Summary
ここでは、ポリ(βアミノエステル)ポリマーに基づいてmRNAナノ粒子を製造するための簡単なプロトコルが提示され、カプセル化されたmRNAを変更することによって容易に調整できる。また、ポリマー、ナノ粒子、およびそれらの インビトロ 必須の特徴を合成するためのワークフローも記載されている。予防接種に関する概念実証も追加されます。
Abstract
予防接種は現代社会の大きな成功の一つであり、病気の予防と予防に欠かせないものです。従来のワクチンは、感染因子の全体または一部で構成されていた。しかし、課題は残っており、新しいワクチン技術が不可欠です。この文脈において、免疫目的のためのmRNAの使用は、SARS-CoV-2感染を予防する2つのmRNAワクチンの迅速な承認によって示されるように、強化された性能を示している。ウイルス感染の予防に成功するだけでなく、mRNAワクチンを治療用のがん用途にも使用できます。
それにもかかわらず、ヌクレアーゼの存在によるmRNAの不安定性および身体からの速いクリアランスは、その裸の送達を不可能にする。この文脈において、ナノ医薬品、特に高分子ナノ粒子は、重要なmRNA送達系である。したがって、本稿の目的は、独自の高分子ナノ粒子に基づくmRNAワクチン候補の処方および試験のためのプロトコルを記述することである。使用されるポリ(βアミノエステル)ポリマーの合成と化学的特徴づけ、ナノ粒子を形成するためのmRNAによる錯体化、およびそれらの凍結乾燥方法論について、ここで議論する。これは、ストレージと流通のコストを削減するための重要なステップです。最後に、 インビトロ トランスフェクトおよび成熟モデル樹状細胞に対する能力を実証するために必要な試験が示される。このプロトコルは、これらのワクチンが多種多様な疾患を予防または治癒することを可能にする高い汎用性のために、ワクチン接種に取り組んでいる科学界に利益をもたらすでしょう。
Introduction
感染症は、世界中の何百万人もの人間に深刻な脅威を表しており、依然として一部の発展途上国における主要な死因の1つです。予防ワクチン接種は、感染症1,2を予防・管理するための現代社会の最も効果的な介入の一つであった。20世紀の関連性における科学のこれらの重要なマイルストーンは、SARS-CoV-2ウイルス3によって引き起こされる最近の世界的なCovid-19パンデミックによって述べられています。病気の普及を抑制するために効率的なワクチンを持つことの重要性を認識し、すべての生物医学界からの協力的な努力は、1年未満で市場で多くの予防ワクチンを成功に導いた4年未満。
伝統的に、ワクチンは減衰(生きている、減少した病原性)または不活性化(死粒子)ウイルスで構成されていた。しかし、安全ミスのマージンのない病気の場合、ウイルス粒子は不可能であり、代わりにタンパク質サブユニットが使用されます。それにもかかわらず、サブユニットは通常、複数のエピトープ/抗原の組み合わせを可能にせず、ワクチン接種効力を高めるためにアジュバントが必要である5,6。したがって、新しいワクチンタイプの必要性は明らかです。
現在のパンデミックの間に示されているように、核酸に基づく新しいワクチン候補は、長い開発プロセスを回避し、同時に重要な患者の免疫を産生しながら高い汎用性を提供するという点で有利であり得る。これは、最初に実験的ながんワクチンとして設計されたmRNAワクチンの場合です。抗原特異的T細胞応答3、5、6、7を生成するその自然な能力のおかげで。mRNAは抗原性タンパク質をコードする分子であり、同じ変化を変えるだけで、ワクチンは同じ微生物の他の変異体を免疫するように迅速に調整することができ、異なる株、他の感染性微生物、あるいは癌免疫療法治療にもなる。また、大規模な生産コストの面でも有利です。しかし、mRNAは裸の投与を妨げる重大なハードルを持っています:その安定性と完全性は、ヌクレアーゼでいっぱいの生理学的媒体で損なわれます。このため、抗原提示細胞にmRNAをベクター化してそれを保護するナノメトリックキャリアの使用が2,8に必要である。
この文脈では、ポリ(βアミノエステル)(pBAE)は、カチオン電荷9、10、11のおかげで、ナノメトリック粒子中の複雑なmRNAに顕著な能力を示した生体適合性および生分解性ポリマーのクラスである。これらのポリマーは、エステル結合で構成されており、生理学的条件下でのエステラーゼによる分解が容易になります。pBAEライブラリー候補のうち、末端のカチオンオリゴペプチドで機能化したものは、エンドサイトーシスを通じて細胞を効率的に透過し、カプセル化された遺伝子材料をトランスフェクトする小さなナノ粒子を形成する高い能力を示した。さらに、その緩衝能力のおかげで、エンドソームコンパートメントの酸性化により、内経エスケープ12,13が可能となる。すなわち、特定の種類のpBAE、 骨格の疎水性部分(いわゆるC6 pBAE)を含む彼らの安定性とエンドオリゴペプチドの組み合わせを高める(トリリジンで修飾されたポリマーの60%とトリヒスチジンを有するポリマーの40%)は、非経口投与後に選択的に抗原提示細胞をトランスフェクトし、mRNAコード化された抗原提示を行う.さらに、これらの製剤は、ナノメディシン製剤の主なボトルネックステップの1つを回避できることも実証されている:それらの機能性を失うことなく凍結乾燥する可能性は、ソフトドライ環境15での長期安定性を可能にする。
この文脈において、現在のプロトコルの目的は、プロトコルの重要なステップの説明を与え、感染症予防および腫瘍治療アプリケーションのための効率的なワクチンの生産を可能にすることによって、科学界にmRNAナノ粒子の形成のための手順を提供することである。
以下のプロトコルは、オリゴペプチドの最終修飾ポリ(βアミノエステル)-ナノ粒子合成に更に使用されるOM-pBAEポリマーを合成するための完全なトレーニングを記述する。プロトコルには、ナノ粒子製剤も含まれる。さらに、結果として得られる製剤が正または否定的な結果を定義するために必要な品質管理特性評価機能を確実に達成するために、手順および代表的な結果の成功のための重要なステップも提供される。このプロトコルの概要を 図 1に示します。
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Protocol
1. 末端オリゴペプチドを用いたpBAEポリマーの合成(OM-pBAE)
- C6-pBAEの重合
- 5-アミノ-1-ペンタノールを追加します (38 ミリモル;MW = 103.16 Da) 1-ヘキシルアミン (38 ミリモル;MW = 101.19 Da) 丸底ガラスフラスコ(100 mL)に。その後、1,4-ブタンジオールジアクリレート(82ミリモル;2 mmol)を加える。MW = 198.22 Da)。
- シリコーンオイルバスを90°Cで予熱し、丸底フラスコをオイルバスに入れ、一晩(約18時間)磁気攪拌棒の助けを借りて混合物をかき混ぜます。その後、丸底フラスコから製品を取り出し、-20°Cの冷凍庫に入れる。
注:製品は、粘着性の粉末の形で、へらの助けを借りてフラスコから取り出されます。1H-NMRを介して得られたポリマーの構造を検証することが不可欠である。NMRスペクトルは、クロロホルムdとD2Oを溶媒として使用して、400MHzの機器(材料表を参照)に記録されました。各ポリ(βアミノエステル)の約10mgを1mLの重水素化溶媒に取り込み、溶解させた。
- OM-pBAEを得るためにペプチドとの反応
- 選択したペプチドに0.1M HClの25 mLを加え、例えば、トリフルオロ酢酸(TFA、200mg)を有するペプチドCys-His-Hisを、凍結乾燥に耐え、一晩手動で攪拌できる50mL遠心管に入れて、透明な溶液を得る。
- 溶液を-80°Cで1時間凍結し、得られた塩酸ペプチドを凍結乾燥させる。
注: 最終重みが理論値に対応しているかどうかを確認します。 - ジメチルスルホキシドでC6-pBAE(0.031ミリモル)の溶液を作ります。また、ジメチルスルホキシド中の塩酸ペプチド(0.078 mmol)の溶液を作ります。
- 2つのソリューションをスクリューキャップチューブに混ぜ、キャップにネジを入れします。25°Cの温度を20時間、磁気攪拌棒で水浴中に混合液を撹拌します。
- 混合物を7:3(v/v)ジエチルエーテル/アセトンに加えます。得られた懸濁液を4°Cで25,000xgで遠心分離し、溶媒を除去する。 次に、7:3(v/v)ジエチルエーテル/アセトンで固体を2回洗います。その後、真空(<0.2気圧)で製品を乾燥させます。
- ジメチルスルホキシドで100mg/mLの製品の溶液を作ります。得られた生成物はC6-ペプチド-pBAEと名付けられます。得られたポリマーの構造を1H-NMRを通して検証し、末端アクリレートに関連するオレフィン信号の消失を確認することが不可欠である。使用しない場合、ポリマーは-20°Cで凍結することができる。
2. ポリプレックス形成
注: すべての手順は、一定の温度を維持するために、条件付きの部屋内で実行する必要があります。
- ポリマーC6-ペプチドpBAEおよびボルテックス溶液を解凍する。
- ポリマーを上下に混合し、酢酸ナトリウム(NaAc)で12.5mM(V1)の溶液を調製します。その後、混合物をボルテックスし、10分待ちます。
- 0.5 mg/mLでmRNAを調製し、ピペット(V2)で混合する。
注: mRNA のボルテックスを避けることは非常に重要です。 - ポリマー混合物を最終濃度でボルテックスし、DMSO中のポリマーストックとアセテート緩衝液との間に均一な溶液を得た。
注: 最終的なポリマー濃度は、選択したN/P(窒素対リン酸基)比によって異なります。N/P比は、使用する各特定のmRNAに依存します。eGFP カプセル化の場合、たとえば、前に報告された14のように 25:1 の比率が使用されました。 - 遺伝子材料溶液とC6-ペプチドpBAE溶液(mRNA濃度の25倍)を1:1(V i=V1+V2)の比率で混合する。
注:C6-ペプチドpBAEは、mRNAが混合のために上下にピペットすることによって追加されるマイクロ遠心チューブにロードされます。調製後、ポリプレックス、核酸、およびC6-ペプチド-pBAE濃度が半分希釈される。 - 25°Cで30分間、サーモブロックでインキュベートします。1:2 RNaseフリー水で沈殿し、あらかじめロードされたマイクロ遠心分離チューブに水を入れます。
- 賦形剤を含める。mRNAとpBAE(Vi)の混合物と同じボリュームをHEPES 20 mMに加え、スクロースは上下にピペット処理を行い4%を加えます。この時点で、試料は3倍希釈されている。
3. ポリプレックス凍結乾燥
- 瞬間的に、前のポリプレックス溶液の-80°Cフリーザーで1時間凍結する。
- 次の手順で一次乾燥を行います: (1) -60 °C で 1 h および 0.001 hPa;(2) -40 °Cおよび0.0001 hPaで1時間。(3) -20 °C および 0.0001 hPa で 4 h;(4)5°Cで12時間、0.0001 hPa.
- 使用するまで水分補給を避けるために、すぐに-20 °Cで保管してください。
4. ポリプレックス再懸濁液
注:このプロトコルは、凍結乾燥したC6ペプチド-pBAEナノ粒子を再構築するために使用されるプロセスを説明し、特性評価、 インビトロ、 または インビボ 分析のためにさらに使用します。
- 使用の瞬間に-20°Cから凍結乾燥したナノ粒子を取り、迅速に所望の濃度を達成するために固体を再分散するために、対応する量のデミロゲン化(DEPC)水を追加します。
注:同じ濃度が想定される場合、体積はナノ粒子の初期体積と同じになりますが、各実験で示されます。 - ピペットを全再懸濁するまで穏やかにピペット、ピペットと一緒に液体を伴う。
注: バイアルの壁に材料が残らないようにしてください。 - 一度溶解すると、ピペットは激しく上下し、泡を避けます。
注:サンプルは、より高い濃度でより明らかである半透明の側面を持っている必要があります - サンプルを氷の上または4°Cで、再構成後24時間の最大期間保管してください。凍結を避けてください。
5. ポリプレックス特性
- 動的光散乱
注:流体力学直径(nm)、多分散度指数(PDI)、およびナノ粒子の表面電荷を25°C、633 nmレーザー波長、および173°信号検出器で測定し、ゼータ電位分析装置を用いた( 材料表参照)。- 流体力学径(nm)
- 上記のように0.25mg/mLのmRNAの最終濃度に遺伝子材料をピペット化することにより、mRNAとpBAEを混合したナノ粒子を十分に調製します(ステップ2)。
- 濾過された希釈培地でマイクロキュベットを洗い込み、不純物から完全に洗浄します。次に、キュベットに少なくとも50 μLのサンプル溶液を充填し、キャップします。次に、DLS計測器内のサンプルを紹介し、セルが正しく挿入されていることを確認します。
メモ:希釈メディアは0.22 μmのシリンジフィルタを使用してフィルタリングされます。 - 作成された 標準操作手順 (SOP) ファイルを開き、目的の サンプル名を紹介します。[ サイズの計測]を選択します。
注: サイズ測定用の SOP を作成するためのすべてのパラメータを 表 1に示します。 - [再生] をクリックして、DLS を使用してパーティクル サイズの測定を実行します。
メモ:トリプルビープ音が鳴った後、解析は完了です。 - 測定シート上のサンプルに対応する結果を選択して、平均粒子径、平均PDI、標準偏差、およびグラフィックスを取得します。完了したら、DLS機器からセルを取り外します。
- サンプルを取り出し、ゼータ電位分析のために保管し、脱イオン水で細胞をきれいに洗い流します。最後に、洗浄されたキュベットを圧縮空気ガス流で乾燥させます。
- 表面電荷(mV)
- 上記のように0.25mg/mLのmRNAの最終濃度に遺伝子材料をピペット化することにより、mRNAとpBAEを混合したナノ粒子を完全に調製します(ステップ2、ポリプレックス形成)。次に、溶液を凍結して乾燥させます。
注:この場合、表面電荷の測定のために、サンプルの凍結乾燥は、適切なバッファーにサンプルを再分散する措置を実行する前に強くお勧めし、pHおよび電解質濃度の体の状態をシミュレートします。 - 水を使用して凍結乾燥サンプルを再中断します。サンプルを水で1/10(最終濃度0.025mg/mL)で希釈します。
- 濾過された希釈培地で使い捨てに折りたたまれた毛細管細胞(ゼータ電位キュベット)を前洗いして、不純物から完全に洗浄します。次いで、キュベットを希釈したナノ粒子で満たし、1mLシリンジを使用し、フィラーの両側をキャップします。
注:ナノ粒子分散液は、キュベット(〜1mL)で利用可能なボリュームを満たさなければならなくて、気泡の形成に特別な注意を払い、測定を妨げることができました。 - サンプルを DLS 内で紹介します。セルが正しく挿入されていることを確認してください。
- ゼータ電位解析用に作成された SOP ファイルを開き、目的の サンプル名を紹介します。 ゼータ電位測定を選択します。
注: ゼータ電位測定の SOP を作成するためのパラメータは 、表 2に示されています。 - 再生をクリックして、DLSを使用してゼータ電位測定を実行します。
メモ:トリプルビープ音が鳴った後、解析が完了しました。 - 測定シート上のサンプルに対応する結果を選択して、ゼータ電位、標準偏差、およびグラフィックスの平均を取得します。完了したら、DLS装置からセルを取り外します。
- サンプルを取り出し、必要に応じて保存します。次に、キュベットセルを脱イオン水で洗浄し、続いてエタノールと水を再び洗い流します。最後に、洗浄されたキュベットを圧縮空気ガス流で乾燥させます。
メモ:データを分析するには、推奨ソフトウェアを使用してください。
- 上記のように0.25mg/mLのmRNAの最終濃度に遺伝子材料をピペット化することにより、mRNAとpBAEを混合したナノ粒子を完全に調製します(ステップ2、ポリプレックス形成)。次に、溶液を凍結して乾燥させます。
- 流体力学径(nm)
- ナノ粒子追跡解析(NTA)
注:流体力学的直径(nm)およびナノ粒子の濃度は、ナノ粒子追跡アナライザを使用して25°C、488nmレーザー波長で測定されました(参照してください。 資料一覧).- NTA およびサンプル準備
- コンピュータと機器の電源を入れ替えます。まず、すべてのコンポーネントが正しく接続されているかどうかを確認します。次に、推奨ソフトウェアを開きます。ソフトウェアは、すべてのアクセサリが正しく接続されているかどうかを確認します。
- トッププレート(ここではOリングセル)をレーザーモジュールに接続します。
メモ:このパーツをねじ込まないでください。 - まず、1 mL シリンジで、バッファーおよび/または脱イオン水でチャンバーをロードします。この手順を少なくとも 2 回繰り返します。チャンバーに泡を入れないようにしてください。
- DLSサイズ測定に使用した濃度から1/1000を脱イオン水で希釈してサンプルを調製します。少なくとも1 mLを準備し、1 mLのシリンジにロードして、気泡を導入しないようにします。
- サンプルをシリンジを使用してチャンバーにロードします。次に、レーザーモジュールをNTA大チャンバーに差し込みます。
メモ:大きい部屋は部屋が測定のために置かれるスペースを意味する。
- 画像の最適化
- まず、 ハードウェアで カメラ と適切なレーザーが選択されているかどうかを確認します。
注:ここでは、1台のカメラとブルーレーザー488 nmしかありません。 - カメラレベルを0から開始し、キャプチャウィンドウで カメラの開始 を押します。
注: この時点で、次のパラメータを調整します。 ビーム位置 (画面上で上下に移動可能)。 カメラレベル: 過飽和ピクセルを避けます。 フォーカス(横車輪):できるだけより良い焦点を合わせるようにしてください。未焦点のパーティクルの代わりに、ハローを持つパーティクルを使用することをおしただしい。濃度:濃度を調整して、フィールドあたり10~100個のパーティクルを持つようになります。
- まず、 ハードウェアで カメラ と適切なレーザーが選択されているかどうかを確認します。
- ビデオ録画
- ソフトウェアで、[ 計測選択- SOP]ウィンドウ(左下)に移動し、[ 標準測定]を選択します。
注:(ソフトウェアが平均および標準偏差の計算を実行できるように)30 sの3つの尺度を実行するプログラム。サンプルのレコードを保存するために、名前とフォルダー パス (ベース ファイル名) を指定します。SOP パラメータが正しく設定されたら、[ スクリプトの作成 と 実行] を押します。最初の反復が測定されると、プログラムは新しいサンプルを追加するように要求します。次に、サンプルの別の部分は、シリンジのプランジャーを押すことによってチャンバーに導入されなければなりません。最後に、3 回目の反復を分析するために 3 回目を繰り返します。
- ソフトウェアで、[ 計測選択- SOP]ウィンドウ(左下)に移動し、[ 標準測定]を選択します。
- ビデオ処理
- 3つの測定が完了したら、測定された粒子を分析するために 画面ゲイン と 検出しきい値 を再取り付けします。この時点で、解析を実行するために各フレームに約 100 個のパーティクルが表示されます (高い赤の十字と低い青の十字が予想されます)。
- 解析が完了した後で、結果を pdf ファイルにエクスポートします。また、動画やエクセルファイルとしてエクスポートすることも可能です。
- NTA のクリーニング
注: 次のサンプルを調じる前に、開いているすべての測定値を閉じます。生成されたファイルは膨大であり、コンピュータによっては、複数のオープンを維持することは容易ではありません。- 粒子が観察されないまで、その後の測定を行う前に水を繰り返し洗い流すことによってNTAチャンバーを洗浄します。その後、使用されるバッファー (PBS) をフラッシュして、メジャーを続行します。
- チャンバー内の空気を洗い流し、その日の最後の測定が完了したら、顕微鏡グレードの紙でそれを乾燥させます。
- トランスミッション電子顕微鏡(TEM)でサイズと形状を特徴付けます。サンプルを準備します。最終ボリュームの30 μLは、TEM特性評価に十分です。
注:新鮮で凍結乾燥した - 再懸濁後 - ナノ粒子を測定することができます。 - 炭素被覆銅グリッドに10μLのサンプルをドロップします。10分間乾燥させます。必要に応じて、濾紙を柔らかくタップして、余分な液体を取り除きます。
- 酢酸ウラニル溶液を10 μL(2%w/v)に落とし、負の染色を行います。1分間乾燥させます。必要に応じて、濾紙を柔らかくタップして、液体過剰を除去します。
- サンプルを顕微鏡に導入し、スキャンします(電圧動作80kV)。
注: 画像のさらなる分析には、適切なソフトウェアを使用できます。
- NTA およびサンプル準備
- カプセル化効率
- サンプル準備
- 所望の濃度でナノ粒子を準備し、それらを凍結し、乾燥させます。その後、ナノ粒子を再懸濁し、6μg/mLの最終濃度で希釈します。
- 20x ストック ソリューションから 1x TE バッファーを準備します。
メモ:Vt(総体積)=(サンプル数x 100 μL x 4)(サンプル数x 290 μL)+ 2 mL。 - 100 μg/μL のストックから 3 μg/μL のヘパリンで TE バッファーを準備します。
メモ: Vt = サンプル数 x 50 μL x 2. - 標準を準備する
- 1x Tris-EDTA(TE)バッファで0.2 μg/mLから0.025 μg/mLまでの範囲のRNA規格を準備します(表S1A)。
注:リボソームRNAと異なる場合には、RNA標準でmRNAを使用してください。 - ヘパリン(表S1B)を使用してRNA:pBAE標準を調製する。ヘパリン標準を準備する (表 S1C).
- 96ウェルプレートを次のように準備します。
- 96 ウェルプレートの最初のレーンに 295 μL の TE バッファーをロードします(分析するサンプルと同じ数ウェル)。次に、1x TE バッファの 50 μL をレーン B および C (各サンプルの重複) にロードします。
- ヘパリンの3 μg/μLを持つ1x TBEバッファの50 μLをレーンDとE(各サンプルに対して重複)にロードします。次に、各標準の100 μLをレーンF、G、H(各規格に対して重複)でロードします。
- レーンAに各サンプルの5μLをロードします(各ウェルの濃度は0.1 μg/mL)。下の4つのウェルに各サンプルの50 μLをピペットで混合し、負荷を入れます(そのうちの2つは50 μLのバッファ1x TEを含み、さらに2つはヘパリンの3 μg/μLの1x TEバッファを含みます)。
- 37°Cで30分間サンプルをインキュベートします。 1x TE バッファーで、製造者のプロトコル ( 材料表を参照) に従って RiboGreen 試薬を準備します。
注:1:200と渦を希釈します。光から守る。Vt = フルウェル数 x 100 μL - 各ウェルにリボグリーン溶液の100 μLをロードします。500 nmの励起波長および525 nmの発光波長のマイクロプレートリーダーを使用して蛍光を検出する。
- 結果分析
- 3 つのキャリブレーションカーブを準備する
注:まず、リボソームRNA標準。この較正曲線でヘパリンを含まないサンプルを補間します。第二に、mRNA:pBAEヘパリンを使用する。この検量線でヘパリンを有する試料を補間する。第三に、ヘパリン。働く集中が線形範囲であることを保証するために使用される。 - カプセル化効率 (EE%)
- 3 つのキャリブレーションカーブを準備する
- サンプル準備
6. インビトロ 特性評価
- 定性評価のための蛍光顕微鏡
- トランスフェクションの24時間後に顕微鏡に96ウェルプレートを置きます。10x の目的でセルの視覚化を開始します。
注: この場合、HeLa セルが使用されます。セルは、伝送モード(明るいフィールド)を使用してローカライズされ、この時点でフォーカスを調整する必要があります。- まず、サンプルの背景に関するソフトウェアを参照するためにホワイトバランスを適用します。次いで、画像を取得し、分析中に蛍光画像とオーバーレイする。
- 顕微鏡モードを反射モード(蛍光)に変更し、フィルターホイールを青色レーザー(488nm)に移動してeGFPを可視化します。
注: この時点で、露出時間とゲインを調整する必要があります。ゲインは、バックグラウンド信号のアーティファクトと過剰を避けるために、3と5の間の値で調整する必要があります。露光時間の調整は、トランスフェクション効率(msから1 s)に依存します。 - すべてのサンプルを比較するために、同じ露出時間を使用して、すべての条件またはウェルの画像を取得します。
- トランスフェクションの24時間後に顕微鏡に96ウェルプレートを置きます。10x の目的でセルの視覚化を開始します。
- 定量的評価のためのフローサイトメトリー(FC)
- マルチチャンネルピペットを使用して、フローサイトメトリー実験用の96ウェルプレートを準備します。
注: JAWSII セルラインなどの半接着セルを操作する場合は、すべてのメディアボリュームを回復し、別の 96 ウェル プレートに保存します。大量のトランスフェクトされた細胞が含まれている可能性があるため、このメディアを熱望しないでください。 - 1x PBSの100 μL/wellで細胞(HeLa細胞が使用されています)をきれいにし、それを熱望します。次に、25 μL/ウェルのトリプシンを加え、37°Cで5分間インキュベートします。
- 細胞が切り離されたら、以前に回収された培地を添加してトリプシン作用を停止し、細胞を固定し、ホルマリン10%の31.25 μL/ウェルを20分間(最終濃度2.5%)加えます。
注:この時点で、細胞の剥離を確実にするために顕微鏡で細胞の状態を可視化することが重要です。細胞が取り外し、その凝集を避けるのを助けるために、数回上下にピペットすることを強くお勧めします。これにより、信頼性の高い結果が得られます。 - フローサイトメーターとソフトウェアをオンにします。ソフトウェアでは、実験の適切な条件(プレートの種類、サンプルの体積、および、サンプル間の揺れ、リンスなどの他のパラメータ)を設定します。
注: ステップ 6.2.5 の場合、流量は 120 μL/min である必要があります。1分ごとに1サイクルを混ぜ、1サイクルずつよくすすいでください。混合は、培地中に分散した細胞を維持し、個々の細胞のより良い分析を可能にするために不可欠です。また、リンスは、サンプル間のサイトメーターのマイクロ流体を洗浄する必要があります。最後に、十分なバッファがあるかどうか、およびすべてのコンポーネントが正しく接続されているかどうかを確認します。 - 正にトランスフェクトされた細胞の割合を定量化するために、適切なパラメータを設定します。
- まず、フローデータを(前方散乱光)FSC対SCC(側面散乱光)散乱プロットで表示し、細胞を破片と区別します。次に、振幅(FSC-A)と高さ(FSC-H)を比較する別の散布図が、個々の細胞をゲートにプロットし、判別する。
注:未治療の集団は、陽性トランスフェクト細胞に対応する集団をゲートすることができます。次に、陽性トランスフェクトされた細胞の定量がヒストグラムプロット上の適切なチャネル上で行われる。したがって、陽性にトランスフェクトされた細胞は、ヒストグラム上のイベントの連続体として表現されなければならない。
- まず、フローデータを(前方散乱光)FSC対SCC(側面散乱光)散乱プロットで表示し、細胞を破片と区別します。次に、振幅(FSC-A)と高さ(FSC-H)を比較する別の散布図が、個々の細胞をゲートにプロットし、判別する。
- マルチチャンネルピペットを使用して、フローサイトメトリー実験用の96ウェルプレートを準備します。
7. インビトロ 機能試験:オボアルブミン(OVA)を抗原モデルmRNAとして用いることで免疫細胞を活性化する能力
- トランスフェクションの前日に96ウェルプレートに10,000個の細胞/ウェル(JAWSII細胞が使用されています)。
注:各条件の三重を持っている必要がある限り多くのウェルをプレート。細胞を少なくとも12時間プレートに取り付けます(一晩のインキュベーションをお勧めします)。 - 以下のノートに記載されているようにpBAE NPを準備し、ウェルあたり0.6 μg mRNAをトランスフェクトします。
注:陽性のコントロールとして、トランスフェクション試薬を使用して細胞をトランスフェクトします。ここでは、ウェルあたり0.1 μg mRNA、1ウェル当たり0.25μLのトランスフェクション試薬を使用しました。OVA 用の mRNA のコーディゼーションを購入しました ( 材料表を参照)。ポリアデニル化され、5-メトキシウリジンで修飾され、哺乳類のシステムに最適化され、サプライヤーの独自の方法であるCap1構造のエンドキャッピングによって保護されています。 - 乾燥空気インキュベーターで24時間96ウェルプレートを37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
注: この時間の後、メディアには特定の数のセルが含まれている可能性があるため、メディアを熱望しないでください。細胞を回復し、別のウェルやプレートに保存します。 - ウェルに残った細胞を25 μLの1x PBSで洗浄します。次に、それを熱望し、トリプシンの25 μLを加え、37°Cで5分間プレートをインキュベートして細胞を取り外します。以前に回収したメディアを対応する井戸に追加して、トリプシン反応を停止します。
- プレートを4°Cで5分間400xgで遠心します。 メディアを熱望する。1x PBSの50 μL/ウェルとホルマリンの2.5%を加えます。細胞を固定するために4°Cで20分間インキュベートします。
- 手順 7.5 と 7.5.1 を繰り返します。その後、1x PBSと3%BSA(ブロッキングバッファ)の50 μL/ウェルを加え、4°Cで30分間インキュベートします。 再度、ステップ7.5と7.5.1を繰り返し、1x PBSで一次抗体(マウスα-OVA)の50μL/wellを加え、BSAを3%で30分間インキュベートします。
- ステップ7.5と7.5.1を繰り返し、1x PBSの50 μL/ウェルで細胞を洗います。アスパイアメディア、および2次抗体溶液(α-マウス-AlexaFluor488/PerCPおよびCy5.5-CD11b/APC-CD86)を1x PBSおよび3%BSAに添加します。4°Cで1時間インキュベートします。
- プレートを400xgで5分間遠心します。その後、50 μL/ウェルの1x PBSで細胞を洗浄します。次に、遠心分離機(400 x g 5分間)を目指し、1x PBSおよび2.5%ホルマリンの100 μL/ウェルで細胞を再懸濁します。
- 上述したようにフローサイトメトリーで分析する(ステップ6.2)。
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Representative Results
ポリマー合成と特性評価
OM-pBAE合成手順は 図2に示されています。 図2A が示すように、OM-pBAEを得る第一の工程は、アミン(1-ヘキシルアミンおよび5-アミノ-1-ペンタノール、比1:1)をジアクリレート(1,4-ブタンジオールジアクリレート)に添加してC6-pBAEを合成することです。この反応は、90°Cで20時間、一定の攪拌を行う。その後、オリゴペプチドの溶液を、前の反応から得られたC6ポリマーの溶液に添加する(図2B)。最後に、合成は20時間連続撹拌しながら25°Cで溶媒としてDMSOを用いて行なう。 図2C は、重合の結果として生じる生成物であるOM-pBAEの構造を示す。得られたポリマーは 、1H-NMR( 補足図S2を参照)によって特徴付けられる。特性評価では、正の結果は、7~10の間で構成される複数の単量体単位(図中のn +m)を持つ結果です。1つのユニットタイプの半分と半分を分散します。この範囲外の他の数値は負の結果になります。
ナノ粒子合成と物理化学的特性評価
表3 は、ナノ粒子をカプセル化したGFP mRNAの物理化学的特徴付けの結果を概念実証として示す。以前は、サイズと表面電荷は、カプセル化されたmRNAタイプに関係なく有意な差を示さないことが実証された。特性評価は、それらの物理化学的特性の安定性を証明するために、新たに調製された、そして凍結乾燥したナノ粒子の両方で行われ、また、既に公表したように、凍結乾燥プロセスがこれらの製剤15に調整されたことを実証する。ポリプレックスの流体力学的半径は、150〜220 nmの周りに及ぶ場合に正しいと考えられます。さらに、PDI は 0.2 程度の定数である必要がありますが、0.3 まで受け入れられます。したがって、サイズもPDIも、代表的な結果を用いてここに示すように、凍結乾燥の前後に有意な差を示さなかった。また、ナノ粒子サイジングをNTAで行い、先に得られた結果を確認した。上記で指定した範囲を超える値は負の結果と見なされ、パーティクルは後で使用するために破棄する必要があります。
このタイプのサンプルの物理化学的特性解析の間に、DLSが得た結果とNTAが得た結果を比較すると便利です。どちらの手法でも、拡散係数を測定して粒子の流体力学的半径を決定します。NTAのフレーム当たりの数が80~100個のナノ粒子の数は、粒子を正確に追跡します。表面電荷はまた、ナノ粒子の正電荷を確保し、細胞膜との静電相互作用を促進することを特徴付けた。最後に、ポリプレックスの形態は、トランスミッション電子顕微鏡(TEM)によって特徴付けられた。図3は、直径50nmの大きさの球形および単分散ナノ粒子の形成を確認している。小径は、NTAとDLSの両方が流体力学的直径を測定する際にTEM画像を分析することによって得られた。散乱測定と比較して電子顕微鏡測定16,17を行う場合は常に小さいサイズが予想されるが、その差が100nm近くであることをここで強調することは重要であり、通常は期待されない。これは、これらのナノ粒子の高い吸湿性特性に起因し、ポリマーを構成するカプセル化されたmRNAおよび末端オリゴペプチドの両方によって与えられる。
mRNAカプセル化効率の測定
測定するもう一つの重要なパラメータは、ナノ粒子がmRNAをカプセル化する能力であり、これは活性原理であり、ヌセラーゼ18、19、20からの保護を達成するためにカプセル化する必要がある。このプロトコルは、サプライヤーの指示に従ってカプセル化効率(EE;核酸封じ込めの%)を分析するために開発されました。得られた値は、ナノ粒子に正常に包み込まれる核酸の割合についてのアイデアを与える。この目的のために、蛍光核酸染色であるリボグリーン色素が用いられる。このプロトコルは、蛍光色素にアクセス可能なRNAを定量化することで構成されています。RNA全体を定量化するには、ナノ粒子を分解する必要があり、ヘパリンはこの目的に使用されます。
表4 は、概念実証として、GFPおよびOVA mRNAの両方をカプセル化するOM-pBAEポリプレックスのカプセル化効率(EE%)を示す。リボグリーン蛍光アッセイは、ヘパリンを添加してその含有量を放出することにより、分解後のナノ粒子に閉じ込められたmRNAの量を計算することを可能にする。得られた効率値は80%より高くなければならないし、ここで示されるように、mRNAの種類によって有意な差を示さない。より低いカプセル化効率値は、負の結果を表し、これらの製剤を廃棄するためのシグナルを構成する。これらの結果は、OM-pBAEのmRNAの高い封入能力、その汎用性、および遺伝子導入におけるその有望な応用を確認した。
インビトロ 代表結果
pBAE ポリプレックスの容量を決定することが不可欠です。まず、トランスフェクトし、第2に、免疫細胞14を活性化させる。トランスフェクション効率は、レポーターmRNAとしてeGFPを用いて、トランスフェクション効率を定量化するレポータータンパク質およびフローサイトメトリー発現を視覚的に決定する2つの異なる技術によって評価される。CCDカメラを搭載した蛍光顕微鏡、5x、10x、20x、および40xの目的とUV、青、緑のフィルターレーザーを用いて、マウス樹状細胞株であるJAWSII細胞株におけるeGFPタンパク質の発現を定性的に決定した。eGFPタンパク質は、488nmで最大励起を有し、青色レーザーに対応し、最大510nm前後の発光を有し、緑色に対応する。標的タンパク質のトランスフェクション効率発現を定量化するために、トランスフェクトされた細胞のフローサイトメトリー分析は、eGFP mRNAを有するpBAEsポリプレックスによるトランスフェクションの24時間後に行われる。細胞がGFPやRFPなどの蛍光レポーターにトランスフェクションされている場合、固定ステップが役立ちます。
図4 は、JAWSII細胞株におけるトランスフェクションの24時間後のeGFP発現の定性的分析を示す。繰り返しますが、負の制御と比較して、eGFPレポーター信号は、かなり高い。また、 表5 は、JAWSII細胞株におけるOM-pBAEナノ粒子によって示されるトランスフェクション効率を示す。また、効率値は、古典的なトランスフェクション試薬で行われる正のコントロールに匹敵する。
モデル免疫細胞を活性化するOVA mRNAを搭載したpBAE NPの容量は、マウス未熟樹状細胞株であるJAWSII細胞株をトランスフェクトして評価した。免疫細胞の活性化を決定するために、2つの異なるマーカー:CD11bおよびCD86が採用された。まず、フローサイトメーター構成に適した蛍光ホルを選択します。ここでは、PerCP-Cy5.5(CD11b)およびPE(CD86)が使用されます。未成熟および非活性化細胞株はCD11b-/CD86-プロファイルを示す必要があるのに対し、活性化された細胞はCD11b+/CD86+プロファイルを提示しなければならない。488nmの青色レーザーを用いて標的タンパク質発現を決定し、抗OVA抗体と二次抗マウス-Alexa488抗体を用いた。 表6 は、この実験で使用された最終的なパネルを示しています。 図5 は、細胞免疫応答の活性化を示す、DCを活性化するOVA mRNA搭載OM-pBAEナノ粒子の容量を示す。非トランスフェクト細胞はCD11bおよびCD86膜マーカーを発現する細胞の数が少なく、一方、mRNA OVA OM-pBAE処理細胞はCD11bおよびCD86マーカーの発現を示す。この結果は、OM-pBAEナノ粒子が成熟を促進することを示唆している。全体として、これらの結果は、効率的に樹状細胞をトランスフェクトするOM-pBAEsナノ粒子の容量を確認し、未熟なDCの成熟を促進する免疫応答の活性化を仲介する。
図1: 合成プロトコル全体の概略図 この図では、mRNAワクチン合成ステップは、重要な特性評価パラメータを含む詳細である。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:C6-pBAEオリゴペプチド末端修飾(OM-pBAE)の合成(A)マイケル添加を行う生の化学物質。(B) pBAE + オリゴペプチド.(C) OM-pBAE.Rはヒスチジン(H)またはリジン(K)である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:OM-pBAEナノ粒子を封入する新鮮なGFP mRNAのTEM画像 電子顕微鏡特性解析のためにポリプレックスが負染色された。直径約60nmの単分散粒子が示されている。(A) と (B) の画像は、同じサンプルの 2 つの異なる顕微鏡を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:OM-pBAE/eGFP mRNAナノ粒子を用いたJAWSIIトランスフェクション細胞の蛍光顕微鏡イメージング(A)明るい視野画像(B) GFP 蛍光 (緑色)。(C) 前の 2 つの画像の合成。スケールバー= 100 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:OM-pBAE/OVA mRNAナノ粒子によるトランスフェクション後のJAWSIIの活性化 負のコントロール(CN)値は黒のラベルに対応します。トランスフェクトされた細胞はグレーのラベルに対応します。バーは、3つの反復の標準偏差(SD)に対応します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 材料 | 材料 | マイクロベシクル |
| 屈折率 | 1.4 | |
| 吸収 | 0.01 | |
| 分 散剤 | 分 散剤 | 水 |
| 温度(°C) | 25 | |
| 粘度(cP) | 0.8872 | |
| 屈折率 | 1.33 | |
| 温度 | 温度(°C) | 25 |
| 平衡時間(複数可) | 10 | |
| セル | セルタイプ | ゼニ0040 |
表1:サイズ測定用のSOPを作成するためのパラメータ。
| 材料 | 材料 | マイクロベシクル |
| 屈折率 | 1.4 | |
| 吸収 | 0.01 | |
| 分 散剤 | 分 散剤 | 水 |
| 温度(°C) | 25 | |
| 粘度(cP) | 0.8872 | |
| 屈折率 | 1.33 | |
| 温度 | 温度(°C) | 25 |
| 平衡時間 | 10 | |
| セル | セルタイプ | DTS1070 |
表2:ゼータ電位測定のSOPを作成するためのパラメータ
| GFP mRNA/OM-pBAE | T(oC) | ハイドロダミック直径 (nm) | PDI | 表面電荷(mV) | |
| NTA | DLS | ||||
| 新鮮 | 25 | 124 ± 32 | 134 ± 8 | 0.2 ± 0.04 | 32 ± 0.7 |
| 凍結 乾燥 | 25 | 135 ± 35 | 138 ± 2 | 0.17 ± 0.02 | 34 ± 0.7 |
OM-pBAEナノ粒子を封入するmRNAの物理化学的特徴付け OM-pBAEポリプレックスをカプセル化するGFP mRNAは、粒子の安定性を確保するために、調製直後に、新鮮で凍結乾燥プロセスの後に特徴付けられました。DLS および NTA サイジング、および表面電荷データが表示されます。
| EE% | |
| GFP mRNA/OM-pBAE | 82.3 ± 1.5 |
| オバ・ムラナ/オム・プバエ | 83.1 ± 1.5 |
OM-pBAEナノ粒子を封入するmRNAのカプセル化効率(EE%)データを表4に示した。 OM-pBAEナノ粒子を封入するGFPおよびOVA mRNAのカプセル化効率パーセンテージ。リボグリーン蛍光アッセイは、ポリプレックスに閉じ込められたmRNAの量を評価するために凍結乾燥サンプルに対して行った。
| 見本 | GFP 陽性細胞 % | SD |
| ネガティブコントロール | 1.85% | 0.21% |
| OM-pBAE/eGFP mRNA トランスフェクション細胞 | 57.79% | 5.28% |
表5:JAWSII細胞株におけるOM-pBAE/eGFP mRNAナノ粒子のトランスフェクション効率。 トランスフェクション効率はフローサイトメトリーにより追跡した。
| 抗体 | 染色された細胞 | 蛍光標識 |
| CD11b | アクティブ化 DC | パーCP-サイ 5.5 |
| CD86 | アクティブ化 DC | PE |
| αマウス アレクサフルオール488 | OVA陽性細胞 | アレクサフルオール 488 |
表6:フローサイトメトリーパネル。 このパネルは、mRNAワクチンの インビトロ 機能を決定するためのフローサイトメトリー試験に使用された。
補足情報: すべての補足情報が含まれている補足ファイルを参照してください。[ファイル] の下のダウンロードはこちら をクリックしてください。
表S1A:リボソームRNA標準。
表S1B: ヘパリン標準のRNA:pBAE。
表 S1C: ヘパリン標準。
図S2:C6-pBAEおよびOM-pBAEの1H-NMR陽子スペクトル。(C6-pBAE からの A ) 1H-NMR.クロロホルムdを溶媒として用いた(δ=7.25ppm)。(B) C6CH3 からの 1H-NMR。D2Oを溶媒として用いた(δ=4.64ppm)。
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Discussion
昨年Covid-19大流行が発生した後、感染症対策の観点からワクチンの重要性が重要な成分8として明らかになってきた。世界中の科学者からの努力は、多くのワクチンの市場へのリリースを可能にしました。歴史上初めて、mRNAワクチンは、数ヶ月以内に新しい抗原に適応する能力のために彼らの迅速な設計のおかげで、以前の仮説の成功を実証しました5,6,21.mRNAは、リボ核酸をメッセンジャー、DNAにコードされた情報からタンパク質合成を駆動する核酸をいう。ここで、ワクチン接種のために、mRNAは、感染性微生物に属する抗原タンパク質(または治療的腫瘍ワクチン接種の場合には腫瘍抗原に対して)8,22に対して体系化する。この文脈では、科学界がmRNAワクチンを合成するための明確なプロトコルを持つことは重要です。
この考え方を念頭に置いて、独自の高分子ナノ粒子に基づいてmRNAワクチンを合成するための簡単な手順を24に記載することを目指した。プロトコルセクションで説明したように、まず、ポリマー骨格を合成するために一次アミンをアクリル基にマイケル添加に基づく2段階の手順を用いて合成し、続いて末端オリゴペプチドを添加して、エンドーソームから得られたポリマー12、13、14にエンドーソームから脱出する増強カチオン特性および容量を与える。.次に、さらなるステップで、ナノ粒子は、ポリマーをmRNAと混合して調製し、その静電相互作用を達成して小さなナノメトリック粒子を形成する。
ポリマーの合成は簡単なプロトコルであるが、ナノ粒子製剤については同じことは言えない。世界中の多くの共同研究者がこれらのポリマーを使用しており、粒子の調製と使用に言及する際に共通の重要なステップを発見しました。合成が手動混合によるものであることを考慮して、ユーザーの能力は重要な役割を果たす。最もトリッキーなステップは、ポリマーとmRNAを混合することです, それは水に混合物のさらなる沈殿ステップとバッファーの追加のために行わなければならないように、制御された方法で行われなければなりません.2つの成分を混合する仕組みに変更を加えた場合、(ナノ粒子の代わりに)微粒子が生じ、人間には使用できません。したがって、ミキシングは、正しく達成するために何らかの方法を必要とするトラブルシューティング手順の 1 つです。
もう一つの顕著な点は、凍結乾燥です。広く知られているように、ナノ製剤のボトルネックステップの1つを表す。この特定のケースでは、すべてのパラメータを調整し、15を成功したプロトコルを記述するのに何年かかかりました。その調整を行っても、プロトコルのもう一つの重要なステップは、製剤の再分散であり、正しく行われなければ、ナノ粒子の凝集をもたらし、その機能性を失う。この場合、制御されていない水分補給を避けるために、乾燥した、わずかに冷たい環境に製剤を迅速に配置する必要があります。その高い吸湿性の性質のために、凍結乾燥によって形成されたすべての粘着性粉末を慎重に上下にピペットすることによって、制御された方法でそれらを水分補給するために特別な注意を払う必要があります。サンプルが非制御的な方法で水分補給する場合、それらはすぐに不透明な分散にトランスルーシドを形成して凝集します。
ここで重要なステップが挙げられるが、pBAEポリプレックスを合成するプロトコルは容易かつ迅速であり、遺伝子送達系の他の合成方法の中でも有利である。ここでは、mRNAワクチン接種の具体的な適用が詳細に提供されている。しかしながら、それは、腫瘍学および心血管分野における他のタイプの核酸および非ワクチン使用をカプセル化するためにも適用できる汎用性の高い方法論を表し、前述の13、23、24に記載されている。
結論として、このプロトコルは、これらの独自のポリマーが科学界に利用可能であり、このトラブルシューティングをすべて避けながら新しいmRNAワクチンを設計することを可能にする。これらのポリマーは、凍結乾燥、長期安定性、および超低温温度を必要としないことによる貯蔵および流通コストの減少の可能性に関する他のmRNA脂質製剤と比較して有利である。そのため、OM-pBAEワクチンは予防および治療の応用のためにワクチン接種分野において重要な役割を果たすと期待される。
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Disclosures
著者は何も開示したり、利益相反を持っていません。
Acknowledgments
MINECO/FEDER(補助金SAF2015-64927-C2-2-R、RTI2018-094734-B-C22、COV20/01100)からの財政支援を認めている。CGFは彼女のIQS博士フェローシップを認めました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
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