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Biochemistry

ताजा पृथक माउस हेपेटोसाइट्स के निलंबन में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण का मापन

Published: September 9, 2021 doi: 10.3791/62904
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biochemistry, School of Medicine, West Virginia University
* These authors contributed equally

Summary

फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण एक आवश्यक चयापचय मार्ग है जो हेपेटोसाइट्स सहित कई अलग-अलग सेल प्रकारों में ऊर्जा उत्पन्न करने के लिए जिम्मेदार है। यहां, हम 14सी-लेबल वाले पामिटिक एसिड का उपयोग करके ताजा पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण को मापने की एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण यकृत की ऊर्जा मांगों को पूरा करने और अतिरिक्त प्रक्रियाओं के लिए सब्सट्रेट और कॉफ़ैक्टर्स प्रदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण चयापचय मार्ग है, जैसे कि कीटोजेनेसिस और ग्लूकोनोजेनेसिस, जो पूरे शरीर के ग्लूकोज होमियोस्टेसिस को बनाए रखने और उपवास की स्थिति में अतिरिक्त-यकृत अंग समारोह का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं। फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण माइटोकॉन्ड्रिया और पेरोक्सीसोम के भीतर होता है और कई तंत्रों के माध्यम से विनियमित होता है, जिसमें फैटी एसिड, एंजाइम अभिव्यक्ति के स्तर और कोएंजाइम ए और एनएडी + जैसे कॉफ़ैक्टर्स की उपलब्धता और सक्रियण शामिल है। यकृत होमोजेनेट्स, सेल लिसिस में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण को मापने वाले परखों में और कॉफ़ैक्टर्स के सुपरफिजियोलॉजिकल स्तरों के सामान्य जोड़ इन नियामक तंत्रों के प्रभावों को मुखौटा करते हैं। इसके अलावा, होमोजेनेट्स में ऑर्गेनेल की अखंडता को नियंत्रित करना मुश्किल है और तैयारी के बीच काफी भिन्न हो सकता है। बरकरार प्राथमिक हेपेटोसाइट्स में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण का माप उपरोक्त नुकसान को दूर करता है। यह प्रोटोकॉल 14सी-लेबल वाले पामिटिक एसिड के साथ ऊष्मायन ताजा पृथक प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स के निलंबन में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण के माप के लिए एक विधि का वर्णन करता है। संस्कृति के दिनों के घंटों से बचने से, इस विधि में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर और मूल यकृत की चयापचय मार्ग गतिविधि को बेहतर ढंग से संरक्षित करने का लाभ होता है, जिसमें खिलाए गए चूहों की तुलना में उपवास वाले चूहों से पृथक हेपेटोसाइट्स में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण की सक्रियता शामिल है।

Introduction

फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण लिपिड चयापचय में एक आवश्यक प्रक्रिया है, जो फैटी एसिड संश्लेषण और आहार से सेवन को संतुलित करने के लिए एक अपचय मार्ग प्रदान करता है। यह प्रक्रिया हृदय की मांसपेशियों, गुर्दे के प्रांतस्था और उपवास यकृत सहित कई अंगों के लिए ऊर्जा उत्पन्न करती है, और आहार, वसा ऊतक लिपोलिसिस और आंतरिक ट्राइग्लिसराइड स्टोर 1,2 से प्राप्त फैटी एसिड का उपयोग करती है।

β-ऑक्सीकरण मार्ग के माध्यम से फैटी एसिड के ऑक्सीकरण के परिणामस्वरूप एक समय में दो कार्बन द्वारा फैटी एसाइल श्रृंखला का अनुक्रमिक छोटा होना होता है, जिसे एसिटाइल-सीओए के रूप में जारी किया जाता है, और यह प्रक्रिया माइटोकॉन्ड्रिया और पेरोक्सीसोम दोनों में होती है। जबकि अधिकांश फैटी एसिड केवल β-ऑक्सीकरण से गुजरते हैं, कुछ इस मार्ग में प्रवेश करने से पहले विभिन्न कार्बन पर ऑक्सीकरण होते हैं। उदाहरण के लिए, 3-मिथाइल-प्रतिस्थापित फैटी एसिड, जैसे कि फाइटेनिक एसिड, β-ऑक्सीकरण मार्ग में प्रवेश करने से पहले पेरोक्सीसोम में α-ऑक्सीकरण द्वारा एक कार्बन को हटाने से गुजरते हैं। इसी तरह, कुछ फैटी एसिड को पहले एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में टर्मिनल मिथाइल समूह (ω-ऑक्सीकरण) के ऑक्सीकरण द्वारा डाइकारबॉक्सिलिक फैटी एसिड में परिवर्तित किया जाता है, इससे पहले कि β-ऑक्सीकरण3 द्वारा पेरोक्सीसोम में अधिमानतः ऑक्सीकरण किया जाता है।

विशिष्ट ऑर्गेनेल के बावजूद, एक फैटी एसिड को पहले कोएंजाइम ए (सीओए) थियोस्टर, या एसाइल-सीओए में परिवर्तित किया जाना चाहिए, ताकि β-ऑक्सीकरण मार्ग के माध्यम से ऑक्सीकरण किया जा सके। माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में लंबी श्रृंखला एसाइल-सीओए के β-ऑक्सीकरण के लिए कार्निटाइन शटल की आवश्यकता होती है, जहां कार्निटाइन पामिटॉयलट्रांसफेरेज़ 1 (सीपीटी 1) एसाइल-सीओए के एसाइलकार्निटाइन में रूपांतरण को उत्प्रेरित करता है और इस प्रक्रिया में दर-सीमित एंजाइम है4. एक बार माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में स्थानांतरित होने के बाद, एसाइल-सीओए को फिर से बनाया जाता है और माइटोकॉन्ड्रियल β-ऑक्सीकरण मशीनरी के लिए सब्सट्रेट के रूप में काम करता है। उपवास की स्थिति में, यकृत माइटोकॉन्ड्रिया में β-ऑक्सीकरण के माध्यम से उत्पादित एसिटाइल-सीओए मुख्य रूप से केटोजेनेसिस के लिए चैनल किया जाता है। पेरोक्सीसोम बहुत लंबी श्रृंखला, शाखित-श्रृंखला और डाइकारबॉक्सिलिक फैटी एसिड के β-ऑक्सीकरण के लिए प्राथमिक साइट के रूप में कार्य करते हैं। पेरोक्सीसोम को फैटी एसिड सब्सट्रेट आयात करने के लिए कार्निटाइन शटल की आवश्यकता नहीं होती है, इसके बजाय एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर एबीसीडी 1-35 की गतिविधि के माध्यम से संवाददाता एसाइल-सीओए आयात करते हैं। पेरोक्सीसोम के भीतर, एसाइल-सीओए को तब एंजाइमों के एक समर्पित सेट द्वारा ऑक्सीकरण किया जाता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण मशीनरी से अलग होता है। माइटोकॉन्ड्रिया और पेरोक्सीसोम दोनों को फैटी एसाइल श्रृंखलाओं को ऑक्सीकरण करने के लिए एनएडी + और मुक्त सीओए की आपूर्ति की भी आवश्यकता होती है। यकृत में सीओए के स्तर को उपवास के जवाब में वृद्धि के लिए दिखाया गया है, जो फैटी एसिड ऑक्सीकरण की बढ़ी हुई दर का समर्थन करता है जो इस राज्य में होता है6. इसके अलावा, पेरोक्सिसोम में सीओए गिरावट में वृद्धि के परिणामस्वरूप पेरोक्सिसोमल फैटी एसिड ऑक्सीकरण में चयनात्मक कमी होती है7. इसलिए, कोशिका के भीतर फैटी एसिड ऑक्सीकरण की प्रक्रिया को फैटी एसिड के सक्रियण, परिवहन और ऑक्सीकरण में शामिल एंजाइमों की अभिव्यक्ति के स्तर और गतिविधियों के साथ-साथ कई उपकोशिकीय डिब्बों में कॉफ़ैक्टर्स और अन्य चयापचयों की सांद्रता द्वारा विनियमित किया जाता है।

फैटी एसिड ऑक्सीकरण को मापने के लिए ऊतक होमोजेनेट्स का उपयोग करने वाली प्रक्रियाएं इस प्रक्रिया को विनियमित और समर्थन करने वाले सेलुलर आर्किटेक्चर को नष्ट कर देती हैं, जिससे डेटा का संग्रह होता है जो विवो चयापचय में सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करता है। जबकि मढ़वाया प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग करने वाली तकनीकें इस प्रणाली को संरक्षित करती हैं, विस्तारित अवधि के लिए पृथक कोशिकाओं को संवर्धन करने से इन विवो जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का नुकसान होता है जो कोशिकाओं में मौजूद था जब वे अभी भी जानवर 8,9 के भीतर रह रहे थे। निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को अलग करने और [1-14सी] पामिटिक एसिड का उपयोग करके अलगाव के तुरंत बाद और निलंबन में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण के लिए उनकी क्षमता परख करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। परख एसिड-घुलनशील चयापचयों (एएसएम) या एसिटाइल-सीओए जैसे उत्पादों से जुड़ी रेडियोधर्मिता के माप पर आधारित है, जो [1-14 सी] पामिटिक एसिड10,11 के β-ऑक्सीकरण द्वारा उत्पादित है।

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Protocol

चूहों पर सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं (सी 57 बीएल / 6 जे, पुरुष, 9-11 सप्ताह की उम्र) को वेस्ट वर्जीनिया विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. हेपेटोसाइट अलगाव

  1. तैयारी
    1. हेपेटोसाइट अलगाव से पहले के दिनों में, तालिका 1 में सूचीबद्ध बफर और सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें। सर्जरी की जाएगी, उसके करीब 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट तापमान के साथ एक पानी का स्नान स्थापित करें।
    2. हेपेटोसाइट अलगाव के दिन, एक लामिना प्रवाह हुड के तहत, बफर 1 के 35 मिलीलीटर को बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और बफर 2 के 70 एमएल को 100 एमएल बाँझ बीकर या बोतल में स्थानांतरित करें।
    3. दोनों बफर में एंटीबायोटिक्स जेंटामाइसिन (50 μg /एमएल) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x) जोड़ें।
    4. बफर 2 के 20 एमएल हस्तांतरण के रूप में कदम 1.1.3 में तैयार करने के लिए एक 100 मिमी सेल संस्कृति पकवान और बर्फ पर जगह है।
    5. एक बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए बफर 2 के शेष 50 एमएल स्थानांतरण। एंटीबायोटिक-पूरक बफ़र्स 1 और 2 युक्त 50 एमएल ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में रखें और छिड़काव शुरू करने से पहले उन्हें कम से कम 15 मिनट तक गर्म होने दें।
      नोट: यदि एक सत्र में कई हेपेटोसाइट्स अलगाव का संचालन करते हैं, तो तदनुसार तैयार करने के लिए बफर 1 और 2 के एंटीबायोटिक-पूरक विभाज्य की संख्या बढ़ाएं।
    6. कोलेजनेज समाधान का एक विभाज्य पिघलाएं और बर्फ पर रखें।
      नोट: यदि ठीक से संग्रहीत किया जाता है, तो कोलेजनेज समाधानों में एंजाइम गतिविधि का कोई महत्वपूर्ण नुकसान नहीं होता है और 3 बार तक पिघल जाता है और तैयारी से 3 सप्ताह के भीतर उपयोग किया जाता है।
    7. सर्जिकल उपकरणों और पेरिस्टाल्टिक पंप तैयार करें। 70% इथेनॉल के 15 मिलीलीटर परिसंचारी द्वारा पेरिस्टाल्टिक पंप की लाइनों को निष्फल करें, इसके बाद 15 मिलीलीटर बाँझ पानी।
    8. बाहर निकलने की रेखा (चित्रा 1 ए) के लिए एक 22 जी सुई कनेक्ट करें। कैथेटर का खोखला फिल्टर एक कनेक्टर के रूप में अच्छी तरह से काम करता है। बफर 1 के साथ लाइनों को भरें और लाइनों, कनेक्टर और सुई का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले फंस गए हैं।

Figure 1
चित्रा 1: छिड़काव उपकरण और सुगंधित यकृत( ए) यकृत को कैन्युलेट और परफ्यूज करने के लिए उपयोग की जाने वाली सुई से जुड़ी आउटलेट लाइन के साथ पेरिस्टाल्टिक पंप। (बी) सफल कैनुलेशन यकृत के तत्काल और सजातीय ब्लैंचिंग द्वारा इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. जिगर छिड़काव और पृथक्करण
    1. वाहक गैस के रूप में चिकित्सा ग्रेड हवा के साथ आइसोफ्लूरेन साँस लेना के माध्यम से एक माउस को संवेदनाहारी करें, प्रेरण के लिए 4% आइसोफ्लूरेन और संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए 1.5% आइसोफ्लूरेन का उपयोग करें। पेडल पलटा के नुकसान का आकलन करके संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें।
    2. जब पैर की अंगुली पिंचिंग का कोई जवाब नहीं होता है, तो माउस को सर्जरी बोर्ड पर लापरवाह स्थिति में रखें, अंगों को बाहर निकालें, और उन्हें पिन के साथ बोर्ड पर सुरक्षित करें।
    3. उदारतापूर्वक 70% इथेनॉल के साथ माउस के पेट और छाती स्प्रे।
    4. संदंश का उपयोग करके, पेट के आधार के पास त्वचा और पेट की दीवार को खींचें और अंगों को उजागर करने के लिए मिडलाइन के दोनों ओर और डायाफ्राम तक पार्श्व रूप से काट लें।
    5. आंतों को दाईं ओर ले जाकर और यकृत के लोब को धीरे-धीरे फ्लिप करके अवर वेना कावा (आईवीसी) का पर्दाफाश करें। आईवीसी को थोड़ा झुकाव करने और इसके कैनुलेशन (चित्रा 1 बी) की सुविधा के लिए माउस के पीछे एक सुई टोपी जैसे एक छोटी बेलनाकार वस्तु डालें।
    6. सबसे कम गति से पंप शुरू करें और बफर 1 बहने के साथ, आईवीसी में सुई डालें।
    7. दबाव को दूर करने के लिए पोर्टल नस को काटें और रक्त और छिड़काव बफर की जल निकासी की अनुमति दें, फिर तुरंत प्रवाह दर को 7 एमएल / यदि सही ढंग से किया जाता है, तो यकृत कुछ सेकंड (चित्रा 1 बी) के भीतर समान रूप से ब्लांच करेगा।
    8. अधिक सुसंगत परिणामों के लिए, छिड़काव की पूरी अवधि के लिए सुई को हाथ से स्थिति में रखें।
    9. गर्म बफर 1 के साथ जिगर को सुगंधित करें। हवा के बुलबुले पेश करने से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि बफर 1 युक्त ट्यूब में डाली गई लाइन लगातार जलमग्न रहती है।
    10. छिड़काव होता है, जबकि बफर 2 के लिए कोलेजनेज समाधान के 130 μL जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग या एक 5 एमएल या 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल विंदुक के साथ सरगर्मी करके मिश्रण।
    11. चूंकि बफर 1 युक्त ट्यूब में मात्रा लगभग 5 एमएल तक कम हो जाती है, धीरे-धीरे ट्यूब के किनारे पाइपिंग करके बफर 2 के 5 एमएल को बफर 1 में जोड़ें। लक्ष्य बफर 1 से बफर 2 में बदलते समय लाइन में हवा के बुलबुले पेश करने से बचना है।
    12. वॉल्यूम 5 एमएल तक फिर से कम होने तक प्रतीक्षा करें और धीरे-धीरे बफर 2 का एक और 5 एमएल जोड़ें। इसे एक बार और दोहराएं। जैसा कि बफर 2 बफर 1 की जगह लेता है और पृथक्करण शुरू होता है, यकृत सूज जाएगा।
    13. मूल रूप से बफर 1 युक्त ट्यूब के लिए शेष बफर 2 जोड़ें। ट्यूब में बफर 2 के बारे में 5-10 मिलीलीटर छोड़ दिया है जब छिड़काव बंद करो।
      नोट: जबकि बफर 2 यकृत को सुगंधित कर रहा है, पोर्टल नस को रुक-रुक कर 5 एस के लिए संदंश के साथ क्लैंप किया जा सकता है। यह कदम वैकल्पिक है, लेकिन पूरे यकृत में दबाव में परिणामी वृद्धि इसके पृथक्करण में सुधार कर सकती है और इस प्रकार, अंतिम हेपेटोसाइट उपज।
    14. ध्यान से जिगर का उत्पादन करें और इसे 100 मिमी संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें जिसमें 20 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा बफर 2 चरण 1.1.4 पर अलग सेट किया गया है।
    15. लामिना प्रवाह हुड के तहत, धीरे-धीरे सर्जिकल कैंची और चिमटी का उपयोग करके यकृत को अलग करें।
    16. हेपेटोसाइट निलंबन में लगभग 20 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा एम 199 जोड़ें और बड़े जिगर के टुकड़ों से अतिरिक्त हेपेटोसाइट्स की रिहाई को धीरे-धीरे बढ़ावा देने के लिए सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करके 100 μm सेल छलनी के माध्यम से इसे फ़िल्टर करें।
    17. संग्रह ट्यूब भरा होने तक अतिरिक्त एम 199 के साथ 100 मिमी संस्कृति पकवान और सेल छलनी धो लें।
    18. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 50 एक्स जी पर निलंबन अपकेंद्रित्र। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और धीरे-धीरे घूमने से ठंडे एम 199 के 30 मिलीलीटर में हेपेटोसाइट गोली को फिर से निलंबित करें।
    19. चरण 1.2.18 में उल्लिखित हेपेटोसाइट्स को गोली दें। धोने को एक बार और दोहराएं।
    20. गर्म एम 199 के 10 एमएल में हेपेटोसाइट्स को फिर से निलंबित करें और ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण विधि और हेमोसाइटोमीटर12 का उपयोग करके व्यवहार्यता और उपज निर्धारित करें।
    21. एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एम 199 में कोशिकाओं को पतला करें और तुरंत परख शुरू करें।

2. फैटी एसिड β ऑक्सीकरण परख

नोट: परख ट्रिप्लिकेट में आयोजित की जाती है, और प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण में 750,000 कोशिकाएं, 1.35 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 100 μM पामिटिक एसिड और 0.4 μCi [1-14सी] पामिटिक एसिड 2 एमएल की अंतिम मात्रा में होता है।
सावधानी: रेडियोधर्मी यौगिक खतरनाक हैं। संस्थागत, राज्य और संघीय नियमों के अनुसार रेडियोधर्मी सामग्री की खरीद, संभाल, भंडारण और निपटान करें।

  1. तैयारी
    1. परख से पहले के दिनों में, पामिटिक एसिड और बीएसए समाधान (तालिका 1) तैयार करें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. परख के दिन, यकृत छिड़काव शुरू करने से पहले 2.1.3-2.1.9 चरणों को पूरा करें।
    3. पामिटिक एसिड और बीएसए समाधान को पिघलाएं। तालिका 2 में दिखाए गए एक विशिष्ट परख सेटअप के साथ कई प्रतिक्रियाओं प्लस 20% -30% अतिरिक्त के लिए सब्सट्रेट मिश्रण तैयार करें।
    4. एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में प्रति प्रतिक्रिया बीएसए समाधान के विभाज्य 13.5 μL और 41 डिग्री सेल्सियस तक गर्म, फिर प्रति प्रतिक्रिया 200 एमएम पामिटिक एसिड समाधान (बीएसए: पामिटिक एसिड दाढ़ अनुपात = 1: 5) का 1 μL जोड़ें।
      नोट: एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट और उचित युक्तियों के साथ रेडियोधर्मी और गैर-रेडियोधर्मी पामिटिक एसिड समाधान जैसे कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करके तैयार समाधानों को वितरित करना बेहतर है।
    5. भंवर सख्ती से और घुलनशील पामिटिक एसिड के गठन की सुविधा के लिए 41 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं: बीएसए कॉम्प्लेक्स। इनक्यूबेशन अवधि के दौरान कभी-कभी भंवर।
    6. मिश्रण शुरू में बादल दिखाई देगा लेकिन 41 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 20-30 मिनट के बाद पूरी तरह से स्पष्ट हो जाएगा। प्रतिक्रियाओं को शुरू करने के लिए तैयार होने तक इसे 41 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    7. प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में 1 एम पर्क्लोरिक एसिड के 133 μL विभाज्य।
      सावधानी: पर्क्लोरिक एसिड एक मजबूत एसिड और एक मजबूत ऑक्सीडेंट है। इस यौगिक को संभालने के लिए उपयुक्त सुरक्षात्मक गियर की आवश्यकता होती है।
    8. एक ट्यूब में प्रति प्रतिक्रिया एम 199 के 485.5 μL को विभाज्य करें और रेडियोधर्मी बीएसए को पतला करने के लिए इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें: प्रतिक्रियाओं को शुरू करने से पहले चरण 2.1.4-2.1.6 पर तैयार पामिटिक एसिड कॉम्प्लेक्स।
    9. नमूनों के रूप में कई 14 एमएल गोल तल ट्यूबों में एम 199 के 750 μL वितरण। यदि वांछित है, तो फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण के अवरोधक जोड़ें, जैसे कि एटोमोक्सिर, रोटेनोन और एंटीमाइसिन, जिसमें वाहन नियंत्रण (तालिका 2) शामिल है।
    10. हेपेटोसाइट धोने के चरणों के दौरान, प्रतिक्रियाओं को शुरू करने से पहले 10-15 मिनट, चरण 2.1.9 पर तैयार ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए एक मिलाते हुए पानी के स्नान में स्थानांतरित करें और 180-200 आरपीएम पर मिलाते हुए।
  2. फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं को शुरू करना, रोकना और विश्लेषण करना
    1. यदि हेपेटोसाइट्स की व्यवहार्यता स्वीकार्य है (आमतौर पर ≥ 75%, चित्रा 2), प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, स्पष्ट बीएसए युक्त माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में [1-14सी] पामिटिक एसिड (0.5 एमसीआई / एमएल) के 0.8 μL स्थानांतरित करें: पामिटिक एसिड समाधान (चरण 2.1.4-2.1.6)। भंवर और 41 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान के लिए वापसी।
    2. हेपेटोसाइट्स को 37 डिग्री सेल्सियस तक संतुलित करने और उन्हें अवरोधकों (यदि मौजूद हो) के साथ पूर्व-इनक्यूबेट करने के लिए, अंतिम हेपेटोसाइट पुन: निलंबन (चरण 1.2.21) के तुरंत बाद, 1 एमएल पिपेट के साथ हेपेटोसाइट निलंबन के 750 μL को हिलाने वाले पानी के स्नान में 14 एमएल राउंड-बॉटम ट्यूबों में से प्रत्येक में स्थानांतरित करें (चरण 2.1.9-2.1.10) और भंवर संक्षेप में
    3. 30 एस द्वारा प्रत्येक जोड़ कंपकंपी और 15 मिनट के लिए सेते हैं। प्रोटीन निर्धारण के लिए एक नमूना बचाने के लिए, हेपेटोसाइट्स के एक और विभाज्य को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 3,000 एक्स जी पर स्पिन करें।
      नोट: वितरण करते समय, हेपेटोसाइट निलंबन को नमूनों में सेल नंबर में बसने और बड़ी परिवर्तनशीलता को रोकने के लिए डिस्पेंसिंग 1 एमएल पिपेट के साथ लगातार घुमाया या धीरे-धीरे हिलाया जाना चाहिए।
    4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और परिणाम (चित्रा 3) को सामान्य करने के लिए नमूने में प्रोटीन की कुल मात्रा को मापने के लिए तैयार होने तक गोली को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. जबकि हेपेटोसाइट्स 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-इनक्यूबेशन के तहत हैं, रेडियोधर्मी बीएसए जोड़ें: 2.1.8 में गर्म माध्यम में पामिटिक एसिड कॉम्प्लेक्स, और प्रतिक्रियाओं को शुरू करने के लिए तैयार होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। यह अंतिम सब्सट्रेट मिश्रण है।
    6. प्रतिक्रियाओं को शुरू करने के लिए, पानी के स्नान से हेपेटोसाइट्स को हटा दें और सब्सट्रेट मिश्रण के 500 μL जोड़ें।
    7. 5 एस के लिए कम गति पर भंवर पूरी तरह से कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने और पानी के स्नान में लौटने के लिए। सभी नमूनों के साथ दोहराएं, 30 एस से चौंका देने वाला।
    8. 15 मिनट के लिए सेते हैं। प्रतिक्रियाओं का एक सेट शुरू करें और पृष्ठभूमि रेडियोधर्मिता (तालिका 2) निर्धारित करने के लिए तुरंत रोकें (चरण 2.2.10-2.2.11 देखें)।
    9. बचे हुए सब्सट्रेट मिश्रण के डुप्लिकेट विभाज्य (200-250 μL) को 6 एमएल जगमगाहट शीशियों में स्थानांतरित करें और गिनती करने के लिए अलग सेट करें। सब्सट्रेट मिश्रण के 500 μL में ऑक्सीकरण के लिए उपलब्ध पामिटिक एसिड के कुल एनएमओएल के अनुरूप रेडियोधर्मिता की गणना करने के लिए इन गिनती का उपयोग करें।
    10. प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए, पानी के स्नान से हेपेटोसाइट्स को हटा दें, मध्यम गति से भंवर करके हेपेटोसाइट्स को फिर से निलंबित करें, और फिर हेपेटोसाइट निलंबन के 400 μL को पर्क्लोरिक एसिड युक्त माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    11. तुरंत ट्यूबों को कैप करें। सभी नमूनों के लिए इस अनुक्रम को दोहराएं, 30 एस से चौंका देने वाला।
    12. सख्ती से 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों भंवर और उन्हें 10 मिनट के लिए 13,000 एक्स जी पर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों के नीचे स्पिन।
    13. सतह पर तैरनेवाला के 300 μL को 6 मिलीलीटर जगमगाहट शीशी में स्थानांतरित करें, जगमगाहट द्रव के 4 मिलीलीटर जोड़ें, और नमूनों में रेडियोधर्मिता की गणना करें और सब्सट्रेट मिश्रण विभाज्य (चरण 2.2.9) एक जगमगाहट काउंटर में।
      सावधानी: सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद, फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण द्वारा उत्पन्न 14सी-एसिटाइल-सीओए के पूर्ण ऑक्सीकरण द्वारा उत्पादित 14सी-सीओ2 को सांस लेने से बचने के लिए एक धूआं हुड के नीचे ट्यूबों को खोलें और अम्लीय स्थितियों द्वारा जारी किया गया।
बफ़र्स/मीडिया घटक राशि अंतिम एकाग्रता निर्देश
समाधान सी
केसीएल 1.79 ग्राम 480 एमएम 50 एमएल में पानी डालें।  4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
एमजीएसओ4 हेप्टाहाइड्रेट 1.48 ग्राम 120 एमएम
केएच2पीओ4 0.81 ग्राम 119 एमएम
क्रेब्स-हेन्सेलाइट बफर (केएचबी), कैल्शियम मुक्त
एनएसीएल 7.0 ग्राम 120 एमएम 900 एमएल में पानी जोड़ें, पीएच को 7.4 में समायोजित करें, और अंतिम मात्रा को 1 एल में लाएं।
एनएएचसीओ3 2.0 ग्राम 24 एमएम
1 एम एचईपीईएस पीएच 7.45 5 मिलीलीटर 5 एमएम
ग्लूकोज़ 1 या 2 ग्राम 5.6 या 11 एमएम
समाधान सी 10 मिलीलीटर
बफर 1
केएचबी 500 मिलीलीटर घटकों को मिलाएं और फ़िल्टर निष्फल करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
50 एमएम ईजीटीए 1.0 मिलीलीटर 0.1 एमएम
बफर 2
केएचबी 500 मिलीलीटर घटकों को मिलाएं और फ़िल्टर निष्फल करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
1 एम सीएसीएल2 डाइहाइड्रेट 686 μL 1.4 एमएम
जेंटामाइसिन समाधान
जेंटामाइसिन सल्फेट 0.5 ग्राम 50 मिलीग्राम / 10 मिलीलीटर में पानी जोड़ें और फ़िल्टर निष्फल करें। विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
कोलेजनेज समाधान
कोलेजनेज मैं और द्वितीय मिश्रण 10 मिलीग्राम 7 मिलीग्राम / शीशी की पूरी सामग्री को 1.43 मिलीलीटर पानी में भंग करें।  विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
एम 199
एम 199 1 थैली 900 एमएल में पानी जोड़ें और पीएच को 7.2-7.4 में समायोजित करें। अंतिम मात्रा को 1 एल में लाएं और फ़िल्टर निष्फल करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
एनएएचसीओ3 2.2 ग्राम 26 एमएम
1 एम एचईपीईएस (सेल संस्कृति ग्रेड) 25 मिलीलीटर 25 एमएम
अतिरिक्त ग्लूकोज (केवल खिलाए गए चूहों के लिए) 1 ग्राम 11 एमएम
बीएसए समाधान
फैटी एसिड मुक्त बीएसए 400 मिलीग्राम 20% (डब्ल्यू / 2 मिलीलीटर पानी में घुल जाएं।  विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
गैर-रेडियोधर्मी पामिटिक एसिड समाधान
पामिटिक एसिड 103 मिलीग्राम 200 एमएम इथेनॉल के 2 एमएल में भंग करें, -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
1 एम पर्क्लोरिक एसिड
70% पर्क्लोरिक एसिड 3.5 मिलीलीटर 1 एम पानी के साथ 40 मिलीलीटर तक पतला करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें

तालिका 1: बफ़र्स, मीडिया, और हेपेटोसाइट अलगाव और फैटी एसिड β ऑक्सीकरण परख के लिए आवश्यक अन्य समाधान

प्रतिक्रिया संख्या एम 199 ± अवरोधक हेपेटोसाइट निलंबन (μL) सब्सट्रेट मिश्रण (μL)
आयतन (μL) एटोमोक्सिर
1 750 - 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्म 750 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व सेते हैं 500 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं
2
3
4 +
5
6
7 + तुरंत बंद करो
8
9

तालिका 2: एटोमोक्सिर की उपस्थिति और अनुपस्थिति में ट्रिप्लिकेट में परख किए गए हेपेटोसाइट निलंबन के लिए प्रयोगात्मक सेटअप का उदाहरण।

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Representative Results

यहां वर्णित यकृत छिड़काव आमतौर पर 80% की औसत व्यवहार्यता के साथ 30-40 मिलियन कोशिकाओं / यकृत की पैदावार करता है, जैसा कि ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण (चित्रा 2) द्वारा अनुमान लगाया गया है। क्रेब्स-हेन्सेलाइट बफर (केएचबी) में ग्लूकोज की विशिष्ट एकाग्रता, जिसका उपयोग छिड़काव बफर 1 और 2 तैयार करने के लिए किया जाता है, 11 एमएम है। उपवास वाले चूहों से पृथक हेपेटोसाइट्स में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण को मापते समय, केएचबी में ग्लूकोज की एकाग्रता को उपवास की स्थिति का बेहतर प्रतिनिधित्व करने के लिए कम किया जा सकता है। जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, ग्लूकोज एकाग्रता को 5.6 एमएम तक कम करने से हेपेटोसाइट्स की उपज या व्यवहार्यता पर कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं पड़ता है।

तालिका 2 सीपीटी 1 के एक शक्तिशाली अवरोधक एटोमोक्सिर की उपस्थिति और अनुपस्थिति में ट्रिप्लिकेट में परख किए गए हेपेटोसाइट निलंबन के लिए एक विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटअप दिखाती है और इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल फैटी एसिड ऑक्सीकरण10,13। माइटोकॉन्ड्रियल फैटी एसिड ऑक्सीकरण के इस या अन्य अवरोधकों की उपस्थिति में, [1-14सी] पामिटिक एसिड ऑक्सीकरण द्वारा उत्पन्न किसी भी अवशिष्ट 14 सी-लेबल वाले उत्पादों को पेरोक्सीसोम में β-ऑक्सीकरण के पहले चक्र के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इस प्रकार, कुल फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण में माइटोकॉन्ड्रियल फैटी एसिड ऑक्सीकरण के योगदान की गणना कुल (-एटोमोक्सिर) और पेरोक्सिसोमल (+ एटोमोक्सिर) फैटी एसिड ऑक्सीकरण 7,14,15 (चित्रा 3) के बीच अंतर के रूप में की जा सकती है।

हेपेटोसाइट्स के लिए, [1-14 सी] पामिटिक एसिड के β-ऑक्सीकरण के उत्पादों से जुड़ी रेडियोधर्मिता का 95% से अधिक एएसएम में पाया जाता है, और बाकी को 14सी-सीओ210 के रूप में जारी किया जाता है। पृष्ठभूमि रेडियोधर्मिता से जुड़ी गिनती प्रति मिनट (सीपीएम) [1-14सी] पामिटिक एसिड के बैच के साथ भिन्न होती है। हालांकि, वे अभी भी 15 मिनट (चित्रा 3 ए) के लिए सब्सट्रेट मिश्रण के साथ सेते करने की अनुमति नमूनों में प्राप्त सीपीएम की तुलना में काफी कम हैं। जैसा कि अपेक्षित था, उपवास वाले चूहों से पृथक हेपेटोसाइट्स माइटोकॉन्ड्रियल और पेरोक्सीसोमल फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण दोनों की दरों में एक मजबूत वृद्धि दिखाते हैं, जो इन मार्गों 16,17,18,19 के ज्ञात सक्रियण के अनुरूप है।

Figure 2
चित्रा 2: यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके पृथक हेपेटोसाइट्स की व्यवहार्यता और उपज। हेपेटोसाइट्स को पुरुष चूहों से अलग किया गया था विज्ञापन लिबिटम खिलाया गया था या पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ 16-18 घंटे के लिए रात भर उपवास किया गया था। (ए) हेपेटोसाइट व्यवहार्यता और (बी) यकृत प्रति उपज। डेटा को एसईएम के ± व्यक्तिगत हेपेटोसाइट तैयारी (हलकों) पर माप के औसत (सलाखों) के रूप में रिपोर्ट किया जाता है खिलाया और उपवास चूहों से अलग हेपेटोसाइट्स की तुलना एक अप्रकाशित दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। * पी < 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण क्षमता हेपेटोसाइट्स में खिलाया और उपवास पुरुष चूहों से अलग और निलंबन में परख। सब्सट्रेट मिश्रण के अलावा से पहले ताजा पृथक हेपेटोसाइट्स को एटोमोक्सिर (45 μM, +Eto) या डीएमएसओ (वाहन, -ईटो) के साथ पूर्व-ऊष्मायन किया गया था। (ए) कुल सीपीएम प्रत्येक परख में पेश किया गया और पृष्ठभूमि रेडियोधर्मिता, कुल (-ईटो), पेरोक्सिसोमल (+ ईटो), और माइटोकॉन्ड्रियल फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण का अनुमान लगाने के लिए स्थापित प्रतिक्रियाओं के एएसएम अंश में बरामद किया गया। ये डेटा किसी भी सुधार (पृष्ठभूमि, सेल नंबर, या प्रोटीन स्तर के लिए) या किसी अन्य गणना को लागू करने से पहले दिखाए जाते हैं। (बी) पृष्ठभूमि के लिए (ए) में डेटा, परख की कुल मात्रा, 1 मिलियन व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए सामान्यीकृत और उस दर के रूप में व्यक्त किया जाता है जिस पर पामिटिक एसिड को खिलाया और उपवास चूहों से अलग हेपेटोसाइट्स में ऑक्सीकरण किया जाता है। (सी) अनुमानित 750,000 हेपेटोसाइट्स / परख के अनुरूप कुल प्रोटीन का उपयोग किया जाता है। (डी) में डेटा (ए) (बी) के रूप में सही किया गया है लेकिन प्रोटीन के मिलीग्राम के लिए सामान्यीकृत है। डेटा को एसईएम के ± व्यक्तिगत हेपेटोसाइट तैयारी (हलकों) पर माप के औसत (सलाखों) के रूप में रिपोर्ट किया जाता है खिलाया और उपवास चूहों से अलग हेपेटोसाइट्स की तुलना एक अप्रकाशित दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। * पी < 0.05; ** पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यकृत छिड़काव के दौरान, हवा के बुलबुले की शुरूआत से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे यकृत में माइक्रोकेशिकाओं को अवरुद्ध करते हैं, बफर परिसंचरण को रोकते हैं या प्रतिबंधित करते हैं और समग्र रूप से हेपेटोसाइट उपज और व्यवहार्यता20,21 को कम करते हैं। सावधानियां, जैसे कि आईवीसी के कैनुलेशन से पहले बफर से भरी इनलेट लाइन का बारीकी से निरीक्षण करना और बफर 2 पर स्विच करने के लिए बफर 1 युक्त ट्यूब से इनलेट लाइन को उठाने से बचना, जैसा कि यहां वर्णित है, असफल छिड़काव (व्यवहार्यता <70%) की संख्या को सफलतापूर्वक कम कर सकता है। छिड़काव प्रणाली में बुलबुला जाल का उपयोग भी इस जोखिम20,21 को काफी कम कर सकता है।

कोलेजनेज गतिविधि हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर है, ऐतिहासिक रूप से12,20 अधिग्रहित प्रत्येक नए बैच के परीक्षण और अनुकूलन की आवश्यकता होती है। कोलेजनेज के अत्यधिक शुद्ध और परिभाषित मिश्रण का उपयोग नाटकीय रूप से बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता को कम करता है, प्रत्येक नए बैच का परीक्षण करने की आवश्यकता को समाप्त करता है। इसके अलावा, जब इन मिश्रणों का उपयोग किया जाता है, तो उपयोग की जाने वाली मात्रा में छोटे समायोजन (±10-20 μL) आमतौर पर हेपेटोसाइट तैयारी की उच्च पैदावार या व्यवहार्यता को बहाल करने के लिए पर्याप्त होते हैं।

हेपेटोसाइट्स नाजुक कोशिकाएं हैं। कतरनी क्षति और लिसिस को कम करने के लिए धीरे-धीरे घूमने या पाइपिंग करके सभी पुन: निलंबन और वितरण चरणों को धीरे-धीरे किया जाना चाहिए। वाइड-बोर युक्तियों का उपयोग हेपेटोसाइट क्षति को और कम कर सकता है। परख के चरण 2.2.2 और 2.2.7 पर भंवर सबसे कम सेटिंग संभव है कि अभी भी घटकों के अच्छा मिश्रण सुनिश्चित करता है पर किया जाना चाहिए।

पारंपरिक प्रोटोकॉल 20,21,22 की तुलना में, यहां वर्णित हेपेटोसाइट अलगाव प्रक्रिया में पेश किए गए प्रमुख परिवर्तनों में से एक ऑपरेटर द्वारा स्थिति में आयोजित हाइपोडर्मिक सुई के सम्मिलन के साथ अंतःशिरा कैथेटर सम्मिलन और बंधाव का प्रतिस्थापन है। यह संशोधन दो मुख्य लाभ प्रदान करता है। सबसे पहले, यह अंतःशिरा कैथेटर के अंत को लाइन से जोड़ते समय हवा के बुलबुले पेश करने के जोखिम को कम करता है, क्योंकि आईवीसी में हाइपोडर्मिक सुई डालने पर बफर पहले से ही बह रहा है। दूसरा, यह कैथेटर के जोड़तोड़ के दौरान आईवीसी को छिद्रित करने के जोखिम को कम करता है, जैसे कि सुई का पीछे हटना या टांके के साथ इसकी सुरक्षा। इस संशोधन की कमियों में से एक यह है कि प्रक्रिया की लगातार सफलता सुनिश्चित करने के लिए छिड़काव की अवधि के लिए सुई को हाथ से पकड़ना आमतौर पर आवश्यक है। यह सर्जरी करने वाले व्यक्ति के लिए थकाऊ हो सकता है और एक सत्र में किए जा सकने वाले लगातार छिड़काव की संख्या को सीमित कर सकता है। सुई को पकड़ने वाले व्यक्ति के आंदोलनों को सीमित करने के लिए, जो आईवीसी के अनजाने छिद्र का कारण बन सकता है, जोड़े में काम करना उचित है, एक व्यक्ति सर्जरी का संचालन करता है और दूसरा व्यक्ति छिड़काव में रुकावट के बिना छिड़काव बफर बदलता है। कई बैक-टू-बैक छिड़काव के लिए प्रत्येक पूर्ण हेपेटोसाइट अलगाव के 1-2 मिनट के भीतर फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण परख शुरू करने के लिए एक तीसरे व्यक्ति की आवश्यकता होगी।

अन्य हेपेटोसाइट अलगाव विधियों के समान, यहां वर्णित प्रक्रिया हेपेटोसाइट्स पैदा करती है जिसका उपयोग निलंबन या संस्कृति में विभिन्न प्रकार की अन्य यकृत प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें अतिरिक्त चयापचय मार्ग और विभिन्न उपचारों के कारण जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तनशामिल हैं 23,24,25. हेपेटोसाइट्स की संस्कृति के लिए, चरण 1.2.20-1.2.21 को उचित माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करके आसानी से संशोधित किया जा सकता है, इसके बाद सेल संस्कृति व्यंजनों में चढ़ाना और20,22,26 इनक्यूबेशन। इसके अलावा, जबकि β-ऑक्सीकरण परख के लिए आवश्यक नहीं है, यदि अन्य अनुप्रयोगों द्वारा आवश्यक हो, तो व्यवहार्य हेपेटोसाइट्स का प्रतिशत एक पेरकोल परत22,26 के माध्यम से मृत कोशिकाओं को हटाकर बढ़ाया जा सकता है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल बरकरार हेपेटोसाइट्स में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण की दर को मापने के लिए एक मजबूत परख का वर्णन करता है और बहिर्जात कॉफ़ैक्टर्स के अलावा के बिना, इस प्रकार इस मार्ग के अंतर्जात नियामक तंत्र को संरक्षित करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को रॉबर्टा लियोनार्डी को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ अनुदान आर 35 जीएम 119528 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(R)-(+)-Etomoxir sodium salt Tocris Bioscience 4539/10
[1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL American Radiolabeled Chemicals ARC 0172A
1 M HEPES, sterile Corning 25060CI
10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette Mettler Toledo 17008604
1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips
5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes
50 mL sterile centrifuge tubes CellTreat 229421
70% Perchloric acid Fisher Scientific A2296-1LB
BSA, fatty acid-free Fisher Scientific BP9704100
CaCl2 dihydrate MilliporeSigma 223506
D-(+)-Glucose MilliporeSigma G7021
EGTA Gold Biotechnology E-217
Ethanol Pharmco 111000200CSPP
Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile CellTreat 229707
Gentamicin sulphate Gold Biotechnology G-400-25
HDPE, 6.5 mL scintillation vials Fisher Scientific 03-342-3
Hemocytometer
Hypodermic needles 22 G, 1.5 in BD Biosciences 305156
Isoflurane VetOne 502017
KCl Fisher Scientific BP366-1
KH2PO4 MilliporeSigma P5655
Liberase TM Research Grade MilliporeSigma 5401119001 Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin
M199 medium MilliporeSigma M5017
MgSO4 heptahydrate MilliporeSigma M1880
Microcentrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Microdissecting Scissors Roboz Surgical Instrument Co RS-5980
NaCl Chem-Impex International 30070
NaHCO3 Acros Organics 424270010
Palmitic acid MilliporeSigma P0500
Penicillin/streptomycin (100x) Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Cytiva Life Sciences SH30256.01
Positive displacement pipette MR-10, 10 µL Mettler Toledo 17008575
Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes Eppendorf 5810 R
Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes Fisher Scientific 14-956-9A
Scintillation counter Perkin Elmer TriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD cocktail Fisher Scientific SX18-4
Shaking water bath, 30 L capacity New Brunswick Scientific  Model G76
Sterile cell strainers, 100 µm Fisher Scientific 22363549
Thumb Dressing Forceps Roboz Surgical Instrument Co RS-8120
Trypan Blue Corning 25900CI
Variable-flow peristaltic pump Fisher Scientific 138762
Water baths, 2–2.5 L capacity

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References

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जैव रसायन अंक 175
ताजा पृथक माउस हेपेटोसाइट्स के निलंबन में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण का मापन
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Vickers, S. D., Saporito, D. C.,… More

Vickers, S. D., Saporito, D. C., Leonardi, R. Measurement of Fatty Acid β-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (175), e62904, doi:10.3791/62904 (2021).

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