Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kısa ve Uzun Süredir Okunan Dizileme Teknolojilerini Kullanarak İdrar Bakterilerinin Tam Genomlarının Üretilmesi için Hibrit De Novo Genom Montajı

Published: August 20, 2021 doi: 10.3791/62872
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Texas at Dallas, 2Department of Urology, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

Bu protokol, üriner bakterilerin kültleme, dizileme ve de novo hibrid genom montajı için kapsamlı bir yaklaşımı detaylandırmak. İdrar kolonizasyonuna, patogeneze ve antimikrobiyal direncin yayılmasına katkıda bulunan kromozomal ve ekstrakrozomal genetik elementlerin incelenmesinde yararlı olan tam, dairesel genom dizilerinin üretimi için tekrarlanabilir bir prosedür sağlar.

Abstract

Komple genom dizileri, üriner mikropların genetik çeşitliliğinin ve benzersiz kolonizasyon faktörlerinin anlaşılması için değerli veriler sağlar. Bu veriler, antimikrobiyal direncin yayılmasına ve idrar yolu enfeksiyonunun (UTI) tedavisini daha da zorlaştıran plazmidler ve ekstrakromozomal faj gibi mobil genetik unsurları içerebilir. Genom yapısının ince çözünürlüğünü sağlamanın yanı sıra, tam, kapalı genomlar ayrıntılı karşılaştırmalı genomik ve evrimsel analizlere izin verir. Tam genom de novo'nun üretimi, mevcut sıralama teknolojisinin sınırlamaları nedeniyle uzun zamandır zorlu bir görev olmuştur. Eşleştirilmiş uçlu Yeni Nesil Dizileme (NGS), genellikle doğru ancak parçalanmış genom derlemeleriyle sonuçlanan yüksek kaliteli kısa okumalar üretir. Aksine, Nanopore dizilimi normalde hataya eğilimli komple montajlara yol açan daha düşük kalitenin uzun okumalarını sağlar. Bu tür hatalar genom çapındaki ilişkilendirme çalışmalarını engelleyebilir veya yanıltıcı varyant analizi sonuçları sağlayabilir. Bu nedenle, hem kısa hem de uzun okumaları birleştiren hibrit yaklaşımlar, son derece doğru kapalı bakteri genomları elde etmek için güvenilir yöntemler olarak ortaya çıkmıştır. Burada bildirilen, çeşitli üriner bakterilerin kültürü, 16S rRNA gen dizilimi ile tür tanımlama, genomik DNA'nın (gDNA) çıkarılması ve NGS ve Nanopore platformları tarafından kısa ve uzun okumaların üretilmesi için kapsamlı bir yöntemdir. Ek olarak, bu yöntem, açıklamalı tam genom dizilerinin üretimi için kalite kontrol, montaj ve gen tahmin algoritmalarının biyoinformatik bir boru hattını açıklar. Biyoinformatik araçların kombinasyonu, hibrit genom montajı ve aşağı akış analizi için yüksek kaliteli okuma verilerinin seçilmesini sağlar. Bu protokolde açıklanan hibrit de novo genom tertibatı için kolaylaştırılmış yaklaşım, herhangi bir kült bakteride kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Introduction

İdrar mikrobiyomu, idrar yollarının sağlıklı bireylerde steril olduğuna dair onlarca yıllık yanlış algıyı paramparça eden gelişmekte olan bir araştırma alanıdır. İdrar mikrobiyotası üyeleri idrar ortamını dengelemeye ve idrar yolu enfeksiyonunu önlemeye hizmet edebilir (UTI)1,2. Üropatojenik bakteriler idrar yollarını istila eder ve yerleşik mikrobiyotayı yerinden etmek, ürotelyumu kolonileştirmek, bağışıklık tepkilerinden kaçınmak ve çevresel baskılara karşı koymak için çeşitli virülans mekanizmaları kullanmaktadır3,4. İdrar, yüksek ozmolarite, sınırlı azot ve karbonhidrat kullanılabilirliği, düşük oksijenasyon ve düşük pH 5 ,6,7ile karakterize nispeten besin sınırlı bir ortamdır. İdrar ayrıca antimikrobiyal olarak kabul edilir, yüksek konsantrasyonlarda inhibitör üre ve insan katetisin LL-378gibi antimikrobiyal peptitlerden oluşur. İdrar yollarını kolonize etmek için hem yerleşik bakteriler hem de üropatojenler tarafından kullanılan mekanizmaların araştırılması, idrar yolu sağlığını daha iyi anlamak ve UTI tedavisi için yeni stratejiler geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, ön cephe antimikrobiyal tedavilerin başarısızlığı daha yaygın hale geldikçe, üriner bakteri popülasyonlarında antimikrobiyal direnç belirleyicileri taşıyan mobil genetik elementlerin yayılmasını izlemek giderek daha önemlidir9,10.

İdrar bakterilerinin genotiplerini ve fenotiplerini araştırmak için başarılı kültürleri ve sonraki tüm genom dizilimleri (WGS) zorunludur. İdrar örneklerinde uygulanabilir mikropları tespit etmek ve tanımlamak için kültüre bağımlı yöntemler gereklidir11. Standart klinik idrar kültürü, idrarı% 5 koyun kanı agar (BAP) ve MacConkey agar üzerine kaplamayı ve 24 saat12için 35 ° C'de aerobik olarak kuluçkalamayı içerir. Bununla birlikte,≥10 5 CFU / mL13algılama eşiği ile üriner mikrobiyotanın birçok üyesi bu yöntemle bildirilmez. Gelişmiş Nicel İdrar Kültürü (EQUC)11 gibi geliştirilmiş kültleme teknikleri, standart idrar kültürü tarafından yaygın olarak kaçırılan mikropları tanımlamak için farklı idrar hacimleri, kuluçka süreleri, kültür medyası ve atmosferik koşulların çeşitli kombinasyonlarını kullanır. Bu protokolde açıklanan EQUC modifiye bir sürümüdür, burada modifiye Geliştirilmiş İdrar Kültürü protokolü olarak adlandırılan, seçici medya ve optimal atmosferik koşullar kullanarak çeşitli üriner bakteri ve üropatojenlerin kültünü sağlayan ancak doğası gereği nicel değildir. İdrar bakterilerinin başarılı izolasyonu, aşağı akış WGS ve genom montajı için genomik DNA'nın (gDNA) çıkarılmasını sağlar.

Genom derlemeleri, özellikle komple montajlar, hem yerleşik mikrobiyota hem de üropatojenik bakteriler arasında kolonizasyona, niş bakımına ve virülansa katkıda bulunabilecek genetik faktörlerin keşfedilmesini sağlar. Taslak genom derlemeleri, sıralama hataları içerebilecek ve yönlendirme bilgilerinden yoksun çeşitli bitişik diziler (contigs) içerir. Tam bir genom montajında, her baz çiftinin hem yönü hem de doğruluğu doğrulanmıştır14. Ayrıca, tam genom dizileri elde etmek genom yapısı, genetik çeşitlilik ve mobil genetik elementler hakkında fikir verir15. Kısa okumalar tek başına önemli genlerin varlığını veya yokluğunu tanımlayabilir, ancak genomik bağlamlarını tam olarak belirleyemeyebilir16. Oxford Nanopore ve PacBio gibi uzun süredir okunan dizileme teknolojilerini etkinleştirerek, bakteri genomlarının kapalı de novo derlemelerini üretmek artık çok katlı PCR 17,18ile de novo montajlarının manuel olarak kapatılması gibi yorucu yöntemler gerektirmez. Yeni Nesil kısa okuma dizileme ve Nanopore uzun okumalı dizileme teknolojilerinin kombinasyonu, nispeten düşük maliyetlerle doğru, eksiksiz ve kapalı bakteri genom derlemelerinin facile üretimine izin verir19. Kısa okuma dizilimi, genellikle ortalama 40-100 contigs'den oluşan doğru ancak parçalanmış genom derlemeleri üretirken, Nanopore dizileme, daha az doğru olan ancak contigs'i birleştirmek ve genomik sentezi çözmek için iskele görevi görebilen yaklaşık 5-100 kb uzunluğunda uzun okumalar üretir. Hem kısa okuma hem de uzun okuma teknolojilerini kullanan hibrit yaklaşımlar doğru ve eksiksiz bakteri genomları üretebilir19.

Burada, insan idrarından bakterilerin izolasyonu ve tanımlanması, genomik DNA ekstraksiyonu, dizileme ve hibrit bir montaj yaklaşımı kullanılarak tam genom montajı için kapsamlı bir protokol açıklanmıştır. Bu protokol, kapalı bir bakteri kromozomunun ve plazmidler gibi ekstrakromosomal elemanların doğru montajı için kısa okuma ve uzun okuma dizilimi tarafından oluşturulan okumaları düzgün bir şekilde değiştirmek için gereken adımlara özel bir vurgu sağlar.

Protocol

Bakteriler, kurumsal inceleme kurulu onaylı 19MR0011 (UTD) ve STU 032016-006 (UTSW) çalışmalarının bir parçası olarak rızalı kadınlardan toplanan idrardan kültürlendi.

1. Değiştirilmiş gelişmiş idrar kültürü

NOT: Tüm kültür adımları steril koşullar altında yapılmalıdır. Tüm cihazları, çözümleri ve medyayı sterilize edin. Çalışma alanını% 70 etanol ile temizleyin, ardından bir Bunsen brülörü kurun ve kirlenme olasılığını azaltmak için aleve yakın dikkatlice çalışın. Alternatif olarak, steril bir ortamı korumak için sınıf II biyogüvenlik kabini kullanılabilir. Potansiyel patojenik mikroplara maruz kalmamak için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyin.

  1. Kaplama gliserol stoklu idrar ve koloni izolasyonu
    1. Gliserol stoklu idrarı oda sıcaklığında (RT) çözün. Çözüldükten sonra, örneği karıştırmak için 5 sn boyunca girdaplayın. Steril mikrosantrifüj tüplerinde, steril 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile idrarın 1:3 ve 1:30 seyreltmelerini 100 μL'lik son hacme hazırlayın.
      NOT: Gliserol stoklu idrar, 500 μL seyreltilmemiş idrar ve %50 steril gliserolün 500 μL'si cryovials'te karıştırılarak ve -80 °C'de depolanarak hazırlanır.
    2. Kullanmadan önce 15 dakika boyunca 37 °C'de önceden ısıtın agar plakaları. Yaygın üriner bakteri cinslerine uygun ortam türleri ve kültür koşulları için lütfen Şekil 1'e bakın. Seyreltilmiş idrarı kaplamadan önce pipetleme ile iyice karıştırın, seyreltilmiş idrarın 100 μL plakasını istenen agar plakasına koyun ve steril cam boncuklar kullanarak numuneyi yayın. Plaka 100 μL 1x PBS seyreltici ayrı bir plaka üzerinde büyüme kontrolü yok olarak.
      NOT: Yaygın üropatojenik türleri kültürlemeye çalışıyorsanız (örneğin, Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterococcus faecalis, vb.), üropatojenik bakteri türlerinin kolay tanımlanmasını sağladığından kromojenik agar(Malzeme Masası)kullanılması önerilir (Şekil 1). Colistin Nalidixic Acid (CNA) veya MRS agar, seçici olmayan agarlarda titiz türleri geride kalabilen Gram negatif üropatojenler içerdiği bilinen idrardan titiz Gram-pozitif türleri (örneğin Lactobacillus spp.) izole etmek için yararlıdır.
    3. Üropatojenler için 24 saat ve titiz bakteriler için 3-5 gün süreyle 35 °C'de istenen atmosferik durumda ters çevrilmiş plakayı kuluçkaya yatırın (Şekil 1).
    4. Kuluçka süresinden sonra plakaları inkübatörden çıkarın. Her plakadan benzersiz bir renk, morfoloji veya hemolitik desenler sergileyen kolonileri seçin.
    5. Bakteri kolonisini steril bir döngü kullanarak ilgili agar üzerine yeniden çizin ve iyi izole edilmiş koloniler elde etmek için plakayı istenen atmosferde 2-5 gün boyunca inkübte edin.
      NOT: Birincil kültür için BAP kullanıyorsanız, kromojenik agar üzerindeki kolonların yamalması, numunedeki bakteri popülasyonunun heterojenliği hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir.
  2. Sıvı et suyunda kültleme ve gliserol stoklayan bakteriyel izolatlar
    1. Ana koloninin morfolojisine uyan izole koloniler elde edildikten sonra, tek bir koloni seçin ve steril bir aşılama döngüsü kullanarak 3 mL sıvı suyuna aşılayın. Yaygın üriner mikrobiyota cinsinin büyümesini destekleyebilen et suyu için Şekil 1'e bakın. Agar plakalarını parafilm ile kapatın ve 2-4 gün boyunca 4 °C'de saklayın. Sıvı kültürleri, kültür gözle görülür şekilde bulanık olana kadar 1-5 gün boyunca istenen atmosferik koşullarda kuluçkaya yatırın.
    2. Büyüme gözlendikten sonra, kültürü girdap ve daha sonra 2 mL cryovial içinde 500 μL steril% 50 gliserol için geceleme kültürünün 1 mL'sini ekleyin; mühürleyin ve ters çevrilerek hafifçe karıştırın. Her koloni için iki gliserol stok hazırlayın (biri yedek olarak hizmet eder) ve -80 °C'de saklayın.

2. Bakteri türlerinin 16S rRNA geni Sanger dizilimi ile tanımlanması

NOT: Mikrobiyal kimlik alternatif olarak Uçuş Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF)20'ninMatris Destekli Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Süresi kullanılarak doğrulanabilir.

  1. Koloni-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
    1. 12,5 μL 2x Taq Polimeraz Ana Karışımı ekleyerek PCR tüplerinde 25 μL PCR reaksiyonu hazırlayın, 0,5 μL 10 μM 8F astar, 0,5 μL 10 μM 1492R astar (Malzeme Tablası) ve 11,5 μL çekirdeksiz su21.
      NOT: Birden fazla numune için PCR yapıyorsanız, Taq Polymerase karışımı, astarlar ve steril nükleaz içermeyen suyun reaksiyon ana karışımını yapın. Daha sonra her PCR tüpüne aliquot 25 μL.
    2. Koloni-PCR gerçekleştirmek için steril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak iyi izole edilmiş bir koloniyi yeniden çizgiden çekin. 2.1.1. adımda hazırlanan PCR reaksiyon karışımında koloniyi yeniden kullanın. Yavaşça karıştırın. Tüpün altındaki sıvıyı 2000 x g'dahızlı bir dönüşle toplayın.
      NOT: Numunenin hava kabarcıkları içermemesine dikkat edin. Yalnızca PCR reaksiyon karışımını içeren şablonsuz denetim (NTC) örneği ekleyin.
    3. Numune tüplerini termosiklete yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 3 dakika boyunca 95 °C; 40 döngü: 30 s için 95 °C, 30 s için 51 °C ve 1 dk 30 sn için 72 °C; 10 dakika için 72 °C; 10 °C'de tutun.
  2. Jel ekstraksiyonu ve türlerin tanımlanması
    1. PCR çalışmasının tamamlanmasının ardından, PCR ürününü 0,5x Tris-Borat-EDTA (TBE) tamponunda hazırlanan% 1 agarose jel üzerinde kontrol edin. Jeli dökmeden önce ethidium bromür (EtBr) ekleyin. Ardından, en az 20 μL numune hacmine sahip kuyular için taraklar kullanarak jeli atın.
      DİkKAT: EtBr kanserojen olduğundan şüphelenilen bir intercalating ajandır. Kullanırken her zaman eldiven ve KKD giyin ve EtBr içeren malzemeleri kurumun yönergelerine göre atın.
    2. Jel ayarlandığında, jeli 0,5x TBE tamponu ile dolu elektroforez tankına yerleştirin ve tarağı çıkarın. 1 kb'lık merdiveni ilk kuyuya ve PCR reaksiyonunun 10-20 μL'lik kısmını sonraki kuyulara yükleyin. Çözülene kadar 100-140 V'ta çalıştırın. Jeli UV ışığı altında görselleştirin ve NTC kuyusunda bulunmayan ~1,5 kb'da açıkça tanımlanmış bir bandın varlığını onaylayın.
      DİkKAT: UV ışınları cilde ve gözlere zararlıdır, jeli görselleştirirken uygun bir koruma kullanın ve uygun KKD giyin.
      NOT: Koloni PCR bazı bakteriler için başarısız olabilir; izole gDNA'dan PCR ile devam alternatif bir seçenektir22.
    3. ~1,5 kb bantları jilet kullanarak çıkarın ve jel kesimlerini temiz mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Üreticinin talimatlarına göre jel çıkarma protokolüne devam edin (Malzeme Masası). Saflaştırılmış DNA'nın konsantrasyonunu mikrovolum spektrofotometre ile ölçün.
      NOT: 10 > ng/μL konsantrasyonu istenir ve 1.7-2.0 arasında A260/280 kabul edilebilir.
    4. Her örnek için biri 8F, diğeri de seçilen sanger sıralama hizmetinin yönergelerine göre nükleaz içermeyen suda 1492R astarı kullanarak iki Sanger dizileme reaksiyonları hazırlayın.
    5. Sıralama verileri alındıktan sonra, DNA dizilerini NCBI Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) web sitesine (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi yükleyin, Nükleotid BLAST (blastn) öğesini seçin, rRNA/ITS veritabanı 16S ribozomal RNA dizilerini (Bakteri ve Arkea) seçin ve Megablast programını çalıştırın. İzole, veritabanından bir başvuruya en yüksek kalitede isabetle tanımlanabilir.
      NOT: Bazı bakteri türleri 16S rRNA dizilerinde yüksek kimlik sergiler ve sadece bu yöntemle ayırt edilemez olabilir. Speciation, aynı cinsin üyelerini güvenle ayırt etmek için DNA homolojisi ve biyokimyasal analizler gerektirecektir23.

3. Genomik DNA'nın çıkarılması (gDNA)

NOT: Bu bölümde, çeşitli bakteri türlerinden kaliteli genomik DNA'nın yüksek verimle çıkarılması için Malzeme Tablosunda atıfta bulunulan gDNA ekstraksiyon kitinde sağlanan reaktifler ve spin sütunları kullanılmaktadır. Aşağıda önerilen değişiklikler ve talimatlar verilmiştir.

  1. Üreticinin talimatlarına göre kit reaktifleri hazırlayın.
  2. İyi izole edilmiş kolonilerdeki bakterileri ortama aşılayarak ve yeterli büyüme gözleninnceye kadarŞekil 1'debelirtilen sıcaklık ve atmosferik basınçta inkübasyon yaparak uygun steril et suyunda 3-10 mL kültürler hazırlayın ( Şekil 1).
  3. Kuluçkadan sonra, bir spektrofotometre kullanarak kültürün 600 nm (OD600)optik yoğunluğunu ölçün24.
    1. Gece kültürlerini 1:10 oranında seyrelterek numuneyi niceleme için hazırlayın. Ölçüm için steril kültür medyasından bir boşluk da ekleyin. Örnek okumadan boş okumayı çıkararak ve on seyreltme faktörüyle çarparak optik yoğunluğu hesaplayın.
  4. OD600 ölçümünü ve türler için önceden oluşturulmuş bir OD600 ila CFU / mL oranını kullanarak, 2 x 109 hücre elde etmek için kaç mililitre kültürün gerekli olduğunu hesaplayın.
  5. Gerekli kültür hacmini pelet için 5000 x g'da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantı emişin ve peleti 200 μL soğuk TE tamponunda yeniden uygulayın (prosedürün başında buzda ön soğukluk).
  6. Numuneyi 5000 x g'da 2 dakika santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve ardından peleti 180 μL Enzimatik Lizis Tamponunda (ELB) yeniden çıkarın ve önceden kaynatılmış RNase A (10 mg/mL) ekleyin. Gram-pozitif bakterilerin verimli lizisi için 18 μL mutanolysin (25 kU/mL) ekleyin. Vortex iyi ve sonra 2 saat boyunca rotator üzerinde 37 °C'de örnekleri kuluçkaya yatırın.
    NOT: Üreticinin protokolünde açıklanan ELB'nin hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakteriler için kullanılması önerilir.
  7. Üreticinin talimatlarına göre devam edin.
    NOT: İstenirse ek gDNA verimi elde etmek için bir veya iki kez daha elution adımlarını tekrarlayın.
  8. Bölüm 4'te belirtildiği gibi çıkarılan gDNA'nın kalitesini değerlendirin ve 1 hafta içinde kullanılacaksa gDNA'yı 4 °C'de saklayın. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için gDNA'yı -20 °C'de tutun.

4. Çıkarılan gDNA'nın kalitesinin değerlendirilmesi

  1. Jel elektroforez ile kaliteyi değerlendirmek için, 2.2 alt bölümünde açıklandığı gibi% 1 agarose jel hazırlayın. Numuneyi temiz bir tüpte hazırlayın: parafilm üzerinde 1-2 μL çıkarılan gDNA ve 3 μL 2x yükleme boyasını karıştırın. Jeli yüklendikten sonra çalıştırın ve UV ışığı altında görselleştirin.
    NOT: Başarılı gDNA ekstraksiyonu jelin üst kısmındaki ayrık bir bant ve minimum lekeleme ile belirgin olacaktır (Şekil 2A). Lekeleme kesmenin göstergesidir. GDNA bandı belirgin değilse ve/veya bulaştırma önemliyse, gDNA ekstraksiyonu tekrarlayın. RNase A ve Proteinaz K'de kuluçka sürelerini azaltmayı düşünün. 1,5-3 kb civarında iki bant gözlenirse, bu RNA kontaminasyonını gösterir (Şekil 2B). Taze RNase A hazırlayın ve ekstraksiyonu tekrarlayın.
  2. Kaliteyi mikrovolum spektrofotometresi ile değerlendirmek için gDNA konsantrasyonunu ve absorbans oranı A260/280'i mikrovolum spektrofotometre ile ölçün. 1.7-2.0 arasında 50 >/μL ve A260/280 konsantrasyonları kabul edilebilir.
    NOT: Düşük gDNA verimi düşük giriş, yüksek giriş, çekirdeklerin kirlenmesi, yetersiz lizizden kaynaklanabilir. Aralığın üzerindeki absorbans oranları RNA kontaminasyonını gösterir. gDNA kalitesi düşükse ekstraksiyonu tekrarlayın.
  3. Kaliteyi florometre ile değerlendirmek için, Yüksek Hassasiyetli test kiti ve florometre cihazı(Malzeme Masası)kullanarak gDNA konsantrasyonunun ölçülmesi için üreticinin talimatlarını izleyin. Konsantrasyon >50 ng/μL arzu edilir.

5. Eşleştirilmiş uçlu yeni nesil kısa okuma dizilimi ve kütüphane hazırlığı

NOT: Kısa okuma dizilimi, çeşitli enstrümanlarda farklı okuma uzunluklarında ve yönlerinde gerçekleştirilebilir. Bakteriyel WGS için 150 bp (300 döngü) eşleştirilmiş uçlu dizileme önerilir. Hem kütüphane hazırlama hem de sıralama, temel tesislere veya ticari laboratuvarlara dış kaynaklı olabilir.

  1. Sıralama kitaplığını üreticinin talimatlarına görehazırlayın( Malzeme Masası ). Üreticinin önerilen son yükleme kitaplığı konsantrasyonuna uyun; ancak, önerilen bir değişiklik, NextSeq enstrümanlarında en iyi okuma oluşturma için havuza havuza alan kitaplığı 1,8 pM'de yüklemektir.
  2. İsteğe bağlı olsa da, havuza alınan kitaplık parçası dağılımını değerlendirmek ve parça boyutunun ortalama 600 bp olduğundan emin olmak için bir Biyoanalyzer (Malzeme Tablosu)kullanın.

6. Nanopore MinION sıralı kütüphane hazırlığı

  1. Sıralama kitaplığını üreticinin protokolüne görehazırlayın( Malzeme Masası ). İki barkod genişletme kiti kullanmak, tek bir akış hücresinde 24 numuneye kadar çoklama sağlar. Kütüphane hazırlığının, 24 numunenin çoklandığında bir seferde 12 örnek olmak üzere iki bölümde yapılması önerilir. 24 numunenin tümü aşağıda açıklandığı gibi birikebilir.
    NOT: Numuneler, Yerel Barkod Ligasyonu'nun bitirilmesinden sonra bir gecede 4 °C'de saklanabilir - bu, gerekirse protokolde bir durma noktası sağlar. Kütüphane hazırlık protokolünün Yerel barkod ligasyon bölümünün sonunda, her numunenin eşitlikçi miktarlarının mümkün olan maksimum DNA kütlesine (ng) kadar birleştirilmesi önerilir.
    1. Bunu yapmak için, barkod ligasyonunu izleyen tüm numuneleri, üreticinin talimatlarına göre bir florometre (Malzeme Tablosu)kullanarak ölçün. En düşük dsDNA konsantrasyonuna sahip numunenin hacmini tahmin edin ve sonra bu örnekte bulunan toplam dsDNA'yı hesaplayın. Birlikte havuza alınacak diğer tüm örneklerin eşitlikçi miktarlarını belirlemek için bu numarayı kullanın.
      NOT: Ekinoler hesaplama havuzalanmış dsDNA miktarını en üst düzeye çıkaracağından ve böylece yüksek hacimli bir havuz (>65 μL) elde edeceğinden, havuzu konsantre etmek için temizlik gereklidir.
  2. dsDNA havuz temizleme ve konsantrasyonu
    1. DNA havuzuna 2,5x hacimli paramanyetik boncuk (Malzeme Masası)ekleyin ve ardından içeriği karıştırmak için tüpü hafifçe hareket ettirin. Tüpü RT'de 5 dakika boyunca rotatora yerleştirin.
    2. Peletin rahatsız olmamasına dikkat ederek 250 μL taze hazırlanmış% 70 etanol (çekirdeksiz suda) ekleyin. Etanol aspirat ve bir kez etanol yıkama tekrarlayın.
    3. İkinci aspirasyondan sonra, numuneyi 2000 x g'da aşağı çevirin ve mıknatısa geri yerleştirin. Pipet herhangi bir artık etanol kapalı ve numune yaklaşık 30 s için kurumaya izin verin.
    4. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve peletin 60-70 μL çekirdeksiz suya yeniden harcayın. RT'de 2 dakika kuluçkaya yaslanın. Elute temizleninceye kadar numuneyi mıknatıs üzerinde pelet ve ardından elute'yi çıkarın ve temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    5. Konsantre havuzu bir florometre kullanarak ölçün ve ardından adaptör ligasyon adımına ilerlemek için bir aliquot hazırlayın: numunenin 700 ng'lik kısmını 65 μL son hacimde hazırlayın. İlk çalıştırma tamamlandıktan sonra ikinci bir çalıştırmanın tamamlanması için havuzun geri kalanını 4 °C'de tutun.
    6. Üreticinin talimatıyla adaptör ligasyonuna devam edin ve örneği akış hücresine yükleyin. Sıralama çalıştırmasını başlatın.
      NOT: Numune yüklemesinden önce akış hücresi astar bağlantı noktasından hava ve ~200 μL depolama tamponu aspirat. Bu, başarılı akış hücresi astarlama ve numune yükleme için kritik öneme sahiptir. Akış hücresinin astar bağlantı noktasından çözeltileri çizip biriktirirken bir p1000 pipet ve uç kullanın.
  3. Kitaplığı üreticinin talimatlarına göre sıralayın.
    1. Sıralama için işletim yazılımını açın ve Başlat'ı tıklatın. Deneme için bir ad girin, önerilen bir isimlendirme çalışma tarihini ve kullanıcı adını içerir. Kit Seçimine Devam Et 'itıklatın, kullanılan uygun kitaplık hazırlık kitini ve barkod genişletme paketlerini seçin ve ardından Çalıştırmaya Devam Seçenekleri'ni tıklatın.
    2. İkinci bir çalışma için yeterli kitaplık hazırlamayı planlıyorsanız çalışma uzunluğunu 48 h'ye ayarlayın (aksi takdirde varsayılan olarak 72 saat bırakın). Basecalling'e Devam Et 'itıklatın.
    3. Temel arama seçeneği Config: Fast Basecalling'i kontrol edin ve Barcoding'in Etkin olarak ayarlandığından emin olun, böylece çıkış FASTQ dosyaları barkod dizilerinden kırpılır ve barkoda dayalı ayrı dizinlere dönüştürülür. Çıktıya Devam 'ıtıklatın.
    4. Çıktı sıralama verilerinin kaydedileceği yeri seçin. Yalnızca FASTQ çıkışını kaydediyorsa yaklaşık 30-50 Gb veri ve FAST5 çıkışını da kaydediyorsanız >500 Gb veri bekleyin. Süzme seçeneği Qscore: 7 | işaretini kaldırın Readlength: Bölüm 7.2'de açıklanan filtrelemeye devam etmeyi planlıyorsanız filtresiz, aksi takdirde işaretli bırakın ve Readlength'i 200 olarak ayarlayın.
    5. Kurulumu Çalıştırmaya Devam Et'i tıklatın ve tüm ayarları gözden geçirin. Ayarlar doğruysa, Başlat'a tıklayın, aksi takdirde Geri'ye tıklayın ve gerekli ayarlamaları yapın.
    6. İstenirse, akış hücresi üreticinin talimatlarına göre yıkanabilir ve kalan havuzla birlikte yeniden yüklenebilir. İlk çalıştırma tamamlandıktan ve akış hücresi yıkandıktan sonra kalan havuz için 6.2'deki adımları yineleyin.
      NOT: İkinci çalıştırmayı ayarlarken, bias voltajını daha önce 48 saatin üzerindeki çalıştırmalarda kullanılan akış hücreleri için üreticinin önerilerine göre -250 mV olarak ayarlayın.

7. Okumaların değerlendirilmesi ve hazırlanması

NOT: Şekil 4 'te önerilen bir dizin yapısı gösterilmektedir. Aşağıdaki hesaplama adımlarına geçmeden önce Masaüstündebulunan dizinleri oluşturun, yani Long_Reads, Short_Reads ve Trimmed_Reads.

  1. Kısa okumalar (Şekil 3)
    NOT: Kısa okumalar FASTQ biçiminde oluşturulur. Dosyalar FASTQ başına en fazla 4000 okuma içerir. Bunlar genellikle fermuarlı (arşiv .gz) ve birden fazla dosya halinde düzenlenir. Platforma bağlı olarak, barkodlar genellikle kırpılır. Bazı programlar sıkıştırılmış biçimde dosyaları kabul ederken, diğerleri içe aktarmadan önce çıkarmalarını gerektirebilir. Okumalar, genom montajı sırasında veri doğruluğunu sağlamak için kalite kontrol (QC) adımlarını geçmelidir. CLC Genomics Workbench kullanılamıyorsa, Trimmomatic gibi kısa okumaları kırpmak ve QC kısa okumaları için alternatif programlar kullanılabilir25 veya Kırpma için Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) ve okuma kalitesini değerlendirmek için FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) kırpın. Okuma sayısının ortalama okuma uzunluğu ile çarpılması ve genom boyutuna bölünmesiyle tahmin edilen ortalama kısa okuma kapsamının 100x > olması önerilir.
    1. Genomics Workbench yazılımını (Malzeme Tablosu) açın ve tüm eşleştirilmiş uçlu kısa okuma FASTQ dosyalarını içe aktarın. Eşleştirilmiş dosyalar otomatik olarak oluşturulur.
      1. Üst araç çubuğundaki Yeni'yi tıklatıp Klasör'ü seçerek CLC_Data altında yeni bir klasör oluşturun ... dosyaları depolamak için. Klasörü istediğiniz gibi adlandırın, önerilen bir kural örnek kimliği kullanıyor.
      2. Üst araç çubuğunda, İçe Aktar düğmesine tıklayın ve Illumina'yı seçin ... Örneğe karşılık gelen tüm kısa okuma dosyalarına gidin ve seçin. Eşleştirilmiş okuma seçeneğinin seçili olduğundan emin olun ve Başarısız okumaları kaldır seçeneğinin işaretini kaldırın. İleri 'yitıklatın, Kaydet 'iseçin ve İleri'yi yeniden tıklatın. İçe aktarılan dosyaları önceki adımda oluşturulan yeni klasöre kaydetmeyi seçin ve Son 'utıklatın.
    2. İzole etmek için tüm eşleştirilmiş dosyaların sıra listesini oluşturun; bu, analiz basitliği için okuma verilerini tek bir dosyada birleştirir.
      1. Üst araç çubuğunda, Yeni düğmesine tıklayın ve Sıra Listesi 'niseçin ... Soldaki dizin listesinde, birleştirilecek dosyaları seçin ve bunları sağdaki seçili dosyalar listesine taşımak için okları kullanın. İleri 'yitıklatın, Kaydet 'iseçin ve İleri'yi yeniden tıklatın. Sıra listesini kaydetmeyi seçin ve Son 'utıklatın.
      2. Sıra listesi oluşturulduktan sonra, örnek kimlikle hemen yeniden adlandırın.
    3. Sıra listesinde Okumaları Sıralama için QC aracını çalıştırın: Bu yordam, kısa okuma ngs tarafından oluşturulan okumaların genel kalite parametrelerini değerlendirir.
      1. Araç kutusu menüsünde (sol alt pencere) Sıralama Okumaları için QC aracını arayın. Aracı çift tıklatın ve analiz edilecek sıra listesini seçin ve İleri'yi tıklatın.
      2. Tüm çıktı seçeneklerinin işaretli olduğundan emin olun ve Sonuç İşlemealtında Kaydet 'i seçin. İleri 'yi tıklatın ve çıktı dosyalarını kaydetmek için belirtin ve sonra Son 'utıklatın.
    4. Sıra listesinde Okumaları Kırp aracını çalıştırın: Kırpma, kaliteye, uzunluğa ve belirsizliğe göre yapılır. Bu işlem, sıralamada kullanılan barkodların bu adımdan önce kırpıldığını varsayar.
      1. Araç kutusunda (sol alt pencere) Okumaları Kırp aracını arayın. OkumalarıKırp 'ı çift tıklatın ve sonra analiz edilecek sıra listesini seçin ve İleri 'yitıklatın.
      2. Kalite kırpma: kalite puanı sınırını 0,01 olarak ayarlayın ve belirsiz nükleotitleri 2'de bırakın. İleri 'yitıklatın.
        NOT: Parametreler kullanıcının takdirine bağlı olarak ayarlanabilir; bunlar önerilen ayarlardır.
      3. Otomatik Okuma Bağdaştırıcısı Kırpma'nın işaretini kaldırın (bunu yalnızca bağdaştırıcılar CLC'ye almadan önce okumalardan kırpılmışsa yapın). İleri'ye tıklayın ve Uzunluğun Altındaki Okumaları At 'ıkontrol edin, varsayılan 15'i kullanın.
      4. İleri 'yitıklatın, Rapor Oluştur'u kontrol edin ve Kaydet 'iseçin. İleri'yi tıklatın ve çıktı dosyalarının nereye kaydedileceğine ilişkin bir belirtin. Son 'utıklatın.
    5. Kırpılmış sıra listesini dışa aktar: sonraki karma montaj ve analiz CLC dışında tamamlanacak ve kesilmiş kısa okuma dosyalarının dışa aktarılmasını gerektirir.
      1. Sol üstteki dizin gezintisinden, 7.1.4 adımında oluşturulan kırpılmış dosyayı seçin ve üst araç çubuğunda Dışarı Aktar'ı tıklatın. Dışa aktarma dosyası türü için Fastq'u seçin ve İleri 'yitıklatın. Eşleştirilmiş Sıra Listesini İki Dosyaya Ver 'i denetleyin. Ardından, İleri'yi tıklatın ve dosyaların Trimmed_Reads dizinini seçin. Son 'utıklatın. Kırpılan kısa okuma dosyalarının .fastquzantılı iki dosya (R1 ve R2) olarak başarıyla dışa aktarıldığını sağlayın.
        NOT: Kırpılan sıra listesi, genellikle CLC tarafından R1 ve R2 olarak belirlenen iki dosyaya verilmelidir. Aşağı akış karma derlemesi, kısa okuma veri girişinin bu şekilde ayarılmasını gerektirdiği için bu kritik öneme sahiptir.
      2. Dışa aktarılan dosyaları yeniden adlandırın, lütfen dosya adlarında boşluk ve özel karakterler kullanmaktan kaçının. Basitlik için önerilen bir biçim trimmed_short_file. R1.fastq.
  2. Uzun (MinION) okur (Şekil 3)
    NOT: Karma montaj için Uzun (MinION) sıralama okumalarının hazırlanması için aşağıdaki işlem hattı, komut satırı tarafından yürütülen NanoFilt ve Nanostat programları26'yı kullanır. Devam etmeden önce araçları yükleyin ve bu komutları yürütmek için UNIX'in temellerini bilin. Varsayılan terminaller ve Bash Shell önerilir. Ortak terminal komutları ve kullanımı için bir ders kılavuzu Yazılım Marangozluk27'de bulunur. Aşağıdaki talimatlar, oluşturulan dosyaların barkod isimlendirmesi (NB01, NB02, vb.) ile adlandırılacağını ve Long_Reads dizinine kaydedildiğini varsayar. Alternatif olarak, sıralama çalıştırmasını ayarlarken MinKNOW kullanılarak okuma filtrelemesi gerçekleştirilebilir. Ortalama uzun okuma kapsamının >100x olması önerilir. Önerilen ortalama okuma uzunluğu >2000 bp'dir; bu nedenle, gereken uzun okuma sayısı kısa okuma sayısından daha düşüktür.
    1. Long_Reads dizininde çalıştırmada kullanılan her barkod (barkod01, barkod02 vb.) için yeni dizinler oluşturun (Şekil 4). Her barkoda karşılık gelen tüm .fastq dosyalarını uygun klasöre kopyalayın. Her çalıştırmadan her barkod için tüm .fastq dosyalarını birleştirin.
    2. Terminal'i açın ve cd komutunu kullanarak Long_Reads dizini içindeki barkod dizinlerine gidin: cd Desktop/Long_Reads/barcode01
    3. Aşağıdaki komutu yürüterek barkod başına tüm .fastq dosyalarını tek bir .fastq dosyasında birleştirilmesi: cat *.fastq > NB01.fastq
      NOT: Bu komut, FASTQ dosyalarının her birinden gelen tüm okumaları NB01.fastq adlı tek bir büyük, tek FASTQ'da birleştirir.
    4. Aşağıdaki komutu yürüterek örneğin okuma kalitesini değerlendirmek için NanoStat'ı kullanın: NanoStat --fastq NB01.fastq
    5. Çıktıyı ileride başvurmak üzere bir metne veya Word dosyasına kopyalayarak sonuçları kaydedin.
    6. NanoFilt komutunu çalıştırarak Q < 7 ve uzunluğu 200 ile okumaları < 7 Q ile filtrelemek için NanoFilt kullanın: NanoFilt -q 7 -l 200 bp NB01.fastq | gzip > NB01 _trimmed.fastq.gz
    7. NanoStat --fastq NB01 _trimmed.fastq komutunu yürüterek 7.2.6 adımında oluşturulan kırpılmış dosyada NanoStat'ı çalıştırın.gz
    8. Çıktıyı bir metne veya Word dosyasına kopyalayarak sonuçları kaydedin ve filtrelemenin başarılı olduğundan emin olmak için 7.2.4 adımındaki sonuçlarla karşılaştırın (Tablo 1).
    9. Sıralama çalıştırmasında kullanılan her barkod için 7.2.2 ile 7.2.8 adımlarını yineleyin.
      NOT: 7.2.6 adımında oluşturulan NB01_trimmed.fastq.gz dosyası karma montaj için kullanılacaktır.

8. Hibrit genom montajı oluşturma

NOT: Aşağıdaki montaj ardışıkdüzeni,bölüm 7.1ve7.2'de (Şekil 3) hazırlanan kısa ve uzun okumaları birleştirmek için Unicycler 19 , 28 ,29,30'ukullanır. Unicycler ve bağımlılıklarını yükleyin ve aşağıdaki komutları çalıştırın. 7.1.5 adımında verilen kısa okuma dosyalarının trimmed_short_file olarak adlandırıldığı varsayılır. R1.fastq ve trimmed_short_file. Basitlik için R2.fastq.

  1. Kısa okunan dosyaları ve uzun süredir okunan dosyaları Trimmed_Reads adlı tek bir dizinde düzenleyin. Dizin aşağıdakileri içermelidir:
    1. Kırpılmış uzun okumalar için .fastq.gz dosyası (adım 7.2.6'da oluşturulur).
    2. Kırpılmış kısa okumalar için iki .fastq dosyası (R1 ve R2) (adım 7.1.5'te oluşturulur).
  2. Terminal'deki cd komutunu kullanarak okuma dosyalarını depolayan dizin Trimmed_Reads gidin: cd Masaüstü/Trimmed_Reads
    1. Doğru dizine girdikten sonra, aşağıdaki komutu yürüterek iki kısa okuma dosyasını .fastq.gz biçiminde olacak şekilde fermuarlayın: gzip trimmed_short_file. R1.fastq
  3. Hem R1 hem de R2 için 8.2 adımlarını yineleyin. Tüm okuma dosyalarının artık .fastq.gz biçiminde olup olmadığını denetleyin ve tüm dosyaların aynı yalıtmayla eşleştiğini doğrulayın.
  4. Aşağıdaki komutu çalıştırarak Unicycler kullanarak karma derlemeye başlayın:
    tek tekerlekli bisiklet -1 trimmed_short_file. R1.fastq.gz -2 trimmed_short_file. R2.fastq.gz -l NB01 _trimmed.fastq.gz -o unicycler_output_directory
    NOT: -o Unicycler çıktısının kaydedileceği dizini belirtir, Unicycler komut çalıştırıldıktan sonra bu dizini oluşturur; dizini önceden oluşturmayın. Çalışma süresi, kullanılan bilgisayarın hesaplama gücüne, genom boyutuna ve okuma sayısına göre değişir. Bu, 4 saat ila 1 veya 2 gün arasında sürebilir. Bu protokol, 250 Gb RAM'e sahip bir CentOS Linux 7 makinesinde, 2.5 GHz 12 pratik çekirdeğe ve 48 sanal çekirdeğe sahip Intel Xeon (R) CPU'da gerçekleştirildi. Alternatif olarak, 16 Gb RAM ve 2,6 GHz 6 çekirdekli işlemcilere sahip kişisel bilgisayarlar bu derlemeleri daha uzun bir işlem süresiyle hesaplayabilir.
  5. Çalıştırma tamamlandığında, hata olmadığından emin olmak için unicycler.log dosyasını gözden geçirin - oluşturulan contigs sayısını, boyutunu ve durumunu (tam, eksik) kaydedin.
    1. Tamamlanmamış contigs tanımlanırsa (Unicycler günlüğünde eksik olarak gösterilir), 8.4 adımında komuta aşağıdaki bayrağı ekleyerek Unicycler'ı kalın modda yeniden çalıştırın: --mode kalın.
      NOT: Kalın mod, montaj sırasında uzun okuma köprüleri için kabul edilen kalite eşiğini düşürür; bu tam bir montaj sağlayabilir, ancak montaj kalitesi azalabilir. Kalın modun yalnızca gerektiğinde ve contig birleştirmenin pcr tarafından daha sonra onaylanması için ön kanıt olarak kullanılması önerilir.

9. Montaj kalitesinin değerlendirilmesi

NOT: Aşağıdaki protokol bandaj31 ve QUAST32,kullanmadan önce ayarlanılması gereken iki program kullanır (Şekil 2 ve Şekil 4). Bandaj indirildikten sonra kurulum gerektirmez ve QUAST temel komut satırı kullanımına aşinalık gerektirir. Ayrıca, Evrensel Tek KopyaLı Ortologları (BUSCO)33ile karşılaştırma kullanarak genom eksiksizliğinin değerlendirilmesi önerilir.

  1. Bandaj: Dosyayatıklayın. Ardından, Grafiği Yükle'yi seçin ve 8.4 adımında Unicycler tarafından oluşturulan unicycler_output_directory kaydedilen assembly.gfa dosyasını seçin. Yüklendikten sonra, sol araç çubuğundaki Grafik Çiz düğmesine tıklayın ve montajın tamamlanıp tamamlanıp düzenlenmediğini değerlendirmek için contigs'in (düğümler olarak adlandırılır) nasıl bağlandığı ve düzenlendiğine bakın (Şekil 5).
    NOT: Komple montajlar her iki uçta bağlı tek dairesel contigs ile temsil edilir (Şekil 5A,B). Tamamlanmamış derlemelerin birbirine bağlı birden çok contigs'i vardır veya doğrusaldır (Şekil 5C). Küçük doğrusal contigs, doğrusal ekstrakrozomal elementleri gösterebileceği için eksik olmayabilir. Derinlik olarak da adlandırılan kapsama alanı bandajla not edilecek ve Unicycler'de 1x'e normalleştirilen kromozom contigs'in göreceli bolluğunu temsil eder.
  2. QUAST
    1. Terminal içinde, cd komutunu kullanarak Unicycler çıktısını depolayan klasöre gidin: cd Desktop/Trimmed_Reads/unicycler_output_directory
      NOT: Derlemenin bulunduğu yolda boşluklara izin verilmez, diğer bir de değil, Unicycler çıktısına giden dizinlerin kendi adlarında boşluk olamaz. Alternatif olarak, kolay erişim için assembly.fasta dosyasını Masaüstü'ne kopyalayın.
    2. Quast komutunu çalıştırarak aşağıdaki komutu çalıştırın: quast assembly.fasta -o quast_output_directory
    3. QUAST tarafından çıktı dizininde oluşturulan raporları gözden geçirin quast_output_directory.

10. Genom ek açıklaması

NOT: Aşağıdaki ek açıklama ardışık düzeni, kullanımdan önce yüklenmesi gereken bir komut satırı aracı olan Prokka34'ükullanır. Alternatif olarak, Prokka'yı otomatik GUI K-Base (Malzeme Tablosu) aracılığıyla kullanın veya rast35web sunucusu aracılığıyla genomlara açıklama ekleme . Genomları NCBI'ye yatırıyorsanız, Prokaryotik Genom Ek Açıklama Boru Hattı (PGAP)36kullanılarak otomatik olarak açıklama eklenecektir.

  1. Terminal içinde CD komutunu kullanarak Unicycler çıktısını depolayan klasöre gidin (bkz. adım 9.2.1). Ardından, aşağıdaki komutu yürüterek Prokka'yı çalıştırın: prokka -önek sample_ID - assembly.fasta prokka_output_directory dandaha fazla
    NOT: --önek, belirtilen sample_ID göre tüm çıktı dosyalarını adlandırır. --outdir, tüm Prokka çıktı dosyalarının kaydedileceği belirtilen ada sahip bir çıktı dizini oluşturur; Önceden Prokka için bir çıkış dizini oluşturmayın.
  2. .tsv tablosunu açarak ve/veya ek açıklamaları görselleştirmek ve analiz etmek için oluşturulan .gff dosyasını bir sıra analiz yazılımına yükleyerek ek açıklamaları gözden geçirin (Şekil 6).
  3. İlgi çekici genetik faktörlere bağlı olarak belirli ek açıklamalar üretilebilir. Ön analiz için Genomik Epidemiyoloji Merkezi (www.genomicepidemiology.org/) web sunucusundaki kullanıcı dostu araçlarla başlamanız önerilir37 , 38,39,40,41. CRISPR-cas sistemlerinin ve profilaklarının tespiti için ek araçlar mevcuttur (Şekil 3)42,43.

11. Veri demokratikleştirme için önerilen uygulamalar

  1. Mümkün olduğunda, tüm ham okuma verilerini ve birleştirilmiş genomları NCBI Sequence Read Archive (SRA) ve Genbank gibi halka açık bir depoya yatırın. Genomlar, NCBI biriktirme işlemi sırasında PGAP işlem hattı üzerinden otomatik olarak açıklamalır.

Representative Results

Bu protokol Şekil 1'de listelenen cinse ait üriner bakterilerin kültürü ve dizilimi için optimize edilmiştir. Tüm üriner bakteriler bu yöntemle kült değildir. Kültür ortamı ve koşulları Şekil 1'de cins tarafından belirtilir. GDNA bütünlüğünün örnek jel elektroforez değerlendirmeleri Şekil 2'detasvir edilmektedir. Okuma işleme, genom montajı ve ek açıklama sıralama için biyoinformatik işlem hattına genel bir bakış Şekil 3'teaçıklanmıştır. İletişim kuralı anlayışını basitleştirmek ve başarılı bir organizasyon için çerçeve sağlamak üzere Şekil 4'te hesaplamalı dizin yapısı kılavuzu sağlanmıştır. Ayrıca, bu protokol tarafından oluşturulan iki Klebsiella spp., K. pneumoniae ve K. oxytoca'nın temsili tam genomları da dahildir. Bu derlemelerin bir gösterimi Şekil 5'te verilmiştir ve ayrıca eksik bir örnek K. pneumoniae genom içerir. Şekil 6'da her tam açıklamalı tam genomun ayrıntılı bir özeti gösterilmiştir. Son olarak, yüksek kaliteli kapalı genom derlemelerinin üretimi için yeterli ham ve kırpılmış verilerin geniş bir anlayışını sunmak için Tablo 1'de okuma istatistiklerinin sırasının bir özeti sağlanmıştır. Ayrıca, iki temsilcinin anahtar parametreleri Klebsiella spp'yi tamamlar. genomlar listelenmiştir. Genomlar ve ham veriler Genbank'ta BioProject PRJNA683049 kapsamında biriktirildi.

Figure 1
Şekil 1: Çeşitli idrar cinslerinin değiştirilmiş gelişmiş idrar kültürü. Çeşitli idrar cinsini kültüre etmek için kullanılabilecek agar ve sıvı suyu grafiği. Tüm kültlemenin 1.1 alt bölümünde açıklandığı gibi 35 °C'de yapılması önerilmiştir. Daireler belirli bir cinsi kültleme için uygun medyayı temsil eder, renkler bir ortam türünü diğerinden ayırmak için keyfi olarak seçilmiştir. CDC-AN BAP (kırmızı), CDC Anaerobe Koyun Kanı Agar; % 5 Koyun-BAP (turuncu), Koyun Kanı Agar; BHI (yeşil), Beyin Kalbi infüzyonu; TSB (sarı), Triptik Soya Suyu; CHROMagar Oryantasyon (mavi). birGardnerella vajinalis mikroaerofilik atmosferde ve özel et suyu kültürü gereksinimleri altında HBT Bilayer G. vaginalis Seçici agar kültürlü olmalıdır44. bLactobacillus iners mikroaerofilik atmosferde% 5 Tavşan-BAP plakaları ve NYCIII suyu üzerinde kültürlenmelidir. cLactobacillus spp. mikroaerofilik koşullarda MRS'de kültürlenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Genomik DNA ekstraksiyonu agarose jel görüntüleri. GDNA ekstraksiyon sonuçlarını gösteren temsili jel görüntüler. (A) Şerit 1: 1 kb merdiven, Şerit 2: başarılı ekstraksiyonu temsil eden sağlam gDNA, Şerit 3: parçalanmış gDNA'yı gösteren lekeleme. (B) Şerit 1: 1 kb merdiven, Şerit 2 ve 3: rRNA kontaminasyon 1.5 kb ile 3 kb arasında iki bantla gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Hibrit genom montaj iş akışı. Okuma kalitesi denetimi ve ön işlemeden montaj ek açıklamasına kadar adımların şeması. Okuma kırpması belirsiz ve düşük kaliteli okumaları kaldırır. Q-score ve length parametreleri belirtilir ve tutulan okumaları temsil eder. Montaj, hibrit de novo genom montajı oluşturmak için hem kısa hem de uzun okumalar kullanır. Montaj kalitesi, belirtilen araçlar ve parametreler kullanılarak eksiksizlik ve doğruluk esas alınarak değerlendirilir. Son genom montajı tüm genler ve belirli ilgi alanları için açıklamalı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Biyoinformatik dizin yapısı kılavuzu. Kısa ve uzun okumaların, karma derlemenin ve genom ek açıklama ve QC'nin işlenmesi için önerilen dizin ve dosya kuruluşunun şeması. Anahtar komut satırı veri işleme adımları, karşılık gelen dosya ve dizinlerin yanında vurgulanır. Komutlar ve bayraklar (kalın), giriş dosyaları (mavi), çıktı dosyaları veya dizinler (kırmızı), dosya adlandırma kuralı (macenta) gibi kullanıcı girdileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Bandaj ile genom montaj grafikleri. (A) Klebsiella oxytoca KoPF10 ve (B) Klebsiella pneumoniae KpPF25'in temsili tam genom montaj grafikleri ve (C) Klebsiella pneumoniae KpPF46'nın tamamlanmamış genom montajı. KoPF10'un tam genomunda tek bir kapalı kromozom ve KpPF25'in tam genomunun kapalı bir kromozom ve beş kapalı plazmidden oluştuğu gösterilmiştir. KpPF46'nın tamamlanmamış kromozomu birbirine bağlı iki contigsten oluşur. Unicycler hybrid de novo montajı Bandaj tarafından görselleştirilen bir montaj grafiği oluşturur. Montaj grafiği, tek bir kontrtun iki ucunun birbirine bağlanan bir bağlayıcı tarafından kapalı kromozom veya plazmidleri gösteren genomun basit bir şemasını sağlar. Birden fazla birbirine bağlı contig varlığı tamamlanmamış derlemeyi gösterir. Contig boyutu ve derinliği Bandajda da not edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Açıklamalı hibrit montajların tam genom haritaları. Geneious Prime tarafından (A) K. oxytoca KoPF10 ve (B) K. pneumoniae KpPF25'in plazmid omurgalar boyunca renkli oklarla gösterilen açıklamalı genleri gösteren tam genomu için oluşturulan montaj haritaları. Kromozomlar basitlik için sadece rRNA ve tRNA genlerini gösterir. Genom ek açıklamaları, bu protokolün 10. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Table 1
Tablo 1: Temsilci Klebsiella spp. komple montaj özellikleri. K. oxytoca strain KoPF10 ve K. pneumoniae strain KpPF25.'nin montaj parametreleri NCBI'de biriken veriler için katılım numaraları sağlanır. Her iki sıralama teknolojisi için de kırpmadan önce ve sonra okuma sayısı belirtilir. N50, yalnızca kısa okumalar kontrollü bir uzunlukta olduğundan uzun okumalar için sağlanır. Plasmid replicon, PlasmidFinder v2.1 Enteroebacteriaceae veritabanı kullanılarak tahmin edildi ve parametreler% 80 kimlik ve% 60 uzunluğa ayarlandı. MLST, Multilocus Sıra Türü. b CDS, Kodlama Dizileri. c Plasmid replicon PlasmidFinder v2.1 Enterobacteriaceae veritabanı kullanılarak tahmin edildi parametreler% 80 kimlik ve% 60 uzunluğa ayarlandı. d Oxford Nanopore Technologies (ONT) okuma verilerini biriktirdi. e Illumina okuma verilerini yatırdı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan kapsamlı hibrit genom montaj protokolü, çeşitli üriner mikrobiyota ve üropatojenlerin başarılı bir şekilde kült haline getirildirilmeleri ve genomlarının tam olarak bir şekilde birebriasyonu için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunmaktadır. Bakteri genomlarının başarılı WGS'si, genomik DNA'larını çıkarmak için çeşitli ve bazen titiz mikropların izolasyonu ile başlar. Bugüne kadar, mevcut idrar kültürü protokolleri ya birçok idrar türünü tespit etmek için gerekli hassasiyete sahip değil ya da uzun zaman ve kaynak gerektiren uzun ve kapsamlı yaklaşımlar içeriyor11. Açıklanan Modifiye Geliştirilmiş İdrar Kültürü yaklaşımı, potansiyel patojenik veya faydalı kommensal türler ve hem öğretim üyesi hem de zorunlu aerobik veya anaerobik bakteriler de dahil olmak üzere 17 yaygın üriner cinse ait bakterilerin başarılı bir şekilde izole edilmesi için basitleştirilmiş ancak kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Bu da bakteriyel genomların doğru dizilimi ve montajı ve üriner sağlık ve hastalığın anlaşılmasına katkıda bulunan kritik fenotipik deneyler için gerekli başlangıç malzemesini sağlar. Ayrıca, bu değiştirilmiş kültür yaklaşımı, idrar örneklerinde bulunan canlı mikroorganizmaların daha tanımlanmış bir klinik tanısını sağlar ve gelecekteki genomik çalışmalar için biyobankalanmalarına izin verir. Ancak, bu protokol sınırlamalar olmadan değildir. Organizmaya bağlı olarak uzun kuluçka sürelerinin yanı sıra hipoksi odası veya kontrollü inkübatörler gibi kaynakların kullanımı gerektirebilir. Anaerobik GasPak kullanımı alternatif bir çözüm sunar, ancak bunlar maliyetlidir ve her zaman sürekli ve kontrollü bir ortam üretmez. Son olarak, kültür önyargısı ve örnek çeşitliliği, belirli organizmaların ve üropatojenlerin titiz bakterileri alt etmesine izin verebilir. Bu sınırlamalara rağmen, bu yaklaşımla çeşitli üriner bakteri kültürü mümkün olmaktadır.

Genomik dizileme, sıralama verilerinin hem verimini hem de doğruluğunu muazzam bir şekilde artıran Yeni Nesil Sıralama teknolojilerinin ilerlemesiyle popülerlik kazanmıştır14,15. Veri işleme ve de novo montajı için algoritmaların geliştirilmesiyle birleştiğinde, tam genom dizileri acemi ve uzman bilim adamlarının parmak uçlarında15,45. Tam genomlar tarafından sağlanan genel genom organizasyonu bilgisi, gen çoğaltma, gen kaybı ve yatay gen transferi dahil olmak üzere önemli evrimsel ve biyolojik içgörüler sunar14. Ek olarak, antimikrobiyal direnç ve virülans için önemli genler genellikle taslak genom derlemelerinde çözülmeyen mobil elemanlar üzerinde lokalize edilir15,16.

Buradaki protokol, tam genom derlemeleri oluşturmak için kısa ve uzun okuma platformlarından gelen sıralama verilerinin kombinasyonu için karma bir yaklaşım izler. İdrar bakteri genomlarına odaklanılırken, bu prosedür çeşitli izolasyon kaynaklarından çeşitli bakterilere uyarlanabilir. Bu yaklaşımdaki kritik adımlar arasında yeterli steril tekniğin takip edilmesi ve saf idrar bakterilerinin izolasyonu için uygun ortam ve kültür koşullarının kullanılması yer almaktadır. Ayrıca, sağlam, yüksek verimli gDNA'nın çıkarılması, montaj başarısını engelleyebilecek kontamine okumalardan arınmış sıralama verileri oluşturmak için gereklidir. Sonraki kütüphane hazırlama protokolleri, yeterli uzunluk ve derinlikte kaliteli okumaların üretilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, özellikle uzun süre okunan sıralama için kütüphane hazırlığı sırasında gDNA'yı özenle ele almak son derece önemlidir, çünkü bu teknolojinin en büyük yararı teorik üst uzunluk sınırı olmayan uzun okumaların üretilmesidir. Ayrıca, gürültülü verileri ortadan kaldıran ve montaj sonucunu iyileştiren sıralama okumalarının uygun kalite kontrolü (QC) için bölümler de özetlenmiştir.

Başarılı DNA izolasyonu, kütüphane hazırlığı ve dizilişine rağmen, bazı türlerin genomik mimarisinin doğası hala kapalı bir genom derlemesinin üretilmesi için bir engel sağlayabilir45,46. Yinelenen diziler genellikle derleme hesaplamasını zorlaştırır ve uzun okuma verilerine rağmen, bu bölgeler düşük güvenle çözülebilir veya hiç çözülmeyebilir. Bu nedenle uzun okumalar, genomdaki veya kapsamadaki en büyük tekrar bölgesinden ortalama olarak daha uzun olmalıdır yüksek olmalıdır (>100x)19. Bazı genomlar eksik kalabilir ve tamamlanması için manuel yaklaşımlar gerektirebilir. Bununla birlikte, hibrit monte edilmiş eksik genomlar tipik olarak kısa okumalı taslak genomlardan daha az contigs oluşur. Montaj algoritmasının varsayılan parametrelerini ayarlamak veya QC okumak için daha sıkı kesmeleri takip etmek yardımcı olabilir. Alternatif olarak, önerilen bir yaklaşım, en olası montaj yolu için kanıt aramak için eksik bölgelere uzun okumaları haritalamak ve daha sonra güçlendirilmiş bölgenin PCR ve Sanger dizilimini kullanan yolu onaylamaktır. Minimap2 kullanılarak okumaların haritalanması önerilir ve Bandaj, contig bağlantısı47için kanıt sağlayan birleştirilmiş contigs boyunca eşlenen okumaların görselleştirilmesi için yararlı bir araç sunar.

Tam genom üretmenin ek bir zorluğu, komut satırı araçlarına aşinalık ve konforda yatır. Birçok biyoinformatik araç, herhangi bir kullanıcıya hesaplama fırsatları sunmak için geliştirilmiştir; ancak, kullanımları UNIX ve programlamanın temellerini içeren bir anlayışa dayanır. Bu protokol, önceden komut satırı deneyimi olmayan bireylerin kapalı genom derlemeleri oluşturmalarını ve bunlara açıklama eklemelerini sağlamak için yeterince ayrıntılı talimatlar sağlamayı amaçlamaktadır.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Dr. Moutusee Jubaida Islam ve Dr. Luke Joyce'a bu protokole katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Ayrıca Dallas Genom Merkezi'ndeki Teksas Üniversitesi'ni geri bildirimleri ve destekleri için tanımak istiyoruz. Bu çalışma Welch Vakfı tarafından finanse edildi, ödül numarası AT-2030-20200401'den N.J.D.'ye, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından, R01AI116610 ödül numarası K.P.'ye ve P.E.Z.'nin elinde bulunan Felecia ve John Cain Kadın Sağlığı Başkanı tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment:
Bioanalyzer 2100 Agilent G29398A Optional but recommended
Centrifuge Eppendorf -- Any centrifuge for spinning conicals and microcentrifuge tubes (e.g. Models 5810R/5424R)
Electrophoresis BioRad Laboratories 1645070
Gel Imaging System BioRad Laboratories ChemiDoc models
Incubator ThermoFisher Scientific -- Any CO2 Incubator (e.g. Thermo Forma model 3110)
Magnetic Rack New England BioLabs S15095 12-tube rack
MinION Oxford Nanopore Technologies --
Nanodrop ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NextSeq 500 Illumina SY-415-1002 Other Illumina models are acceptable
Plate Reader BioTek -- Synergy H1
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33238
Rotator Benchmark Scientific H2024
Thermocycler ThermoFisher Scientific -- Any thermocycler for PCR reactions (e.g. ProFlex PCR system)
Materials:
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3991
10X TBE buffer -- -- 1M Tris,1M Boric Acid,0.2M EDTA (pH 8.0)
1429R primer Sigma Aldrich (Custom oligos) -- GGTTACCTTGTTACGACTT
1kb Ladder VWR 101228-494
1M Tris-Cl (pH 7.5) ThermoFisher Scientific 15567027
6x Loading dye Fisher Scientific NC0783588
8F primer Sigma Aldrich (Custom oligos) -- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
Agar Fisher Scientific BP1423-2
Agarose BioRad Laboratories 63001
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880
Anaerobe Pouch System - GasPak EZ BD Diagnostic Systems B260683
Boric Acid Fisher Scientific A73-500
Brain Heart Infusion Broth BD Diagnostic Systems 212304
CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar BD Diagnostic Systems L007357
CHROMagar Orientation BD Diagnostic Systems PA-257481.04
DNeasy Blood & Tissue QIAGEN 69504
DreamTaq Master Mix ThermoFisher Scientific K1081
Dry Anaerobic Indicator Strips BD Diagnostic Systems 271051
EDTA Fisher Scientific S311-500
Ethanol 200 Proof Sigma Aldrich E7023 For molecular biology
Ethidium Bromide ThermoFisher Scientific BP130210
Flow cell priming kit Oxford Nanopore Technologies EXP-FLP002
Flow cell wash kit Oxford Nanopore Technologies EXP-WSH003
Gel Extraction Miniprep Kit BioBasic BS654
Ligation sequencing kit Oxford Nanopore Technologies SQK-LSK109
Lysozyme Research Products International Corp L381005.05
Mutanolysin Sigma Aldrich M9901-5KU
Native barcoding expansion 1-12 Oxford Nanopore Technologies EXP-NBD104
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix New England BioLabs M0367L
NEBNext FFPE DNA Repair Mix New England BioLabs M6630L
NEBNext quick ligation buffer New England BioLabs B6058S
NEBNext Ultra II End repair / dA-tailing module New England BioLabs E7546L
Nextera DNA CD Indexes Illumina 20018708
Nextera DNA Flex Library Prep - (M) Tagmentation Illumina 20018705
Nuclease-free water Sigma Aldrich W4502
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Scientific Q33230
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Scientific Q32856
Quick T4 DNA Ligase New England BioLabs E6056L
R9 Flow cell Oxford Nanopore Technologies FLO-MIN106D
RNase A ThermoFisher Scientific EN0531
Sheep Blood Hemostat Laboratories DS13250
TE buffer -- -- 10mM Tris, 1mM EDTA (pH 8.0)
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Tryptic Soy Broth BD Diagnostic Systems 211825
Software & Bioinformatic Tools:
Bandage -- -- https://rrwick.github.io/Bandage/
Center for Genomic Epidemiology -- -- http://www.genomicepidemiology.org/
CLC Genomics Workbench 12 QIAGEN --
CRISPRcasFinder -- -- https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/
FastQC -- -- https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
Geneious Prime Geneious --
gVolante (BUSCO) -- -- https://gvolante.riken.jp/
Kbase Prokka Wrapper -- -- https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release
Minimap2 -- -- https://github.com/lh3/minimap2
MinKNOW Oxford Nanopore Technologies --
NanoFilt -- -- https://github.com/wdecoster/nanofilt
NanoStat -- -- https://github.com/wdecoster/nanostat
PHASTER -- -- https://phaster.ca/
Prokka -- -- https://github.com/tseemann/prokka
QUAST -- -- http://quast.sourceforge.net/quast
Trim Galore -- -- https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
Trimmomatic -- -- http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Unicycler -- -- https://github.com/rrwick/Unicycler#necessary-read-length

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brubaker, L., Wolfe, A. The urinary microbiota: a paradigm shift for bladder disorders. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 28 (5), 407-412 (2016).
  2. Neugent, M. L., Hulyalkar, N. V., Nguyen, V. H., Zimmern, P. E., De Nisco, N. J. Advances in understanding the human urinary microbiome and its potential role in urinary tract infection. mBio. 11 (2), (2020).
  3. Klein, R. D., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: microbial pathogenesis, host-pathogen interactions and new treatment strategies. Nature Reviews. Microbiology. 18 (4), 211-226 (2020).
  4. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), 83637 (2013).
  5. Reitzer, L., Zimmern, P. Rapid growth and metabolism of uropathogenic Escherichia coli in relation to urine composition. Clinical Microbiology Reviews. 33 (1), 00101-00119 (2019).
  6. Snyder, J. A., et al. Transcriptome of uropathogenic Escherichia coli during urinary tract infection. Infection and Immunity. 72 (11), 6373-6381 (2004).
  7. Ipe, D. S., Horton, E., Ulett, G. C. The basics of bacteriuria: Strategies of microbes for persistence in urine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 14 (2016).
  8. Babikir, I. H., et al. The impact of cathelicidin, the human antimicrobial peptide LL-37 in urinary tract infections. BMC Infectious Diseases. 18 (1), 17 (2018).
  9. Jancel, T., Dudas, V. Management of uncomplicated urinary tract infections. The Western Journal of Medicine. 176 (1), 51-55 (2002).
  10. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T. 40 (4), 277-283 (2015).
  11. Price, T. K., et al. The clinical urine culture: Enhanced techniques improve detection of clinically relevant microorganisms. Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1216-1222 (2016).
  12. Kass, E. H. Asymptomatic infections of the urinary tract. Transactions of the Association of American Physicians. 69, 56-64 (1956).
  13. Garcia, L. S. Clinical microbiology procedures handbook. 3rd edn. , ASM Press. (2010).
  14. Fraser, C. M., Eisen, J. A., Nelson, K. E., Paulsen, I. T., Salzberg, S. L. The value of complete microbial genome sequencing (you get what you pay for). Journal of Bacteriology. 184 (23), 6403-6405 (2002).
  15. Chen, Z., Erickson, D. L., Meng, J. Benchmarking hybrid assembly approaches for genomic analyses of bacterial pathogens using Illumina and Oxford Nanopore sequencing. BMC Genomics. 21 (1), 631 (2020).
  16. Greig, D. R., Dallman, T. J., Hopkins, K. L., Jenkins, C. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of bacterial antibiotic resistance determinants in a multidrug-resistant strain of enteroaggregative Escherichia coli. Microbial Genomics. 4 (10), 000213 (2018).
  17. Carraro, D. M., et al. PCR-assisted contig extension: stepwise strategy for bacterial genome closure. Biotechniques. 34 (3), 626-628 (2003).
  18. Tettelin, H., Radune, D., Kasif, S., Khouri, H., Salzberg, S. L. Optimized multiplex PCR: efficiently closing a whole-genome shotgun sequencing project. Genomics. 62 (3), 500-507 (1999).
  19. Wick, R. R., Judd, L. M., Gorrie, C. L., Holt, K. E. Unicycler: Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Computational Biology. 13 (6), 1005595 (2017).
  20. Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in Microbiology. 6, 791 (2015).
  21. Turner, S., Pryer, K. M., Miao, V. P., Palmer, J. D. Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 46 (4), 327-338 (1999).
  22. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
  23. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  24. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Science Reports. 6, 38828 (2016).
  25. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  26. De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 34 (15), 2666-2669 (2018).
  27. Wilson, G., et al. The UNIX Shell. Zenodo. , (2019).
  28. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  29. Vaser, R., Sovic, I., Nagarajan, N., Sikic, M. Fast and accurate de novo genome assembly from long uncorrected reads. Genome Research. 27 (5), 737-746 (2017).
  30. Walker, B. J., et al. Pilon: an integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement. PLoS One. 9 (11), 112963 (2014).
  31. Wick, R. R., Schultz, M. B., Zobel, J., Holt, K. E. Bandage: interactive visualization of de novo genome assemblies. Bioinformatics. 31 (20), 3350-3352 (2015).
  32. Gurevich, A., Saveliev, V., Vyahhi, N., Tesler, G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 29 (8), 1072-1075 (2013).
  33. Simao, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31 (19), 3210-3212 (2015).
  34. Seemann, T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
  35. Aziz, R. K., et al. The RAST server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics. 9, 75 (2008).
  36. Tatusova, T., et al. NCBI prokaryotic genome annotation pipeline. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6614-6624 (2016).
  37. Carattoli, A., Hasman, H. PlasmidFinder and In Silico pMLST: Identification and Typing of Plasmid Replicons in Whole-Genome Sequencing (WGS). Methods in Molecular Biology. 2075, 285-294 (2020).
  38. Carattoli, A., et al. In silico detection and typing of plasmids using PlasmidFinder and plasmid multilocus sequence typing. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 3895-3903 (2014).
  39. Larsen, M. V., et al. Multilocus sequence typing of total-genome-sequenced bacteria. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1355-1361 (2012).
  40. Bortolaia, V., et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (12), 3491-3500 (2020).
  41. Joensen, K. G., et al. Real-time whole-genome sequencing for routine typing, surveillance, and outbreak detection of verotoxigenic Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology. 52 (5), 1501-1510 (2014).
  42. Arndt, D., et al. PHASTER: a better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Research. 44 (1), 16-21 (2016).
  43. Couvin, D., et al. CRISPRCasFinder, an update of CRISRFinder, includes a portable version, enhanced performance and integrates search for Cas proteins. Nucleic Acids Research. 46 (1), 246-251 (2018).
  44. Totten, P. A., Amsel, R., Hale, J., Piot, P., Holmes, K. K. Selective differential human blood bilayer media for isolation of Gardnerella (Haemophilus) vaginalis. Journal of Clinical Microbiology. 15 (1), 141-147 (1982).
  45. Nagarajan, N., Pop, M. Sequence assembly demystified. Nat Reviews. Genetics. 14 (3), 157-167 (2013).
  46. Phillippy, A. M., Schatz, M. C., Pop, M. Genome assembly forensics: finding the elusive mis-assembly. Genome Biology. 9 (3), 55 (2008).
  47. Wick, R. R. Unicycler Wiki. , Available from: https://github.com/rrwick/Unicycler/wiki (2017).

Tags

Genetik Sayı 174 idrar yolu enfeksiyonu bakteri hibrid genom montajı Nanopore dizilimi 16S rRNA yeni nesil dizileme mobil genetik element antimikrobiyal direnç
Kısa ve Uzun Süredir Okunan Dizileme Teknolojilerini Kullanarak İdrar Bakterilerinin Tam Genomlarının Üretilmesi için Hibrit <em>De Novo</em> Genom Montajı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharon, B. M., Hulyalkar, N. V.,… More

Sharon, B. M., Hulyalkar, N. V., Nguyen, V. H., Zimmern, P. E., Palmer, K. L., De Nisco, N. J. Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies. J. Vis. Exp. (174), e62872, doi:10.3791/62872 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter