Summary
El objetivo de este protocolo es desarrollar un sistema modelo para el efecto de la hiperoxia en las comunidades microbianas de las vías respiratorias de la fibrosis quística. El medio de esputo artificial emula la composición del esputo, y las condiciones de cultivo hiperóxico modelan los efectos del oxígeno suplementario en las comunidades microbianas pulmonares.
Abstract
Se cree que las comunidades microbianas de las vías respiratorias desempeñan un papel importante en la progresión de la fibrosis quística (FQ) y otras enfermedades pulmonares crónicas. Los microbios se han clasificado tradicionalmente en función de su capacidad para usar o tolerar el oxígeno. El oxígeno suplementario es una terapia médica común administrada a personas con fibrosis quística (pwCF); sin embargo, los estudios existentes sobre el oxígeno y el microbioma de las vías respiratorias se han centrado en cómo la hipoxia (bajo nivel de oxígeno) en lugar de la hiperoxia (alto contenido de oxígeno) afecta a las comunidades microbianas pulmonares anaeróbicas predominantemente aeróbicas y facultativas. Para abordar esta brecha crítica de conocimiento, este protocolo se desarrolló utilizando un medio de esputo artificial que imita la composición del esputo de pwCF. El uso de la esterilización por filtro, que produce un medio transparente, permite que los métodos ópticos sigan el crecimiento de microbios unicelulares en cultivos en suspensión. Para crear condiciones hiperóxicas, este sistema modelo aprovecha las técnicas de cultivo anaeróbico establecidas para estudiar las condiciones hiperóxicas; en lugar de eliminar el oxígeno, el oxígeno se agrega a los cultivos mediante el sparging diario de botellas de suero con una mezcla de oxígeno comprimido y aire. El esputo de 50 pwCF se sometió a un sparging diario durante un período de 72 horas para verificar la capacidad de este modelo para mantener condiciones diferenciales de oxígeno. La secuenciación metagenómica con escopeta se realizó en muestras de esputo cultivadas y no cultivadas de 11 pwCF para verificar la capacidad de este medio para apoyar el crecimiento de microbios comensales y patógenos que se encuentran comúnmente en el esputo de fibrosis quística. Se obtuvieron curvas de crecimiento a partir de 112 aislamientos obtenidos de pwCF para verificar la capacidad de este medio de esputo artificial para apoyar el crecimiento de patógenos comunes de fibrosis quística. Encontramos que este modelo puede cultivar una amplia variedad de patógenos y comensales en el esputo cf, recupera una comunidad muy similar al esputo no cultivado en condiciones normóxicas y crea diferentes fenotipos de cultivo en condiciones variables de oxígeno. Este nuevo enfoque podría conducir a una mejor comprensión de los efectos imprevistos inducidos por el uso de oxígeno en pwCF en las comunidades microbianas de las vías respiratorias y los patógenos respiratorios comunes.
Introduction
La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética caracterizada por una incapacidad para eliminar el moco espeso de los pulmones, lo que lleva a infecciones repetidas y disminución progresiva de la función pulmonar que a menudo resulta en la necesidad de un trasplante de pulmón o la muerte. El microbioma de las vías respiratorias de los pacientes con fibrosis quística (PTCF) parece rastrear la actividad de la enfermedad1,con una reducción de la diversidad microbiana asociada con resultados adversos a largo plazo2,3. En estudios clínicos de pwCF, la oxigenoterapia suplementaria se ha asociado con una enfermedad más avanzada4,5, aunque tradicionalmente, el uso de la oxigenoterapia se ha visto simplemente como un marcador de la gravedad de la enfermedad6. Estudios recientes de un ensayo clínico de pacientes con insuficiencia respiratoria han demostrado que los niveles más altos de oxígeno en los pacientes se asocian paradójicamente con un aumento de las infecciones bacterianas graves y una mayor mortalidad7,lo que sugiere que el oxígeno suplementario puede contribuir a la patogénesis de la enfermedad. El efecto del oxígeno suplementario sobre el microbioma pulmonar de la fibrosis quística y las comunidades microbianas pulmonares y respiratorias asociadas no se ha estudiado bien.
Los estudios mecanicistas a menudo no se pueden realizar directamente en sujetos humanos debido a dificultades logísticas y posibles problemas éticos asociados con intervenciones de beneficio o daño médico desconocido. Los enfoques traslacionales que integran bioespecímenes humanos en sistemas modelo pueden ofrecer importantes conocimientos biológicos en estos casos. Si bien la capacidad de usar o tolerar el oxígeno ha sido tradicionalmente un componente importante de la clasificación microbiana, se sabe poco sobre cómo la introducción terapéutica de oxígeno suplementario en el medio ambiente podría perturbar las comunidades microbianas de las vías respiratorias. Para arrojar luz sobre los efectos desconocidos del oxígeno suplementario en los microbiomas de las vías respiratorias de pwCF, necesitábamos abordar dos desafíos principales; primero, la creación de un medio de cultivo que se aproxime fisiológicamente a la composición del esputo cf; segundo, la creación de un sistema modelo que permita el mantenimiento de concentraciones elevadas de oxígeno en cultivo durante largos períodos de tiempo.
Los medios de esputo artificial (MAPE) se utilizan ampliamente para emular el esputo pulmonar ex vivo8,9,10,pero no hay un consenso claro sobre una receta específica. Este protocolo describe una receta de medio de esputo artificial y una estrategia de preparación cuidadosamente diseñada para aproximarse fisiológicamente al esputo de pwCF. La Tabla 1 describe los valores de la receta elegida en función de la literatura publicada. Los componentes químicos básicos y el pH se compararon con los valores identificados por los estudios de esputo de FQ humana11,12,13. Se añadieron nutrientes fisiológicos de baja concentración utilizando yema de huevo, que se incluyó como 0,25% del volumen final10,así como mezclas de vitaminas y metales traza14,15. La mucina, el componente clave del esputo16,se incluyó al 1% p/v14. Aunque requiere más mano de obra, se eligió la esterilización por filtro sobre la práctica más convencional de esterilización por calor para reducir los problemas potenciales de la desnaturalización inducida por el calor de los componentes esenciales de los medios10. Un beneficio adicional de la esterilización por filtro es que genera medios que son transparentes (la esterilización por calor puede crear medios turbios debido a la precipitación y coagulación de sales y proteínas), lo que permite que este medio de esputo artificial se utilice para seguir el crecimiento microbiano basado en aumentos en la turbidez.
Este sistema modelo para el cultivo hiperóxico se basa en técnicas de cultivo anaeróbico donde se agrega oxígeno en lugar de eliminarse, creando un modelo para el efecto del uso de oxígeno suplementario para pwCF. La Figura 1 y el protocolo de ahorro de oxígeno asociado describen los componentes de un sistema de ahorro de oxígeno, que se pueden obtener a bajo costo de proveedores generales de laboratorios y hospitales. Este sistema permite la mezcla de oxígeno comprimido y aire a concentraciones fijas que van desde el 21% hasta el 100% de oxígeno. La integración de un sensor de oxígeno permite verificar la concentración de la mezcla de gas de salida, así como verificar la composición del gas de salida de las botellas de suero previamente escasas para verificar que las condiciones de oxígeno se hayan mantenido dentro del rango deseado.
Este protocolo describe los procedimientos para crear un medio de esputo artificial, la construcción y el uso de un sistema de ahorro de oxígeno y la aplicación de ambos para cultivar esputo cf en condiciones diferenciales de oxígeno.
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Protocol
Este estudio recibió la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de Socios (Protocolo # 2018P002934). El criterio de inclusión incluyó pacientes adultos con fibrosis quística que dieron su consentimiento informado por escrito para el estudio. No había criterio de exclusión. De acuerdo con las pautas del protocolo, todas las muestras de esputo se recolectaron de pacientes con fibrosis quística durante una visita ambulatoria programada con su proveedor clínico.
1. Preparación del medio de esputo artificial
NOTA: Las cantidades enumeradas aquí son para la producción de 1 L de medio de esputo artificial final, y asumen los reactivos específicos enumerados en la Tabla de Materiales. Los números deben ajustarse para otros volúmenes o para el uso de diferentes reactivos para garantizar el mismo producto final. Véase el cuadro 1 para las concentraciones objetivo.
- Mezcla química de esputo artificial (ASCM)
NOTA: ASCM constituye el 25% del volumen medio final. Es estable en el estante y se puede preparar a granel o con anticipación. Si se está preparando para su uso posterior, autoclave la mezcla química y guárdela de forma segura a temperatura ambiente.- Mezclar las soluciones de stock químico constituyente.
- Preparar 1 M de NaCl caldo: Añadir 58,44 g de NaCl por litro de agua estéril.
- Preparar 1 M KCl caldo: Añadir 74,55 g de KCl por litro de agua estéril.
- Preparar 1 M MgSO4 caldo: Añadir 246,47 g de MgSO4·7H2O por litro de agua estéril, o 120,37 g de MgSO4 anhidro por litro de agua estéril.
- Preparar 1 M de caldo de glucosa: Añadir 180,16 g de glucosa por litro de agua estéril.
- Autoclave esteriliza las soluciones químicas de stock, así como una botella vacía de 250 ml. Realice los pasos de autoclave a valores mínimos estándar de 121 °C y 15 PSI durante 30 min.
- Agregue 80.59 ml de agua estéril a la botella vacía de 250 ml.
- Agregue 152.30 mL de 1 M de material de NaCl a la mezcla.
- Agregue 15.8 mL de 1 M de stock de KCl a la mezcla.
- Añadir 610 μL de 1 M MgSO4 caldo a la mezcla.
- Añadir 700 μL de 1 M de caldo de glucosa a la mezcla.
- Mezclar las soluciones de stock químico constituyente.
- Mezcla artificial de mucina de esputo (ASMM)
NOTA: ASMM constituye el 50% del volumen medio final. Asegúrese de que se prepara el mismo día que el lote medio final.- Agregue 450 ml de agua estéril a una botella vacía de 1 L.
- Agregue 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x a la botella.
- Agregue una barra de agitación magnética desechable a la botella.
- Autoclave la botella que contiene PBS y la barra de agitación.
- Mida 10 g de mucina en polvo y agréguelo al PBS.
- Agite la botella vigorosamente para una mezcla preliminar.
- Coloque la botella en una placa caliente con un agitador magnético. Ajuste el calor a medio-alto apuntando a 50 ° C y la velocidad de agitación a 1100 rpm. Aumente la velocidad gradualmente para que la barra no salga volando del imán.
- Dejar calentar y remover durante 15 min.
- Recoge la botella con guantes resistentes al calor. Observe para verificar si el polvo de mucina se asienta fuera de la solución.
- Si el polvo de mucina no está completamente disuelto, devuelva la botella al calor/agitador durante intervalos de 5 minutos hasta que se disuelva por completo.
- Deje que la mezcla de mucina se enfríe a temperatura ambiente.
- Mezcla biológica de esputo artificial (ASBM)
NOTA: ASBM es el 25% del volumen medio final. Prepárelo el mismo día que el lote medio final y, a diferencia de las otras mezclas, no exponga sus componentes a ningún calor.- Descongele el caldo de vitaminas 100x en un refrigerador de 4 ° C o en hielo.
NOTA: Pre-porcionar el stock de vitaminas en alícuotas de 10 ml para minimizar el número de ciclos de congelación / descongelación. - Añadir 124,24 ml de agua estéril a la botella vacía de 250 ml en autoclave.
- Agregue 25.76 ml de 50x de contenido de aminoácidos esenciales a la mezcla.
- Agregue 80.14 ml de 100x de aminoácidos no esenciales a la mezcla.
- Agregue 10 ml de caldo de vitaminas 100x (descongelado) a la mezcla.
- Agregue 1 ml de material de metales traza 1000x a la mezcla.
- Agregue 8.33 ml de emulsión de yema de huevo al 30% a la mezcla.
- Añadir 400 μL de 10 g/L de cepa de ferritina a la mezcla.
- Mezcle bien la solución mediante agitación manual.
- Descongele el caldo de vitaminas 100x en un refrigerador de 4 ° C o en hielo.
- Medio de esputo artificial (ASM)
- Añadir 250 ml de ASCM al frasco de 1 L que contiene ASMM.
- Agregue 250 ml de ASBM a la botella mediana.
- Valore el medio con tampón MOPS básico (1 M) para alcanzar un pH de 6.3 en un papel de pH de rango estrecho. Antes de la titulación, la mezcla media será demasiado ácida.
- Refrigere el medio de esputo artificial resultante a 4 °C hasta que esté listo para la filtración.
- Para iniciar el proceso de filtración, transfiera 200 ml de medio de esputo artificial sin filtrar a un sistema de filtración al vacío con un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.
- Conecte el sistema de filtración a la bomba de vacío, encienda la bomba de vacío, configúrela a 70 mbar y luego coloque la cámara en un agitador orbital que tiembla a 90 rpm en una cámara frigorífica a 4 ° C.
- Remata con 150 ml adicionales del medio a medida que se filtra una cantidad apreciable. Se necesitan 1-2 días para filtrar 1 L de medio por completo.
- Repetir con cámaras adicionales hasta filtrar todos los medios.
NOTA: Trate de no filtrar más de 350 ml del medio a través del mismo filtro de 0,22 μm, ya que la mucina tapará el filtro con el tiempo.
- Refrigere el medio de esputo artificial filtrado a 4 °C hasta que esté listo para su uso. Use ASM dentro de un mes de la preparación para obtener los mejores resultados.
2. Ahorro de oxígeno
- Configuración de la estación sparging
NOTA: Este protocolo solo debe realizarse en su totalidad una vez, después de lo cual la configuración se puede mantener a través de un mantenimiento simple según sea necesario. Consulte la Figura 1 para obtener un esquema visual del sistema de ahorro de oxígeno.- Obtener y asegurar adecuadamente los tanques de aire comprimido y oxígeno.
PRECAUCIÓN: La alta presión hace que los tanques sean extremadamente peligrosos cuando se manejan mal. Asegúrese de que los tanques estén completamente sellados y asegurados, que no haya fugas cuando el tanque esté cerrado y que todo el personal de manejo esté completamente capacitado en su uso. - Conecte un regulador de aire al tanque de aire comprimido con una llave inglesa. Para una lectura óptima del flujo en el regulador, coloque el regulador lo más cerca posible de una posición vertical.
- Conecte un regulador de oxígeno al tanque de oxígeno comprimido, uniéndose lo más cerca posible de una posición vertical. Dependiendo del tanque de oxígeno, es posible que deba invertir la dirección para apretar.
- Conecte el tubo de los reguladores a un conector en Y para combinar el flujo de gas de los dos tanques.
- Conecte la salida del conector Y a la válvula central de unión en T.
- Conecte un lado de la válvula central de unión en T a un manómetro de gas.
- Conecte el otro lado del manómetro de gas a un filtro de jeringa estéril de 25 mm de diámetro con un tamaño de poro de 0,22 μm.
- Conecte un segundo filtro de jeringa de 25 mm de diámetro a una jeringa sin émbolo para utilizarlo como liberación de gas durante el sparging.
- Conecte el lado final de la válvula central de unión en T a una segunda válvula de unión en T para el monitor de oxígeno.
- Conecte un filtro de jeringa de 25 mm de diámetro a un lado de esta segunda válvula de unión en T, junto con un tubo para conectar agujas de 18 G.
- Conecte el lado final de la segunda válvula de unión en T al aparato de monitoreo de oxígeno.
- Conecte un tubo de corte al otro lado del aparato de monitoreo de oxígeno para usarlo como liberación de gas durante el monitoreo.
PRECAUCIÓN: Al probar / usar el sistema de ahorro de oxígeno, tome nota cuidadosamente de la posición de las uniones en T y asegúrese de que coincida con la trayectoria prevista a través del sistema. Si no lo hace, se acumulará presión dentro del sistema y hará que los componentes fallen y se separen. - Para el mantenimiento del sistema y para mantenerlo funcionando a un rendimiento óptimo, las siguientes prácticas son beneficiosas.
- Refuerce las conexiones con cantidades liberales de cinta de teflón para mejorar en gran medida su sellado y reducir la posibilidad de que los componentes se separen de la presión interna.
- Mantenga el caudal combinado por debajo de 10 L/min para mitigar la presión máxima y evitar fallos.
- Si se sospecha una fuga, use una solución detergente como los detectores de fugas de líquidos disponibles en el mercado para identificar su ubicación fácilmente, ya que burbujeará por encima de cualquier fuga de gas. Parchee las fugas con una cinta de politetrafluoroetileno (por ejemplo, teflón).
- Reemplace los filtros de jeringa de 25 mm de diámetro en el sistema de ahorro de oxígeno dos veces por semana, pero esto varía con la frecuencia de uso. Con el tiempo, las partículas atrapadas en el filtro reducen el caudal de gas y causan acumulaciones de presión.
- Calibre el monitor de oxígeno al 21% de oxígeno comprimido antes de realizar las mediciones.
- Al finalizar el uso del sistema, apague los tanques y desangre el exceso de gas de los reguladores hasta que el flujo se detenga por completo.
- Obtener y asegurar adecuadamente los tanques de aire comprimido y oxígeno.
- Cultivo de botellas de suero
- Etiquete los frascos de suero en autoclave de 500 ml con identificadores de muestra, fecha/hora de inoculación y porcentaje de oxígeno objetivo.
- En una campana biológica, agregue 24 ml del medio de esputo artificial a cada frasco de suero que se esté configurando.
- Añadir 1 ml de esputo del paciente homogeneizado con una aguja de 18 G (diluido con solución salina estéril si es necesario para obtener un volumen suficiente de muestra para cada condición de cultivo) a cada frasco de suero.
- Usando pinzas estériles, coloque los tapones de goma en autoclave en la parte superior de cada frasco de suero.
- Presione los tapones de goma, tenga cuidado de no tocar la parte inferior del tapón con las manos.
- Retire las botellas de la campana, aplique y engarce los sellos de aluminio. Retire la pieza central de los sellos.
- Limpie la parte superior de las botellas con una toallita con alcohol y páselas a través de una llama de quemador Bunsen.
- Coloque una aguja estéril de 18 G en una jeringa sin émbolo con un filtro. Inserte primero esta liberación de gas en la botella.
- Coloque una aguja estéril de 18 G en la salida de gas del sistema e inserte también la aguja de salida de gas en la botella.
- Dirija las uniones en T desde los tanques a través del monitor de oxígeno. Verifique que la concentración de oxígeno objetivo fluya a través del sistema. Objetivo de aproximadamente 5 L/min de flujo de gas.
- Desvíe las uniones en T desde los tanques hasta la salida de gas. El gas comienza a fluir a través de la botella de suero.
PRECAUCIÓN: Preste mucha atención al manómetro durante el ahorro de oxígeno. Si la presión aumenta inesperadamente, apague el sistema inmediatamente. - Pase el sparge de oxígeno a través de la botella de suero durante 1 min. A 5 L/min, esto permite 10 intercambios de aire y asegura que la atmósfera interna alcance la presión parcial deseada.
- Retire la aguja de liberación de gas 18-G.
- Permita que la presión en la botella de suero se acumule a +1 atmósfera (2 atmósferas al nivel del mar) y luego retire inmediatamente la aguja de salida de gas.
NOTA: Mantener la presión ayuda a la retención de condiciones hiperóxicas a lo largo del tiempo. - Coloque el frasco de suero en un agitador de incubadora de 37 °C a 150 RPM. Incubar las muestras durante tres intervalos de 24 horas. En cada intervalo de 24 horas, tome una alícuota para el análisis aguas abajo, vuelva a sparge las muestras y devuélvalas a incubación durante un tiempo total de incubación de 72 h.
- Medición de oxígeno de salida
- Calibre el medidor de oxígeno al 21% de aire comprimido y luego apague el tanque.
- Dirija la ingesta del frasco sérico a través del monitor de oxígeno y coloque una aguja estéril hasta el final.
- Inserte la aguja a través del tapón de goma en el frasco de suero.
- Espere a que la lectura del flujo de salida se estabilice. Un caudal bajo de las botellas de suero significa que esto puede tardar hasta 2 minutos. Informe la diferencia máxima del aire de la habitación (número más alejado del 21%).
- Si realiza varias lecturas, enjuague el sistema con aire comprimido entre lecturas.
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Representative Results
Estos protocolos se aplicaron a 50 muestras de esputo expectorado de pwCF que se presentaron para atención de rutina a una clínica ambulatoria de fibrosis quística en el Hospital General de Massachusetts en Boston, Massachusetts. El esputo de cada paciente se cultivó bajo condiciones de oxígeno al 21%, 50% y 100% utilizando el medio de esputo artificial, con 0,5 ml de alícuotas tomadas de cada cultivo a las 24 h, 48 h y 72 h de tiempo de cultivo para la prueba. Las culturas fueron fotografiadas cuando se hicieron extracciones para rastrear los cambios visuales. Además, se tomó una alícuota de 0,5 ml de cada muestra primaria de esputo antes del cultivo. Esto resultó en 10 muestras discretas por paciente y un N final de 500 muestras. De estos, el esputo de 11 pacientes (11 sputa no cultivada, 11 sputa cultivada a partir de oxígeno al 21% a las 48 h de incubación) se sometió a extracción de ácido nucleico17,las bibliotecas de secuenciación se generaron utilizando un kit de preparación de biblioteca de ADN comercial y la secuenciación metagenómica se realizó en una plataforma de secuenciación del genoma completo dirigida a ~ 5 Gb de secuencia por muestra con 150 pares de bases, lecturas de extremo pareado. Las lecturas en bruto se procesaron utilizando el conjunto de herramientas bioBakery18,que incluye el control de calidad y la eliminación de secuencias de "contaminantes" humanos y el perfil taxonómico con el perfilador MetaPhlAn319. En el momento de la extracción de ácidos nucleicos, 10 millones de células de Imtechella halotolerans,una especie halotolerante que normalmente se encuentra en los ecosistemas de estuarios y no en las comunidades microbianas humanas, se dispararon en cada muestra, lo que permitió cuantificar la carga microbiana absoluta para cada muestra20.
La Figura 2 muestra las mediciones individuales y promedio de oxígeno de salida y los niveles de pH en el transcurso del proceso de cultivo para 50 muestras de esputo cultivadas bajo cada condición de oxígeno y un ejemplo de un fenotipo de cultivo diferencial visual. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C, excepto durante períodos breves en los que se realizó el sparging y la extracción de las alícuotas de la muestra. Con ambos intervalos de ahorro de 12 h y 24 h, se mantuvieron concentraciones elevadas de oxígeno, aunque se observó una caída en el tiempo para las tres condiciones de oxígeno, con un 100% de oxígeno cayendo a aproximadamente 85%, 50% de oxígeno cayendo a 40% y 21% de oxígeno cayendo a 18%. Las condiciones de oxígeno permanecieron distintas y, lo que es más importante, se mantuvieron concentraciones elevadas de oxígeno durante todo el proceso para las muestras hiperóxicas. Las mediciones de pH mostraron un mayor grado de variabilidad, pero se mantuvieron dentro de un rango fisiológicamente normal sin cambios estadísticamente significativos a lo largo del tiempo. Estas mediciones indican que estos métodos mantienen condiciones diferenciales discretas de oxígeno durante todo el proceso de cultivo. Por último, se muestra un ejemplo de uno de los muchos fenotipos de cultivo visual que se diferencian a través de la concentración de oxígeno. Esta muestra tuvo marcadas diferencias de turbidez después de 72 h de cultivo, con mayor oxígeno asociado a menor turbidez visual. Los fenotipos de cultivo diferencial apoyan la presencia de efectos inducidos por hiperoxia en las comunidades de cultivo.
La Figura 3 compara la carga microbiana, la diversidad microbiana y la composición de la comunidad microbiana entre el esputo no cultivado y el esputo cultivado (21% de condición de oxígeno durante un período de 48 h). Las mediciones revelan que la única diferencia importante introducida por el acto de cultivar es un aumento de aproximadamente 20 veces en la carga microbiana en comparación con el esputo no cultivado. El sistema inmunológico y los mecanismos mecánicos típicos de eliminación del esputo, como la tos, normalmente sirven como un proceso regulador que limita la carga microbiana en el pulmón, incluso en casos de disfunción e infección como los observados en pwCF. El cultivo ex vivo no tiene tales mecanismos reguladores, y las comunidades microbianas son libres de proceder hacia la saturación celular. Las métricas de diversidad alfa y beta indican que, a pesar de esta diferencia en la carga microbiana, la composición de la comunidad subyacente permanece bien conservada, con diferencias globales mínimas introducidas por el proceso de cultivo.
La Figura 4 amplía la comparación entre muestras de esputo no cultivadas y cultivadas, observando la presencia/ausencia binaria de las 120 especies microbianas identificadas de manera concluyente mediante la secuenciación de metagenómica de escopeta a partir de esputo cultivado y no cultivado obtenido de 11 pacientes. Los microbios se agrupan en función de las similitudes filogenéticas. 46 (38,3%) de estas especies se identificaron tanto en muestras no cultivadas como cultivadas (color cian), mientras que 35 (29,2%) se identificaron exclusivamente en muestras no cultivadas (amarillo) y 39 (32,5%) se identificaron exclusivamente en muestras cultivadas (azul). Es probable que haya una mayor paridad de la que identificamos utilizando la secuenciación en términos de lo que está presente y lo que está ausente, pero algunos taxones caen por debajo del umbral de detección de secuenciación en algunos casos. Las diferencias indican que el proceso de cultivo introduce cierto sesgo en el esputo cultivado en comparación con el no cultivado. En particular, el cultivo aumenta la presencia de hongos como Candida y Aspergillus,así como miembros de Enterobacterales como Escherichia, Serratiay miembros de Streptococcus. Por el contrario, los miembros de Bacteroidetes como Prevotella y Clostridiales, que son anaerobios, estaban presentes en muestras no cultivadas, pero no estaban presentes en muestras cultivadas. Esto puede atribuirse a la falta de una condición anaeróbica en nuestro modelo experimental.
La Figura 5 muestra curvas de crecimiento basadas en la absorbancia de patógenos pulmonares comunes de la FQ aislados del esputo obtenidos de 50 pwCF diferentes. Estos aislamientos representan fenotípicamente diferentes aislamientos clínicos obtenidos mediante procedimientos de cultivo de enriquecimiento del Laboratorio de Microbiología Clínica del Hospital General de Massachusetts, e incluyen Pseudomonas aeruginosa (N = 53), Staphylococcus aureus (N = 37), Stenotrophomonas maltophilia (N = 12), Klebsiella pneumoniae (N = 3) y Achromobacter sp (N = 7). Las curvas de crecimiento se obtuvieron cultivando cada aislado en medios de esputo artificial a 37 °C en la oscuridad, con LA MAPE sin inoculación bacteriana que sirve como control negativo. La calidad transparente de la MAPE (que se debe al filtro en lugar de a la esterilización por calor) permite realizar medidas ópticas para estimar las curvas de crecimiento. Se tomaron lecturas ópticas a 600 nm (OD600) cada 10 min, y se muestran las primeras 24 h de cada curva. La ausencia de cambios en las lecturas ópticas en el control negativo solo de MAPE indica cultivos libres de contaminación. Las curvas demostrativas que se muestran aquí siguen patrones típicos de curvas de crecimiento que indican la viabilidad de esta receta de MAPE como medio para la generación de curvas de crecimiento basadas en la absorbancia.
| Columna 1 | Columna 2 | Columna 3 | Columna 4 | Columna 5 | Columna 6 | Columna 7 | Columna 8 | Columna 9 | |
| Valor | Comstock | Kirchner | Sriramulu | Palmer | Flynn | Gallagher | Lai | Fuente | |
| Mucina | 2% p/v | 0,5% p/v | 0,5% p/v | - | 1% p/v | 2% p/v | 1% p/v | Flynn | |
| Cloruro de sodio | 85,5 millones de metros | 85,5 millones de metros | 85,5 millones de metros | 66,6 millones | 89,8 mM | 85,5 millones de metros | 152,3 metros | Lapierre | |
| Cloruro de potasio | 29,5 mM | 29,5 mM | 29,5 mM | 15,8 mM | - | 2,95 mM | 15,8 mM | Palmer | |
| Sulfato de magnesio | - | - | - | 0,6 mM | 1 mM | 1 mM | 0,61 mM | Palmer | |
| Sulfato de hierro | - | - | - | 0,0036 mM | - | - | - | - | |
| Cloruro de amonio | - | - | - | 2,3 mM | 60 metros | - | - | - | |
| Fosfato monopotásico | - | - | - | 2,5 mM | 60 metros | - | - | - | |
| Glucosa | - | - | - | 3,2 mM | 13 metros | 40 mM | 0,7 mM | Sambeek | |
| Lactato | - | - | - | 9 mM | - | - | - | - | |
| Aminoácidos esenciales | 14,45 veces | 0,25 g/L | 0,25 g/L | Por ácido | 0,5 veces | 0,375 veces | 1,29 veces | Palmer | |
| Aminoácidos no esenciales | 28,9 veces | 0,25 g/L | 0,25 g/L | Por ácido | 0,25 veces | 0,5 veces | 8,01x | Palmer | |
| Vitaminas | - | - | - | - | - | 1x | 1x | Gallagher | |
| Metales traza | - | - | - | - | 1x | 1x | 1x | Flynn | |
| Yema | 0.25% | 0.25% | 0.25% | - | - | 0.25% | 0.25% | Kirchner | |
| Ferritina | 0,0003 g/L | - | - | - | - | 0,0004 g/L | 0,0004 g/L | Gallagher | |
| ADN de esperma de salmón | 1,4 g/L | 4 g/L | 4 g/L | - | - | 1,4 g/L | - | - | |
| DPTA (en inglés) | - | - | 0,0059 g/L | - | - | - | - | - | |
| pH | - | 6.9 | - | 6.8 | - | - | 6.3 | Lapierre | |
| Almacenamiento | 0 | 4° | - | - | 4° | 4° | 4° | Kirchner | |
| Esterilización | Autoclave | Filtro | Autoclave | - | Autoclave | Autoclave | Filtro | Kirchner | |
Tabla 1: Receta de medio de esputo artificial derivada de la revisión de la literatura. (Columna 1) Reactivos y valores clave en la formulación de medio de esputo artificial. (Columnas 2-7) Comparación de recetas de la literatura existente8,9,10,12,14,15. (Columnas 8-9) Receta de medio de esputo artificial detallada en este protocolo y las fuentes correspondientes que informaron cada valor seleccionado10,11,12,13,14,15.
| Columna 1 | Columna 2 | Columna 3 |
| ESPUTO CF | ASM | |
| Aminoácidos totales | 10,25 mM | 10,76 mM |
| Alanina | 0,96 mM | 0,80 mM |
| Arginina | 0,17 mM | 0,94 mM |
| Asparagina | 0,91 mM | |
| Ácido aspártico | 0,45 mM | 0,80 mM |
| Cisteína | 0,09 metros | 0,33 mM |
| Ácido glutámico | 0,84 mM | 0,80 mM |
| Glicina | 0,65 mM | 0,80 mM |
| Histidina | 0,28 mM | 0,35 mM |
| Isoleucina | 0,60 mM | 0,52 mM |
| Leucina | 0,87 mM | 0,52 mM |
| Lisina | 1,15 mM | 0,64 mM |
| Metionina | 0,34 mM | 0,13 mM |
| Ornitina | 0,36 mM | |
| Fenilalanina | 0,29 mM | 0,26 mM |
| Prolina | 0,90 mM | 0,80 mM |
| Serina | 0,78 mM | 0,80 mM |
| Treonina | 0,58 mM | 0,52 mM |
| Triptófano | 0,07 mM | 0,06 mM |
| Tirosina | 0,43 mM | 0,26 mM |
| Valina | 0,60 mM | 0,52 mM |
Tabla 2: Concentraciones de aminoácidos previamente descritas en la receta de esputo de fibrosis quística y en medio de esputo artificial detallada en este protocolo. (Columna 1) Aminoácidos clave. (Columna 2) Concentraciones de aminoácidos de esputo de personas con fibrosis quística12. (Columna 3) Concentraciones de aminoácidos en medio de esputo artificial detalladas en este protocolo
Figura 1: Esquema de conexión de los componentes del sistema de esparchado de oxígeno. Diagrama de flujo de las conexiones entre los componentes del sistema utilizado para ahorrar botellas de suero a las concentraciones de oxígeno deseadas entre el 21% y el 100%. El sistema tiene 3 modos de uso determinados por la posición de las dos válvulas de unión en T. El sistema puede enrutar el gas desde los tanques a través de la salida de gas o a través del monitor de porcentaje de oxígeno, así como enrutar el gas de salida de las botellas de suero previamente dispersas a través del monitor para verificar la concentración después de que haya transcurrido el tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las concentraciones de oxígeno objetivo se mantienen aproximadamente con intervalos de ahorro de 12 h y 24 h, y el pH permanece en el rango fisiológico durante el cultivo. (A) Lecturas de oxígeno de salida de intervalos de ahorro de oxígeno de 12 h y 24 h durante un período de 72 h. (B) Lecturas de pH para muestras medidas cada 24 h. (C) Una imagen de ejemplo de muestra cultivada CFB010 después de 72 h, que muestra turbidez diferencial a través de las concentraciones de oxígeno. El color indica el porcentaje de oxígeno objetivo; las barras de error denotan intervalos de confianza del 95%. Los umbrales críticos se enfatizan con líneas discontinuas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:El cultivo aumenta la carga microbiana, pero se conserva la composición de la comunidad subyacente. Esputo no cultivado (amarillo) y esputo cultivado (azul) utilizando medio de esputo artificial al 21% de oxígeno durante 48 h. Las alícuotas se sometieron a extracción de ácido nucleico y secuenciación de metagenómica de escopeta para detectar posibles sesgos introducidos por las condiciones de cultivo. (A) Carga microbiana absoluta (determinada por controles de pico) y métricas de diversidad alfa. Utilizando modelos lineales de efectos mixtos, el esputo no cultivado frente al cultivado predijo la carga microbiana, pero no la diversidad alfa. (B) Ordenación de los dos primeros componentes de las métricas de diversidad beta, controlando la diferencia en la carga microbiana. No hay diferencias significativas en ninguna de las métricas después de PERMANOVA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La mayoría de los taxones identificados están presentes tanto en el esputo fuente como en el cultivo, mientras que otros solo aparecen en el esputo fuente o cultivo. Secuenciación de metagenómica de escopeta utilizada para comparar las diferencias en la composición de la comunidad microbiana entre muestras de esputo no cultivadas y cultivadas. Árbol filogenético de todas las especies microbianas identificadas en muestras secuenciadas (N = 120). Las especies marcadas con amarillo (N = 35, 29,2%) solo se observaron en muestras de esputo no cultivadas. Las especies marcadas con azul (N = 39, 32,5%) solo se observaron en muestras de cultivo de medio de esputo artificial. Las especies marcadas con cian (N = 46, 38,3%) se observaron tanto en muestras no cultivadas como cultivadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El medio de esputo artificial es lo suficientemente transparente como para ser utilizado como medio de curva de crecimiento para el cultivo de aislados clínicos. Se tomaron lecturas de densidad óptimas a 600 nm cada 10 min, y se muestran las primeras 24 h de cada curva. Las líneas grises representan lecturas individuales, y las líneas naranjas representan la absorbancia media para cada taxón. Esputo artificial medio en blanco incluido como control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, se desarrolló un modelo in vitro para estudiar el efecto de la hiperoxia en las comunidades microbianas pulmonares. Este modelo, basado en medio de esputo artificial y sparging diario de botellas de suero, mantiene concentraciones elevadas de oxígeno y apoya el crecimiento de microbios identificados en esputo de pwCF.
Hay varios pasos críticos de este enfoque. La primera es la elección de usar la esterilización por filtro en lugar de la esterilización por calor del medio de esputo artificial. La esterilización por filtro evita la desnaturalización de la mucina y otros componentes sensibles al calor del medio y produce un medio transparente que se puede utilizar para medidas ópticas del crecimiento microbiano. Si bien la esterilización por filtro se ha propuesto en otros protocolos10,hemos encontrado que la adición de agitación orbital durante el proceso de filtración fue esencial para evitar la obstrucción del filtro que de otro modo se produjo cuando se había filtrado una cantidad mínima del medio preparado. Mientras que el medio de esputo artificial filtrado puede tener una concentración final de mucina más baja de lo previsto debido a la impactación de mucina en el filtro, se ha demostrado que el esputo de pwCF tiene concentraciones de mucina más bajas que el esputo de personas sin fibrosis quística21. La concentración inicial de mucina del 1% utilizada en este protocolo es mayor que en otros enfoques que han utilizado la esterilización por filtro, con un grupo que utiliza una concentración inicial de mucina del 0,5%10,mientras que las recetas típicas utilizan concentraciones de mucina que van desde el 0,5% -2%(Tabla 1). Por lo tanto, incluso con una pérdida de mucina en el proceso de esterilización por filtro, es probable que el medio final preparado utilizando este protocolo tenga concentraciones de mucina dentro del rango fisiológico22.
El segundo es la composición del medio de esputo artificial. La receta para el medio de esputo artificial se eligió en base a los estudios fisiológicos existentes del esputo de pwCF(Tabla 1). Utilizando la secuenciación de metagenómica de escopeta, pudimos verificar que el esputo cultivado con este medio de esputo artificial recapitula ampliamente la composición de la comunidad microbiana del esputo no cultivado(Figura 3). En condiciones normóxicas, este medio también apoyó el crecimiento de 112 aislamientos clínicos diferentes que representan patógenos comunes aislados del esputo de pacientes con fibrosis quística. Por lo tanto, estos datos demuestran que esta formulación de medio de esputo artificial apoya el crecimiento de la microbiota de las vías respiratorias a partir de pwCF. Se omitió el ADN del esperma de salmón, una adición común a las recetasexistentes (Tabla 1). Una aplicación prevista de este modelo es la secuenciación metagenómica, y por lo tanto el ADN de los espermatozoides de salmón no se incluyó para reducir la adición de ácidos nucleicos no microbianos, ya que estas lecturas se filtrarían después de la secuenciación, disminuyendo así nuestra profundidad de secuenciación efectiva. Si bien el esputo de pwCF tiene altas concentraciones de ADN extracelular23,una proporción significativa de él es de origen microbiano24, y no está claro si la adición de ADN de esperma de salmón al medio de esputo artificial lo hace más fisiológico o si el enfoque de cultivo descrito en este protocolo conduce a altos niveles de ADN extracelular derivado de microbios; no distinguimos entre las concentraciones de ADN extra e intracelular en nuestros estudios. Es posible que los estudios futuros deseen verificar la concentración de ADN extracelular generado por este método de cultivo.
En tercer lugar, hasta donde sabemos, ningún estudio publicado sobre las comunidades microbianas pulmonares de fibrosis quística ha abordado las condiciones hiperóxicas. Este modelo utiliza equipos económicos y comúnmente disponibles de proveedores generales de laboratorio u hospital para construir un sistema de ahorro de oxígeno. Las consideraciones importantes para el mantenimiento de las condiciones hiperóxicas incluyen el volumen del medio de cultivo en relación con el espacio de cabeza disponible en las botellas de suero. En los intentos iniciales durante el desarrollo del protocolo, se utilizaron frascos de suero de 125 ml. Sin embargo, el uso de frascos de suero de 500 ml (lo que permite una relación de cultivo de 475 ml de espacio de cabeza a 25 ml) permitió el mantenimiento de la concentración deseada durante hasta 24 h, reduciendo así la frecuencia de ahorro de oxígeno. Este enfoque genera condiciones discretas de oxígeno, lo que permite el cultivo simultáneo de diferentes muestras de pacientes a través de múltiples condiciones de oxígeno. Otras herramientas del cultivo anaeróbico se pueden aprovechar para el cultivo hiperóxico, incluido el uso de frascos anaeróbicos o tubos de tipo Balch salpicados de oxígeno. Los análisis de las comunidades microbianas pulmonares utilizando la secuenciación metagenómica indican que la diversidad alfa y beta general es comparable entre el esputo cultivado y no cultivado. Al evaluar la abundancia diferencial a nivel de especie, se cultiva al 21% de oxígeno, enriquecido para el crecimiento de aerobios y anaerobios facultativos, incluyendo Enterobacterale, Streptococcus y hongos. Esto es probablemente debido a la exclusión de una condición anaeróbica que se ha observado en las vías respiratorias de pwCF25,26. Estudios futuros podrían considerar la inclusión de gas nitrógeno en este modelo para estudiar una variedad de condiciones anóxicas y óxicas y la correspondiente microbiota aeróbica y anaeróbica que se encuentra en las comunidades microbianas de las vías respiratorias.
Los principios clave descritos en estos protocolos pueden ser instructivos para la realización de estudios similares relacionados con la influencia del oxígeno en comunidades microbianas complejas o patógenos pulmonares comunes. El oxígeno es la terapia más común utilizada en el tratamiento de todas las enfermedades pulmonares avanzadas, y una mejor comprensión de cómo podría conducir a efectos imprevistos colaterales en las comunidades microbianas de las vías respiratorias y los patógenos respiratorios comunes será importante para el cuidado de la pwCF y otras enfermedades pulmonares crónicas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Parte de este trabajo se realizó en el Laboratorio de Biología Marina con el apoyo del Laboratorio de Biología Marina, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (número de subvención 5600373) y una donación de la Fundación Simons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
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