Medicine

嚢胞性線維症気道マイクロバイオームに対する酸素付加の効果を研究するモデルの設計と開発

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62888

Jacob Vieira¹, Tara Gallagher², Hui-Yu Sui¹, Sirus Jesudasen³, Katrine Whiteson², George A. O'Toole⁴, Kurt Hanselmann⁵, Peggy S. Lai¹

¹Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, ²Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, ³Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, ⁴Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, ⁵Swiss i-research and teaching institute

Summary

このプロトコルの目的は、嚢胞性線維症の気道微生物群集に対する高酸素の効果に対するモデルシステムを開発することです。人工喀痰培地は痰の組成をエミュレートし、高酸素培養条件は肺微生物群集に対する補足的な酸素の影響をモデル化する。

Abstract

気道微生物群集は、嚢胞性線維症(CF)および他の慢性肺疾患の進行に重要な役割を果たすと考えられている。微生物は、伝統的に酸素を使用または許容する能力に基づいて分類されてきました。補足酸素は嚢胞性線維症(pwCF)を持つ人々に投与される一般的な医療療法である;しかし、酸素と気道マイクロバイオームに関する既存の研究は、高酸素(高酸素)ではなく低酸素(低酸素)が主に好気性および栄養性嫌気性肺微生物群集に及ぼす影響に焦点を当てている。この重要な知識のギャップに対処するために、このプロトコルはpwCFからの痰の組成を模倣する人工痰媒体を使用して開発された。透明な媒体をもたらすフィルター殺菌の使用は、光学的方法が懸濁培養中の単細胞の微生物の成長に従うことを可能にする。高酸素状態を作り出すために、このモデルシステムは、高酸素状態を研究するために確立された嫌気性培養技術を利用する;酸素を除去する代わりに、酸素は、圧縮された酸素と空気の混合物と血清ボトルの毎日のスパージングによって培養物に追加されます。50 pwCFの痰は、このモデルが微分酸素状態を維持する能力を検証するために、72時間の間毎日のスペアリングを受けました。ショットガンメタゲノムシーケンシングは、嚢胞性線維症痰に一般的に見られる昏睡および病原性微生物の増殖をサポートするこの培地の能力を検証するために、11 pwCFの培養および未培養痰サンプルに対して行われた。成長曲線は、一般的な嚢胞性線維症病原体の増殖をサポートするこの人工痰培地の能力を検証するためにpwCFから得られた112の分離株から得られた。このモデルは、CF痰中の多種多様な病原体および分性を培養し、ノルモキシ状態下で未培養痰に非常に類似したコミュニティを回収し、様々な酸素条件下で異なる培養機種を作り出すことを発見した。この新しいアプローチは、気道微生物群集および一般的な呼吸器病原体にpwCFの酸素の使用によって誘発される予期せぬ影響のより良い理解につながる可能性があります。

Introduction

嚢胞性線維症(CF)は、肺から厚い粘液を取り除くことができないことを特徴とする遺伝性疾患であり、繰り返し感染し、肺移植または死亡の必要性を引き起こす進行性肺機能の低下につながる。嚢胞性線維症(pwCF)を有する人々の気道マイクロバイオームは、疾患活性¹を追跡するように見えるが、有害な長期的な結果^2、3に関連する微生物多様性の減少を伴う。pwCFの臨床研究では、補足的な酸素療法は、より高度な疾患^4、5と関連しているが、伝統的に、酸素療法の使用は、単に疾患の重症度^{のマーカーとして見られてきた6。}呼吸器不全患者の臨床試験の最近の研究では、患者の酸素レベルが高いほど、重篤な細菌感染の増加と死亡率^の上昇に逆説的に関連することが示されており、補足的な酸素が病原発に寄与する可能性があることが示唆されている。嚢胞性線維症肺マイクロバイオームおよび関連する肺および気道微生物群集に対する補足酸素の影響は十分に研究されていない。

多くの場合、機械学的研究は、未知の医学的利益または害の介入に関連する物流上の困難および潜在的な倫理的問題のために、人間の被験者に直接行うことができない。ヒトの生体標本をモデルシステムに統合するトランスレーショナルアプローチは、これらの場合に重要な生物学的洞察を提供することができる。酸素を使用または許容する能力は、伝統的に微生物分類の重要な構成要素であったが、環境への補足酸素の治療的導入が気道微生物群集をどのように摂動させるかについてはほとんど知られていない。pwCFの気道マイクロバイオームに対する補助酸素の未知の影響に光を当てるには、2つの大きな課題に取り組む必要がありました。まず、CF痰の組成を生理学的に近似する培養培地の作成。第二に、培養中の酸素濃度の上昇を長期間にわたって維持できるモデルシステムの作成である。

人工喀痰培地(ASM)は肺痰ex vivo^8,9,10をエミュレートするために広く使用されていますが^、特定のレシピに関する明確なコンセンサスはありません。このプロトコルは、pwCFから生理学的に近似的な痰に設計された人工痰培地のレシピと準備戦略を記述する。表 1に、公開された文献に基づいて選択したレシピ値の概要を示します。基礎化学成分およびpHは、ヒトCF痰^11、12、13の研究によって同定された値^に一致^した。低濃度の生理学的栄養素を、最終体積¹⁰の0.25%として含まれていた卵黄、ならびにビタミンおよび微量金属混合^14、15を用いて添加した。痰¹⁶の主要成分であるムチンは、1%w/v¹⁴に含まれていた。より労働集約的であるが、必須培地成分¹⁰の熱誘発性変性による潜在的な問題を低減するために、より従来の熱滅菌の実施よりもフィルタ滅菌が選択された。フィルター滅菌の追加の利点は、透明な媒体を生成することです(熱殺菌は、塩やタンパク質の沈殿と凝固に起因する濁った媒体を作成することができます)、この人工痰培地は、濁度の増加に基づいて微生物の成長に従うために使用することができます。

この高酸素培養モデルは、酸素を除去するのではなく、酸素を添加する嫌気性培養技術に基づいており、pwCFの酸素補充使用の効果を示すモデルを作成する。図1 と関連する酸素スペアリングプロトコルは、一般の実験室および病院のサプライヤーから低コストで得ることができる酸素スペアリングシステムの成分を概説しています。このシステムは21%から100%の酸素の範囲の固定された濃度に圧縮された酸素および空気の混合を可能にする。酸素センサーの統合は出力ガス混合物の集中の確認、ならびに酸素状態が所望の範囲内で維持されていることを確認するために前にスパージされた血清びんの流出ガスの組成を確認することを可能にする。

このプロトコルは、人工痰培地を作成する手順、酸素スペアリングシステムの構築と使用、および微分酸素条件下での培養CF痰への両方の適用を概説する。

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Protocol

この研究は、パートナー機関審査委員会(プロトコル#2018P002934)から承認を受けました。包含基準には、研究のための書面によるインフォームド・コンセントを提供した嚢胞性線維症の成人患者が含まれていた。除外基準はありませんでした。プロトコルガイドラインによると、すべての痰サンプルは、臨床提供者との予定外来訪問中に嚢胞性線維症患者から採取された。

1. 人工痰培地製剤

注:ここに記載されている数量は、最終的な人工痰培地の1 Lの生産のためのものであり、 材料表に記載されている特定の試薬を想定しています。同じ最終製品を確保するために、他のボリュームや異なる試薬の使用に対して、数値を調整する必要があります。目標濃度については表1 を参照してください。

人工喀痰化学ミックス(ASCM)
注: ASCM は、最終メディアボリュームの 25% を占めます。それは棚安定性があり、バルクまたは事前に準備することができます。後で使用する場合は、化学ミックスをオートクレーブし、安全に室温で保存してください。
1. 構成化学ストックソリューションを混合します。
  1. 1 M NaClストックを準備する:無菌水のリットル当たりNaClの58.44 gを追加します。
  2. 1 M KCl ストックを準備する: 滅菌水のリットル当たり KCl の 74.55 g を追加します。
  3. 1 M MgSO₄ストックを準備する:無菌水1リットル当たりMgSO 4·7H2Oの246.47g、または無水MgSO4 1リットル当たり120.37gの無水MgSO4を加える。
  4. 1 Mグルコースストックを準備する:滅菌水のリットル当たり180.16グラムのグルコースを追加します。
2. オートクレーブは、化学ストック溶液だけでなく、空の250 mLボトルを滅菌します。オートクレーブ処理の手順を、少なくとも標準値の 121 °C、15 PSI を 30 分間実行します。
3. 空の250 mLボトルに80.59mLの無菌水を加えます。
4. ミックスに1 M NaClストックの152.30 mLを追加します。
5. ミックスに1 M KClストックの15.8 mLを追加します。
6. ミックスに1 M MgSO₄ ストックの610 μLを加えます。
7. ミックスに1 Mグルコースストックの700 μLを加えます。
人工喀痰ムチンミックス(ASMM)
注: ASMM は、最終メディアボリュームの 50% を占めます。最終メディアバッチと同じ日に準備されていることを確認します。
1. 450 mLの無菌水を空の1Lボトルに加えます。
2. 50 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をボトルに加えます。
3. 使い捨ての磁気攪拌棒をボトルに加えます。
4. PBSと攪拌棒を含むボトルをオートクレーブします。
5. 10gのムチン粉末を測定し、PBSに加えます。
6. ボトルを激しく振って予備混合します。
7. ボトルを磁気スターラーでホットプレートに置きます。熱を中高ターゲティング50°Cに設定し、攪拌速度を1100rpmに設定します。棒が磁石から飛び降りないように徐々に速度を上げろ。
  1. 熱を加え、15分間かき混ぜます。
  2. 耐熱手袋でボトルを拾います。ムチン粉末が溶液から落ち着くかどうかを確認するために観察します。
  3. ムチン粉末が完全に溶解していない場合は、ボトルを加熱/攪拌機に5分間戻して、完全に溶解するまで加熱します。
8. ムチンミックスを室温まで冷却します。
人工喀痰生物混合(ASBM)
注: ASBM は、最終メディアボリュームの 25% です。最終培地バッチと同じ日にそれを準備し、他のミックスとは異なり、任意の熱にその成分を公開しないでください。
1. 4°C冷蔵庫または氷の上で100xビタミンストックを解凍します。
  注:凍結/解凍サイクルの数を最小限に抑えるために、ビタミンストックを10 mLアリコートに事前に分割します。
2. 空のオートクレーブ250 mLボトルに124.24mLの無菌水を加えます。
3. ミックスに50x必須アミノ酸ストックの25.76 mLを追加します。
4. 80.14 mLの100x非必須アミノ酸ストックをミックスに加えます。
5. ミックスに10mL(解凍)100倍のビタミンストックを加えます。
6. 1000xの微量金属ストックの1mLをミックスに加えます。
7. ミックスに30%卵黄エマルジョンの8.33 mLを追加します。
8. ミックスに10 g/Lフェリチンストックの400 μLを加えます。
9. 手動振盪を介して溶液をよく混ぜます。
人工痰培地(ASM)
1. ASCMを含む1Lボトルに250mLのASCMを加えます。
2. 中型ボトルに250mLのASBMを加えます。
3. 塩基性MOPSバッファー(1M)で媒体をタントレートし、狭い範囲のpH紙で6.3のpHに到達します。滴定する前に、培地ミックスは酸性になりすぎます。
4. 得られた人工喀痰培地を濾過の準備ができるまで4°Cで冷蔵します。
5. 濾過プロセスを開始するには、200 mLの未濾過人工痰媒体を、0.22 μmの細孔サイズフィルターを備えた真空ろ過システムに移します。
6. ろ過システムを真空ポンプに接続し、真空ポンプをオンにして70mbarに設定し、チャンバーを4°Cの冷蔵室で90rpmで揺れる軌道シェーカーに置きます。
  1. かなりの量がフィルタリングされるように、培地の追加の150 mLでトップオフ。1 L の培地を完全にフィルタするには 1~2 日かかります。
  2. すべてのメディアがフィルタリングされるまで、追加のチャンバーで繰り返します。
    メモ:Mucinは時間をかけてフィルタを差し込むので、同じ0.22 μmフィルタを介して350 mL以上の媒体をフィルタリングしないようにしてください。
7. 4°Cで人工痰培地を冷蔵して使用できる状態にします。最適な結果を得るには、準備から 1 か月以内に ASM を使用してください。

2. 酸素スパージング

スパージングステーションのセットアップ
注: このプロトコルは、一度だけ完全に行う必要があり、その後、セットアップは、必要に応じて簡単なメンテナンスで維持することができます。酸素スペアリングシステムの視覚的な概略図については 、図1 を参照してください。
1. 圧縮空気と酸素タンクを入手し、適切に固定します。
  注意:高圧は、誤って取り扱われたときにタンクを非常に危険にします。タンクが完全に密閉され、固定され、タンクが閉じられたときに漏れが発生しないようにし、すべての取り扱い担当者がその使用に関する訓練を受けていることを確認します。
2. 空気レギュレータをレンチ付きの圧縮空気タンクに取り付けます。レギュレータの最適なフロー読み取りのために、レギュレータをできるだけ直立位置に近づけます。
3. 圧縮酸素タンクに酸素レギュレータを取り付け、できるだけ直立位置に取り付けます。酸素タンクによっては、締め付ける方向を反転する必要があります。
4. レギュレータから Y コネクタにチューブを接続し、2 つのタンクからのガス流を結合します。
5. Y コネクタの出力を中央 T-ジャンクションバルブに接続します。
6. 中央T-接合弁の片側をガス圧力計に接続します。
7. ガス圧力計の反対側を直径25mmの無菌シリンジフィルターに0.22 μmの細孔サイズで接続します。
8. 2番目の直径25mmのシリンジフィルターを、スパージング時にガス放出として使用するプランジャーなしでシリンジに取り付けます。
9. 中央T接合バルブの最終側を、酸素モニタ用の第2のTジャンクションバルブに接続します。
10. 直径25mmのシリンジフィルターをこの2番目のT接合バルブの片側に接続し、チューブとともに18Gの針を取り付けます。
11. 第2T接合弁の最終側を酸素監視装置に接続します。
12. 遮断チューブを、監視中のガス放出として使用する酸素監視装置の反対側に接続します。
  注意: 酸素スペアリングシステムをテスト/使用する場合は、T-接合部の位置を注意深くメモし、システムを通る意図したパスと一致することを確認してください。そうしないと、システム内部に圧力が高まり、コンポーネントが故障してばらばらになります。
13. システムのメンテナンスと最適なパフォーマンスでの動作を維持するために、次のプラクティスが有益です。
  1. 自由な量のTeflonテープとの接続を強化して、シールを大幅に改善し、内部圧力から離れてコンポーネントが来る可能性を減らします。
  2. 最大圧力を軽減し、故障を防ぐために、結合された流量を10 L/min以下に保ちます。
  3. 漏れが疑われる場合は、市販の液体漏出検知器などの洗剤溶液を使用して、ガス漏れの上に泡立つため、その位置を容易に特定します。ポリテトラフルオロエチレンテープ(例えば、テフロン)を用いたパッチ漏れ。
  4. 直径25mmのシリンジフィルターを酸素スペアリングシステムで隔週で交換しますが、これは使用頻度によって異なります。時間が経つにつれて、フィルターに巻き込まれた粒子は、ガスの流量を減少させ、圧力の蓄積を引き起こします。
  5. 測定を行う前に酸素モニターを21%の酸素圧縮空気に較正してください。
  6. システムの使用が完了したら、タンクをオフにし、流れが完全に停止するまでレギュレータから余分なガスを出血させます。
血清ボトル培養スパージング
1. サンプル識別子、接種日時、および目標酸素率を持つ500 mLオートクレーブ血清ボトルをラベル付けします。
2. 生物学的フードに、セットアップされている各血清瓶に人工痰培地の24 mLを加えます。
3. 各血清瓶に18-G針で均質化した患者の痰1mL(必要に応じて滅菌生理食塩水で希釈して、各培養条件に十分な量のサンプルを得る)を加える。
4. 滅菌ピンセットを使用して、各血清瓶の上部にオートクレーブゴムストッパーを置きます。
5. ゴム製ストッパーを押し下げ、ストッパーの下側に手で触れないように注意してください。
6. ボンネットからボトルを取り出し、アルミニウムシールを塗布し、圧着します。シールから中心部分を取り外します。
7. アルコール拭きでボトルの上部を拭き取り、ブンゼンバーナーの炎を通します。
8. 無菌18-G針をフィルターでプランジャーレス注射器に貼り付けます。最初にこのガス放出をボトルに挿入します。
9. システムから出力されるガスに無菌18-G針を貼り付け、ガス出力針をボトルにも挿入します。
10. タンクからTジャンクションを酸素モニターを通してルーティングします。目標酸素濃度がシステムを通って流れているか確認します。約5 L/分のガス流量を目標とする。
11. タンクからガス出力まで T ジャンクションを再ルーティングします。ガスは血清瓶を通って流れ始める。
  注意:酸素スペアリング中の圧力計に細心の注意を払ってください。圧力が予想外に高まった場合は、すぐにシステムをシャットダウンします。
12. 血清瓶を通して酸素スパージを1分間走ら。5 L/minで、これは10の空気交換を可能にし、内部大気が所望の分圧に達することを保障する。
13. ガス放出18-G針を取り外します。
14. 血清瓶の圧力を+1雰囲気(海面で2気圧)に構築し、すぐにガス出力針を取り除きます。
  注:圧力を維持することは、時間の経過とともに高酸素状態の保持を助けます。
15. 血清瓶を150RPMで37°Cインキュベーターシェーカーに入れます。3つの24時間間隔のサンプルをインキュベートします。各24時間間隔で、下流分析のためのアリコートを取り、サンプルを再スパージし、72時間の全インキュベーション時間のためにインキュベーションに戻します。
流出酸素測定
1. 酸素メーターを21%圧縮空気にキャリブレーションし、タンクの電源を切ります。
2. 酸素モニターを通して血清瓶の摂取量を回し、最後まで滅菌針を貼り付けます。
3. ゴム栓を通して針を血清瓶に入れます。
4. 流出読み取りが安定するまで待ちます。血清ボトルの流量が低いと、最大2分かかる可能性があります。室内空気とのピーク差(21%から最も遠い数)を報告する。
5. 複数の読み取りを実行する場合は、読み取り値の間に圧縮空気でシステムをフラッシュします。

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Representative Results

これらのプロトコルは、マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ総合病院の外来嚢胞性線維症クリニックに定期的なケアのために提示するpwCFから50の期待痰サンプルに適用されました。各患者の痰は、人工痰培地を用いて21%、50%、および100%の酸素条件下で培養され、各培養から0.5mLのアリコートを24時間、48時間、および72時間の培養時間で試験用に採取した。文化は、視覚的な変化を追跡するために抽出されたときに撮影されました。さらに、培養前に各々の一次痰試料の0.5mLのアリコートを採取した。その結果、患者1人あたり10個の離散サンプルと500サンプルの最終Nが得られた。このうち、11人の患者の痰(11人の未培養痰、48時間のインキュベーションで21%の酸素から11の培養スプータ)が核酸抽出¹⁷を受け、シーケンシングライブラリを市販のDNAライブラリ調製キットを用いて生成し、メタゲノムシーケンシングプラットフォーム全体で行ったペアエンド読み取り。生の読み取りは、MetaPhlAn3プロファイラ¹⁹を使用して、人間の「汚染物質」配列と分類プロファイリングの品質管理と除去を含むツール¹⁸のbioBakeryスイートを使用して処理されました。核酸抽出の時点で、1000万個の細胞である インテケラハロレランスは、通常は河口生態系に見られるハロラント種であり、ヒト微生物群集にはないが、各サンプルにスパイクされ、各サンプル²⁰に対する絶対微生物負荷の定量を可能にした。

図2は、各酸素条件下で培養された50個の痰サンプルに対する培養過程における個々および平均流出酸素測定値およびpHレベルおよび視覚微分培養表現型の例を示す。培養物は、サンプルアリコートのスパージングおよび除去が行われた短期間を除いて、37°Cで維持した。12時間と24時間の両方のスパージング間隔で、酸素濃度の上昇は維持され、3つの酸素条件すべてで時間の経過とともに低下が見られ、100%の酸素が約85%、50%の酸素が40%に低下し、21%の酸素が18%に低下しました。酸素状態は明確なままであり、重要なことに、高酸素サンプルのプロセス全体を通して酸素濃度の上昇が維持された。pH測定は変動の度合いが大きいが、経時的に統計的に有意な変化を伴う生理学的正常範囲内にとどまった。これらの測定は、これらの方法が培養プロセス全体を通して離散的な微分酸素条件を維持することを示している。最後に、酸素濃度を越えて分化した多くの視覚培養表現型の一つの例が示される。このサンプルは、培養の72時間後に濁度の差を示し、より低い視覚濁度に関連する高い酸素を有していた。微分培養型は、培養群に対する過酸刺激性の影響の存在を支持する。

図3は、未培養痰と培養痰(48時間の酸素状態21%)の間の微生物負荷、微生物多様性、および微生物群集組を比較した。測定は、培養の作用によってもたらされる唯一の大きな違いを、未培養の痰と比較して、微生物負荷の約20倍の増加であることが明らかになる。免疫系や咳などの典型的な機械的痰クリアランス機構は、通常、pwCFのような機能不全や感染の場合でも、肺の微生物負荷を制限する調節プロセスとして機能します。 Ex vivo 培養にはこのような調節機構がなく、微生物群集は細胞飽和に向かって自由に進むことができます。アルファおよびベータ多様性メトリックは、微生物負荷のこの差にもかかわらず、基礎となるコミュニティ組成が十分に保存されたままであり、培養プロセスによって導入される世界的な差が最小限であることを示している。

図4は、培養されていない痰サンプルと培養痰サンプルの比較を拡大し、11人の患者から得られた培養および未培養痰から培養された培養および未培養痰からシーケンシングされた散弾銃メタゲノミクスによって決定的に同定された120種の微生物種のバイナリ存在/存在を見ている。微生物は系統的類似性に基づいてクラスター化される。これらの種の46(38.3%)は、未培養サンプルと培養サンプル(シアン色)の両方で同定され、35(29.2%)は培養されていないサンプル(黄色)で独占的に同定され、39(32.5%)は培養サンプル(青色)で独占的に同定された。何が存在し、何が存在するかの観点から、シーケンスを使用して識別したものよりも大きなパリティがある可能性がありますが、場合によっては、一部の分類はシーケンシング検出のしきい値を下回ります。違いは、培養プロセスが培養されていない痰と比較して培養にいくらかの偏りを導入することを示している。最も顕著なのは、カンジダやアスペルギルスなどの真菌、エシェリヒア、セラチア、ストレプトコッカスのメンバーを含むエンテバクテラレスのメンバーの存在を増加させる。逆に、嫌気性であるプレボテラやクロストリジアルなどのバクテロイデス会員は、培養されていないサンプルには存在していたが、培養サンプルには存在しなかった。これは、我々の実験モデルにおける嫌気性状態の欠如に起因する可能性がある。

図5は、50種類のpwCFから得られた痰から単離された一般的なCF肺病原体の吸光度ベースの成長曲線を示す。これらの分離株は、マサチューセッツ総合病院臨床微生物学研究所の濃縮培養手順を用いて得られた異形性臨床分離株を表し、 シュードモナス緑膿菌 (N=53)、 黄色ブドウ球菌 (N=37)、 ステノトロホモナスマルトフィリア (N=12)、 クレブシエラ肺炎 (N=3)、 およびスプラクターを 含む (N = 7)。成長曲線は、暗闇の中で37°Cの人工痰培地で各単離物を培養することによって得られ、ASMサン菌の菌接種は陰性対照となる。ASMの透明な品質(熱滅菌ではなくフィルターによるもの)は、成長曲線を推定する光学的な測定を行うことを可能にする。600 nm(OD600)での光学測定値を10分ごとに撮影し、各曲線の最初の24時間を示した。ASMのみの否定的な制御の光学的測定値の変化の不在は汚染のない培養を示す。ここに示す実証曲線は、吸光度ベースの成長曲線生成のための媒体としてこのASMレシピの生存可能性を示す典型的な成長曲線パターンに従う。

列 1	列 2	列 3	列 4	列 5	列 6	列 7	列 8	列 9
価値	コムストック	キルヒナー	スリラムル	パーマー	フリン	ギャラガー	ライ	源
ムチン	2% w/v	0.5% w/v	0.5% w/v	-	1% w/v	2% w/v	1% w/v	フリン
塩化ナトリウム	85.5 mM	85.5 mM	85.5 mM	66.6 mM	89.8 mM	85.5 mM	152.3 mM	ラピエール
塩化カリウム	29.5 mM	29.5 mM	29.5 mM	15.8 mM	-	2.95 mM	15.8 mM	パーマー
硫酸マグネシウム	-	-	-	0.6 mM	1 mM	1 mM	0.61 mM	パーマー
硫酸鉄	-	-	-	0.0036 mM	-	-	-	-
塩化アンモニウム	-	-	-	2.3 mM	60mM	-	-	-
リン酸モノカリウム	-	-	-	2.5 mM	60mM	-	-	-
グルコース	-	-	-	3.2 mM	13mM	40mM	0.7 mM	サンビーク
乳酸	-	-	-	9 mM	-	-	-	-
必須アミノ酸	14.45x	0.25 g/L	0.25 g/L	酸当	0.5x	0.375x	1.29x	パーマー
非必須アミノ酸	28.9x	0.25 g/L	0.25 g/L	酸当	0.25x	0.5x	8.01x	パーマー
ビタミン	-	-	-	-	-	1x	1x	ギャラガー
微量金属	-	-	-	-	1x	1x	1x	フリン
卵黄	0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	キルヒナー
フェリチン	0.0003 g/L	-	-	-	-	0.0004 g/L	0.0004 g/L	ギャラガー
サケ精子DNA	1.4 g/L	4 g/L	4 g/L	-	-	1.4 g/L	-	-
DPTA	-	-	0.0059 g/L	-	-	-	-	-
pH	-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	ラピエール
貯蔵	0	4°	-	-	4°	4°	4°	キルヒナー
殺菌	オートクレーブ	フィルター	オートクレーブ	-	オートクレーブ	オートクレーブ	フィルター	キルヒナー

表1:文献のレビューから得られた人工痰培地レシピ。(1 列目 )人工痰培地の製剤における試薬およびキー値。(列 2-7)現存する文献^{8、9、10、12、14、15}からのレシピの比較。(列 8-9)このプロトコルで詳述された人工痰培地のレシピと、選択した各値^{10、11、12、13、14、15}を知らせた対応するソース。

列 1	列 2	列 3
	CFスプトゥム	ASM
総アミノ酸	10.25 mM	10.76 mM
アラニン	0.96 mM	0.80 mM
アルギニン	0.17 mM	0.94 mM
アスパラギン		0.91 mM
アスパラギン酸	0.45 mM	0.80 mM
システイン	0.09 mM	0.33 mM
グルタミン酸	0.84 mM	0.80 mM
グリシン	0.65 mM	0.80 mM
ヒスチジン	0.28 mM	0.35 mM
イソロイシン	0.60 mM	0.52 mM
ロイシン	0.87 mM	0.52 mM
リジン	1.15 mM	0.64 mM
メチオニン	0.34 mM	0.13 mM
オルニチン	0.36 mM
フェニルアラニン	0.29 mM	0.26 mM
プロリン	0.90 mM	0.80 mM
セリン	0.78 mM	0.80 mM
トレオニン	0.58 mM	0.52 mM
トリプトファン	0.07 mM	0.06 mM
チロシン	0.43 mM	0.26 mM
バリン	0.60 mM	0.52 mM

表2:嚢胞性線維症痰および人工痰培地レシピにおいて以前に記載されたアミノ酸濃度は、このプロトコルで詳述した。 (1 列目 )キーアミノ酸.(2 桁目)嚢胞性線維症患者からの痰のアミノ酸濃度¹².(3 列目 )このプロトコルで詳述された人工痰培地中のアミノ酸濃度

図1:酸素スパージングシステムコンポーネントの接続概略図血清ボトルを望ましい酸素濃度にスパージするために使用されるシステムのコンポーネント間の接続のフロー図は、21%と100%の間で。システムには、2つのT接合バルブの位置によって決定される3つの使用モードがあります。システムは、タンクからガス出力または酸素パーセンテージモニタを介してガスをルーティングし、時間が経過した後に濃度を確認するために、以前にスパージされた血清ボトルからの流出ガスをモニターを通してルーティングすることができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:標的酸素濃度は、およそ12時間と24時間のスペアリング間隔で維持され、pHは培養中に生理学的範囲内に残る。(A)72-時間の期間にわたって12時間と24時間の酸素スパージング間隔からの流出酸素測定値。(B)24時間毎に測定したサンプルのpH測定値(C)72時間後に培養サンプルCFB010の画像の例を示し、酸素濃度全体にわたって差動濁度を示す。色は目標酸素率を示します。誤差範囲は 95% 信頼区間を表します。クリティカルしきい値は破線で強調されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:培養は微生物の負荷を増加させるが、基礎となるコミュニティ組成は保存される。 未培養の喀痰(黄色)及び培養痰(青色)を人工喀痰培地を用いて21%酸素で48時間。アリコートは、培養条件から導入される可能性のあるバイアスを検出するために核酸抽出および散弾銃メタゲノミクスシーケンシングを行った。(A)絶対微生物負荷(スパイクインコントロールによって決定される)とアルファ多様性メトリック。線形混合効果モデルを使用して、培養されていないと培養された痰は微生物負荷を予測したが、アルファ多様性は予測しなかった。(B)ベータ多様性指標の最初の2つの成分のオーディネーション、微生物負荷の差を制御する。ペルマノバ後のどちらのメトリックにも有意な差はありません。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4: 同定された分類器の大部分は、ソースの痰と文化の両方に存在し、他のものはソースの痰または文化にのみ現れる。未培養および培養痰サンプル間の微生物群集組の違いを比較するために使用される散弾銃メタゲノミクスシーケンシング。配列配列サンプル中で同定されたすべての微生物種の系統樹(N=120)。黄色でマークされた種(N = 35、29.2%)は、未培養の痰サンプルでのみ見られました。青色でマークされた種(N = 39,32.5%)は、人工痰培地培養サンプルでのみ見られた。シアン(N =46、38.3%)でマークされた種は、未培養および培養サンプルの両方で見られた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:人工痰培地は、臨床分離株を培養するための成長曲線媒体として使用するのに十分に透明である。 600 nmでの最適な密度測定値を10分ごとに採取し、各曲線の最初の24時間を示した。灰色の線は個々の読み取り値を表し、オレンジ色の線は各分類の平均吸光度を表します。人工喀痰培地ブランクは、コントロールとして含まれる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

本研究では、肺微生物群集に対する高酸素の影響を研究するために 、in vitro モデルが開発された。このモデルは、人工喀痰媒質および血清瓶の毎日のスパージングに基づいて、上昇した酸素濃度を維持し、pwCFから痰で同定された微生物の成長をサポートする。

このアプローチには、いくつかの重要なステップがあります。まず、人工痰培地の熱殺菌ではなく、フィルター滅菌を使用する選択である。フィルター滅菌は、培地のムチンおよび他の熱感受性成分の変性を防止し、微生物の成長の光学的測定に使用できる透明な媒体を生み出す。フィルター滅菌は他のプロトコル¹⁰でも提案されているが、濾過プロセス中の軌道揺れの添加は、調製された培地の最小量が濾過されたときに発生するフィルタの目詰まりを防ぐために不可欠であることがわかった。濾過された人工痰培地は、フィルタ中のムチンの衝撃による意図より低い最終ムチン濃度を有し得るが、pwCFからの痰は嚢胞性線維症²¹を有さない人々からの痰よりも低いムチン濃度を有することが示されている。このプロトコルで使用される1%の開始ムチン濃度は、フィルタ滅菌を使用した他のアプローチよりも高く、1つのグループが0.5%^の開始ムチン濃度を使用し、一般的なレシピは0.5%〜2%の範囲のムチン濃度を使用する(表1)。したがって、フィルター滅菌処理でムチンの損失を伴っても、このプロトコルを用いて調製した最終培地は、生理学的範囲²²内にムチン濃度を有する可能性が高い。

第2は人工痰培地の組成である。人工喀痰培地のレシピはpwCF(表1)から喀痰の既存の生理学的研究に基づいて選択された。散弾銃メタゲノミクスシーケンシングを用いて、この人工痰培地で培養された痰が未培養痰の微生物群集組を広く再現することを検証することができた(図3)。ノルモキシ性の状態では、この培地はまた、嚢胞性線維症患者の痰から単離された一般的な病原体を表す112の異なる臨床分離株の成長を支持した。したがって、これらのデータは、人工痰培地のこの製剤がpwCFからの気道微生物叢の成長を支えていることを示している。サケ精子DNAは、既存のレシピ(表1)に一般的な添加物を省略した。このモデルの意図されたアプリケーションの1つはメタゲノミクスシーケンシングであり、したがって、これらの読み取りがシーケンシング後にフィルタリングされるため、サケ精子DNAは非微生物核酸の添加を減らすために含まれず、したがって、私たちの効果的なシーケンシング深さを減少させる。pwCFの痰は細胞外^DNA23の濃度が高いが、そのかなりの割合は起源²⁴の微生物であり、人工痰培地にサケ精子DNAを添加することがより生理的なものになるのか、このプロトコルに記載された培養アプローチが微生物由来の細胞外DNAの高レベルにつながるのかは不明である。我々の研究では、細胞内DNA濃度と細胞内DNA濃度を区別しなかった。今後の研究では、この培養方法によって生じる細胞外DNAの濃度を検証することを望むかもしれません。

第三に、私たちの知る限りでは、嚢胞性線維症肺微生物群集に関する公表された研究は、高酸素状態に対処していない。このモデルは酸素のスペアリングシステムを造るために一般実験室か病院の供給者からの安価で一般的に利用できる装置を使用する。高酸素状態の維持に関する重要な考慮事項は、血清ボトル内の利用可能なヘッドスペースに対する培養培地の体積を含む。プロトコル開発中の最初の試みでは、125 mL血清ボトルが使用されました。しかし、500 mL血清ボトル(25 mL培養比に475 mLのヘッドスペースを可能にする)を使用することで、24時間までの所望濃度の維持が可能となり、酸素スペアリングの頻度が低下しました。このアプローチは、離散的な酸素条件を生成し、複数の酸素条件にわたって異なる患者サンプルの同時培養を可能にする。嫌気性培養の他のツールは、酸素を噴き出した嫌気性瓶やバルチ型チューブの使用を含む高酸素培養に活用することができます。メタゲノミクスシーケンシングを用いた肺微生物群集の分析は、全体的なアルファおよびベータの多様性が培養された痰と未培養痰の間で比較可能であることを示している。種レベルでの微分量を評価する場合、21%の酸素で培養し、エンテババクテラレ、ストレプトコッカス、真菌を含むエアロベおよび気性嫌気性の成長のために濃縮した。これは、pwCF^{25, 26}の気道で観察された嫌気性状態の排除に起因する可能性が^高い。今後の研究では、このモデルに窒素ガスを含めることで、気道微生物群集に見られる無酸素および酸化性条件の範囲と対応する有酸素および嫌気性微生物叢を研究することを検討することができる。

これらのプロトコルで概説されている主要な原則は、複雑な微生物群集または一般的な肺病原体に対する酸素の影響に関連する同様の研究の実施に有益である可能性がある。酸素は、すべての進行した肺疾患の治療に使用される最も一般的な治療法であり、それが気道微生物群集および一般的な呼吸器病原体に対する担保的な予期せぬ影響につながる可能性についてのより良い理解は、pwCFおよび他の慢性肺疾患のケアにとって重要である。

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Disclosures

著者らは開示する利益相反はない。

Acknowledgments

この作業の一部は、海洋生物学研究所、DOE(DE-SC0016127)、NSF(MCB1822263)、HHMI(助成金番号5600373)、サイモンズ財団からの贈り物の支援を受けて海洋生物学研究所で行われました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BME Vitamins (100x) Solution	MilliporeSigma	B6891	Concentrated solution of supplemental vitamins.
Crimper, 30 mm	DWK Life Sciences	224307	Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021	Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).
Diaphragm Pump ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Vacuum pump for vacuum filtration.
Egg Yolk Emulsion	HiMedia	FD045	Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.
Ferritin, Cationized from Horse Spleen	MilliporeSigma	F7879	Ferritin (iron-storage protein) solution.
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner	Integra Biosciences	144000	Bunsen burner with user interface and safety features.
Hydrion pH Paper (1.0–14.0)	Micro Essential Laboratory	94	pH testing paper for the range of 1.0–14.0.
Hydrion pH Paper (4.0–9.0)	Micro Essential Laboratory	55	pH testing paper for the range of 4.0–9.0.
Hydrion pH Paper (6.0–8.0)	Micro Essential Laboratory	345	pH testing paper for the range of 6.0–8.0.
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G	Smiths Medical	401815	18 G needles with safety caps.
In-Line Pressure Gauge	MilliporeSigma	20469	Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.
Innova 42 Incubated Shaker	Eppendorf	2231000756	Combination incubator/orbital shaker.
Luer-Lok Syringe with Attached Needle	Becton Dickinson	309580	Combination 3 mL syringe and 18 G needle.
Luer Valve Assortment	World Precision Instruments	14011	Valves for gas flow tubing.
LSE Orbital Shaker	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Orbital shaker to agitate media during filtration.
Magnesium Sulfate Heptahydrate	MilliporeSigma	M2773	Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-346-15FM	Air flow rate regulator with 15 L/min meter.
MEM Amino Acids (50x) Solution	MilliporeSigma	M5550	Concentrated solution of essential amino acids.
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution	MilliporeSigma	M7145	Concentrated solution of non-essential amino acids.
Millex-GP Filter, 0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q sterile water filtration system.
MiniOX 3000 Oxygen Monitor	MSA	814365	Gas flow oxygen percentage monitor.
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)	Boston BioProducts	BBM-90	MOPS buffer for adjusting media pH.
Mucin from Porcine Stomach	MilliporeSigma	M2378	Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit	Harvard Apparatus	72-1413	Connectors for gas flow tubing.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096	Library preparation for identification during sequencing.
NovaSeq 6000 Sequencing System	Illumina	770-2016-025-N	Shotgun sequencing platform for generating sample reads.
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-540-15FM	Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors	SunMed	2001-01	Tubing for connecting gas system components.
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Concentrated phosphate-buffered saline solution.
PC 420 Hot Plate/Stirrer	Marshall Scientific	CO-PC420	Combination hot plate/stirrer.
Potassium Chloride	MilliporeSigma	P9541	Solid potassium chloride salt.
PTFE Disposable Stir Bars	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Disposable magnetic stir bars.
PTFE Thread Seal Teflon Tape	VWR	470042-938	Teflon tape for reinforcing gas system connections.
Q-Gard 2 Purification Cartridge	MilliporeSigma	QGARD00D2	Purification cartridge for Milli-Q system.
Reusable Media Storage Bottles	ThermoFisher Scientific	06-423A	Bottles for mixing and storing culture media.
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl	DWK Life Sciences	224100-331	Rubber stoppers for serum bottles.
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL	DWK Life Sciences	223952	Glass serum bottles for sealed culturing.
Small Bore Extension Set	Braun Medical	471960	Tubing extension with luer lock connectors.
Sodium Chloride	MilliporeSigma	S3014	Solid sodium chloride salt.
Spike-in Control I (High Microbial Load)	ZymoBIOMICS	D6320	Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber.
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes	Professional Disposables International	H04082	Disposable germicidal wipes for sterilization.
Trace Metals Mixture, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Concentrated solution of physiological trace metals.
Unlined Aluminum Seal, 30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.
USP Medical Grade Air Tank	Airgas	AI USP200	Compressed air tank for input to sparging system.
USP Medical Grade Oxygen Tank	Airgas	OX USP200	Compressed oxygen tank for input to sparging system.