Summary
Целью данного протокола является разработка модельной системы влияния гипероксии на микробные сообщества дыхательных путей муковисцидоза. Искусственная среда мокроты имитирует состав мокроты, а гипероксичные условия культуры моделируют воздействие дополнительного кислорода на микробные сообщества легких.
Abstract
Считается, что микробные сообщества дыхательных путей играют важную роль в прогрессировании муковисцидоза (МВ) и других хронических заболеваний легких. Микробы традиционно классифицируются на основе их способности использовать или переносить кислород. Дополнительный кислород является распространенной медицинской терапией, назначаемой людям с муковисцидозом (pwCF); однако существующие исследования кислорода и микробиома дыхательных путей были сосредоточены на том, как гипоксия (низкий уровень кислорода), а не гипероксия (высокий уровень кислорода) влияет на преимущественно аэробные и факультативные анаэробные микробные сообщества легких. Чтобы устранить этот критический пробел в знаниях, этот протокол был разработан с использованием искусственной среды мокроты, которая имитирует состав мокроты из pwCF. Использование фильтрующей стерилизации, которая дает прозрачную среду, позволяет оптическими методами следить за ростом одноклеточных микробов в культурах суспензии. Для создания гипероксических условий эта модельная система использует установленные методы анаэробного культивирования для изучения гипероксических состояний; вместо удаления кислорода кислород добавляют в культуры путем ежедневного разбрызгивания сывороточных баллонов смесью сжатого кислорода и воздуха. Мокрота от 50 pwCF подвергалась ежедневному спаррингу в течение 72-часового периода, чтобы проверить способность этой модели поддерживать дифференциальные кислородные условия. Метагеномное секвенирование дробовика проводили на культивируемых и некультурных образцах мокроты из 11 pwCF для проверки способности этой среды поддерживать рост комменсальных и патогенных микробов, обычно встречающихся в мокроте муковисцидоза. Кривые роста были получены из 112 изолятов, полученных из pwCF, для проверки способности этой искусственной среды мокроты поддерживать рост распространенных патогенов муковисцидоза. Мы обнаружили, что эта модель может культивировать широкий спектр патогенов и комменсалов в мокроте муковисцидоза, восстанавливает сообщество, очень похожее на некультурную мокроту в нормоксических условиях, и создает различные фенотипы культуры в различных кислородных условиях. Этот новый подход может привести к лучшему пониманию непредвиденных эффектов, вызванных использованием кислорода в pwCF, на микробные сообщества дыхательных путей и распространенные респираторные патогены.
Introduction
Муковисцидоз (МВ) является генетическим заболеванием, характеризующимся неспособностью очищать густую слизь из легких, что приводит к повторным инфекциям и прогрессирующему снижению функции легких, что часто приводит к необходимости трансплантации легких или смерти. Микробиом дыхательных путей людей с муковисцидозом (pwCF), по-видимому, отслеживает активность заболевания1с уменьшением микробного разнообразия, связанного с неблагоприятными долгосрочными исходами2,3. В клинических исследованиях pwCF дополнительная кислородная терапия была связана с более продвинутым заболеванием4,5,хотя традиционно использование кислородной терапии рассматривалось просто как маркер тяжести заболевания6. Недавние исследования из клинического испытания пациентов с дыхательной недостаточностью показали, что более высокие уровни кислорода у пациентов парадоксальным образом связаны с увеличением серьезных бактериальных инфекций и более высокой смертностью7,предполагая, что дополнительный кислород может способствовать патогенезу заболевания. Влияние дополнительного кислорода на микробиом легкого муковисцидоза и связанные с ним микробные сообщества легких и дыхательных путей не было хорошо изучено.
Механистические исследования часто не могут быть выполнены непосредственно на людях из-за логистических трудностей и потенциальных этических проблем, связанных с вмешательствами с неизвестной медицинской пользой или вредом. Трансляционные подходы, которые интегрируют биообразцы человека в модельные системы, могут предложить важную биологическую информацию в этих случаях. Хотя способность использовать или переносить кислород традиционно была важным компонентом микробной классификации, мало что известно о том, как терапевтическое введение дополнительного кислорода в окружающую среду может нарушить микробные сообщества дыхательных путей. Чтобы пролить свет на неизвестное влияние дополнительного кислорода на микробиомы дыхательных путей pwCF, нам нужно было решить две основные проблемы; во-первых, создание питательной среды, физиологически аппроксимирующей состав мокроты МВ; во-вторых, создание модельной системы, позволяющей поддерживать повышенные концентрации кислорода в культуре в течение длительных периодов времени.
Искусственные среды мокроты (ASM) широко используются для эмуляции мокроты легких ex vivo8,9,10,но нет четкого консенсуса по конкретному рецепту. Этот протокол описывает рецепт искусственной мокроты и стратегию приготовления, тщательно разработанную для физиологически аппроксимации мокроты из pwCF. В таблице 1 приведены значения выбранных рецептов на основе опубликованной литературы. Основные химические компоненты и рН были сопоставлены со значениями, выявленными исследованиями человеческого МВ мокроты11,12,13. Низкоконцентрированные физиологические питательные вещества добавляли с использованием яичного желтка, который включался в виде 0,25% от конечного объема10,а также смеси витаминов и микрометаллов14,15. Муцин, ключевой компонент мокроты16,был включен в 1% мас./v14. Несмотря на то, что фильтрация является более трудоемкой, стерилизация фильтров была выбрана вместо более традиционной практики тепловой стерилизации для уменьшения потенциальных проблем, связанных с термоиндуцированной денатурацией основных компонентов среды10. Дополнительным преимуществом фильтрационной стерилизации является то, что она генерирует прозрачные среды (теплостерилизация может создавать мутные среды из-за осаждения и коагуляции солей и белков), что позволяет использовать эту искусственную среду мокроты для отслеживания роста микробов на основе увеличения мутности.
Эта модельная система для гипероксической культуры основана на методах анаэробного культивирования, где кислород добавляется, а не удаляется, создавая модель эффекта дополнительного использования кислорода для pwCF. На рисунке 1 и связанном с ним протоколе разбрызгивания кислорода описываются компоненты кислородной разбрызгивающей системы, которые могут быть получены при низких затратах от общих лабораторных и больничных поставщиков. Эта система позволяет смешивать сжатый кислород и воздух с фиксированными концентрациями в диапазоне от 21% до 100% кислорода. Интеграция датчика кислорода позволяет проверить концентрацию выходной газовой смеси, а также проверить газовый состав оттока ранее разрозненных сывороточных баллонов, чтобы убедиться, что кислородные условия поддерживались в желаемом диапазоне.
В этом протоколе описываются процедуры создания искусственной мокроты, построение и использование системы разбрызгивания кислорода, а также применение обоих для культивирования мокроты CF в дифференциальных кислородных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование получило одобрение Совета по институциональному обзору партнеров (Протокол No 2018P002934). Критерий включения включал взрослых пациентов с муковисцидозом, которые предоставили письменное информированное согласие на исследование. Критерия исключения не существует. Согласно протокольным рекомендациям, все образцы мокроты были собраны у пациентов с муковисцидозом во время запланированного амбулаторного визита к их клиническому врачу.
1. Искусственная подготовка среды мокроты
ПРИМЕЧАНИЕ: Количества, перечисленные здесь, предназначены для производства 1 л конечной искусственной мокроты и предполагают конкретные реагенты, перечисленные в таблице материалов. Цифры должны быть скорректированы для других объемов или для использования различных реагентов для обеспечения одного и того же конечного продукта. Целевые концентрации см. в таблице 1.
- Химическая смесь искусственной мокроты (ASCM)
ПРИМЕЧАНИЕ: ASCM составляет 25% от конечного объема среды. Он устойчив к хранению и может быть приготовлен навалом или заранее. Если вы подготовлены к последующему использованию, автоклавируйте химическую смесь и безопасно храните ее при комнатной температуре.- Смешайте составные химические растворы.
- Приготовить 1 M NaCl бульона: Добавить 58,44 г NaCl на литр стерильной воды.
- Приготовить бульон 1 M KCl: Добавить 74,55 г KCl на литр стерильной воды.
- Приготовить 1 M MgSO4 бульона: Добавить 246,47 г MgSO4·7H2Oна литр стерильной воды или 120,37 г безводного MgSO4 на литр стерильной воды.
- Приготовьте 1 М запаса глюкозы: Добавьте 180,16 г глюкозы на литр стерильной воды.
- Автоклав стерилизует химические растворы, а также пустую бутылку объемом 250 мл. Выполните этапы автоклавирования по крайней мере до стандартных значений 121 °C и 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 минут.
- Добавьте 80,59 мл стерильной воды в пустую бутылку объемом 250 мл.
- Добавьте в смесь 152,30 мл 1 мл naCl.
- Добавьте в смесь 15,8 мл запаса 1 мл кКл.
- Добавьте в смесь 610 мкл 1 M MgSO4 бульона.
- Добавьте в смесь 700 мкл 1 М запаса глюкозы.
- Смешайте составные химические растворы.
- Искусственная смесь муцина мокроты (ASMM)
ПРИМЕЧАНИЕ: ASMM составляет 50% от конечного объема среды. Убедитесь, что он приготовлен в тот же день, что и последняя средняя партия.- Добавьте 450 мл стерильной воды в пустую бутылку объемом 1 л.
- Добавьте в бутылку 50 мл 10-кратного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
- Добавьте в бутылку одноразовый магнитный перемешивание.
- Автоклавируйте бутылку, содержащую PBS и перемешивающий батончик.
- Отмерьте 10 г порошка муцина и добавьте его в PBS.
- Энергично встряхните флакон для предварительного перемешивания.
- Поместите флакон на конфорку с магнитной мешалкой. Установите нагрев до средней высоты 50 °C и скорость перемешивания до 1100 об/мин. Увеличивайте скорость постепенно, чтобы стержень не отлетел от магнита.
- Дайте нагреться и помешивать в течение 15 мин.
- Подберите бутылку в термостойких перчатках. Понаблюдайте, чтобы проверить, оседает ли порошок муцина из раствора.
- Если порошок муцина не полностью растворен, верните бутылку к нагреванию / мешалке с интервалом в 5 минут, пока она полностью не растворится.
- Дайте смеси муцина остыть до комнатной температуры.
- Биологическая смесь искусственной мокроты (ASBM)
ПРИМЕЧАНИЕ: ASBM составляет 25% от конечного объема среды. Приготовьте его в тот же день, что и последнюю среднюю партию, и в отличие от других смесей, не подвергайте его компоненты воздействию тепла.- Разморозьте 100-кратный витаминный бульон в холодильнике с температурой 4 °C или на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно порционируйте витаминный запас в 10 мл аликвот, чтобы свести к минимуму количество циклов замораживания/оттаивания. - Добавьте 124,24 мл стерильной воды в пустую автоклавную бутылку объемом 250 мл.
- Добавьте в смесь 25,76 мл 50-кратного запаса незаменимых аминокислот.
- Добавьте в смесь 80,14 мл 100-кратного запаса заменимых аминокислот.
- Добавьте в смесь 10 мл (размороженного) 100-кратного витаминного бульона.
- Добавьте в смесь 1 мл 1000-кратного запаса следовых металлов.
- Добавьте в смесь 8,33 мл 30% эмульсии из яичного желтка.
- Добавьте в смесь 400 мкл ферритина 10 г/л.
- Хорошо перемешайте раствор с помощью ручного встряхивания.
- Разморозьте 100-кратный витаминный бульон в холодильнике с температурой 4 °C или на льду.
- Искусственная среда мокроты (ASM)
- Добавьте 250 мл ASCM во флакон емкостью 1 л, содержащий ASMM.
- Добавьте 250 мл ASBM в среднюю бутылку.
- Титруйте среду основным буфером MOPS (1 M) для достижения рН 6,3 на бумаге pH узкого диапазона. Перед титрованием средняя смесь будет слишком кислой.
- Охладите полученную искусственную среду мокроты при 4 °C до тех пор, пока она не будет готова к фильтрации.
- Чтобы начать процесс фильтрации, перенесите 200 мл нефильтрованной искусственной мокроты в вакуумную систему фильтрации с фильтром размером пор 0,22 мкм.
- Подключите систему фильтрации к вакуумному насосу, включите вакуумный насос, установите его на 70 мбар, а затем поместите камеру на орбитальный шейкер, трясущийся при 90 об/мин в холодном помещении при 4 °C.
- Добавьте дополнительные 150 мл среды, так как заметное количество фильтруется. Для полной фильтрации 1 л среды требуется 1-2 дня.
- Повторяйте с дополнительными камерами до тех пор, пока все среды не будут отфильтрованы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не фильтровать более 350 мл среды через тот же фильтр 0,22 мкм, так как муцин со временем заткнет фильтр.
- Хранить в холодильнике фильтрованную искусственную среду мокроты при 4 °C до готовности к использованию. Используйте ASM в течение одного месяца после подготовки для достижения наилучших результатов.
2. Кислородное разбрызгивание
- Настройка разбрызгивательной станции
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен быть выполнен в полном объеме только один раз, после чего настройка может поддерживаться путем простого обслуживания по мере необходимости. На рисунке 1 приведена визуальная схема системы разбрызгивания кислорода.- Получите и правильно закрепите баллоны со сжатым воздухом и кислородом.
ВНИМАНИЕ: Высокое давление делает резервуары чрезвычайно опасными при неправильном обращении. Убедитесь, что резервуары полностью герметизированы и защищены, что при закрытии резервуара нет утечек и что весь обслуживающий персонал полностью обучен их использованию. - Прикрепите регулятор воздуха к баку сжатого воздуха с помощью гаечного ключа. Для оптимального считывания расхода на регуляторе прикрепите регулятор как можно ближе к вертикальному положению.
- Прикрепите регулятор кислорода к сжатому кислородному баллону, прикрепив как можно ближе к вертикальному положению. В зависимости от кислородного баллона может потребоваться перевернуть направление, чтобы затянуться.
- Подключите трубку от регуляторов к Y-образному разъему для объединения потока газа из двух резервуаров.
- Подключите выход Y-образного разъема к центральному Т-образному клапану.
- Подключите одну сторону центрального Т-образного клапана к манометру давления газа.
- Подключите другую сторону манометра газа к стерильному шприцевому фильтру диаметром 25 мм с размером пор 0,22 мкм.
- Прикрепите второй шприцевой фильтр диаметром 25 мм к шприцу без плунжера, который будет использоваться в качестве газоотвода во время разбрызгивания.
- Подключите конечную сторону центрального Т-образного клапана ко второму Т-образному клапану для кислородного монитора.
- Подключите шприцевой фильтр диаметром 25 мм к одной стороне этого второго Т-образного клапана вместе с трубкой для прикрепления игл 18 G.
- Подключите конечную сторону второго Т-образного клапана к устройству контроля кислорода.
- Подключите светотеневую трубу к другой стороне устройства контроля кислорода, которое будет использоваться в качестве газоотвода во время мониторинга.
ВНИМАНИЕ: При тестировании/использовании системы разбрызгивания кислорода внимательно следите за положением Т-образных соединений и убедитесь, что она соответствует предполагаемому пути через систему. Неспособность сделать это приведет к повышению давления внутри системы и приведет к выходу из строя и развалу компонентов. - Для обслуживания системы и поддержания ее оптимальной производительности полезны следующие методы.
- Укрепите соединения большим количеством тефлоновой ленты, чтобы значительно улучшить их уплотнение и уменьшить вероятность того, что компоненты отделятся от внутреннего давления.
- Поддерживайте комбинированную скорость потока ниже 10 л/мин для снижения максимального давления и предотвращения сбоев.
- Если подозревается утечка, используйте моющее средство, такое как коммерчески доступные детекторы утечки жидкости, чтобы легко определить ее местоположение, так как она будет пузыриться над любыми утечками газа. Пластырь протекает с помощью политетрафторэтиленовой ленты (например, тефлона).
- Заменяйте шприцевые фильтры диаметром 25 мм в кислородной разбрызгивательной системе два раза в неделю, но это зависит от частоты использования. Со временем частицы, попавшие в фильтр, уменьшают расход газа и вызывают повышение давления.
- Откалибруйте кислородный монитор до 21% кислородного сжатого воздуха перед проведением измерений.
- По завершении использования системы выключите резервуары и отводите лишний газ от регуляторов до тех пор, пока поток полностью не прекратится.
- Получите и правильно закрепите баллоны со сжатым воздухом и кислородом.
- Разбрызгивание бутылочной культуры сыворотки
- Маркировка 500 мл автоклавных сывороточных флаконов с идентификаторами образцов, датой/временем инокуляции и целевым процентом кислорода.
- В биологическом капюшоне добавьте 24 мл искусственной мокроты в каждый установленный флакон сыворотки.
- Добавляйте 1 мл мокроты пациента, гомогенизированной иглой 18 г (разбавленной стерильным физиологическим раствором, если это необходимо для получения достаточного объема образца для каждого состояния культуры) в каждый флакон сыворотки.
- Используя стерильный пинцет, поместите автоклавные резиновые пробки на верхнюю часть каждого флакона сыворотки.
- Прижмите резиновые пробки, следите за тем, чтобы не коснуться нижней стороны пробки руками.
- Снимите бутылки с вытяжки, нанесите и обжимайте алюминиевые уплотнения. Снимите центральную часть с уплотнений.
- Протрите верхнюю часть бутылок спиртовой салфеткой и пропустите их через пламя горелки Бунзена.
- Прикрепите стерильную иглу 18-G к плунжерному шприцу с фильтром. Сначала вставьте этот газ в баллон.
- Прикрепите стерильную иглу 18-G к выходу газа из системы и вставьте выходную газовую иглу в баллон.
- Проложите Т-образные переходы из резервуаров через кислородный монитор. Убедитесь, что целевая концентрация кислорода протекает через систему. Целевой показатель расхода газа приблизительно 5 л/мин.
- Перенаправление Т-образных соединений от резервуаров к выходу газа. Газ начинает течь через баллон со сывороткой.
ВНИМАНИЕ: Обратите пристальное внимание на манометр во время разбрызгивания кислорода. Если давление неожиданно увеличивается, немедленно выключите систему. - Пропустите кислород через флакон с сывороткой в течение 1 мин. При 5 л/мин это обеспечивает 10 воздухообменов и гарантирует, что внутренняя атмосфера достигнет желаемого парциального давления.
- Снимите иглу с выделением газа 18-G.
- Дайте давлению в бутылке сыворотки нарастить до +1 атмосферы (2 атмосферы на уровне моря), а затем немедленно удалите иглу выхода газа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание давления способствует сохранению гипероксичных состояний с течением времени. - Поместите флакон сыворотки в шейкер инкубатора при температуре 37 °C при 150 об/мин. Инкубируйте образцы в течение трех 24-часовых интервалов. На каждом 24-часовом интервале берут аликвоту для последующего анализа, повторно разбирают образцы и возвращают их в инкубацию в течение общего времени инкубации 72 ч.
- Измерение оттока кислорода
- Откалибруйте кислородометр до 21% сжатого воздуха, а затем выключите бак.
- Проведите прием флакона с сывороткой через кислородный монитор и прикрепите стерильную иглу к концу.
- Вставьте иглу через резиновую пробку в флакон с сывороткой.
- Подождите, пока показания оттока стабилизируются. Низкая скорость потока из бутылок с сывороткой означает, что это может занять до 2 минут. Сообщите о пиковой разнице с воздухом в помещении (число, наиболее удаленное от 21%).
- При выполнении нескольких показаний промывайте систему сжатым воздухом между показаниями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эти протоколы были применены к 50 отхаркивающим образцам мокроты из pwCF, представленным для обычной помощи в амбулаторной клинике муковисцидоза в Массачусетской больнице общего профиля в Бостоне, штат Массачусетс. Мокроту каждого пациента культивировали при 21%, 50% и 100% кислородных условиях с использованием искусственной мокроты, причем 0,5 мл аликвот брали из каждой культуры через 24 ч, 48 ч и 72 ч культурального времени для тестирования. Культуры были сфотографированы, когда были сделаны извлечения для отслеживания визуальных изменений. Кроме того, перед культивированием была взята аликвота 0,5 мл каждого первичного образца мокроты. Это привело к 10 дискретным образцам на пациента и конечному N из 500 образцов. Из них мокрота 11 пациентов (11 некультурных спута, 11 культивируемых спута из 21% кислорода в 48 ч инкубации) подверглась экстракции нуклеиновых кислот17,библиотеки секвенирования были сгенерированы с использованием коммерческого набора для подготовки библиотеки ДНК, а метагеномное секвенирование было выполнено на целой платформе секвенирования генома, нацеленной на ~ 5 Гб последовательности на образец со 150 парами оснований, сопряженное чтение. Необработанные считывания обрабатывали с использованием набора инструментов18bioBakery, который включает в себя контроль качества и удаление человеческих «загрязняющих» последовательностей и таксономическое профилирование с помощью профилировщика MetaPhlAn319. Во время экстракции нуклеиновых кислот 10 миллионов клеток Imtechella halotolerans,галотолерантного вида, обычно встречающегося в экосистемах лиманов, а не в микробных сообществах человека, были включены в каждый образец, что позволило количественно оценить абсолютную микробную нагрузку для каждого образца20.
На рисунке 2 показаны индивидуальные и средние измерения оттока кислорода и уровни рН в ходе процесса культивирования для 50 образцов мокроты, культивируемых при каждом кислородном состоянии, а также пример визуального дифференциального фенотипа культуры. Культуры поддерживались при температуре 37 °C, за исключением коротких периодов, когда выполнялось разбрызгивание и удаление образцов аликвот. С интервалами разбрызгивания 12 ч и 24 ч поддерживались повышенные концентрации кислорода, хотя со временем наблюдалось падение для всех трех кислородных состояний, при этом 100% кислорода падали примерно до 85%, 50% кислорода падали до 40% и 21% кислорода падали до 18%. Кислородные условия оставались отчетливыми, и, что важно, повышенные концентрации кислорода поддерживались на протяжении всего процесса для гипероксических образцов. Измерения pH показали большую степень изменчивости, но оставались в физиологически нормальном диапазоне без статистически значимых изменений с течением времени. Эти измерения показывают, что эти методы поддерживают дискретные дифференциальные кислородные условия на протяжении всего процесса культивирования. Наконец, показан пример одного из многих фенотипов визуальной культуры, которые дифференцируются по концентрации кислорода. Этот образец имел заметные различия в мутности после 72 ч культуры, с более высоким содержанием кислорода, связанным с более низкой зрительной мутностью. Дифференциальные культуральные фенотипы поддерживают наличие гипероксии-индуцированных воздействий на культурные сообщества.
На рисунке 3 сравнивается микробная нагрузка, микробное разнообразие и состав микробного сообщества между некультивированной мокротой и культивируемой мокротой (состояние кислорода 21% в течение 48 ч). Измерения показывают, что единственным существенным отличием, вызванным актом культивирования, является примерно 20-кратное увеличение микробной нагрузки по сравнению с некультурной мокротой. Иммунная система и типичные механические механизмы очистки мокроты, такие как кашель, обычно служат регуляторным процессом, ограничивающим микробную нагрузку в легких, даже в случаях дисфункции и инфекции, таких как те, которые наблюдаются в pwCF. Культура ex vivo не имеет таких регуляторных механизмов, и микробные сообщества вместо этого могут свободно переходить к клеточному насыщению. Показатели альфа- и бета-разнообразия показывают, что, несмотря на эту разницу в микробной нагрузке, основной состав сообщества остается хорошо сохраненным, с минимальными глобальными различиями, вызванными процессом культивирования.
Рисунок 4 расширяет сравнение между некультурными и культивируемыми образцами мокроты, рассматривая бинарное присутствие/отсутствие 120 микробных видов, окончательно идентифицированных методом метагеномического секвенирования дробовика из культивируемой и некультивированной мокроты, полученной от 11 пациентов. Микробы группируются на основе филогенетического сходства. 46 (38,3%) этих видов были идентифицированы как в некультурных, так и в культивируемых образцах (голубой цвет), в то время как 35 (29,2%) были идентифицированы исключительно в некультурных образцах (желтый) и 39 (32,5%) были идентифицированы исключительно в культивируемых образцах (синий). Вполне вероятно, что существует больший паритет, чем то, что мы определили с помощью секвенирования с точки зрения того, что присутствует, а что отсутствует, но некоторые таксоны в некоторых случаях падают ниже порога обнаружения секвенирования. Различия указывают на то, что процесс культивирования вносит некоторую предвзятость в культивируемую по сравнению с некультурной мокротой. В частности, культивирование увеличивает присутствие грибов, таких как Candida и Aspergillus,а также членов Enterobacterales, включая членов Escherichia, Serratiaи Streptococcus. И наоборот, члены Bacteroidetes, такие как Prevotella и Clostridiales, которые являются анаэробами, присутствовали в некультурных образцах, но не присутствовали в культивируемых образцах. Это может быть связано с отсутствием анаэробного состояния в нашей экспериментальной модели.
На рисунке 5 показаны основанные на абсорбции кривые роста распространенных патогенов легких муковисцидоза, выделенных из мокроты, полученной из 50 различных pwCF. Эти изоляты представляют собой фенотипически различные клинические изоляты, полученные с использованием процедур культивирования обогащения из Лаборатории клинической микробиологии Массачусетской больницы общего профиля, и включают Pseudomonas aeruginosa (N = 53), Staphylococcus aureus (N = 37), Stenotrophomonas maltophilia (N = 12), Klebsiella pneumoniae (N = 3) и Achromobacter sp (N = 7). Кривые роста были получены путем культивирования каждого изолята в искусственной среде мокроты при 37 °C в темноте, при этом ASM без бактериальной инокуляции служила отрицательным контролем. Прозрачное качество ASM (которое обусловлено фильтром, а не тепловой стерилизацией) позволяет проводить оптические измерения для оценки кривых роста. Оптические показания при 600 нм (OD600) снимались каждые 10 мин, и показывались первые 24 ч каждой кривой. Отсутствие изменений оптических показаний в ASM-только отрицательном контроле указывает на культуры, свободные от загрязнения. Демонстративные кривые, показанные здесь, следуют типичным паттернам кривой роста, указывающим на жизнеспособность этого рецепта ASM в качестве среды для генерации кривых роста на основе поглощения.
| Колонка 1 | Колонка 2 | Колонка 3 | Колонка 4 | Колонка 5 | Колонка 6 | Колонка 7 | Колонка 8 | Колонка 9 | |
| Ценность | Комсток | Киршнер | Шрирамулу | Паломник | Флинн | Галлагер | Лай | Источник | |
| Муцин | 2% мас./кв | 0,5% мас./об | 0,5% мас./об | - | 1% мас./об. | 2% мас./кв | 1% мас./об. | Флинн | |
| Хлорид натрия | 85.5 мМ | 85.5 мМ | 85.5 мМ | 66.6 мМ | 89.8 мМ | 85.5 мМ | 152.3 мМ | Лапьер | |
| Хлористый калий | 29.5 мМ | 29.5 мМ | 29.5 мМ | 15.8 мМ | - | 2.95 мМ | 15.8 мМ | Паломник | |
| Сульфат магния | - | - | - | 0,6 мМ | 1 мМ | 1 мМ | 0.61 мМ | Паломник | |
| Сульфат железа | - | - | - | 0.0036 мМ | - | - | - | - | |
| Нашатырь | - | - | - | 2,3 мМ | 60 мМ | - | - | - | |
| Монокалийфосфат | - | - | - | 2,5 мМ | 60 мМ | - | - | - | |
| Глюкоза | - | - | - | 3,2 мМ | 13 мМ | 40 мМ | 0,7 мМ | Самбек | |
| Лактат | - | - | - | 9 мМ | - | - | - | - | |
| Незаменимые аминокислоты | в 14,45 раза | 0,25 г/л | 0,25 г/л | На кислоту | в 0,5 раза | в 0,375х | в 1,29х | Паломник | |
| Заменимые аминокислоты | в 28,9 раза | 0,25 г/л | 0,25 г/л | На кислоту | в 0,25х | в 0,5 раза | в 8,01 раза | Паломник | |
| Витамины | - | - | - | - | - | в 1 раз | в 1 раз | Галлагер | |
| Следовые металлы | - | - | - | - | в 1 раз | в 1 раз | в 1 раз | Флинн | |
| Желток | 0.25% | 0.25% | 0.25% | - | - | 0.25% | 0.25% | Киршнер | |
| Ферритина | 0,0003 г/л | - | - | - | - | 0,0004 г/л | 0,0004 г/л | Галлагер | |
| ДНК сперматозоидов лосося | 1,4 г/л | 4 г/л | 4 г/л | - | - | 1,4 г/л | - | - | |
| ДПТА | - | - | 0,0059 г/л | - | - | - | - | - | |
| рН | - | 6.9 | - | 6.8 | - | - | 6.3 | Лапьер | |
| Хранение | 0 | 4° | - | - | 4° | 4° | 4° | Киршнер | |
| Стерилизация | Автоклав | Фильтр | Автоклав | - | Автоклав | Автоклав | Фильтр | Киршнер | |
Таблица 1: Рецепт искусственной среды мокроты, полученный из обзора литературы. (Колонка 1) Реагенты и ключевые значения в рецептуре искусственной мокроты среды. (Колонки 2-7) Сравнение рецептов из дошедшей до нас литературы8,9,10,12,14,15. (Колонки 8-9) Рецепт искусственной мокроты среды подробно описан в настоящем протоколе и соответствующих источниках, которые информируют каждого выбранного значения10,11,12,13,14,15.
| Колонка 1 | Колонка 2 | Колонка 3 |
| Cf Мокрота | АНМ | |
| Общее количество аминокислот | 10.25 мМ | 10.76 мМ |
| Аланин | 0.96 мМ | 0.80 мМ |
| Аргинин | 0.17 мМ | 0,94 мМ |
| Аспарагин | 0.91 мМ | |
| Аспарагиновая кислота | 0.45 мМ | 0.80 мМ |
| Цистеин | 0.09 мМ | 0.33 мМ |
| Глутаминовая кислота | 0.84 мМ | 0.80 мМ |
| Глицин | 0.65 мМ | 0.80 мМ |
| Гистидин | 0.28 мМ | 0.35 мМ |
| Изолейцин | 0.60 мМ | 0.52 мМ |
| Лейцин | 0.87 мМ | 0.52 мМ |
| Лизин | 1,15 мМ | 0,64 мМ |
| Метионин | 0,34 мМ | 0.13 мМ |
| Орнитин | 0.36 мМ | |
| Фенилаланин | 0.29 мМ | 0.26 мМ |
| Пролин | 0.90 мМ | 0.80 мМ |
| Серин | 0.78 мМ | 0.80 мМ |
| Треонин | 0.58 мМ | 0.52 мМ |
| Триптофан | 0,07 мМ | 0.06 мМ |
| Тирозин | 0.43 мМ | 0.26 мМ |
| Валин | 0.60 мМ | 0.52 мМ |
Таблица 2: Концентрации аминокислот, ранее описанные в мокроте муковисцидоза и в искусственной среде мокроты, подробно описаны в настоящем протоколе. (Колонка 1) Ключевые аминокислоты. (Колонка 2) Концентрации аминокислот мокроты у людей с муковисцидозом12. (Колонка 3) Концентрации аминокислот в искусственной мокроте подробно описаны в этом протоколе
Рисунок 1:Схема соединения компонентов кислородной разбрызгивающей системы. Блок-схема соединений между компонентами системы, используемой для разборки сывороточных баллонов до желаемых концентраций кислорода от 21% до 100%. Система имеет 3 режима использования, определяемых положением двух Т-образных клапанов. Система может направлять газ из резервуаров через выход газа или через монитор процента кислорода, а также направлять отток газа из ранее разбрызганных сывороточных баллонов через монитор, чтобы проверить концентрацию по прошествии времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Целевые концентрации кислорода приблизительно поддерживаются с интервалами разбрызгивания 12 ч и 24 ч, а рН остается в физиологическом диапазоне во время культивирования. (A)Показания оттока кислорода с интервалов разбрызгивания кислорода через 12 ч и 24 ч в течение 72-часового периода. (B)Показания pH для образцов, измеренных каждые 24 ч.(C)Пример изображения культивируемого образца CFB010 через 72 ч, отображающего дифференциальное мутное поперек концентраций кислорода. Цвет указывает на целевой процент кислорода; полосы погрешностей обозначают 95% доверительных интервалов. Критические пороги подчеркнуты пунктирными линиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Культивирование увеличивает микробную нагрузку, но основной состав сообщества сохраняется. Некультивированная мокрота (желтая) и культивируемая мокрота (синяя) с использованием искусственной мокроты при 21% кислорода в течение 48 ч. Аликвоты подверглись экстракции нуклеиновых кислот и секвенированию метагеномики дробовика для выявления возможного смещения, введенного из условий культивирования. (A)Абсолютная микробная нагрузка (определяемая контрольными показателями всплеска) и метрики альфа-разнообразия. Используя линейные модели смешанных эффектов, некультурная и культивируемая мокрота предсказывали микробную нагрузку, но не альфа-разнообразие. (B)Координация первых двух компонентов метрик бета-разнообразия, контролирующая разницу в микробной нагрузке. Нет существенной разницы ни в одной метрике после ПЕРМАНОВОЙ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Большинство идентифицированных таксонов присутствуют как в исходной мокроте, так и в культуре, в то время как другие появляются только в исходной мокроте или культуре. Метагеномическое секвенирование дробовика используется для сравнения различий в составе микробного сообщества между некультурными и культивируемыми образцами мокроты. Филогенетическое дерево всех идентифицированных микробных видов в секвенированных образцах (N = 120). Виды, отмеченные желтым цветом (N = 35, 29,2%), были замечены только в образцах некультурной мокроты. Виды, отмеченные синим цветом (N = 39, 32,5%), были замечены только в образцах культур искусственной среды мокроты. Виды, отмеченные голубым (N = 46, 38,3%), были замечены как в некультурных, так и в культивируемых образцах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Искусственная среда мокроты достаточно прозрачна, чтобы ее можно было использовать в качестве среды кривой роста для культивирования клинических изолятов. Показания оптимальной плотности при 600 нм снимались каждые 10 мин, и показывались первые 24 ч каждой кривой. Серые линии представляют отдельные показания, а оранжевые линии представляют среднее поглощение для каждого таксона. Искусственная мокрота средняя заготовка включена в качестве контрольной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании была разработана модель in vitro для изучения влияния гипероксии на микробные сообщества легких. Эта модель, основанная на искусственной среде мокроты и ежедневном разбрызгивании сывороточных баллонов, поддерживает повышенные концентрации кислорода и поддерживает рост микробов, идентифицированных в мокроте из pwCF.
Существует несколько критических шагов этого подхода. Во-первых, это выбор использовать фильтр-стерилизацию, а не тепловую стерилизацию искусственной мокроты. Фильтр-стерилизация предотвращает денатурацию муцина и других термочувствительных компонентов среды и дает прозрачную среду, которая может быть использована для оптических измерений роста микробов. В то время как стерилизация фильтра была предложена в других протоколах10,мы обнаружили, что добавление орбитального встряхивания во время процесса фильтрации было необходимо для предотвращения засорения фильтра, которое в противном случае происходило при фильтрации минимального количества подготовленной среды. В то время как фильтрованная искусственная среда мокроты может иметь более низкую, чем предполагалось, конечную концентрацию муцина из-за воздействия муцина в фильтре, было показано, что мокрота из pwCF имеет более низкие концентрации муцина, чем мокрота у людей без муковисцидоза21. Начальная концентрация муцина 1%, используемая в этом протоколе, выше, чем в других подходах, которые использовали фильтр-стерилизацию, причем одна группа использовала начальную концентрацию муцина 0,5%10,в то время как типичные рецепты используют концентрации муцина в диапазоне от 0,5% до 2%(таблица 1). Таким образом, даже при потере муцина в процессе фильтрации-стерилизации конечная среда, приготовленная с использованием этого протокола, вероятно, будет иметь концентрации муцина в пределах физиологического диапазона22.
Второй – состав искусственной среды мокроты. Рецепт искусственной среды мокроты был выбран на основе существующих физиологических исследований мокроты из pwCF(таблица 1). Используя секвенирование метагеномики дробовика, мы смогли проверить, что мокрота, культивируемая с помощью этой искусственной среды мокроты, широко повторяет состав микробного сообщества некультивированной мокроты(рисунок 3). При нормоксических условиях эта среда также поддерживала рост 112 различных клинических изолятов, представляющих общие патогены, выделенные из мокроты пациентов с муковисцидозом. Таким образом, эти данные демонстрируют, что данная формула искусственной мокроты поддерживает рост микробиоты дыхательных путей из pwCF. ДНК сперматозоидов лосося, распространенное дополнение к существующим рецептам(таблица 1),была опущена. Одним из предполагаемых применений этой модели является секвенирование метагеномики, и, таким образом, ДНК сперматозоидов лосося не была включена для того, чтобы уменьшить добавление немикробных нуклеиновых кислот, поскольку эти показания будут отфильтрованы после секвенирования, тем самым уменьшая нашу эффективную глубину секвенирования. В то время как мокрота из pwCF имеет высокие концентрации внеклеточной ДНК23,значительная ее часть является микробной по происхождению24,и неясно, делает ли добавление ДНК сперматозоидов лосося к искусственной мокроте среду ее более физиологичной или культуральный подход, описанный в этом протоколе, приводит к высоким уровням внеклеточной ДНК, полученной из микробов; мы не различали концентрации вне- и внутриклеточной ДНК в наших исследованиях. Будущие исследования, возможно, пожелают проверить концентрацию внеклеточной ДНК, генерируемой этим методом культивирования.
В-третьих, насколько нам известно, ни одно опубликованное исследование микробных сообществ муковисцидоза легких не касалось гипероксических состояний. Эта модель использует недорогое и общедоступное оборудование от общих лабораторных или больничных поставщиков для создания системы разбрызгивания кислорода. Важные соображения для поддержания гипероксических условий включают объем питательной среды относительно доступного пространства над головой во флаконах сыворотки. В первоначальных попытках во время разработки протокола использовались флаконы сыворотки объемом 125 мл. Однако использование сывороточных флаконов объемом 500 мл (что позволяет увеличить пространство над головой 475 мл к культуральному соотношению 25 мл) позволило поддерживать желаемую концентрацию до 24 ч, тем самым уменьшая частоту спарживания кислорода. Этот подход генерирует дискретные кислородные условия, что позволяет одновременно культивировать различные образцы пациентов в нескольких кислородных условиях. Другие инструменты из анаэробной культуры могут быть использованы для гипероксичной культуры, включая использование анаэробных банок или трубок типа Балха, разбрызгиваемых кислородом. Анализ микробных сообществ легких с использованием метагеномического секвенирования показывает, что общее альфа- и бета-разнообразие сопоставимо между культивируемой и некультурной мокротой. При оценке дифференциальной численности на видовом уровне культивируют на 21% кислород, обогащенный для роста аэробов и факультативных анаэробов, включая Энтеробактералы, Стрептококки, грибы. Это, вероятно, связано с исключением анаэробного состояния, которое наблюдалось в дыхательных путях pwCF25,26. В будущих исследованиях можно было бы рассмотреть вопрос о включении газообразного азота в эту модель для изучения ряда бескислородных и окислительных состояний и соответствующих аэробных и анаэробных микробиот, обнаруженных в микробных сообществах дыхательных путей.
Ключевые принципы, изложенные в этих протоколах, могут быть поучительными для проведения аналогичных исследований, связанных с влиянием кислорода на сложные микробные сообщества или распространенные легочные патогены. Кислород является наиболее распространенной терапией, используемой при лечении всех распространенных заболеваний легких, и лучшее понимание того, как он может привести к побочным непредвиденным воздействиям на микробные сообщества дыхательных путей и общие респираторные патогены, будет иметь важное значение для лечения pwCF и других хронических заболеваний легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Часть этой работы была выполнена в Морской биологической лаборатории при поддержке Морской биологической лаборатории, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (номер гранта 5600373) и подарком от Фонда Саймонса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S.
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K.
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
