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Genetics

लघु और लंबे समय से पढ़ने वाली अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके मूत्र बैक्टीरिया के पूर्ण जीनोम की पीढ़ी के लिए हाइब्रिड डी नोवो जीनोम असेंबली

Published: August 20, 2021 doi: 10.3791/62872
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Texas at Dallas, 2Department of Urology, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

यह प्रोटोकॉल मूत्र बैक्टीरिया की संस्कृति, अनुक्रमण और डी नोवो हाइब्रिड जीनोम असेंबली के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण का विवरण देता है। यह मूत्र उपनिवेशीकरण, रोगजनन और रोगाणुरोधी प्रतिरोध प्रसार में योगदान देने वाले गुणसूत्र और एक्सट्राक्रोमोमल आनुवंशिक तत्वों दोनों का अध्ययन करने में उपयोगी पूर्ण, परिपत्र जीनोम दृश्यों की पीढ़ी के लिए एक प्रजनन योग्य प्रक्रिया प्रदान करता है।

Abstract

पूर्ण जीनोम दृश्य आनुवंशिक विविधता और मूत्र रोगाणुओं के अद्वितीय उपनिवेशीकरण कारकों की समझ के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान करते हैं। इन आंकड़ों में प्लाज्मिड और एक्सट्राक्रोमोमोमल फेज जैसे मोबाइल जेनेटिक तत्व शामिल हो सकते हैं, जो एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध के प्रसार में योगदान देते हैं और मूत्र पथ संक्रमण (यूटीआई) के उपचार को और जटिल बनाते हैं। जीनोम संरचना का ठीक समाधान प्रदान करने के अलावा, पूर्ण, बंद जीनोम विस्तृत तुलनात्मक जीनोमिक्स और विकासवादी विश्लेषणों के लिए अनुमति देते हैं। उपलब्ध अनुक्रमण प्रौद्योगिकी की सीमाओं के कारण पूर्ण जीनोम डी नोवो की पीढ़ी लंबे समय से एक चुनौतीपूर्ण कार्य रही है। युग्मित-अंत अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS) उच्च गुणवत्ता कम पढ़ता है अक्सर सटीक लेकिन खंडित जीनोम विधानसभाओं में जिसके परिणामस्वरूप पैदा करता है । इसके विपरीत, नैनोपोर अनुक्रमण कम गुणवत्ता के लंबे समय तक पढ़ता है सामान्य रूप से त्रुटि प्रवण पूर्ण विधानसभाओं के लिए अग्रणी प्रदान करता है। ऐसी त्रुटियां जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययनों में बाधा डाल सकती हैं या भ्रामक संस्करण विश्लेषण परिणाम प्रदान कर सकती हैं। इसलिए, संकर दोनों छोटे और लंबे पढ़ता है संयोजन दृष्टिकोण अत्यधिक सटीक बंद जीवाणु जीनोम को प्राप्त करने के लिए विश्वसनीय तरीकों के रूप में उभरा है । यहां रिपोर्ट विविध मूत्र बैक्टीरिया की संस्कृति के लिए एक व्यापक विधि है, 16S rRNA जीन अनुक्रमण द्वारा प्रजातियों की पहचान, जीनोमिक डीएनए (gDNA) का निष्कर्षण, और कम और लंबे समय से देखा जाता है की पीढ़ी क्रमशः NGS और नैनोपोर प्लेटफार्मों द्वारा पढ़ता है । इसके अतिरिक्त, यह विधि एनोटेटेड पूर्ण जीनोम दृश्यों की पीढ़ी के लिए गुणवत्ता नियंत्रण, असेंबली और जीन भविष्यवाणी एल्गोरिदम की जैव सूचनाबद्ध पाइपलाइन का वर्णन करती है। बायोइंफॉर्मेटिक टूल्स का संयोजन हाइब्रिड जीनोम असेंबली और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले पढ़े गए डेटा के चयन में सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित हाइब्रिड डी नोवो जीनोम असेंबली के लिए सुव्यवस्थित दृष्टिकोण को किसी भी कृषि योग्य बैक्टीरिया में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

मूत्र माइक्रोबायोम अनुसंधान का एक उभरता हुआ क्षेत्र है जिसने दशकों लंबी गलतफहमी को चकनाचूर कर दिया है कि मूत्र पथ स्वस्थ व्यक्तियों में बाँझ है। मूत्र माइक्रोबायोटा के सदस्य मूत्र वातावरण को संतुलित करने और मूत्र पथ संक्रमण (यूटीआई)1,2को रोकने के लिए काम करसकतेहैं । यूरोपैथोजेनिक बैक्टीरिया मूत्र पथ पर आक्रमण करते हैं और निवासी माइक्रोबायोटा को विस्थापित करने, यूरोथेलियम को उपनिवेश बनाने, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने और पर्यावरणीय दबावों का प्रतिकार करने के लिए विविध उग्रता तंत्रको नियोजितकरते हैं3,4 । मूत्र एक अपेक्षाकृत पोषक तत्व-सीमित माध्यम है जो उच्च ऑस्मोलेरिटी, सीमित नाइट्रोजन और कार्बोहाइड्रेट की उपलब्धता, कम ऑक्सीजन, और कम पीएच5,6,7की विशेषता है। मूत्र को रोगाणुरोधी भी माना जाता है, जो निरोधात्मक यूरिया और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स जैसे मानव कैथेलिडिनएलएल-37 8की उच्च सांद्रता से बना होता है। मूत्र पथ को उपनिवेश बनाने के लिए निवासी बैक्टीरिया और यूरोपैथोजेन दोनों द्वारा नियोजित तंत्र की जांच करना मूत्र पथ के स्वास्थ्य को और अधिक समझने और यूटीआई उपचार के लिए नई रणनीतियों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, फ्रंट-लाइन एंटीमाइक्रोबियल उपचारों की विफलता के रूप में अधिक आम हो जाता है, मूत्र बैक्टीरिया9,10की आबादी के भीतर एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध निर्धारकों को ले जाने वाले मोबाइल आनुवंशिक तत्वों के प्रसार की निगरानी करना तेजी से महत्वपूर्ण है।

मूत्र बैक्टीरिया के जीनोटाइप और फेनोटाइप की जांच करने के लिए, उनकी सफल संस्कृति और बाद में पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) जरूरी है। मूत्र के नमूनों में व्यवहार्य रोगाणुओं का पता लगाने और उनकी पहचान करने के लिए संस्कृति पर निर्भर तरीके आवश्यक हैं11। मानक नैदानिक मूत्र संस्कृति में 5% भेड़ रक्त आगार (बीएपी) और मैककोंकी आगर पर मूत्र चढ़ाना और 24 एच12के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर एयरोब्यूकल रूप से इनक्यूबेटिंग करना शामिल है। हालांकि, ≥105 सीएलयू/एमएल13की पहचान सीमा के साथ, मूत्र माइक्रोबायोटा के कई सदस्यों को इस विधि द्वारा सूचित नहीं किया जाता है। उन्नत मात्रात्मक मूत्र संस्कृति (इक्वेसी)11 जैसी बेहतर संस्कृति तकनीकों में विभिन्न मूत्र की मात्रा, इनक्यूबेशन बार, संस्कृति मीडिया और वायुमंडलीय स्थितियों के विभिन्न संयोजनों को नियोजित किया जाता है ताकि आमतौर पर मानक मूत्र संस्कृति द्वारा छूटे रोगाणुओं की पहचान की जा सके। इस प्रोटोकॉल में वर्णित EQUC का एक संशोधित संस्करण है, जिसे यहां संशोधित संवर्धित मूत्र संस्कृति प्रोटोकॉल कहा जाता है, जो चयनात्मक मीडिया और इष्टतम वायुमंडलीय स्थितियों का उपयोग करके विविध मूत्र बैक्टीरिया और यूरोपैथोजेन की खेती को सक्षम बनाता है लेकिन स्वाभाविक मात्रात्मक नहीं है। मूत्र बैक्टीरिया का सफल अलगाव डाउनस्ट्रीम डब्ल्यूजीएस और जीनोम असेंबली के लिए जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) को निकालने में सक्षम बनाता है।

जीनोम असेंबली, विशेष रूप से पूर्ण असेंबली, आनुवंशिक कारकों की खोज को सक्षम करती हैं जो उपनिवेशीकरण, आला रखरखाव और दोनों निवासी माइक्रोबायोटा और यूरोपैथोजेनिक बैक्टीरिया के बीच उग्रता में योगदान दे सकते हैं। ड्राफ्ट जीनोम असेंबली में विभिन्न प्रकार के समीपस्थ दृश्य (स्टिग्स) होते हैं जिनमें अनुक्रमण त्रुटियां हो सकती हैं और अभिविन्यास जानकारी की कमी हो सकती है। एक पूर्ण जीनोम असेंबली में, प्रत्येक आधार जोड़ी के अभिविन्यास और सटीकता दोनों को14सत्यापित किया गया है। इसके अलावा, पूर्ण जीनोम दृश्यों को प्राप्त करना जीनोम संरचना, आनुवंशिक विविधता और मोबाइल आनुवंशिक तत्वों15में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। केवल छोटे पढ़ते हैं कि महत्वपूर्ण जीनों की उपस्थिति या अनुपस्थिति की पहचान हो सकती है लेकिन उनके जीनोमिक संदर्भकोइंगित नहीं कर सकते हैं । ऑक्सफोर्ड नैनोपोर और PacBio जैसी लंबे समय से पढ़ी जाने वाली अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों को सक्षम करने के साथ, बैक्टीरियल जीनोम की बंद डी नोवो विधानसभाओं को उत्पन्न करने के लिए अब मल्टीप्लेक्स पीसीआर17,18द्वारा डी नोवो विधानसभाओं को मैनुअल बंद करने जैसे ज़ोरदार तरीकों की आवश्यकता नहीं है। अगली पीढ़ी के छोटे-पढ़ने वाले अनुक्रमण और नैनोपोर लंबे समय से पढ़ी जाने वाली अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों का संयोजन अपेक्षाकृत कम लागत19पर सटीक, पूर्ण और बंद बैक्टीरियल जीनोम असेंबली की फेसियल पीढ़ी की अनुमति देता है। लघु पढ़ें अनुक्रमण सटीक अभी तक खंडित जीनोम विधानसभाओं आम तौर पर 40-100 contigs के एक औसत से मिलकर पैदा करता है, जबकि नैनोपोर अनुक्रमण लंबाई में लगभग 5-100 किलोब के लंबे समय से पढ़ता है कि कम सटीक हैं, लेकिन मचान के रूप में काम कर सकते है contigs में शामिल होने और जीनोमिक सिंटेनी को हल । हाइब्रिड दोनों कम पढ़ा और लंबे समय से पढ़ने वाली प्रौद्योगिकियों का उपयोग करने वाले दृष्टिकोण सटीक और पूर्ण जीवाणु जीनोम19का उत्पादन कर सकते हैं ।

यहां वर्णित अलगाव और मानव मूत्र, जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण, अनुक्रमण, और एक संकर विधानसभा दृष्टिकोण का उपयोग कर पूर्ण जीनोम विधानसभा से बैक्टीरिया की पहचान के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल है । यह प्रोटोकॉल एक बंद बैक्टीरियल गुणसूत्र और प्लाज्मिड जैसे एक्सार्मोमोमल तत्वों की सटीक असेंबली के लिए कम-पढ़ने और लंबे समय तक पढ़ने वाले अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न रीड को ठीक से संशोधित करने के लिए आवश्यक कदमों पर विशेष जोर देता है।

Protocol

बैक्टीरिया को संस्थागत समीक्षा बोर्ड-अनुमोदित अध्ययन 19MR0011 (यूटीडी) और एसटीयू 032016-006 (यूटीएसडब्ल्यू) के हिस्से के रूप में सहमति देने वाली महिलाओं से एकत्र मूत्र से सुसंस्कृत किया गया था ।

1. संशोधित बढ़ी हुई मूत्र संस्कृति

नोट: सभी संस्कृति कदम बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए । सभी उपकरणों, समाधानों और मीडिया को निष्फल करें। 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र को साफ करें, फिर एक बुनसेन बर्नर स्थापित करें और प्रदूषण की संभावना को कम करने के लिए लौ के करीब सावधानीपूर्वक काम करें। वैकल्पिक रूप से, एक बाँझ वातावरण को बनाए रखने के लिए एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग किया जा सकता है। संभावित रोगजनक रोगाणुओं के संपर्क से बचने के लिए उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें।

  1. चढ़ाना ग्लिसरोल-स्टॉक मूत्र और कॉलोनी अलगाव
    1. कमरे के तापमान (आरटी) पर गल ग्लिसरोल-स्टॉक मूत्र। एक बार गल जाने के बाद, मिश्रण करने के लिए 5 एस के लिए नमूना भंवर। बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में, बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में मूत्र के 1:3 और 1:30 कमजोर करने को 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में तैयार करें।
      नोट: ग्लाइस्रोल-स्टॉक किए गए मूत्र को 500 माइक्रोन अनड्लेटेड मूत्र और क्रायोविअल्स में 50% बाँझ ग्लिसरोल के 500 माइक्रोन को मिलाकर तैयार किया जाता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण किया जाता है।
    2. उपयोग से पहले 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म आगर प्लेटें। कृपया मीडिया प्रकार और संस्कृति की स्थिति के लिए चित्रा 1 आम मूत्र जीवाणु जेनेरा के लिए उपयुक्त देखें । पतला मूत्र को चढ़ाना से पहले पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं, वांछित आगर प्लेट पर पतला मूत्र के 100 माइक्रोन प्लेट करें और बाँझ ग्लास मोतियों का उपयोग करके नमूना फैलाएं। प्लेट 1x पीबीएस के 100 μL कोई विकास नियंत्रण के रूप में एक अलग प्लेट पर पतला।
      नोट: यदि सामान्य यूरोपैथोजेनिक प्रजातियों (जैसे, एस्चेरिचिया कोलाई, क्लेबसिएला एसपीपी, एंटेरोकोकस फेकलिस आदि) को संस्कृति का प्रयास करना है, तो क्रोमोजेनिक एगर(सामग्री की तालिका) काउपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह यूरोपैथोजेनिक बैक्टीरियल प्रजातियों(चित्रा 1)की आसान पहचान की अनुमति देता है। कोलिस्टिन नलिडिक्सिक एसिड (सीएनए) या एमआरएस एगर दुराग्रही ग्राम-सकारात्मक प्रजातियों (जैसे, लैक्टोबेसिलस स्पीप)को अलग-थलग करने के लिए उपयोगी होते हैं, जो ग्राम-नकारात्मक यूरोपैथोजेन को शामिल करने के लिए जाना जाता है, जो गैर-चयनात्मक अग्रों में दुराग्रही प्रजातियों को मात दे सकता है।
    3. उरोपैथोजन के लिए 24 घंटे की अवधि के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर वांछित वायुमंडलीय स्थिति में उल्टे प्लेट को इनक्यूबेट करें और दुराग्रही बैक्टीरिया(चित्रा 1) के लिए 3-5दिन।
    4. इनक्यूबेशन अवधि के बाद, इन्क्यूबेटर से प्लेटें हटा दें। प्रत्येक प्लेट से, उन उपनिवेशों को चुनें जो एक अद्वितीय रंग, आकृति विज्ञान या हीमोलिटिक पैटर्न प्रदर्शित करते हैं।
    5. इसी आगर पर बाँझ पाश का उपयोग करके बैक्टीरियल कॉलोनी को फिर से स्ट्रीक करें और अच्छी तरह से अलग-थलग उपनिवेशों को प्राप्त करने के लिए वांछित वातावरण में 2-5 दिनों के लिए उल्टे प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि प्राथमिक संस्कृति के लिए बीएपी का उपयोग करते हैं, तो क्रोमोजेनिक एगर पर कालोनियों को पैचिंग नमूने में बैक्टीरियल आबादी की विषमता के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकता है।
  2. तरल शोरबा और ग्लिसरोल-स्टॉकिंग बैक्टीरियल आइसोले में खेती
    1. एक बार जब मूल कॉलोनी की आकृति विज्ञान से मेल खाने वाले अलग-थलग उपनिवेशों को प्राप्त किया जाता है, तो एक कॉलोनी चुनें और बाँझ टीका लूप का उपयोग करके तरल शोरबा के 3 एमएल में टीका लगाएं। आम मूत्र माइक्रोबायोटा जेनेरा के विकास का समर्थन करने में सक्षम शोरबा के लिए चित्रा 1 का उल्लेख करें। आगर प्लेटों को पैराफिल्म के साथ सील करें और उन्हें 2-4 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 1-5 दिनों तक वांछित वायुमंडलीय स्थितियों में तरल संस्कृतियों को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि संस्कृति टर्बिड दिख न जाए।
    2. विकास के बाद मनाया जाता है, संस्कृति भंवर, और फिर एक 2 एमएल क्रायोवियल में बाँझ 50% ग्लाइसरोल के 500 माइक्रोन करने के लिए रातोंरात संस्कृति के 1 एमएल जोड़ें; सील और धीरे उलटा द्वारा मिश्रण। प्रत्येक कॉलोनी के लिए दो ग्लिसरोल स्टॉक तैयार करें (एक बैकअप के रूप में कार्य करता है) और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. 16S rRNA जीन सेंगर अनुक्रमण द्वारा जीवाणु प्रजातियों की पहचान

नोट: माइक्रोबियल पहचान वैकल्पिक रूप से मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोरप्शन आयनीकरण समय ऑफ फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मालडी-TOF)20का उपयोग करके पुष्टि की जा सकती है ।

  1. कॉलोनी-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर)
    1. पीसीआर ट्यूबों में पीसीआर रिएक्शन का 25 माइक्रोन 2x Taq पॉलीमरेज मास्टर मिक्स के 12.5 माइक्रोन जोड़कर तैयार करें, 0.5 माइक्रोनल का 10 माइक्रोन 8F प्राइमर, 0.5 माइक्रोन का 10 माइक्रोन 1492R प्राइमर(सामग्री की तालिका)और नाभिक मुक्त पानी का 11.5 माइक्रोन21।
      नोट: यदि कई नमूनों के लिए पीसीआर प्रदर्शन करते हैं, तो ताक पॉलीमरेज मिश्रण, प्राइमर और बाँझ नाभिक मुक्त पानी का रिएक्शन मास्टर मिश्रण बनाएं। फिर प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में 25 माइक्रोन को अलीकोट करें।
    2. कॉलोनी-पीसीआर करने के लिए, बाँझ टूथपिक या पिपेट टिप का उपयोग करके री-स्ट्रीक से एक अच्छी तरह से अलग कॉलोनी स्वाइप करें। स्टेप 2.1.1 में तैयार पीसीआर रिएक्शन मिक्स में कॉलोनी को रीसुस्ट करें। धीरे-धीरे मिलाएं। 2000 x ग्राम पर एक त्वरित स्पिन द्वारा ट्यूब के नीचे तरल ले लीजिए।
      नोट: सुनिश्चित करें कि नमूना हवा के बुलबुले से मुक्त है। अकेले पीसीआर रिएक्शन मिक्स युक्त नो-टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी) नमूना शामिल करें।
    3. नमूना ट्यूबों को थर्मोसाइकिलर में रखें और निम्नलिखित कार्यक्रम चलाएं: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; के 40 चक्र: 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 51 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
  2. जेल निष्कर्षण और प्रजातियों की पहचान
    1. पीसीआर रन पूरा होने पर, 0.5x ट्रिस-बोरेट-ईडीटीए (एफबीई) बफर में तैयार 1% एग्राजर्ड जेल पर पीसीआर उत्पाद की जांच करें। जेल कास्टिंग करने से पहले, एथिडियम ब्रोमाइड (ईटीबीआर) जोड़ें। फिर, कुओं के लिए कंघी का उपयोग करके जेल को कास्ट करें जो कम से कम 20 माइक्रोन नमूना मात्रा रखते हैं।
      सावधानी: ईटीबी एक इंटरकैलिंग एजेंट है जो कैंसरजनक होने का संदेह है। इसे संभालते समय हमेशा दस्ताने और पीपीई पहनें और संस्था के दिशानिर्देशों के अनुसार ईटीबी युक्त सामग्रियों का निपटान करें।
    2. जब जेल सेट हो जाए, तो जेल को 0.5x TBE बफर से भरे इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक में रखें और कंघी को हटा दें। पहले कुएं में 1 केबी सीढ़ी लोड करें और पीसीआर प्रतिक्रिया के 10-20 माइक्रोन को बाद के कुओं में लोड करें। हल होने तक 100-140 वी पर चलाएं। यूवी प्रकाश के तहत जेल की कल्पना करें और ~ 1.5 केबी पर एक स्पष्ट रूप से परिभाषित बैंड की उपस्थिति की पुष्टि करें जो एनटीसी में अच्छी तरह से अनुपस्थित है।
      सावधानी: यूवी किरणें त्वचा और आंखों के लिए हानिकारक हैं, जेल की कल्पना करते समय एक उपयुक्त गार्ड का उपयोग करें और उचित पीपीई पहनें।
      नोट: कॉलोनी पीसीआर कुछ बैक्टीरिया के लिए असफल हो सकता है; अलग gDNA से पीसीआर साथ आगे बढ़ने एक वैकल्पिक विकल्प22है .
    3. एक रेजर का उपयोग करके ~ 1.5 केबी बैंड को उत्पादित करें और जेल कटिंग को साफ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) के अनुसार जेल निष्कर्षण प्रोटोकॉल के साथ आगेबढ़ें। माइक्रोवोल्ट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा शुद्ध डीएनए की एकाग्रता को मापें।
      नोट: एक एकाग्रता >10 एनजी/μL वांछनीय है, और 1.7-2.0 के बीच A260/280 स्वीकार्य है ।
    4. प्रत्येक नमूने के लिए दो सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रियाएं तैयार करें, एक 8F का उपयोग करके और दूसरा किसी भी चुने हुए सेंगर अनुक्रमण सेवा के दिशानिर्देशों के अनुसार नाभिक मुक्त पानी में 1492R प्राइमर का उपयोग करके।
    5. एक बार अनुक्रमण डेटा प्राप्त होने के बाद, डीएनए दृश्यों को एनसीबीआई बेसिक लोकल अलाइनमेंट सर्च टूल (ब्लास्ट) वेबसाइट (ब्लास्ट) वेबसाइट (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) पर अपलोड करें, न्यूक्लियोटाइड ब्लास्ट (ब्लास्ट) चुनें, आरएनए/आईटी डाटाबेस 16S रिबोसोमल आरएनए सीक्वेंस (बैक्टीरिया और आर्किया) का चयन करें, और मेगाब्लास्ट प्रोग्राम चलाएं । आइसोले डेटाबेस से एक संदर्भ के लिए उच्चतम गुणवत्ता हिट द्वारा पहचाना जा सकता है ।
      नोट: कुछ जीवाणु प्रजातियां अपने 16S आरएनए दृश्यों में उच्च पहचान प्रदर्शित करती हैं और अकेले इस विधि से अविवेच्य हो सकती हैं। एक ही जीनस23के सदस्यों को आत्मविश्वास से अलग करने के लिए डीएनए होमोलॉजी और बायोकेमिकल विश्लेषण की आवश्यकता होगी ।

3. जीनोमिक डीएनए का निष्कर्षण (gDNA)

नोट: यह अनुभाग विविध जीवाणु प्रजातियों से गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए की उच्च उपज निकासी के लिए सामग्री की तालिका में संदर्भित जीडीएनए निष्कर्षण किट में प्रदान किए गए अभिकर्मकों और स्पिन-कॉलम का उपयोग करता है। नीचे प्रदान की गई सिफारिश संशोधनों और निर्देशों हैं।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार किट रिएजेंट तैयार करें।
  2. मीडिया में अच्छी तरह से अलग उपनिवेशों से बैक्टीरिया को निकालकर और चित्र 1 में नोट किए गए तापमान और वायुमंडलीय दबाव पर इनक्यूबेटिंग करके उपयुक्त बाँझ शोरबा(चित्रा 1)में 3-10 एमएल संस्कृतियों को तैयार करें जब तक कि पर्याप्त विकास नहीं हो जाता।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर24का उपयोग करके संस्कृति के 600 एनएम (ओडी600)पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें।
    1. 1:10 अनुपात में रातोंरात संस्कृतियों को कमजोर करके मात्राकरण के लिए नमूना तैयार करें। माप के लिए बाँझ संस्कृति मीडिया के एक खाली के रूप में अच्छी तरह से शामिल करें । नमूना पढ़ने से खाली पढ़ने को घटाकर और दस के कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करके ऑप्टिकल घनत्व की गणना करें।
  4. प्रजातियों के लिए CFU/mL अनुपात के लिए OD६०० माप और एक पूर्व स्थापित OD६०० का उपयोग करना, गणना संस्कृति के कितने मिलीलीटर 2 x 109 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं ।
  5. 5000 x ग्राम से पैलेट पर 5 मिनट के लिए आवश्यक संस्कृति की मात्रा को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और 200 माइक्रोन कोल्ड ते बफर (प्रक्रिया की शुरुआत में बर्फ पर प्री-चिल) में गोली को फिर से खर्च करें।
  6. 5000 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए नमूना सेंट्रलाइज करें। सुपरनैंट निकालें, और फिर एंजाइमेटिक लाइसिस बफर (ईएलबी) के 180 माइक्रोन में गोली को फिर से ढंकें और पूर्व-उबले हुए आरएनई ए (10 मिलीग्राम/एमएल) के 20 माइक्रोन जोड़ें। चने-सकारात्मक बैक्टीरिया के कुशल लाइसिस के लिए, 18 माइक्रोन म्यूटानोलिसिन (25 किलोवाट/एमएल) जोड़ें। भंवर अच्छी तरह से, और फिर 2 घंटे के लिए रोटेटर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया दोनों के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित ELB का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आगे बढ़ें।
    नोट: यदि वांछित हो तो अतिरिक्त gDNA उपज प्राप्त करने के लिए एक या दो बार के लिए एल्यूशन चरणों को दोहराएं।
  8. धारा 4 में निर्देश के अनुसार निकाले गए जीडीएनए की गुणवत्ता का आकलन करें और यदि 1 सप्ताह के भीतर इसका उपयोग किया जाएगा तो 4 डिग्री सेल्सियस पर जीडीएनए स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर gDNA रखें।

4. निकाले गए gDNA की गुणवत्ता का आकलन

  1. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, उपधारा 2.2 में वर्णित 1% एगरेग्यास जेल तैयार करें। एक साफ ट्यूब में नमूना तैयार करें: पैराफिल्म पर निकाले गए जीडीएनए के 1-2 माइक्रोन और 2x लोडिंग डाई के 3 माइक्रोन मिलाएं। एक बार लोड होने के बाद जेल चलाएं, और फिर इसे यूवी लाइट के नीचे कल्पना करें।
    नोट: सफल gDNA निष्कर्षण जेल के शीर्ष पर एक असतत बैंड और न्यूनतमगंदा (चित्रा 2A)द्वारा स्पष्ट हो जाएगा । गंदा करना कतरनी का संकेत है। यदि कोई gDNA बैंड स्पष्ट है और/या गंदा पर्याप्त है, gDNA निष्कर्षण दोहराएं । RNase A और Proteinase K में इनक्यूबेशन समय को कम करने पर विचार करें । यदि 1.5-3 केबी के आसपास दो बैंड देखे जाते हैं, तो यह आरएनए संदूषण(चित्रा 2B) का सुझाव देता है। ताजा RNase A और दोहराने निष्कर्षण तैयार करें।
  2. माइक्रोवोल्ट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, माइक्रोवोल्टम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा जीडीएनए एकाग्रता और अवशोषण अनुपात A260/280 को मापें। सांद्रता >50 एनजी/μL और A260/280 के बीच 1.7-2.0 स्वीकार्य हैं ।
    नोट: कम जीडीएनए उपज कम इनपुट, उच्च इनपुट, नाभिक के प्रदूषण, अपर्याप्त लाइसिस के कारण हो सकती है। सीमा के ऊपर अवशोषण अनुपात आरएनए संदूषण का संकेत देता है। यदि gDNA गुणवत्ता खराब है तो निष्कर्षण दोहराएं।
  3. फ्लोरोमीटर द्वारा गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, उच्च संवेदनशीलता परख किट और फ्लोरोमीटर उपकरण(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके gDNA एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। एकाग्रता >50 एनजी/μL वांछनीय है ।

5. युग्मित-अंत अगली पीढ़ी कम पढ़ें अनुक्रमण और पुस्तकालय की तैयारी

नोट: लघु-पठन अनुक्रमण विभिन्न उपकरणों पर अलग-अलग पढ़े गए लंबाई और झुकाव पर किया जा सकता है। बैक्टीरियल डब्ल्यूजीएस के लिए 150 बीपी (300 चक्र) युग्मित-अंत अनुक्रमण की सिफारिश की जाती है। पुस्तकालय तैयार करने और अनुक्रमण दोनों को मुख्य सुविधाओं या वाणिज्यिक प्रयोगशालाओं में आउटसोर्स किया जा सकता है।

  1. निर्माता के निर्देशों(सामग्रियोंकी तालिका) के अनुसार अनुक्रमण पुस्तकालय तैयार करें। निर्माता की अनुशंसित अंतिम लोडिंग लाइब्रेरी एकाग्रता का पालन करें; हालांकि, एक अनुशंसित संशोधन नेक्स्टसेक्यू उपकरणों पर इष्टतम पठन पीढ़ी के लिए 1.8 पीएम पर पूल्ड लाइब्रेरी को लोड करना है।
  2. हालांकि वैकल्पिक, पूल्ड लाइब्रेरी टुकड़ा वितरण का आकलन करने और यह सुनिश्चित करने के लिए एक बायोएनालाइजर(सामग्री की तालिका)का उपयोग करें कि टुकड़ा आकार औसतन 600 बीपी है।

6. नैनोपोर मिनियन अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल(सामग्रीकी तालिका) के अनुसार अनुक्रमण पुस्तकालय तैयार करें। दो बारकोड विस्तार किट का उपयोग एक एकल प्रवाह सेल पर 24 नमूनों तक के मल्टीप्लेक्सिंग के लिए अनुमति देता है । यह दो भागों में पुस्तकालय तैयार करने की सिफारिश की है, 12 नमूने एक समय में जब मल्टीप्लेक्स 24 नमूने । सभी 24 नमूनों को नीचे वर्णित के रूप में जमा किया जा सकता है ।
    नोट: नमूनों को देशी बारकोड लिगेशन खत्म करने पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है - यदि आवश्यक हो तो यह प्रोटोकॉल में एक रोक बिंदु प्रदान करता है। पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल के मूल बारकोड लिगेशन अनुभाग के अंत में, प्रत्येक नमूने की समानाखात्मक मात्रा को अधिकतम डीएनए द्रव्यमान (एनजी) तक पूल करने की सिफारिश की जाती है।
    1. ऐसा करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लोरोमीटर(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके बारकोड लिगाशन के बाद सभी नमूनों की मात्रा निर्धारित करें। सबसे कम DsDNA एकाग्रता के साथ नमूने की मात्रा का अनुमान है, और फिर इस नमूने में पाया कुल dsDNA की गणना। इस संख्या का उपयोग अन्य सभी नमूनों की सममोलर मात्रा निर्धारित करने के लिए करें जो एक साथ जमा किए जाएंगे।
      नोट: क्योंकि सममोलीय गणना पूल किए गए डीएसडीएनए की मात्रा को अधिकतम करेगी और इस प्रकार पूल को ध्यान केंद्रित करने के लिए एक उच्च मात्रा पूल (>65 माइक्रोन) निकलेगी, सफाई आवश्यक है।
  2. dsDNA पूल सफाई और एकाग्रता
    1. डीएनए पूल में पैरामैग्नेटिक मोतियों(सामग्री की तालिका) की2.5x मात्रा जोड़ें, और फिर सामग्री को मिलाने के लिए धीरे-धीरे ट्यूब को झटका दें। ट्यूब को रोटेटर में 5 मिनट के लिए आरटी में रखें। 2000 x g और एक चुंबक पर गोली पर नमूना नीचे स्पिन।
    2. 250 माइक्रोन हौसले से तैयार 70% इथेनॉल (नाभिक मुक्त पानी में) जोड़ें, ध्यान रखना गोली परेशान नहीं है। इथेनॉल को एस्पिरेट करें और एक बार इथेनॉल वॉश दोहराएं।
    3. दूसरी आकांक्षा के बाद, 2000 x ग्राम पर नमूना नीचे स्पिन और चुंबक पर वापस जगह है। किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को बंद कर देते हैं और नमूना लगभग 30 एस के लिए सूखने की अनुमति देते हैं।
    4. चुंबक से ट्यूब निकालें और 60-70 माइक्रोन में गोली को रिस्यूंस करें। 2 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट । जब तक एल्यूट स्पष्ट न हो जाए तब तक चुंबक पर नमूना लें, और फिर एल्यूट को हटा दें और एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके केंद्रित पूल को विस्तृत करें, और फिर एडाप्टर लिगेशन चरण में आगे बढ़ने के लिए एक एलिकोट तैयार करें: 65 माइक्रोन अंतिम मात्रा में नमूने के 700 एनजी तैयार करें। पहले रन समाप्त होने के बाद एक दूसरे रन को पूरा करने के लिए पूल के शेष को 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    6. निर्माता द्वारा निर्देश के अनुसार एडाप्टर लिगेशन के साथ आगे बढ़ें और प्रवाह कोशिका पर नमूना लोड करें। अनुक्रमण रन शुरू करें।
      नोट: नमूना लोडिंग से पहले प्रवाह सेल प्राइमिंग पोर्ट से हवा और ~ 200 माइक्रोन स्टोरेज बफर। यह सफल प्रवाह सेल भड़काना और नमूना लोडिंग के लिए महत्वपूर्ण है। प्रवाह सेल के प्राइमिंग पोर्ट के माध्यम से समाधान खींचते और जमा करते समय एक p1000 पिपेट और युक्तियों का उपयोग करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुस्तकालय अनुक्रम।
    1. अनुक्रमण के लिए ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलें और स्टार्ट पर क्लिक करें। प्रयोग के लिए एक नाम इनपुट, एक अनुशंसित नामकरण रन की तारीख और उपयोगकर्ता का नाम भी शामिल है । किट चयन के लिए जारी रखनेपर क्लिक करें, उपयुक्त पुस्तकालय तैयारी किट और बारकोड विस्तार पैक (ओं) का इस्तेमाल का चयन करें, और फिर विकल्प चलाने के लिए जारी रखनेपर क्लिक करें ।
    2. यदि एक दूसरे रन के लिए पर्याप्त पुस्तकालय तैयार करने की योजना बना रहा है तो रन की लंबाई को 48 घंटे तक समायोजित करें (अन्यथा डिफ़ॉल्ट 72 घंटे पर छोड़ दें)। बेसकॉलिंग पर क्लिककरें ।
    3. बेसकॉलिंग विकल्प कॉन्फ़िग की जांच करें: फास्ट बेसकॉलिंग और सुनिश्चित करें कि बारकोडिंग सक्षम होने के लिए सेट किया गया है ताकि आउटपुट FASTQ फ़ाइलों को बारकोड दृश्यों की छंटनी की जाएगी और बारकोड के आधार पर अलग-अलग डायरेक्टरी में विघटित किया जाएगा। आउटपुट के लिए जारी रखनेपर क्लिक करें ।
    4. आउटपुट अनुक्रमण डेटा को बचाने के लिए कहां चुनें। लगभग 30-50 जीबी डेटा की अपेक्षा करें यदि केवल FASTQ आउटपुट और >500 जीबी डेटा की बचत करें यदि फास्ट5 आउटपुट को भी बचाएं। फ़िल्टरिंग विकल्प Qscore को अनचेक करें: 7 | Readlength: धारा 7.2 में वर्णित फ़िल्टरिंग के साथ आगे बढ़ने की योजना बना यदि अनफ़िल्टर्ड, अन्यथा चेक छोड़ दें और रीडलेंग्थ को 200 में समायोजित करें।
    5. सेटअप चलाने के लिए जारी रखने पर क्लिक करें और सभी सेटिंग्स की समीक्षा करें । यदि सेटिंग सही है, तो स्टार्टपर क्लिक करें, अन्यथा बैक पर क्लिक करें और कोई आवश्यक समायोजन करें।
    6. यदि वांछित है, तो प्रवाह सेल को निर्माता के निर्देशों के अनुसार धोया जा सकता है और शेष पूल के साथ फिर से लोड किया जा सकता है। पहले रन पूरा होने के बाद शेष पूल के लिए 6.2 में चरणों को दोहराएं और प्रवाह सेल को धोया गया हो।
      नोट: जब दूसरा रन स्थापित करने, प्रवाह कोशिकाओं के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार पूर्वाग्रह वोल्टेज को समायोजित करें-४८ घंटे से अधिक रन में इस्तेमाल किया ।

7. आकलन और तैयारी पढ़ता है

नोट: एक अनुशंसित निर्देशिका संरचना चित्र 4में चित्रित किया गया है । नीचे दिए गए गणना चरणों के साथ आगे बढ़ने से पहले डेस्कटॉपमें पाए जाने वाले निर्देशिकाओं, अर्थात् Long_Reads, Short_Reads और Trimmed_Reads बनाएं।

  1. लघु पढ़ता है (अंक 3)
    नोट: शॉर्ट रीड्स FASTQ फॉर्मेट में जेनरेट होते हैं । फाइलों में 4000 अधिकतम पढ़ता है प्रति FASTQ। इन्हें अक्सर ज़िपित (.gz संग्रह) किया जाता है और कई फ़ाइलों में व्यवस्थित किया जाता है। मंच के आधार पर, बारकोड आमतौर पर छंटनी की जाती है। कुछ कार्यक्रम ज़िपित प्रारूप में फ़ाइलों को स्वीकार करते हैं, दूसरों को आयात करने से पहले उनके निष्कर्षण की आवश्यकता हो सकती है। जीनोम असेंबली के दौरान डेटा सटीकता सुनिश्चित करने के लिए रीड्स को गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) कदम पारित करना होगा। यदि सीएलसी जीनोमिक्स वर्कबेंच उपलब्ध नहीं है, तो वैकल्पिक कार्यक्रमों का उपयोग ट्रिम करने के लिए किया जा सकता है और क्यूसी शॉर्ट रीड्स जैसे ट्रिमोमैटिक25 या ट्रिम प्रचुर मात्रा में (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) पढ़ने की गुणवत्ता के मूल्यांकन के लिए ट्रिमिंग और FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) के लिए । औसत कम पढ़ा कवरेज, औसत पढ़ा लंबाई और जीनोम आकार द्वारा विभाजित द्वारा पढ़ता है की संख्या गुणा द्वारा अनुमानित, >100x होने की सिफारिश की है ।
    1. ओपन जीनोमिक्स वर्कबेंच सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)और सभी युग्मित-अंत कम-रीड FASTQ फ़ाइलों का आयात करें। युग्मित फ़ाइलें स्वचालित रूप से उत्पन्न होंगी।
      1. शीर्ष टूलबार पर नए पर क्लिक करके और फ़ोल्डर का चयन करके CLC_Data के तहत एक नया फ़ोल्डरबनाएं ... फाइलों को स्टोर करने के लिए। फ़ोल्डर को वांछित के रूप में नाम दें, एक अनुशंसित कन्वेंशन नमूना आईडी का उपयोग कर रहा है। निम्नलिखित चरणों से इस फ़ोल्डर तक सभी आउटपुट को सहेजें।
      2. शीर्ष टूलबार पर, आयात बटन पर क्लिक करें और इलुमिनाका चयन करें ... नमूने के अनुरूप सभी कम पढ़ी जाने वाली फ़ाइलों पर नेविगेट करें और उनका चयन करें। सुनिश्चित करें कि जोड़ा पढ़ता विकल्प का चयन किया है और निकालें असफल पढ़ता विकल्प अनियंत्रित । आगे की स्लाइड्सपर क्लिक करें, सेव चुनेंऔर फिर से नेक्स्ट पर क्लिक करें। पिछले चरण में बनाए गए नए फ़ोल्डर में आयातित फाइलों को सहेजने के लिए चुनें और फिनिश पर क्लिक करें।
    2. आइसोलेड के लिए सभी बनती फ़ाइलों की एक अनुक्रम सूची बनाएं; यह विश्लेषण की सादगी के लिए एक ही फ़ाइल में पढ़ा डेटा को संक्षिप्त करेगा।
      1. शीर्ष टूलबार पर, नए बटन पर क्लिक करें और अनुक्रम सूचीका चयन करें ... बाईं ओर निर्देशिका सूची पर, फाइलों को संक्षिप्त करने के लिए चुनें और तीर का उपयोग उन लोगों को दाईं ओर चयनित फ़ाइलों की सूची में स्थानांतरित करने के लिए करें। आगे की स्लाइड्सपर क्लिक करें, सेव चुनेंऔर फिर से नेक्स्ट पर क्लिक करें। अनुक्रम सूची को बचाने के लिए चुनें और फिनिश पर क्लिक करें।
      2. एक बार अनुक्रम सूची उत्पन्न होने के बाद, तुरंत नमूना आईडी के साथ इसका नाम बदलें।
    3. अनुक्रम सूची पर पढ़ता उपकरण अनुक्रम के लिए QC चलाएं: यह प्रक्रिया कम पढ़े गए एनजीएस द्वारा उत्पन्न रीड्स की समग्र गुणवत्ता मापदंडों का आकलन करेगी।
      1. टूलबॉक्स मेनू (नीचे-बाएं खिड़की) में उपकरण पढ़ता है अनुक्रमण के लिए QC के लिए खोजें। उपकरण पर डबल क्लिक करें, और फिर विश्लेषण करने के लिए अनुक्रम सूची चुनें और अगलेपर क्लिक करें।
      2. सुनिश्चित करें कि सभी आउटपुट विकल्पों की जांच की जाए और सेव अंडर रिजल्ट्स हैंडलिंगचुनें। आउटपुट फ़ाइलों को सहेजने के लिए नेक्स्ट पर क्लिक करें और निर्दिष्ट करें, और फिर फिनिश पर क्लिक करें।
    4. अनुक्रम सूची पर ट्रिम रीड्स टूल चलाएं: गुणवत्ता, लंबाई और अस्पष्टता के आधार पर ट्रिमिंग की जाएगी। इस प्रक्रिया में माना गया है कि अनुक्रमण में उपयोग किए जाने वाले बारकोड को इस चरण से पहले छंटनी की गई है।
      1. टूलबॉक्स (नीचे-बाएं खिड़की) में ट्रिम रीड्स टूल की खोज करें। ट्रिम रीड्सपर डबल क्लिक करें और फिर विश्लेषण करने के लिए अनुक्रम सूची चुनें और आगेपर क्लिक करें ।
      2. गुणवत्ता ट्रिमिंग: गुणवत्ता स्कोर सीमा को 0.01 तक सेट करें और अस्पष्ट न्यूक्लियोटाइड को 2 पर छोड़ दें। आगेक्लिक करें ।
        नोट: पैरामीटर उपयोगकर्ता के विवेक पर समायोजित किए जा सकते हैं; ये अनुशंसित सेटिंग्स हैं।
      3. अनियंत्रित स्वचालित Read-थ्रेडायरिंग ट्रिमिंग (केवल ऐसा करें यदि एडाप्टर को सीएलसी में आयात करने से पहले पढ़ता से छंटनी की गई है)। आगे क्लिक करें और जांच करें डिस्कार्ड नीचे की लंबाई पढ़ता है,डिफ़ॉल्ट 15 का उपयोग करें।
      4. आगे क्लिककरें , रिपोर्ट देखेंऔर फिर सेवचुनें . नेक्स्ट पर क्लिक करें और निर्दिष्ट करें कि आउटपुट फ़ाइलों को कहां से बचाना है। फिनिशपर क्लिक करें ।
    5. छंटनी की गई अनुक्रम सूची का निर्यात करें: बाद में हाइब्रिड असेंबली और विश्लेषण सीएलसी के बाहर पूरा हो जाएगा और निर्यात की जाने वाली छंटनी की गई कम-पढ़ी फ़ाइलों की आवश्यकता होती है।
      1. शीर्ष बाईं ओर निर्देशिका नेविगेशन से, चरण 7.1.4 में उत्पन्न छंटनी की गई फ़ाइल चुनें, और फिर शीर्ष टूलबार पर निर्यात पर क्लिक करें। एक्सपोर्ट फाइल टाइप के लिए Fastq चुनें और नेक्स्टपर क्लिक करें । निर्यात युग्मित अनुक्रम सूची को दो फाइलों मेंदेखें । फिर, नेक्स्ट पर क्लिक करें और फाइलों को निर्यात करने के लिए Trimmed_Reads निर्देशिका चुनें। फिनिशपर क्लिक करें । सुनिश्चित करें कि छंटनी की गई कम पढ़ी गई फाइलों को विस्तार .fastqके साथ दो फ़ाइलों (R1 और R2) के रूप में सफलतापूर्वक निर्यात किया गया था।
        नोट: छंटनी अनुक्रम सूची दो फ़ाइलों में निर्यात किया जाना चाहिए, आम तौर पर R1 और R2 के रूप में सीएलसी द्वारा नामित । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि डाउनस्ट्रीम हाइब्रिड असेंबली को इस तरह स्थापित करने के लिए कम-पढ़ने वाले डेटा इनपुट की आवश्यकता होती है।
      2. निर्यात की गई फाइलों का नाम बदलें, कृपया फ़ाइल नामों में रिक्त स्थान और विशेष पात्रों के उपयोग से परहेज करें। सादगी के लिए एक अनुशंसित प्रारूप trimmed_short_file है। R1.fastq।
  2. लांग (मिनियन) पढ़ता है(चित्र 3)
    नोट: लांग (मिनियन) अनुक्रमण की तैयारी के लिए निम्नलिखित पाइपलाइन हाइब्रिड असेंबली के लिए पढ़ता है नैनोफिल्ट और नैनोस्टैट कार्यक्रमों का उपयोग करता है26 कमांड-लाइन द्वारा निष्पादित किया जाता है। आगे बढ़ने से पहले उपकरण स्थापित करें और इन आदेशों को निष्पादित करने के लिए UNIX की मूल बातें से परिचित रहें। डिफ़ॉल्ट टर्मिनलों और बैश शेल की सिफारिश की जाती है। सॉफ्टवेयर बढ़ईपारा27में कॉमन टर्मिनल कमांड और यूसेज के लिए एक सबक गाइड पाया जाता है । नीचे दिए गए निर्देशों में यह माना गया है कि उत्पन्न फाइलों का नाम बारकोड नामकरण (एनबी01, एनबी02, आदि) के साथ किया जाएगा और Long_Reads निर्देशिका में सहेजा जाएगा। वैकल्पिक रूप से, अनुक्रमण रन स्थापित करते समय मिंकानो का उपयोग करके फ़िल्टरिंग पढ़ें पूरा किया जा सकता है। औसत लंबे समय तक पढ़ने के कवरेज >100x होने की सिफारिश की है । अनुशंसित औसत पठन लंबाई >2000 बीपी है; इसलिए, लंबे समय तक पढ़ने की संख्या की जरूरत कम पढ़ता है की संख्या से कम है।
    1. Long_Reads निर्देशिका(चित्रा 4)के भीतर रन (बारकोड01, बारकोड02, आदि) में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक बारकोड के लिए नई निर्देशिका बनाएं। उपयुक्त फ़ोल्डर में प्रत्येक बारकोड के अनुरूप सभी .fastq फ़ाइलों को कॉपी करें। हर रन से प्रत्येक बारकोड के लिए सभी .fastq फ़ाइलों को मिलाएं।
    2. टर्मिनल खोलें और सीडी कमांड का उपयोग करके Long_Reads निर्देशिका के भीतर बारकोड निर्देशिका पर नेविगेट करें: सीडी डेस्कटॉप Long_Reads/
    3. निम्नलिखित आदेश को निष्पादित करके एक बारकोड के अनुसार सभी .fastq फ़ाइलों को एक ही .fastq फ़ाइल में संक्षिप्त करें: कैट *.fastq > NB01.fastq
      नोट: यह कमांड प्रत्येक फास्टक्यू फ़ाइलों से सभी रीड्स को एक बड़े, एकल FASTQ में जोड़ती है जिसका नाम NB01.fastq है।
    4. निम्नलिखित कमांड को निष्पादित करके नमूने की पठन गुणवत्ता का आकलन करने के लिए नैनोस्टैट का उपयोग करें: नैनोस्टैट --fastq NB01.fastq
    5. भविष्य के संदर्भ के लिए आउटपुट को टेक्स्ट या वर्ड फाइल में कॉपी करके परिणाम रिकॉर्ड करें।
    6. MinION फिल्टर करने के लिए नैनोफिल्ट का उपयोग करें आदेश को क्रियांवित करके Q < 7 और लंबाई < २०० के साथ पढ़ता है पढ़ता है: NanoFilt-q 7-l 200 bp NB01.fastq | gzip > NB01 _trimmed.fastq.gz
    7. आदेश को निष्पादित करके चरण 7.2.6 में उत्पन्न छंटनी की गई फ़ाइल पर नैनोस्टैट चलाएं: नैनोस्टैट --fastq NB01 _trimmed.fastq.gz
    8. आउटपुट को टेक्स्ट या वर्ड फाइल में कॉपी करके परिणामों को रिकॉर्ड करें और यह सुनिश्चित करने के लिए कि फ़िल्टरिंग सफल रही है(तालिका 1)चरण 7.2.4 से परिणामों की तुलना करें।
    9. अनुक्रमण रन में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक बारकोड के लिए 7.2.2 से 7.2.8 चरणों को दोहराएं।
      नोट: NB01_trimmed.fastq.gz चरण 7.2.6 में उत्पन्न फ़ाइल हाइब्रिड असेंबली के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

8. हाइब्रिड जीनोम असेंबली का सृजन

नोट: निम्नलिखित असेंबली पाइपलाइन यूनिसाइकिलर19,28,29, 30का उपयोग वर्ग7.1 और 7.2(चित्र 3)में तैयार छोटे और लंबे समय तक पढ़ने को मिलाने के लिए करती है। यूनिसाइकिलर और इसकी निर्भरता स्थापित करें और नीचे दिए गए आदेशों को निष्पादित करें। कदम 7.1.5 में निर्यात की गई लघु-पढ़ी फ़ाइलों को trimmed_short_file नाम दिया जाता है। R1.fastq और trimmed_short_file। सादगी के लिए R2.fastq।

  1. कम पढ़ी गई फ़ाइलों और लंबे समय से पढ़ी जाने वाली फ़ाइलों को Trimmed_Reads नाम की एक ही निर्देशिका में व्यवस्थित करें। निर्देशिका में निम्नलिखित शामिल होना चाहिए:
    1. छंटनी की गई लंबी रीड्स (चरण 7.2.6 में उत्पन्न) के लिए एक .fastq.gz फ़ाइल।
    2. छंटनी की गई छोटी रीड्स (चरण 7.1.5 में उत्पन्न) के लिए दो .fastq फ़ाइलें (R1 और R2)।
  2. टर्मिनल में सीडी कमांड का उपयोग करके पढ़ी गई फ़ाइलों को संग्रहित करने वाली निर्देशिका Trimmed_Reads Trimmed_Reads पर नेविगेट करें: सीडी डेस्कटॉप/
    1. एक बार सही निर्देशिका में, दो छोटी पढ़ी फ़ाइलों को ज़िप करें ताकि वे निम्नलिखित आदेश को निष्पादित करके .fastq.gz प्रारूप में भी हों: gzip trimmed_short_file। R1.fastq
  3. R1 और R2 दोनों के लिए चरण 8.2 दोहराएं। चेक करें कि सभी पढ़ी गई फाइलें अब .fastq.gz प्रारूप में हैं और सत्यापित करें कि सभी फाइलें एक ही आइसोलेट से मेल खाती हैं।
  4. निम्नलिखित कमांड चलाकर यूनिसाइकिलर का उपयोग करके हाइब्रिड असेंबली शुरू करें:
    यूनिसाइकिलर -1 trimmed_short_file। R1.fastq.gz -2 trimmed_short_file। R2.fastq.gz -l NB01 _trimmed.fastq.gz -o unicycler_output_directory
    नोट: -ओ निर्देशिका जिसमें यूनिसाइकिलर आउटपुट बचाया जाएगा निर्दिष्ट करता है, यूनिसाइकिलर आदेश निष्पादित होने के बाद इस निर्देशिका को बनाएगा; निर्देशिका पहले से उत्पन्न न करें। रन समय कंप्यूटर के कंप्यूटेशनल शक्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीनोम आकार और पढ़ता है की संख्या से बदलता है । इसमें कहीं भी 4 घंटे से लेकर 1 या 2 दिन तक का समय लग सकता है। यह प्रोटोकॉल 250 जीबी रैम, इंटेल एक्सन (आर) सीपीयू के साथ 2.5 गीगाहर्ट्ज 12 प्रैक्टिकल कोर और 48 वर्चुअल कोर के साथ सेंटओएस लिनक्स 7 मशीन पर किया गया था। वैकल्पिक रूप से, 16 जीबी रैम और 2.6 गीगा हर्ट्ज 6-कोर प्रोसेसर वाले पर्सनल कंप्यूटर इन विधानसभाओं की गणना लंबे समय में कर सकते हैं।
  5. जब रन पूरा हो जाए, तो यूनिसाइकिलर की समीक्षा करें.log कोई त्रुटि सुनिश्चित करने के लिए फ़ाइल की समीक्षा करें - उत्पन्न कॉन्टिग्स की संख्या, आकार और स्थिति (पूर्ण, अधूरी) रिकॉर्ड करें।
    1. यदि अपूर्ण कॉन्टिग्स की पहचान की जाती है (यूनिसाइकिलर लॉग में अपूर्ण के रूप में चिह्नित), तो चरण 8.4 में कमांड में निम्नलिखित ध्वज जोड़कर यूनिसाइकिलर को बोल्ड मोड में फिर से चलाएं: -- मोड बोल्ड।
      नोट: बोल्ड मोड विधानसभा के दौरान लंबे समय तक पढ़ने वाले पुलों के लिए स्वीकार की गई गुणवत्ता सीमा को कम करेगा; यह एक पूर्ण विधानसभा उपज हो सकता है, लेकिन विधानसभा की गुणवत्ता कम हो सकती है। आवश्यक होने पर ही बोल्ड मोड का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है और बाद में पीसीआर द्वारा पुष्टि किए जाने वाले contig में शामिल होने के लिए प्रारंभिक साक्ष्य के रूप में।

9. विधानसभा की गुणवत्ता का आकलन

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल पट्टी31 और QUAST32,दो कार्यक्रमों का उपयोग करता है जिन्हें उपयोग करने से पहले स्थापित किया जाना चाहिए(चित्र 2 और चित्रा 4)। पट्टी एक बार डाउनलोड की स्थापना की आवश्यकता नहीं है और QUAST बुनियादी कमांड लाइन उपयोग के साथ परिचित की आवश्यकता है । बेंचमार्किंग यूनिवर्सल सिंगल-कॉपी ऑर्थोलॉग (BUSCO)33का उपयोग करके जीनोम पूर्णता का आकलन करने की भी सिफारिश की गई है।

  1. पट्टी: फ़ाइलपर क्लिक करें । फिर, लोड ग्राफ चुनें और assembly.gfa फ़ाइल का चयन करें जो चरण 8.4 में यूनिसाइकिलर द्वारा उत्पन्न unicycler_output_directory के लिए सहेजा गया था। एक बार लोड होने के बाद, बाएं हाथ के टूलबार पर ड्रा ग्राफ बटन पर क्लिक करें और देखें कि असेंबली पूरी होने पर मूल्यांकन करने के लिए कॉन्टिग्स (जिसे नोड्स कहा जाता है) कैसे जुड़े और व्यवस्थित होते हैं(चित्रा 5)।
    नोट: पूर्ण विधानसभाओं का प्रतिनिधित्व दोनों सिरों(चित्र 5 ए,बी) से जुड़े एकल परिपत्र कॉन्टिग्स द्वारा किया जाताहै। अधूरी विधानसभाओं में एक साथ जुड़े कई कॉन्टिग्स होते हैं या रैखिक(चित्रा 5C) होतेहैं। छोटे रैखिक कॉन्टिग्स अधूरे नहीं हो सकते हैं क्योंकि वे रैखिक एक्स्ट्राक्रोमोमोमल तत्वों का संकेत हो सकते हैं। कवरेज, जिसे गहराई भी कहा जाता है, पट्टी में नोट किया जाएगा और गुणसूत्र के लिए कॉन्टिग्स की सापेक्ष बहुतायत का प्रतिनिधित्व करता है, जो यूनिसाइकिलर में 1x में सामान्यीकृत है।
  2. क्वास्ट
    1. टर्मिनल के भीतर, सीडी कमांड का उपयोग करके यूनिसाइकिलर आउटपुट को स्टोर करने वाले फ़ोल्डर पर नेविगेट करें: सीडी डेस्कटॉप unicycler_output_directory Trimmed_Reads/
      नोट: जहां विधानसभा स्थित है, यानी, यूनिसाइकिलर आउटपुट के लिए अग्रणी कोई निर्देशिका उनके नाम पर रिक्त स्थान हो सकता है, जहां के रास्ते में रिक्त स्थान की अनुमति नहीं है । वैकल्पिक रूप से, आसान पहुंच के लिए डेस्कटॉप पर assembly.fasta फ़ाइल की प्रतिलिपि।
    2. निम्नलिखित आदेश को निष्पादित करके QUAST चलाएं: quast assembly.fasta -o quast_output_directory
    3. आउटपुट डायरेक्टरी quast_output_directory में क्वास्ट द्वारा उत्पन्न रिपोर्टों की समीक्षा करें।

10. जीनोम एनोटेशन

नोट: नीचे एनोटेशन पाइपलाइन प्रोक्का34,एक कमांड-लाइन टूल का उपयोग करती है जिसे उपयोग से पहले स्थापित किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, स्वचालित जीयूआई के-बेस(सामग्री की तालिका)या वेब सर्वर RAST35के माध्यम से जीनोम एनोटेट के माध्यम से प्रोक्का का उपयोग करें। यदि जीनोम को एनसीबीआई में जमा करते हैं, तो वे प्रोकैरियोटिक जीनोम एनोटेशन पाइपलाइन (पीजीएपी) 36 का उपयोग करके स्वचालित रूप से एनोटेट होजाएंगे।

  1. टर्मिनल के भीतर उस फ़ोल्डर पर नेविगेट करें जो सीडी कमांड का उपयोग करके यूनिसाइकिलर आउटपुट को स्टोर करता है (चरण 9.2.1 देखें)। फिर, निम्नलिखित आदेश को निष्पादित करके प्रोक्का चलाएं: प्रोक्का --उपसर्ग sample_ID -- विधानसभा prokka_output_directoryआउटडिर।
    नोट: --उपसर्ग निर्दिष्ट sample_ID के आधार पर सभी आउटपुट फाइलों का नाम होगा। --आउटडिर निर्दिष्ट नाम के साथ एक आउटपुट निर्देशिका बनाएगा जहां सभी प्रोक्का आउटपुट फाइलें सहेजी जाएंगी; प्रोक्का के लिए पहले से आउटपुट डायरेक्टरी न बनाएं।
  2. एनोटेशन(चित्रा 6)की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए एक अनुक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर में उत्पन्न .gff फ़ाइल अपलोड करके .tsv तालिका और/या अपलोड करके एनोटेशन की समीक्षा करें ।
  3. विशिष्ट प्रकार के एनोटेशन ब्याज के आनुवंशिक कारकों के आधार पर उत्पन्न किए जा सकते हैं। प्रारंभिक विश्लेषण37, 38, 39,40, 41के लिए सेंटर फॉर जीनोमिक एपिडेमियोलॉजी (www.genomicepidemiology.org/) वेब सर्वर पर उपयोगकर्ता के अनुकूल उपकरणों के साथ शुरू करने की सिफारिश कीजातीहै। CRISPR-cas सिस्टम और प्रोफेज का पता लगाने के लिए अतिरिक्त उपकरण उपलब्ध हैं(चित्र 3)42,43.

11. डेटा लोकतंत्रीकरण के लिए सुझाए गए तरीके

  1. जब संभव हो, सभी कच्चे पढ़ने के डेटा के साथ-साथ एनसीबीआई अनुक्रम रीड आर्का (एसआरए) और जेनबैंक जैसे सार्वजनिक भंडार में इकट्ठे जीनोम जमा करें। एनसीबीआई जमाव प्रक्रिया के दौरान पीजीएपी पाइपलाइन के माध्यम से जीनोम को स्वचालित रूप से एनोटेट किया जाता है।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल को चित्र 1में सूचीबद्ध जेनेरा से संबंधित मूत्र बैक्टीरिया की संस्कृति और अनुक्रमण के लिए अनुकूलित किया गया है । इस विधि से सभी मूत्र बैक्टीरिया नहीं हैं। संस्कृति मीडिया और शर्तों को चित्र 1में जीनस द्वारा निर्दिष्ट किया गया है। चित्र 2में जीडीएनए अखंडता के अनुकरणीय जैल इलेक्ट्रोफोरेसिस आकलन को दर्शाया गया है । पढ़ने वाले प्रसंस्करण, जीनोम असेंबली और एनोटेशन को अनुक्रमण के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन का अवलोकन चित्र 3में वर्णित किया गया है। कंप्यूटेशनल निर्देशिका संरचना के लिए एक गाइड चित्रा 4 में प्रदान किया जाता है ताकि प्रोटोकॉल समझ को सरल बनाया जा सके और सफल संगठन के लिए ढांचा प्रदान किया जा सके। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न होने वाले दो क्लेबसिला एसपीपी, के निमोनिया और के ऑक्सीटोका केप्रतिनिधि पूर्ण जीनोम शामिल हैं। इन विधानसभाओं का प्रतिनिधित्व चित्र 5 में प्रदान किया जाता है और इसमें एक अतिरिक्त अधूरा उदाहरण के निमोनिया जीनोम भी शामिल है। प्रत्येक पूर्ण एनोटेटेड पूर्ण जीनोम का विस्तृत अवलोकन चित्र 6में दिखाया गया है । अंत में, उच्च गुणवत्ता वाले बंद जीनोम विधानसभाओं की पीढ़ी के लिए पर्याप्त कच्चे और छंटनी किए गए डेटा की व्यापक समझ प्रदान करने के लिए तालिका 1 में अनुक्रमण पठन आंकड़ों का सारांश प्रदान किया जाता है। इसके अतिरिक्त, दो प्रतिनिधि पूर्ण Klebsiella एसपीपी केप्रमुख मापदंडों । जीनोम सूचीबद्ध हैं। बायोप्रोजेक्ट पीआरजेएनए683049 के तहत जीनोम और रॉ डाटा जेनबैंक में जमा किया गया।

Figure 1
चित्रा 1:विविध मूत्र जेनेरा की संशोधित बढ़ी हुई मूत्र संस्कृति। आगर और तरल शोरबा है कि विविध मूत्र जेनेरा संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए चार्ट । सभी संस्कृति को उपधारा 1.1 में वर्णित 35 डिग्री सेल्सियस पर करने का सुझाव दिया गया है। मंडलों एक विशेष जीनस खेती के लिए उपयुक्त मीडिया का प्रतिनिधित्व करते हैं, रंग मनमाने ढंग से एक मीडिया प्रकार दूसरे से भेद करने के लिए चुना गया । सीडीसी-एक बाप (लाल), सीडीसी Anaerobe भेड़ रक्त आगर; 5% भेड़-BAP (नारंगी), भेड़ रक्त आगर; बीएची (हरा), ब्रेन हार्ट जलसेक; टीएसबी (पीला), ट्रिप्टिक सोया शोरबा; CHROMagar अभिविन्यास (नीला) । एकगार्डनरेला योनि को एचबीटी बिलेयर जी योनि पर सूक्ष्मविज्ञान वातावरण में और विशेष शोरबा संस्कृतिआवश्यकताओंके तहत सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। बीलैक्टोबेसिलस इनरों को माइक्रोएरोफिलिक वातावरण में 5% खरगोश-बीएपी प्लेटों और NYCIII शोरबा पर सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। cलैक्टोबेसिलस स्पीप। माइक्रोएरोफिलिक स्थितियों में श्रीमती पर सुसंस्कृत किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण एगर उठे जेल छवियां। प्रतिनिधि जेल gDNA निष्कर्षण परिणामों का चित्रण छवियों। (A)लेन 1: 1 केबी सीढ़ी, लेन 2: सफल निष्कर्षण, लेन 3 का प्रतिनिधित्व करने वाला बरकरार gDNA: खंडित gDNA का संकेत गंदा । (ख)लेन 1: 1 केबी सीढ़ी, लेन 2 और 3: आरएनए संदूषण १.५ केबी और 3 केबी के बीच दो बैंड द्वारा चिह्नित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:हाइब्रिड जीनोम असेंबली वर्कफ़्लो। पढ़ने की गुणवत्ता नियंत्रण और पूर्व प्रसंस्करण से विधानसभा एनोटेशन के लिए कदम की योजनाबद्ध। पढ़ें ट्रिमिंग अस्पष्ट और कम गुणवत्ता पढ़ता है निकालता है । क्यू-स्कोर और लंबाई पैरामीटर इंगित किए जाते हैं और बनाए गए रीड्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। असेंबली हाइब्रिड डी नोवो जीनोम असेंबली उत्पन्न करने के लिए छोटी और लंबी दोनों तरह की पढ़ती है। विधानसभा की गुणवत्ता का मूल्यांकन निर्दिष्ट उपकरणों और मापदंडों का उपयोग करके पूर्णता और शुद्धता के आधार पर किया जाता है। अंतिम जीनोम असेंबली सभी जीन और ब्याज की विशिष्ट loci के लिए एनोटेट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:बायोइन्फॉर्मेटिक्स निर्देशिका संरचना गाइड। लघु और लंबे समय तक पढ़ता है, संकर विधानसभा, और जीनोम एनोटेशन और QC के प्रसंस्करण के लिए अनुशंसित निर्देशिका और फ़ाइल संगठन की एक योजनाबद्ध। संबंधित फ़ाइलों और निर्देशिकाओं के बगल में प्रमुख कमांड-लाइन डेटा प्रोसेसिंग चरणों को हाइलाइट किया जाता है। आदेशों और झंडे (बोल्ड), इनपुट फ़ाइलें (नीली), आउटपुट फ़ाइलें या निर्देशिका (लाल), उपयोगकर्ता इनपुट जैसे फ़ाइल नामकरण सम्मेलन (मैजेंटा) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:पट्टी द्वारा जीनोम असेंबली रेखांकन। प्रतिनिधि(ए) क्लेबसिलेला ऑक्सीटोका KoPF10 और(B) Klebsiella निमोनिया KpPF25 और अधूरा जीनोम विधानसभा के(C) Klebsiella निमोनिया KpPF46 के पूरा जीनोम विधानसभा रेखांकन । KoPF10 का पूरा जीनोम एक बंद गुणसूत्र को दर्शाता है और KPPF25 के पूर्ण जीनोम में एक बंद गुणसूत्र और पांच बंद प्लाज्मिड होते हैं। KpPF46 के अधूरे गुणसूत्र में दो परस्पर contigs होते हैं। यूनिसाइकिलर हाइब्रिड डी नोवो असेंबली एक असेंबली ग्राफ उत्पन्न करती है जिसे पट्टी द्वारा कल्पना की जाती है। असेंबली ग्राफ जीनोम का एक सरलीकृत योजना प्रदान करता है, जो एक ही contig के दो सिरों को जोड़ने वाले लिंकर द्वारा बंद गुणसूत्र या प्लाज्मिड का संकेत देता है। एक से अधिक परस्पर contig की उपस्थिति अधूरी विधानसभा इंगित करता है। Contig आकार और गहराई पट्टी में के रूप में अच्छी तरह से उल्लेख किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:एनोटेटेड हाइब्रिड असेंबली के पूर्ण जीनोम नक्शे। एके ऑक्सीटोका KoPF10 और(बी) निमोनिया KpPF25 के पूर्ण जीनोम के लिए जेनियस प्राइम द्वारा उत्पन्न असेंबली नक्शे प्लाज्मिड बैकबोन के साथ रंगीन तीर द्वारा दर्शाए गए एनोटेटेड जीन दिखाते हैं । गुणसूत्र केवल सादगी के लिए आरएनए और टर्ना जीन दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल की धारा 10 में दर्शाए गए प्रोक्का का उपयोग करके जीनोम एनोटेशन किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Table 1
तालिका 1: प्रतिनिधि क्लेबसिएला एसपीपी।पूर्ण असेंबली विशेषताएं। के ऑक्सीटोका स्ट्रेन कोपीएफ10 और के निमोनिया स्ट्रेन केपीएफ25 के असेंबली पैरामीटर्स। NCBI पर जमा किए गए डेटा के लिए परिग्रहण नंबर दिए जाते हैं। ट्रिमिंग से पहले और बाद में दोनों को पढ़ता है की संख्या अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों दोनों के लिए निर्दिष्ट कर रहे हैं । N50 लंबे समय तक पढ़ता है के लिए प्रदान की जाती है केवल के बाद से कम पढ़ता है एक नियंत्रित लंबाई के हैं । प्लाज्मिड रिप्लिकन ने 80% पहचान और 60% लंबाई के मापदंडों के साथ प्लाज्मिडफाइंडर v2.1 एंटेरोबैक्टीरिया डेटाबेस का उपयोग करने की भविष्यवाणी की। एक एमएलएसटी, मल्टीलोकस सीक्वेंस टाइप। बी सीडीएस, कोडिंग सीक्वेंस। सी प्लाज्मिड रिप्लीकॉन ने 80% पहचान और 60% लंबाई के लिए सेट मापदंडों के साथ प्लाज्मिडफाइंडर v2.1 एंटोबैक्टीरिया डेटाबेस का उपयोग करने की भविष्यवाणी की। d ऑक्सफोर्ड नैनोपोर टेक्नोलॉजीज (ओनटी) ने पढ़े गए आंकड़े जमा किए । ई Illumina पढ़ें डेटा जमा किया । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित व्यापक हाइब्रिड जीनोम असेंबली प्रोटोकॉल विविध मूत्र माइक्रोबायोटा और यूरोपाथोमोजेन की सफल खेती और उनके जीनोम की पूरी असेंबली के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करता है। जीवाणु जीनोम के सफल WGS विविध और कई बार दुराग्रही रोगाणुओं के अलगाव के साथ शुरू होता है ताकि उनके जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए । आज तक, मौजूदा मूत्र संस्कृति प्रोटोकॉल में कई मूत्र प्रजातियों का पता लगाने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता की कमी होती है या इसमें लंबे और व्यापक दृष्टिकोण शामिल होते हैं जिन्हें विस्तारित समय और संसाधनों की आवश्यकता होती है11। संशोधित संवर्धित मूत्र संस्कृति दृष्टिकोण वर्णित 17 आम मूत्र जेनेरा से संबंधित बैक्टीरिया के सफल अलगाव के लिए एक सरलीकृत अभी तक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जिसमें संभावित रोगजनक या लाभकारी अनुकूल प्रजातियां शामिल हैं, और संकाय और अनिवार्य एरोबिक या अवायरोबिक बैक्टीरिया दोनों शामिल हैं। यह बदले में सटीक अनुक्रमण और बैक्टीरियल जीनोम की असेंबली के लिए और महत्वपूर्ण फेनोटाइपिक प्रयोगों के लिए आवश्यक प्रारंभिक सामग्री प्रदान करता है, जो मूत्र स्वास्थ्य और रोग की समझ में योगदान देता है। इसके अलावा, यह संशोधित संस्कृति दृष्टिकोण मूत्र नमूनों में पाए जाने वाले व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों के अधिक परिभाषित नैदानिक निदान के लिए प्रदान करता है और भविष्य के जीनोमिक अध्ययनों के लिए उनके बायोबैंकिंग के लिए अनुमति देता है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल सीमाओं के बिना नहीं है। जीव के साथ-साथ एक हाइपोक्सिया कक्ष या नियंत्रित इनक्यूबेटर जैसे संसाधनों के उपयोग के आधार पर लंबे समय तक इनक्यूबेशन की आवश्यकता हो सकती है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकते हैं। अवायवीय GasPaks का उपयोग एक वैकल्पिक समाधान प्रदान करता है, लेकिन ये महंगा कर रहे है और हमेशा एक निरंतर और नियंत्रित वातावरण का उत्पादन नहीं करते । अंत में, संस्कृति पूर्वाग्रह के साथ-साथ नमूना विविधता विशेष जीवों और यूरोपाथोजनों को दुराग्रही बैक्टीरिया से मात देने की अनुमति दे सकती है। इन सीमाओं के बावजूद, इस दृष्टिकोण से विविध मूत्र बैक्टीरिया की संस्कृति संभव हो जाती है।

जीनोमिक अनुक्रमण ने अगली पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की उन्नति के साथ लोकप्रियता हासिल की है जिससे अनुक्रमण डेटा14,15की उपज और सटीकता दोनों में काफी वृद्धि हुई है । डेटा प्रोसेसिंग और डी नोवो असेंबली के लिए एल्गोरिदम के विकास के साथ मिलकर, पूर्ण जीनोम दृश्य नौसिखिए और विशेषज्ञ वैज्ञानिकों की उंगलियों पर हैं, जो समान रूप से15,45हैं। पूर्ण जीनोम द्वारा प्रदान किए गए समग्र जीनोम संगठन का ज्ञान महत्वपूर्ण विकासवादी और जैविक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जिसमें जीन दोहराव, जीन हानि, और क्षैतिज जीन हस्तांतरण14शामिल हैं । इसके अतिरिक्त, रोगाणुरोधी प्रतिरोध और उग्रता के लिए महत्वपूर्ण जीन अक्सर मोबाइल तत्वों पर स्थानीयकृत होते हैं, जिन्हें आमतौर पर15, 16के मसौदे में जीनोम असेंबली में हल नहीं कियाजाताहै।

यहां प्रोटोकॉल पूर्ण जीनोम असेंबली उत्पन्न करने के लिए कम-पढ़ने वाले और लंबे समय तक पढ़े जाने वाले प्लेटफार्मों से अनुक्रमण डेटा के संयोजन के लिए एक संकर दृष्टिकोण का पालन करता है। मूत्र जीवाणु जीनोम पर ध्यान केंद्रित करते हुए, इस प्रक्रिया को विभिन्न अलगाव स्रोतों से विविध बैक्टीरिया के अनुकूल किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण कदम पर्याप्त बाँझ तकनीक का पालन और शुद्ध मूत्र बैक्टीरिया के अलगाव के लिए उपयुक्त मीडिया और संस्कृति की स्थिति का उपयोग शामिल हैं । इसके अलावा, बरकरार, उच्च उपज gDNA की निकासी दूषित से मुक्त डेटा अनुक्रमण पैदा करने के लिए आवश्यक है कि विधानसभा की सफलता में बाधा हो सकती है । बाद में पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल गुणवत्ता की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण हैं पर्याप्त लंबाई और गहराई के पढ़ता है। इसलिए, विशेष रूप से लंबे समय तक पढ़ने वाले अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी के दौरान देखभाल के साथ gDNA को संभालना बिल्कुल महत्वपूर्ण है, क्योंकि इस तकनीक का सबसे बड़ा लाभ लंबे समय तक कोई सैद्धांतिक ऊपरी लंबाई सीमा के साथ पढ़ता है। इसके अलावा उल्लिखित अनुक्रमण के उचित गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के लिए अनुभाग हैं जो शोर डेटा को समाप्त करते हैं और असेंबली परिणाम में सुधार करते हैं।

सफल डीएनए अलगाव, पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के बावजूद, कुछ प्रजातियों की जीनोमिक वास्तुकला की प्रकृति अभी भी बंद जीनोम असेंबली45,46की पीढ़ी के लिए एक बाधा प्रदान कर सकती है। दोहराव दृश्यों अक्सर विधानसभा गणना जटिल और लंबे समय तक पढ़ा डेटा के बावजूद, इन क्षेत्रों को कम विश्वास के साथ हल किया जा सकता है, या बिल्कुल नहीं । लंबे समय से पढ़ता है इस प्रकार जीनोम में सबसे बड़ा दोहराने क्षेत्र से अधिक समय तक औसत पर होना चाहिए या कवरेज उच्च (>100x)19होना चाहिए । कुछ जीनोम अधूरे रह सकते हैं और पूरा करने के लिए मैनुअल दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। फिर भी, हाइब्रिड इकट्ठे अधूरे जीनोम आमतौर पर कम पढ़े गए ड्राफ्ट जीनोम की तुलना में कम कॉन्टिग्स से बने होते हैं। असेंबली एल्गोरिदम के डिफ़ॉल्ट मापदंडों को समायोजित करना या पढ़ने के लिए अधिक कठोर कटऑफ का पालन करने से मदद मिल सकती है। वैकल्पिक रूप से, एक सुझाए गए दृष्टिकोण सबसे अधिक संभावना विधानसभा पथ के लिए सबूत की तलाश में अधूरे क्षेत्रों को लंबे समय तक पढ़ता है, और फिर प्रवर और प्रवर अनुक्रमण का उपयोग करने वाले पथ की पुष्टि करना है। मैपिंग में मिनीमैप 2 का उपयोग करके पढ़ने का सुझाव दिया जाता है और पट्टी मैप किए गए के दृश्य के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करती है, साथ ही इकट्ठे हुए कॉन्टिग्स के साथ कंटिग लिंकेज47के लिए साक्ष्य प्रदान करते हैं।

पूर्ण जीनोम पैदा करने के लिए एक अतिरिक्त चुनौती कमांड-लाइन उपकरणों के साथ अपनेपन और आराम में निहित है। किसी भी उपयोगकर्ता को कम्प्यूटेशनल अवसर प्रदान करने के लिए कई बायोइंफॉर्मेटिक उपकरण विकसित किए जाते हैं; हालांकि, उनका उपयोग UNIX और प्रोग्रामिंग की मूल बातें के साथ एक समझ पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बंद जीनोम असेंबली उत्पन्न करने और उन्हें एनोटेट करने के लिए पूर्व कमांड-लाइन अनुभव के बिना व्यक्तियों को सक्षम करने के लिए पर्याप्त विस्तृत निर्देश प्रदान करना है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल में योगदान के लिए डॉ मौतुसी जुबैदा इस्लाम और डॉ ल्यूक जॉयस को धन्यवाद देते हैं । हम भी उनकी प्रतिक्रिया और समर्थन के लिए डलास जीनोम केंद्र में टेक्सास विश्वविद्यालय को पहचानना चाहते हैं । इस काम को वेल्च फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था, पुरस्कार संख्या-2030-20200401 N.J.D. को, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा, पुरस्कार संख्या R01AI116610 द्वारा K.P. को, और महिला स्वास्थ्य में Felecia और जॉन कैन कुर्सी द्वारा, पीईजे द्वारा आयोजित

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
Bioanalyzer 2100 Agilent G29398A Optional but recommended
Centrifuge Eppendorf -- Any centrifuge for spinning conicals and microcentrifuge tubes (e.g. Models 5810R/5424R)
Electrophoresis BioRad Laboratories 1645070
Gel Imaging System BioRad Laboratories ChemiDoc models
Incubator ThermoFisher Scientific -- Any CO2 Incubator (e.g. Thermo Forma model 3110)
Magnetic Rack New England BioLabs S15095 12-tube rack
MinION Oxford Nanopore Technologies --
Nanodrop ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NextSeq 500 Illumina SY-415-1002 Other Illumina models are acceptable
Plate Reader BioTek -- Synergy H1
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33238
Rotator Benchmark Scientific H2024
Thermocycler ThermoFisher Scientific -- Any thermocycler for PCR reactions (e.g. ProFlex PCR system)
Materials:
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3991
10X TBE buffer -- -- 1M Tris,1M Boric Acid,0.2M EDTA (pH 8.0)
1429R primer Sigma Aldrich (Custom oligos) -- GGTTACCTTGTTACGACTT
1kb Ladder VWR 101228-494
1M Tris-Cl (pH 7.5) ThermoFisher Scientific 15567027
6x Loading dye Fisher Scientific NC0783588
8F primer Sigma Aldrich (Custom oligos) -- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
Agar Fisher Scientific BP1423-2
Agarose BioRad Laboratories 63001
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880
Anaerobe Pouch System - GasPak EZ BD Diagnostic Systems B260683
Boric Acid Fisher Scientific A73-500
Brain Heart Infusion Broth BD Diagnostic Systems 212304
CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar BD Diagnostic Systems L007357
CHROMagar Orientation BD Diagnostic Systems PA-257481.04
DNeasy Blood & Tissue QIAGEN 69504
DreamTaq Master Mix ThermoFisher Scientific K1081
Dry Anaerobic Indicator Strips BD Diagnostic Systems 271051
EDTA Fisher Scientific S311-500
Ethanol 200 Proof Sigma Aldrich E7023 For molecular biology
Ethidium Bromide ThermoFisher Scientific BP130210
Flow cell priming kit Oxford Nanopore Technologies EXP-FLP002
Flow cell wash kit Oxford Nanopore Technologies EXP-WSH003
Gel Extraction Miniprep Kit BioBasic BS654
Ligation sequencing kit Oxford Nanopore Technologies SQK-LSK109
Lysozyme Research Products International Corp L381005.05
Mutanolysin Sigma Aldrich M9901-5KU
Native barcoding expansion 1-12 Oxford Nanopore Technologies EXP-NBD104
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix New England BioLabs M0367L
NEBNext FFPE DNA Repair Mix New England BioLabs M6630L
NEBNext quick ligation buffer New England BioLabs B6058S
NEBNext Ultra II End repair / dA-tailing module New England BioLabs E7546L
Nextera DNA CD Indexes Illumina 20018708
Nextera DNA Flex Library Prep - (M) Tagmentation Illumina 20018705
Nuclease-free water Sigma Aldrich W4502
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Scientific Q33230
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Scientific Q32856
Quick T4 DNA Ligase New England BioLabs E6056L
R9 Flow cell Oxford Nanopore Technologies FLO-MIN106D
RNase A ThermoFisher Scientific EN0531
Sheep Blood Hemostat Laboratories DS13250
TE buffer -- -- 10mM Tris, 1mM EDTA (pH 8.0)
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Tryptic Soy Broth BD Diagnostic Systems 211825
Software & Bioinformatic Tools:
Bandage -- -- https://rrwick.github.io/Bandage/
Center for Genomic Epidemiology -- -- http://www.genomicepidemiology.org/
CLC Genomics Workbench 12 QIAGEN --
CRISPRcasFinder -- -- https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/
FastQC -- -- https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
Geneious Prime Geneious --
gVolante (BUSCO) -- -- https://gvolante.riken.jp/
Kbase Prokka Wrapper -- -- https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release
Minimap2 -- -- https://github.com/lh3/minimap2
MinKNOW Oxford Nanopore Technologies --
NanoFilt -- -- https://github.com/wdecoster/nanofilt
NanoStat -- -- https://github.com/wdecoster/nanostat
PHASTER -- -- https://phaster.ca/
Prokka -- -- https://github.com/tseemann/prokka
QUAST -- -- http://quast.sourceforge.net/quast
Trim Galore -- -- https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
Trimmomatic -- -- http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Unicycler -- -- https://github.com/rrwick/Unicycler#necessary-read-length

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जेनेटिक्स अंक 174 मूत्र पथ संक्रमण बैक्टीरिया हाइब्रिड जीनोम असेंबली नैनोपोर अनुक्रमण 16S आरएनए अगली पीढ़ी अनुक्रमण मोबाइल आनुवंशिक तत्व रोगाणुरोधी प्रतिरोध
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Sharon, B. M., Hulyalkar, N. V.,… More

Sharon, B. M., Hulyalkar, N. V., Nguyen, V. H., Zimmern, P. E., Palmer, K. L., De Nisco, N. J. Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies. J. Vis. Exp. (174), e62872, doi:10.3791/62872 (2021).

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