Trykk OK.
    2. Tegn en sirkel manuelt rundt hver sfæroid. Når kulen er sirklet inn, trykker du CTRL + M for å la programmet beregne sfæroidområdet i piksler. Konverter arealet av sfæroiden til et volum.
      MERK: Volumet av sfæroidmm3 =0,09403 × Equation 2
    3. Beregn endringen i sfæroidvolum i forhold til volumet på den første dagen av bildeopptak.
      MERK: Dette er for å normalisere sfæroidvolumet til startvolumet og forbedre nøyaktigheten gitt den naturlige variasjonen i startstørrelsen.

Representative Results

Celler dyrket i et flerlags 3D-format gjenspeiler mer nøyaktig kompleksiteten i tumormikromiljøet enn konvensjonelle 2D-kulturer24,25. Tidligere har mange studier supplert sfæroidenes kulturmedier med forskjellige mitogener og vekstfaktorer26 for å initiere sfæroiddannelse. I denne studien gir imidlertid tilsetning av fibroblaster, eller deres CM, essensielle mitogener og vekstfaktorer for å akselerere sfæroid vekst.

Figur 1 viser data fra en pilotstudie der Huh7 humane HCC-celler ble sådd i en synkende såingstetthet fra 12 000 til 125 celler i 20 μL friske medier i 3 dager. En såddtetthet på 12.000 celler ga sfæroider med asymmetrisk form, som ikke ble korrigert selv etter halvering av cellefrøtettheten. Sfæroider opprettet fra 3000 celler virket imidlertid mer avrundede (figur 1, øvre rad). Ytterligere reduksjon av cellekonsentrasjonen lyktes heller ikke i å danne enkeltsfærer (125, 250, 500 celletetthetssfærer) eller hadde et vanlig sfærisk utseende (1000 og 1500 celletetthetssfæroider). Det er verdt å nevne at mange små sfærer ble dannet med en tetthet på 500 tumorceller; Imidlertid ble bare en liten sfæroid fanget ved 50x forstørrelse (figur 1, øvre rad). Den samme optimaliserte protokollen ble brukt på COS7 primat nyre fibroblast celle linje (figur 1, midtre rad). Suspendering av 125, 250 og 500 COS7 fibroblaster i 20 μL hengende dråper resulterte i en avrundet sfæroid med flere mindre sfæroider, mens høyere celletetthet (1000, 1500 og 3000) dannet enkle halvavrundede sfæroider. I likhet med Huh7 tumor sfæroider, høyere celle suspensjoner (6,000 og 12,000 celler / sfære) resulterte i dannelsen av uregelmessige celle aggregater, og dermed høyere cellekonsentrasjoner ble kassert (Figur 1, midtre rad). Lave tettheter av Huh7/COS7 heterotypiske cellesuspensjoner (125, 250 og 500 celler/sfære) genererte en enkelt sfæroid med flere flytende eller todelte sfæroider (figur 1, nederste rad). 1000- og 1500-cellers heterotypiske sfæroider ble halv avrundet, mens en såddtetthet på 3000 celler (1500 per celletype) ga en avrundet 3D-sfæroid. Som nevnt tidligere resulterte høyere celletetthet i dannelsen av aggregater i stedet for veldefinerte sfæroider (figur 1, nederste rad). Til slutt ble 3000 celletetthetssfæroider avrundet, lik menneskelige HCC-svulster, og ble tilpasset for videre eksperimenter. Kultivering av cellesuspensjonene som hengende dråper i 3 dager var tilstrekkelig til å fremme sfæroiddannelse.

Etter å ha optimert den beste cellekonsentrasjonen og tidspunktet for sfæroiddannelse i den nåværende konteksten, ble den proliferative effekten av kokulturerende svulst og fibroblastcellelinjer vurdert langsgående. Figur 2 og figur 3 viser Huh7/COS7 heterotypiske sfæroider (3000 totale celletall per sfæroid) overvåket fra dag 3 til dag 10. Homotypic Huh7 og COS7 sfæroider (1500 celler hver) fungerte som kontroller. Fra dag 4 vokste heterotypiske sfæroider i en ideell rundlignende form sammenlignet med homotypiske sfæroider (figur 2). Det første volumet av den heterotypiske sfæroiden var større enn for hver homotypisk sfæroid. Veksten av sfæroider ble beregnet som endringen i volumet i forhold til det første volumet på dagen for sfæroiddannelse for å unngå normal variasjon i sfæroidvolum (dag 3, figur 3). Heterotypiske sfæroider viste i utgangspunktet en rask vekstfase fra dag 4 til dag 7 etterfulgt av en langsommere vekstfase på dag 8 (figur 2, øvre rad og figur 3). Sfæroidvolumet gikk ned på dag 9 og 10, noe som muligens gjenspeiler uttømming av næringsstoffer eller en hypoksisk kjerne- og celledød.

I kontrast vokste homotypiske Huh7- og COS7-sfæroider med en mye langsommere hastighet (figur 2, midtre og nederste rader; Figur 3). Homotypiske sfæroider viste en relativt statisk vekstkurve til den femte kulturdagen (to dager etter sfæroiddannelse). Fra dag 6 begynte de homotypiske sfæroidene å vise en gradvis økning i vekstkurven, om enn med en betydelig lavere hastighet enn de heterotypiske sfæroidene (figur 3). Til slutt vokser tumor / fibroblast heterotypiske sfæroider i høyere hastighet enn homotypiske sfæroider som antyder at direkte kontakt av tumorceller og fibroblaster øker størrelsen på tumorsfæroidene.

Til slutt, for å validere de ovennevnte funnene og for å studere den parakriminelle effekten av mesenchymale celler på spredningen av HCC-sfæroider i en leverrelatert kontekst, ble 3-dagers homotypiske Hep3B HCC-sfæroider dyrket i vanlige friske medier eller CM fra LX2 lever stellate celler (figur 4 og figur 5) i ytterligere 4 dager. Ved første øyekast dannet 3000 Hep3B-celler perfekt avrundede sfæroider etter 3 dager (figur 4). Hep3B-sfæroider viste kontinuerlig spredning i friske medier fra dag 3 til dag 7 (figur 4, øvre rad). Vekstraten ble forbedret da Hep3B-sfæroider ble opprettholdt i LX2 CM (figur 4, nedre rad). Denne medieavhengige konverteringen i Hep3B sfæroid vekst viste statistisk signifikans fra dag 4 til slutten av eksperimentet (figur 5), noe som tyder på en fibroblastdrevet spredning av tumorsfæroider.

Til slutt har denne studien vellykket modifisert de eksisterende 3D-sfæroidkulturene for å utnytte krysstale mellom HCC-tumorceller og forskjellige fibroblastcellelinjer og undersøke den proliferative betydningen av denne direkte og indirekte cellulære interaksjonen (figur 6). Videre karakterisering av de dannede sfæroidene er nødvendig for å forbedre hvordan tumorceller samhandler med det omkringliggende mikromiljøet.

Figure 1
Figur 1: Optimalisering av optimal celletetthet for sfæroiddannelse. Kolonner representerer forskjellige cellefrøtettheter, og rader representerer sfæroider dannet fra Huh7-celler (øverste rad), COS7-celler (midtre rad) og Huh7/COS7 heterotypiske celler (nederste rad). Bilder representerer sfæroider dannet etter å ha suspendert 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 og 12000 celler (fra venstre til høyre) i 20 μL-medier i 3 dager. Pilotstudien inkluderte to sfæroider per tilstand, og bildene ble tatt ved 50x forstørrelse, skalalinje = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Heterotypisk versus homotypisk sfæroidvekst. Kolonner representerer dagen da sfæroidbilder ble tatt, og rader viser representative bilder for sfæroider dannet fra Huh7-celler (øverste rad), COS7-celler (midtre rad) og Huh7 /COS7-celler (nederste rad). Bildene representerer sfæroidene som dannes etter å ha suspendert 3000 celler fra hver tilstand (homotypisk Huh7, COS7 eller Huh7/COS7 heterotypiske sfæroider) av forskjellige tidspunkter fra venstre til høyre. Eksperimentet inkluderte 10 sfæroider per tilstand, og bildene ble tatt ved 50x forstørrelse, skalalinje = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Langsgående analyse av heterotypisk versus homotypisk sfæroidvekst. Grafen viser vekstkurven til heterotypiske Huh7/COS7-sfæroider versus homotypiske Huh7- og COS7-sfæroider. Data presenteres som gjennomsnittlige ± s.e.m; n = 10 uavhengige sfæroider. ** p < 0,01; p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Vekst av homotypiske hep3B-sfæroider i LX2 CM. Kolonner representerer dagen da sfæroidbilder ble tatt, og rader viser representative bilder av Hep3B-sfæroider dyrket i ferske DMEM-kulturmedier (øverste rad) eller LX2 CM (nederste rad). Eksperimentet inkluderte syv sfæroider per tilstand (ferske medier eller LX2 CM), og bilder ble tatt ved 50x forstørrelse, skalalinje = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Langsgående analyse av den homotypiske Hep3B sfæroidveksten. Grafen viser vekstkurven til Hep3B-sfæroider i ferske DMEM-kulturmedier eller LX2 CM. Data presenteres som gjennomsnittlig ± s.e.m; n = 7 uavhengige sfæroider. p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Skjematisk representasjon av sfæroiddannelsesprosessen. Celleopphenget pipetteres på det indre lokket på 10 cm3 Petri-tallerken. Lokket er invertert og holdt i 3 dager for å tillate homotypisk eller heterotypisk sfæroiddannelse. Sfæroidbilder er tatt med 50x forstørrelse. Figuren er laget ved hjelp av et nettbasert vitenskapsillustrasjonsverktøy (se Materialfortegnelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Konteksten der de eksperimentelle cellelinjene vokser, påvirker deres genuttrykksprofil, baneanalyse og funksjonelle kriterier. For eksempel, i brystkreftceller, beholdes koordineringen mellom forskjellige onkogene veier bare hvis kreftceller dyrkes i 3D-konformasjon27. Deregulerte gener i 3D-melanom og brystkreftsfæroider, men ikke i monolayercellene, er mer relevante for den in vivo menneskelige svulsten28,29. For eksempel var β1 integrinnivåer i pattedyr epitelceller og tumor kolleger lavere enn nivåer dyrket i et 2D-format29. Videre har fibroblaster i 3D-strukturer en tendens til å migrere tydelig når det gjelder morfologi og hastighet sammenlignet med de som dyrkes på plast30. I tillegg aktiverer den mekaniske stivheten til vekstsubstratet spesifikke veier som oppmuntrer til ondartet transformasjon av normale epitelceller via deregulering av den ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK)/Rho i epitelceller31. Disse faktorene favoriserer overgangen fra konvensjonell 2D-kultur til 3D-sfæroidmodeller, da 3D-kulturer er mer i tråd med menneskelig sykdom.

Den nåværende studien brukte konvensjonelle laboratorieverktøy og forsyninger for å produsere en 3D tumor sfæroid modell. De dannede sfæroidene reagerte på spredningssignalene som kommer fra fibroblaster, som vist av deres betydelig økte vekst. Denne modellen tilhører kategorien multicellulære tumorsfæroider. Det er tre andre kategorier av 3D tumor sfæroider, inkludert tumorosfærer32, vevsavledede tumorkuler33,34, og organotypiske multicellulære sfæroider35. I multicellulære tumorsfæroider er tumorceller suspendert under lave vedheftsforhold slik at de kan samles for å danne sfærer uten å berøre bunnen av kulturfartøyet36. Flere tilnærminger har blitt brukt for å levere denne forankringsuavhengige teknikken, alt fra roterende systemer, flytende overleggsteknikker og ubestrøket ultra-lav vedlegg U-formede plater37. I HCC bruker de fleste in vitro sfæroidkulturene de ultra-lave festeplatene 24- eller 96-brønnsplater for å danne avrundede sfæroider18,19,20,21,22. Denne teknikken er imidlertid ikke kostnadseffektiv og utelukker ikke utilsiktet celleplastkontakt. Andre systemer bruker trans-brønner23 eller leverskiver12 for å produsere levermikrovev. Bruk av humant vev i translasjonsarbeid er gullstandarden, men ikke alltid tilgjengelig eller tilgjengelig for mange forskningsgrupper. Den nåværende tilnærmingen hadde nytte av hengende dråper teori. Cellefjæring tilsetts slik at tumorsfæroidene dannes i et tilgjengelig væske-luft-grensesnitt for å danne enkle avrundede sfærer38. Fordeler med å bruke denne teknikken er mangelen på celleplastkontakt og hvor enkelt det er å studere autocrine og paracrine crosstalk mellom tumor og fibroblastceller. Denne modellen ble ytterligere validert i en annen studie som dechiffrerte betydningen av den ikke-parenchymale TREM2 i å beskytte leveren mot HCC-utvikling39. Dette arbeidet viste at volumet av både Hep3B og PLC/PRF5 sfæroider var høyere i kontroll LX2 CM versus TREM2-overekspresserende LX2 CM på en Wnt-avhengig måte39.

I den nåværende studien ble fibroblaster blandet med tumorceller før sfæroiddannelse for å undersøke den proliferative effekten av denne samkulturen. Andre har lagt til fibroblaster, endotelceller og immunceller med tumorcellefjæring etter å ha dannet en tumorsfæroid for å studere stromal cellemigrasjon i svulsten40,41. Den nåværende heterotypiske sfæroidmodellen viste et lignende vekstmønster som de tidligere rapporterte modellene og den opprinnelige in vivo-svulsten; sfæroider viser eksponentiell vekst etterfulgt av en forsinket vekstfase, sannsynligvis på grunn av uttømming av næringsstoffer og utvidelse av den nekrotiske kjernen42. I stedet for å legge til vekstfaktorer og mitogener for å hjelpe sfæroiddannelse, brukte denne studien en mer fysiologisk tilnærming ved å ha disse vekstfaktorene fra direkte kontakt med fibroblaster eller deres sekreom i fibroblast CM. Det er viktig å nevne at LX2-celler kan aktiveres ytterligere ved å behandle med TGFβ1 eller PDGF43. LX2 celler har blitt behandlet med 10 ng / ml TGFβ1 i 48 timer før du fjerner mediet for forskjellige eksperimentelle innstillinger. LX2-celler ble vasket tre ganger med PBS (for å utelukke enhver direkte TGFβ1-effekt), og deretter ble friske medier lagt til i ytterligere 24 timer før de samlet CM. CM samlet inn fra TGFβ1-stimulert LX2 induserte Hep3B sfæroidenes vekst med en høyere hastighet enn CM fra kontroll LX2 (data ikke vist). Dette fleksible systemet kan gi seg til samkulturer av forskjellige kreftceller pluss / minus fibroblaster, samt pasientavledede linjer. Det kan også tilby en middels gjennomstrømning screening analyse for legemidler som raskt kan vedtas og settes inn i en translasjonell narkotika oppdagelse rørledning for å informere dosering for in vivo studier.

En begrensning i den nåværende studien er bruken av de udødelige cellelinjene i sfæroiddannelse i stedet for nyisolerte HCC tumorceller og kreftrelaterte fibroblaster. En annen begrensning er å sammenligne den homotypiske Hep3B-sfæroidens vekst mellom CM fra LX2 og i friske medier i stedet for CM fra andre ikke-fibroblastcellelinjer. Sistnevnte begrensning kan løses ved genetisk modifikasjon av et gen av interesse i fibroblaster etterfulgt av å bruke CM fra vill type versus genetisk konstruert fibroblast til homotypiske sfæroider.

Disclosures

FO er styremedlem og aksjonær i Fibrofind Limited.

Acknowledgments

MYWZ er finansiert av utenriksministeren for forretnings-, energi- og industristrategi og Newtonprisen 2020 som en del av Storbritannias ODA- og Newton-fond. SS støttes av Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist fellowship C53575/A29959. SS, FO og HR mottar finansiering som en del av HUNTER, finansiert gjennom et partnerskap mellom Cancer Research UK, Fondazione AIRC og Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Trypsin Sigma Aldrich 59429C
2 mL tubes Eppendorf
Biorender Biorender.com Online
Class II laminar flow BioMAT2 hood Medair Technologies
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Biosera M-D1107
Excel sofware Microsoft office 365
Graphpad prism sofware GraphPad software
Heat deactivated fetal bovine serum (FBS) life tech 105000064
Image J software Fiji
L-glutamine Sigma Aldrich G7513-100ml
Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin) Sigma Aldrich P0781-100ml
Petri dish 90 mm, triple vented Greiner 633175
Trypan blue Sigma Aldrich T8154
Virkon™ Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket Rely+On™ SCI-129999
Ziess inverted microscope Ziess

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer statistics for the year 2020: an overview. International Journal of Cancer. , (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 6 (2021).
  3. Reeves, H. L., Zaki, M. Y., Day, C. P. Hepatocellular carcinoma in obesity, Type 2 diabetes, and NAFLD. Digestive Diseases & Sciences. 61 (5), 1234-1245 (2016).
  4. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  5. Reig, M., et al. Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma. Update of the consensus document of the AEEH, AEC, SEOM, SERAM, SERVEI, and SETH. Medicina Clinica (Barc). 156 (9), 1-30 (2021).
  6. Pfister, D., et al. NASH limits anti-tumour surveillance in immunotherapy-treated HCC. Nature. 592 (7854), 450-456 (2021).
  7. Llovet, J. M., et al. Trial design and endpoints in hepatocellular carcinoma: AASLD consensus conference. Hepatology. 73, Suppl 1 158-191 (2021).
  8. Llovet, J. M., Hernandez-Gea, V. Hepatocellular carcinoma: reasons for phase III failure and novel perspectives on trial design. Clinical Cancer Research. 20 (8), 2072-2079 (2014).
  9. Brown, Z. J., Heinrich, B., Greten, T. F. Mouse models of hepatocellular carcinoma: an overview and highlights for immunotherapy research. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 15 (9), 536-554 (2018).
  10. Nikolic, M., Sustersic, T., Filipovic, N. In vitro models and on-chip systems: Biomaterial interaction studies with tissues generated using lung epithelial and liver metabolic cell lines. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 120 (2018).
  11. Clark, A. M., Ma, B., Taylor, D. L., Griffith, L., Wells, A. Liver metastases: Microenvironments and ex-vivo models. Experimental Biology and Medicine. 241 (15), 1639-1652 (2016).
  12. Paish, H. L., et al. A bioreactor technology for modeling fibrosis in human and rodent precision-cut liver slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
  13. Brassard-Jollive, N., Monnot, C., Muller, L., Germain, S. In vitro 3D systems to model tumor angiogenesis and interactions with stromal cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 594903 (2020).
  14. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  15. Kleinman, H. K., Philp, D., Hoffman, M. P. Role of the extracellular matrix in morphogenesis. Current Opinion in Biotechnology. 14 (5), 526-532 (2003).
  16. Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
  17. Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W., Koteliansky, V. E., Bissell, M. J. The origin of the myofibroblasts in breast cancer. Recapitulation of tumor environment in culture unravels diversity and implicates converted fibroblasts and recruited smooth muscle cells. Journal of Clinical Investigations. 95 (2), 859-873 (1995).
  18. Shao, H., et al. A novel stromal fibroblast-modulated 3D tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60660 (2020).
  19. Song, Y., et al. Activated hepatic stellate cells play pivotal roles in hepatocellular carcinoma cell chemoresistance and migration in multicellular tumor spheroids. Scientific Reports. 6, 36750 (2016).
  20. Pingitore, P., et al. Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).
  21. Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Scientific Reports. 8 (1), 14297 (2018).
  22. Khawar, I. A., et al. Three dimensional mixed-cell spheroids mimic stroma-mediated chemoresistance and invasive migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
  23. Feaver, R. E., et al. Development of an in vitro human liver system for interrogating non-alcoholic steatohepatitis. Journal of Clinical Investigations Insight. 1 (20), 90954 (2016).
  24. Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) and reactive oxygen species. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
  25. Chen, R., et al. Screening candidate metastasis-associated genes in three-dimensional HCC spheroids with different metastasis potential. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 7 (5), 2527-2535 (2014).
  26. Venkataraman, G., et al. Preferential self-association of basic fibroblast growth factor is stabilized by heparin during receptor dimerization and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (2), 845-850 (1996).
  27. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Research. 59, 1757-1763 (1999).
  28. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  29. Delcommenne, M., Streuli, C. H. Control of integrin expression by extracellular matrix. Journal of Biological Chemistry. 270 (45), 26794-26801 (1995).
  30. Meshel, A. S., Wei, Q., Adelstein, R. S., Sheetz, M. P. Basic mechanism of three-dimensional collagen fibre transport by fibroblasts. Nature Cell Biology. 7 (2), 157-164 (2005).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
  33. Weiswald, L. B., et al. Newly characterised ex vivo colospheres as a three-dimensional colon cancer cell model of tumour aggressiveness. British Journal of Cancer. 101 (3), 473-482 (2009).
  34. Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6235-6240 (2011).
  35. Rajcevic, U., et al. Colorectal cancer derived organotypic spheroids maintain essential tissue characteristics but adapt their metabolism in culture. Proteome Sciences. 12, 39 (2014).
  36. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  37. Friedrich, J., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Experimental anti-tumor therapy in 3-D: spheroids--old hat or new challenge. International Journal of Radiation Biology. 83 (11-12), 849-871 (2007).
  38. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology & Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
  39. Esparza-Baquer, A., et al. TREM-2 defends the liver against hepatocellular carcinoma through multifactorial protective mechanisms. Gut. 70 (7), 1345-1361 (2021).
  40. Dangles-Marie, V., et al. A three-dimensional tumor cell defect in activating autologous CTLs is associated with inefficient antigen presentation correlated with heat shock protein-70 down-regulation. Cancer Research. 63 (13), 3682-3687 (2003).
  41. Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumour angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
  42. Mayer, B., et al. Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas. Gastroenterology. 121 (4), 839-852 (2001).
  43. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54 (1), 142-151 (2005).

Tags

Kreftforskning utgave 175
En tredimensjonal sfæroidmodell for å undersøke tumor-stromal interaksjon i hepatocellulært karsinom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaki, M. Y. W., Shetty, S.,… More

Zaki, M. Y. W., Shetty, S., Wilkinson, A. L., Patten, D. A., Oakley, F., Reeves, H. A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma. J. Vis. Exp. (175), e62868, doi:10.3791/62868 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter