Summary
Yağ asidi β-oksidasyonu, hepatositler de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde enerji üretmekten sorumlu önemli bir metabolik yoldur. Burada, 14C etiketli palmitik asit kullanarak taze izole edilmiş primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Yağ asidi β-oksidasyonu, karaciğerin enerji taleplerini karşılamak ve tüm vücut glikoz homeostazını korumak ve açlık durumunda ekstra-hepatik organ fonksiyonunu desteklemek için gerekli olan ketogenez ve glukoneogenez gibi ek işlemler için substratlar ve kofaktörler sağlamak için önemli bir metabolik yoldur. Yağ asidi β-oksidasyonu, mitokondri ve peroksizomlarda meydana gelir ve yağ asitlerinin alımı ve aktivasyonu, enzim ekspresyon seviyeleri ve koenzim A ve NAD + gibi kofaktörlerin mevcudiyeti dahil olmak üzere çoklu mekanizmalarla düzenlenir. Karaciğer homojenatlarında yağ asidi β-oksidasyonunu ölçen tahlillerde, hücre lizisi ve kofaktörlerin suprafizyolojik seviyelerinin yaygın olarak eklenmesi, bu düzenleyici mekanizmaların etkilerini maskelemektedir. Ayrıca, homojenatlardaki organellerin bütünlüğünün kontrol edilmesi zordur ve preparatlar arasında önemli ölçüde değişebilir. Bozulmamış primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunun ölçümü yukarıdaki tuzakların üstesinden gelir. Bu protokol, 14C etiketli palmitik asit ile inkübe edilmiş taze izole edilmiş birincil fare hepatositlerinin bir süspansiyonunda yağ asidi β-oksidasyonunun ölçülmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Saatlerce kültürden kaçınarak, bu yöntem, beslenen farelere kıyasla oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde gözlenen yağ asidi β-oksidasyonunun aktivasyonu da dahil olmak üzere, orijinal karaciğerin protein ekspresyon seviyelerini ve metabolik yol aktivitesini daha iyi koruma avantajına sahiptir.
Introduction
Yağ asidi β-oksidasyonu, lipid metabolizmasında önemli bir süreçtir ve yağ asidi sentezini ve diyetten alımını dengelemek için katabolik bir yol sağlar. Bu süreç, kalp kası, böbrek korteksi ve oruç tutmuş karaciğer dahil olmak üzere birçok organ için enerji üretir ve diyet, yağ dokusu lipolizi ve iç trigliserit depolarından elde edilen yağ asitlerini kullanır 1,2.
Yağ asidinin β-oksidasyon yolundan oksidasyonu, yağ açil zincirinin bir seferde iki karbon tarafından sırayla kısalmasına neden olur, asetil-CoA olarak salınır ve bu işlem hem mitokondride hem de peroksizomlarda gerçekleşir. Çoğu yağ asidi sadece β oksidasyona uğrarken, bazıları bu yola girmeden önce farklı karbonlarda oksitlenir. Örneğin, fitanik asit gibi 3-metil ikame edilmiş yağ asitleri, α-oksidasyon yoluna girmeden önce peroksizomlarda β-oksidasyon ile bir karbonun uzaklaştırılmasına uğrar. Benzer şekilde, bazı yağ asitleri ilk önce endoplazmik retikulumdaki terminal metil grubunun (ω-oksidasyon) oksidasyonu ile dikarboksilik yağ asitlerine dönüştürülür ve tercihen peroksizomlarda β-oksidasyon3 ile oksitlenir.
Spesifik organelden bağımsız olarak, bir yağ asidi önce β-oksidasyon yolundan oksitlenmek üzere bir koenzim A (CoA) tiyoesterine veya açil-CoA'ya dönüştürülmelidir. β-Mitokondriyal matriksteki uzun zincirli açil-CoAs'ın oksidasyonu, translokasyonları için karnitin mekiğine ihtiyaç duyar, burada karnitin palmitoyltransferaz 1 (CPT1), açil-CoAs'ın asilkarnitinlere dönüşümünü katalize eder ve bu işlemde hız sınırlayıcı enzimdir4. Mitokondriyal matrise aktarıldıktan sonra, açil-CoAs yeniden oluşturulur ve mitokondriyal β-oksidasyon makineleri için substratlar olarak işlev görür. Oruç tutulan durumda, hepatik mitokondride β-oksidasyon yoluyla üretilen asetil-CoA öncelikle ketogeneze kanalize edilir. Peroksizomlar, çok uzun zincirli, dallı zincirli ve dikarboksilik yağ asitlerinin β oksidasyonu için birincil bölge olarak işlev görür. Peroksizomlar, karnitin mekiğinin yağ asidi substratlarını ithal etmesini gerektirmez, bunun yerine ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ABCD1-35'in aktivitesi yoluyla karşılık gelen açil-CoAs'ı ithal eder. Peroksizomlar içinde, açil-CoA'lar daha sonra mitokondriyal yağ asidi β-oksidasyon makinesinden farklı olarak özel bir enzim seti tarafından oksitlenir. Hem mitokondri hem de peroksizomlar, yağlı açil zincirlerini oksitlemek için NAD + ve serbest CoA tedariki gerektirir. Karaciğerdeki CoA seviyelerinin, açlığa yanıt olarak arttığı ve bu durumda meydana gelen yağ asidi oksidasyon oranının artmasını desteklediği gösterilmiştir6. Ayrıca, peroksizomlarda artan CoA bozunumu, peroksizomal yağ asidi oksidasyonunda seçici bir azalmaya nedenolur 7. Bu nedenle, hücre içindeki yağ asidi oksidasyon süreci, yağ asitlerinin aktivasyonu, taşınması ve oksidasyonunda yer alan enzimlerin ekspresyon seviyeleri ve aktivitelerinin yanı sıra çoklu hücre altı bölmeler boyunca kofaktörlerin ve diğer metabolitlerin konsantrasyonları ile düzenlenir.
Yağ asidi oksidasyonunu ölçmek için doku homojenatları kullanan prosedürler, bu süreci düzenleyen ve destekleyen hücresel mimariyi tahrip eder ve bu da in vivo metabolizmayı doğru bir şekilde yansıtmayan bir veri toplanmasına yol açar. Kaplanmış primer hepatositleri kullanan teknikler bu sistemi korurken, izole hücrelerin uzun süre kültürlenmesi, hala hayvan içinde yaşarken hücrelerde bulunan in vivo gen ekspresyon profilinin kaybına neden olur 8,9. Aşağıdaki protokol, primer hepatositleri izole etmek ve [1-14C] palmitik asit kullanarak, izolasyondan hemen sonra ve süspansiyonda yağ asidi β-oksidasyon kapasitelerini test etmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Tahlil, asitte çözünür metabolitler (ASM) veya [1-14 C] palmitik asit10,11'in β-oksidasyonu ile üretilen asetil-CoA gibi ürünlerle ilişkili radyoaktivitenin ölçümüne dayanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareler (C57BL / 6J, erkekler, 9-11 haftalık) üzerindeki tüm deneysel prosedürler, Batı Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hepatosit izolasyonu
- Hazırlık
- Hepatosit izolasyonundan önceki günlerde, Tablo 1'de listelenen tamponları ve hücre kültürü ortamını hazırlayın. Ameliyatın yapılacağı yere yakın sıcaklık 37 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu kurun.
- Hepatosit izolasyonu gününde, laminer bir akış başlığı altında, 35 mL Tampon 1'i steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne ve 70 mL Tampon 2'yi 100 mL'lik steril bir beher veya şişeye aktarın.
- Her iki tampona da gentamisin (50 μg / mL) ve penisilin / streptomisin (1x) antibiyotik ekleyin.
- Adım 1.1.3'te hazırlanan 20 mL Tampon 2'yi 100 mm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
- Kalan 50 mL Tampon 2'yi steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Antibiyotik takviyeli Tampon 1 ve 2'yi içeren 50 mL tüpleri 37 ° C'de ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve perfüzyona başlamadan önce en az 15 dakika ısınmalarına izin verin.
NOT: Bir seansta birden fazla hepatosit izolasyonu yapıyorsanız, buna göre hazırlanmak için Tampon 1 ve 2'nin antibiyotik takviyeli alikotlarının sayısını artırın. - Bir aliquot kollajenaz çözeltisini çözün ve buz üzerinde tutun.
NOT: Uygun şekilde saklanırsa, dondurulmuş ve 3 defaya kadar çözülmüş ve hazırlandıktan sonraki 3 hafta içinde kullanılan kollajenaz çözeltilerinde önemli bir enzim aktivitesi kaybı yoktur. - Cerrahi aletleri ve peristaltik pompayı hazırlayın. Peristaltik pompanın hatlarını 15 mL% 70 etanol, ardından 15 mL steril su sirküle ederek sterilize edin.
- Çıkış hattına 22 G'lik bir iğne bağlayın (Şekil 1A). Bir kateterin içi boş filtresi bir konektör olarak iyi çalışır. Hatları Arabellek 1 ile doldurun ve hava kabarcığı sıkışmadığından emin olmak için çizgileri, konektörü ve iğneyi inceleyin.
Şekil 1: Perfüzyon aparatı ve perfüze karaciğer. (A) Karaciğeri kanüle etmek ve perfüze etmek için kullanılan iğneye bağlı çıkış hattına sahip peristaltik pompa. (B) Başarılı kanülasyon, karaciğerin derhal ve homojen bir şekilde ağartılması ile gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Karaciğer perfüzyonu ve ayrışması
- Bir fareyi, taşıyıcı gaz olarak tıbbi sınıf hava ile izofluran inhalasyonu yoluyla, indüksiyon için% 4 izofluran ve anesteziyi sürdürmek için% 1.5 izofluran kullanarak anestezi yapın. Pedal refleksinin kaybını değerlendirerek anestezi derinliğini doğrulayın.
- Ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt olmadığında, fareyi bir ameliyat tahtasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin, uzuvları uzatın ve pimlerle tahtaya sabitleyin.
- Farenin karnını ve göğsünü % 70 etanol ile serbestçe püskürtün.
- Forseps kullanarak, cildi ve karın duvarını karın tabanına yakın bir yere çekin ve organları açığa çıkarmak için orta hattın her iki tarafında ve diyaframa kadar yanal olarak kesin.
- Bağırsakları sağ tarafa hareket ettirerek ve karaciğerin loblarını hafifçe yukarı çevirerek inferior vena kavayı (IVC) ortaya çıkarın. IVC'yi hafifçe eğmek ve kanülasyonunu kolaylaştırmak için farenin arkasına iğne kapağı gibi küçük bir silindirik nesne yerleştirin (Şekil 1B).
- Pompayı en düşük hızda çalıştırın ve Tampon 1 akarken iğneyi IVC'ye yerleştirin.
- Basıncı hafifletmek ve kan ve perfüzyon tamponlarının drenajına izin vermek için portal damarı kesin, ardından akış hızını hemen 7 mL / dak'ya yükseltin. Doğru yapılırsa, karaciğer birkaç saniye içinde eşit şekilde beyazlayacaktır (Şekil 1B).
- Daha tutarlı sonuçlar için, iğneyi perfüzyonun tüm süresi boyunca elle yerinde tutun.
- Karaciğeri ılık Tampon 1 ile perfüze edin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için, Tampon 1 içeren tüpe yerleştirilen hattın sürekli olarak suya batırıldığından emin olun.
- Perfüzyon meydana gelirken, Tampon 2'ye 130 μL kollajenaz çözeltisi ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetle pipetle veya 5 mL veya 10 mL serolojik pipetle karıştırarak karıştırın.
- Tampon 1'i içeren tüpteki hacim yaklaşık 5 mL'ye düştüğünde, tüpün yan tarafına pipet uygulayarak yavaşça Tampon 1'e 5 mL Tampon 2 ekleyin. Amaç, Tampon 1'den Tampon 2'ye geçerken hatta hava kabarcıkları girmekten kaçınmaktır.
- Ses seviyesi tekrar 5 mL'ye düşene kadar bekleyin ve yavaşça 5 mL'lik bir Arabellek 2 daha ekleyin. Bir kez daha tekrarlayın. Tampon 2, Tampon 1'in yerini aldığında ve ayrışma başladığında, karaciğer şişecektir.
- Kalan Tampon 2'yi, orijinal olarak Tampon 1'i içeren tüpe ekleyin. Tüpte yaklaşık 5-10 mL Tampon 2 kaldığında perfüzyonu durdurun.
NOT: Tampon 2 karaciğeri perfüze ederken, portal ven aralıklı olarak forseps ile 5 s boyunca kelepçelenebilir. Bu adım isteğe bağlıdır, ancak karaciğer boyunca basınçta ortaya çıkan artış, ayrışmasını ve dolayısıyla nihai hepatosit verimini artırabilir. - Karaciğeri dikkatlice tüketin ve 1.1.4 adımında bir kenara bırakılan 20 mL buz gibi soğuk Tampon 2'yi içeren 100 mm'lik kültür kabına aktarın.
- Laminer akış başlığının altında, cerrahi makas ve cımbız kullanarak karaciğeri yavaşça ayırın.
- Hepatosit süspansiyonuna yaklaşık 20 mL buz gibi soğuk M199 ekleyin ve daha büyük karaciğer parçalarından ilave hepatositlerin salınmasını nazikçe teşvik etmek için bir şırınganın pistonunu kullanarak 100 μm hücre süzgecinden süzün.
- 100 mm'lik kültür kabını ve hücre süzgecini toplama tüpü dolana kadar ilave M199 ile yıkayın.
- Süspansiyonu 50 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hepatosit peletini 30 mL soğuk M199'da döndürerek yavaşça yeniden askıya alın.
- Adım 1.2.18'de belirtildiği gibi hepatositleri toplayın. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
- Hepatositleri 10 mL ılık M199'da yeniden askıya alın ve tripan mavisi dışlama yöntemini ve bir hemositometre12'yi kullanarak canlılığı ve verimi belirleyin.
- M199'daki hücreleri 37 ºC'ye ısıtarak 1.0 x 106 canlı hücre / mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltin ve hemen tahlil işlemine başlayın.
2. Yağ asidi β-oksidasyon testi
NOT: Tahlil üçlü olarak gerçekleştirilir ve her reaksiyon karışımı 750.000 hücre, 1.35 mg / mL sığır serum albümini (BSA), 100 μM palmitik asit ve 2 mL'lik son hacimde 0.4 μCi [1-14C] palmitik asit içerir.
DİKKAT: Radyoaktif bileşikler tehlikelidir. Radyoaktif malzemenin Kurumsal, Eyalet ve Federal düzenlemelere uygun olarak satın alınması, taşınması, depolanması ve bertaraf edilmesi.
- Hazırlık
- Tahlilden önceki günlerde, palmitik asit ve BSA çözeltilerini hazırlayın (Tablo 1) ve -20 ° C'de saklayın.
- Tahlil gününde, karaciğer perfüzyonuna başlamadan önce 2.1.3-2.1.9 adımlarını tamamlayın.
- Palmitik asit ve BSA çözeltilerini çözün. Substrat karışımını çoklu reaksiyonlar artı %20-%30 fazlalık için hazırlayın ve tipik bir tahlil kurulumu Tablo 2'de gösterilmiştir.
- Bir mikrosantrifüj tüpünde reaksiyon başına 13.5 μL BSA çözeltisi Aliquot ve 41 ° C'ye ısıtın, ardından reaksiyon başına 200 mM palmitik asit çözeltisinden (BSA: palmitik asit molar oranı = 1: 5) 1 μL ekleyin.
NOT: Radyoaktif ve radyoaktif olmayan palmitik asit çözeltileri gibi organik çözücüler kullanılarak hazırlanan çözeltilerin, pozitif yer değiştirmeli pipet ve uygun uçlarla dağıtılması tercih edilir. - Vorteks, çözünür palmitik asidin oluşumunu kolaylaştırmak için 41 ° C'de kuvvetli bir şekilde inkübe edilir ve inkübe edilir: BSA kompleksi. Kuluçka döneminde ara sıra vorteks.
- Karışım başlangıçta bulanık görünecek, ancak 41 ° C'de 20-30 dakikalık inkübasyondan sonra tamamen netleşecektir. Reaksiyonları başlatmaya hazır olana kadar 41 ° C'de tutun.
- Aliquot 133 μL 1 M perklorik asit 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde reaksiyonları durdurmak için.
DİKKAT: Perklorik asit güçlü bir asit ve güçlü bir oksidandır. Bu bileşiği işlemek için uygun koruyucu ekipman gereklidir. - Bir tüpe reaksiyon başına 485.5 μL M199 Aliquot ve radyoaktif BSA'yı seyreltmek için 37 ° C'de tutun: reaksiyonlara başlamadan önce 2.1.4-2.1.6 adımlarında hazırlanan palmitik asit kompleksi.
- 750 μL M199'u, numuneler kadar 14 mL yuvarlak tabanlı tüplere dağıtın. İstenirse, bir araç kontrolü de dahil olmak üzere etomoksir, rotenon ve antimisin gibi yağ asidi β-oksidasyon inhibitörleri ekleyin (Tablo 2).
- Hepatosit yıkama adımları sırasında, reaksiyonlara başlamadan 10-15 dakika önce, adım 2.1.9'da hazırlanan tüpleri 37 ° C'ye ayarlanmış ve 180-200 rpm'de çalkalanan bir sallanan su banyosuna aktarın.
- Yağ asidi β-oksidasyon reaksiyonlarını başlatmak, durdurmak ve analiz etmek
- Hepatositlerin yaşayabilirliği kabul edilebilirse (tipik olarak %75'≥, Şekil 2), her reaksiyon için, berraklaştırılmış BSA: palmitik asit çözeltisini içeren mikrosantrifüj tüpüne 0.8 μL [1-14C] palmitik asit (0.5 mCi / mL) aktarın (adım 2.1.4-2.1.6). Vorteks yapın ve 41 °C'de su banyosuna geri dönün.
- Hepatositleri 37 ° C'ye dengelemek ve inhibitörlerle (varsa) önceden inkübe etmek için, son hepatosit yeniden süspansiyonundan hemen sonra (adım 1.2.21), hepatosit süspansiyonunun 750 μL'sini, sallanan su banyosundaki 14 mL yuvarlak tabanlı tüplerin her birine 1 mL'lik bir pipetle aktarın (adım 2.1.9-2.1.10) ve vorteksi karıştırmak için kısa bir süre düşük hızda.
- Her bir ilaveyi 30 s kademelendirin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın. Protein tayini için bir numune kaydetmek için, başka bir hepatosit alikotunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 3.000 x g'de döndürün.
NOT: Dağıtım sırasında, numuneler arasında çökelmeyi ve hücre sayısında büyük değişkenliği önlemek için hepatosit süspansiyonunun sürekli olarak döndürülmesi veya 1 mL pipetle birlikte hafifçe karıştırılması gerekir. - Süpernatantı çıkarın ve sonuçları normalleştirmek için numunedeki toplam protein miktarını ölçmeye hazır olana kadar peleti -80 ° C'de saklayın (Şekil 3).
- Hepatositler 37 ° C'de ön inkübasyon altındayken, radyoaktif BSA: palmitik asit kompleksini 2.1.8'deki ılık ortama ekleyin ve reaksiyonları başlatmaya hazır olana kadar 37 ° C'de tutun. Bu son substrat karışımıdır.
- Reaksiyonları başlatmak için, hepatositleri su banyosundan çıkarın ve 500 μL substrat karışımı ekleyin.
- Vorteks, hücreleri tamamen askıya almak ve su banyosuna geri dönmek için 5 s düşük hızda vorteks. Tüm örneklerle tekrarlayın, 30 sn şaşırtın.
- 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Bir dizi reaksiyonu başlatın ve arka plan radyoaktivitesini belirlemek için hemen durdurun (bkz. adım 2.2.10-2.2.11) (Tablo 2).
- Artık substrat karışımının yinelenen alikotlarını (200-250 μL) 6 mL sintilasyon şişelerine aktarın ve sayılmak üzere bir kenara koyun. 500 μL substrat karışımında oksidasyon için mevcut olan toplam palmitik asit nmollerine karşılık gelen radyoaktiviteyi hesaplamak için bu sayıları kullanın.
- Reaksiyonları durdurmak için, hepatositleri su banyosundan çıkarın, hepatositleri orta hızda vorteks yaparak yeniden askıya alın ve ardından hepatosit süspansiyonunun 400 μL'sini perklorik asit içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
- Hemen tüpleri kapatın. Bu sırayı tüm numuneler için 30 sn kademelendirerek tekrarlayın.
- 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini kuvvetlice vorteksleyin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini 10 dakika boyunca 13.000 x g'de döndürün.
- Süpernatantın 300 μL'sini 6 mL'lik bir sintilasyon şişesine aktarın, 4 mL sintilasyon sıvısı ekleyin ve numunelerdeki radyoaktiviteyi ve substrat karışımı alikotları (adım 2.2.9) bir sintilasyon sayacında sayın.
DİKKAT: Santrifüjlemeden sonra, yağ asidi β-oksidasyonu tarafından üretilen ve asidik koşullar tarafından salınan 14C-asetil-CoA'nın tam oksidasyonu ile üretilen 14C-CO2'nin solunmasını önlemek için tüpleri bir duman başlığı altında açın.
| Arabellekler/Medya Bileşenleri | Miktar | Son Konsantrasyon | Talimat -ları |
| Çözüm C | |||
| Kartal | 1.79 gr | 480 mM | 50 mL'ye su ekleyin. 4 °C'de depolayın |
| MgSOİ4 heptahidrat | 1.48 gr | 120 mM | |
| KH2PO4 | 0.81 gr | 119 mM | |
| Krebs-Henseleit Tamponu (KHB), kalsiyum içermez | |||
| Arjantin | 7.0 gr | 120 mM | 900 mL'ye su ekleyin, pH'ı 7,4'e ayarlayın ve son hacmi 1 L'ye getirin. |
| NaHCO3 | 2.0 gr | 24 mM | |
| 1 M HEPES pH 7.45 | 5 mL | 5 mM | |
| Glikoz | 1 veya 2 g | 5,6 veya 11 mM | |
| Çözüm C | 10 mL | ||
| Arabellek 1 | |||
| cesaret | 500 mL | Bileşenleri karıştırın ve filtreleyin. 4 °C'de depolayın | |
| 50 mM EGTA | 1,0 mL | 0,1 mM | |
| Arabellek 2 | |||
| cesaret | 500 mL | Bileşenleri karıştırın ve filtreleyin. 4 °C'de depolayın | |
| 1 M CaCl2 dihidrat | 686 μL | 1,4 mM | |
| Gentamisin çözeltisi | |||
| Gentamisin sülfat | 0.5 gr | 50 mg/mL | 10 mL'ye su ekleyin ve sterilize edin. Aliquot ve -20 °C'de saklayın |
| Kollajenaz çözeltisi | |||
| Kollajenaz I ve II karışımı | 10 mg | 7 mg/mL | Şişenin tüm içeriğini 1.43 mL su içinde çözün. Aliquot ve -20 °C'de saklayın |
| M199 Serisi | |||
| M199 Serisi | 1 kese | 900 mL'ye su ekleyin ve pH'ı 7.2-7.4'e ayarlayın. Son hacmi 1 L'ye getirin ve sterilize edin. 4 °C'de depolayın | |
| NaHCO3 | 2.2 gr | 26 mM | |
| 1 M HEPES (hücre kültürü sınıfı) | 25 mL | 25 mM | |
| Ekstra glikoz (sadece beslenen fareler için) | 1 gr | 11 mM | |
| BSA çözümü | |||
| Yağ asidi içermeyen BSA | 400 mg | %20 (w/d) | 2 mL suda çözün. Aliquot ve -20 °C'de saklayın |
| Radyoaktif olmayan palmitik asit çözeltisi | |||
| Palmitik asit | 103 mg | 200 mM | 2 mL etanol içinde çözün, -20 °C'de saklayın |
| 1 M Perklorik asit | |||
| %70 Perklorik asit | 3,5 mL | 1 milyon | Su ile 40 mL'ye kadar seyreltin. Oda sıcaklığında saklayın |
Tablo 1: Hepatosit izolasyonu ve yağ asidi β-oksidasyon testi için gerekli tamponlar, ortamlar ve diğer çözeltiler
| Reaksiyon numarası | M199 ± İnhibitörleri | Hepatosit süspansiyonu (μL) | Substrat karışımı (μL) | ||||
| Ses seviyesi (μL) | Etomoksir | ||||||
| 1 | 750 | - | 37 °C'de ön ısıtma | 750 | 15 dakika boyunca 37 °C'de ön inkübasyon | 500 | 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin |
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | + | ||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | + | Hemen durdurun | |||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
Tablo 2: Etomoksir varlığında ve yokluğunda üçlü olarak test edilen hepatosit süspansiyonu için deney düzeneği örneği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada tarif edilen karaciğer perfüzyonu tipik olarak, tripan mavisi dışlaması ile tahmin edildiği gibi, ortalama% 80 canlılığa sahip 30-40 milyon hücre / karaciğer verir (Şekil 2). Perfüzyon Tamponları 1 ve 2'yi hazırlamak için kullanılan Krebs-Henseleit tamponundaki (KHB) tipik glikoz konsantrasyonu 11 mM'dir. Oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçerken, KHB'deki glikoz konsantrasyonu, açlık durumunu daha iyi temsil etmek için düşürülebilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, glikoz konsantrasyonunun 5.6 mM'ye düşürülmesinin, hepatositlerin verimi veya canlılığı üzerinde olumsuz bir etkisi yoktur.
Tablo 2, CPT1'in güçlü bir inhibitörü olan etomoksir varlığında ve yokluğunda üçlü olarak test edilen bir hepatosit süspansiyonu için tipik bir deney düzeneğini ve dolayısıyla mitokondriyal yağ asidi oksidasyonu 10,13'ü göstermektedir. Bu veya diğer mitokondriyal yağ asidi oksidasyon inhibitörlerinin varlığında, [1-14C] palmitik asit oksidasyonu tarafından üretilen herhangi bir kalıntı 14 C etiketli ürün, peroksizomlardaki ilk β-oksidasyon döngüsüne atfedilebilir. Böylece mitokondriyal yağ asidi oksidasyonunun total yağ asidi β-oksidasyonuna katkısı, total (-etomoksir) ve peroksizomal (+ etomoksir) yağ asidi oksidasyonu arasındaki fark 7,14,15 olarak hesaplanabilir (Şekil 3).
Hepatositler için, [1-14 C] palmitik asidin β-oksidasyonunun ürünleri ile ilişkili radyoaktivitenin% 95'inden fazlası ASM'de bulunur ve geri kalanı 14C-CO210 olarak salınır. Arka plan radyoaktivitesi ile ilişkili dakika başına sayım (CPM), [1-14C] palmitik asit grubuna göre değişir. Bununla birlikte, 15 dakika boyunca substrat karışımı ile inkübe edilmesine izin verilen örneklerde elde edilen CPM'den hala önemli ölçüde düşüktürler (Şekil 3A). Beklendiği gibi, oruç tutan farelerden izole edilen hepatositler, bu yolakların bilinen aktivasyonu ile tutarlı olarak, hem mitokondriyal hem de peroksizomal yağ asidi β-oksidasyon oranlarında sağlam bir artış göstermektedir 16,17,18,19.
Şekil 2: Burada açıklanan prosedür kullanılarak izole edilen hepatositlerin yaşayabilirliği ve verimi. Hepatositler, ad libitum ile beslenen erkek farelerden izole edildi veya suya serbest erişim ile 16-18 saat boyunca gece boyunca oruç tutuldu. (A) Hepatosit canlılığı ve (B) karaciğer başına verim. Veriler, SEM ± bireysel hepatosit preparatları (daireler) üzerindeki ölçümlerin ortalaması (çubukları) olarak bildirilmiştir. Beslenen ve oruç tutan farelerden izole edilen hepatositler, eşleşmemiş iki kuyruklu bir Öğrenci t-testi kullanılarak karşılaştırılmıştır. * p < 0.05. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Beslenen ve oruç tutulan erkek farelerden izole edilen ve süspansiyonda test edilen hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyon kapasitesi. Yeni izole edilmiş hepatositler, substrat karışımının eklenmesinden önce etomoksir (45 μM, +Eto) veya DMSO (araç, -Eto) ile önceden inkübe edildi. (A) Her tahlilde tanıtılan ve arka plan radyoaktivitesini, toplam (-Eto), peroksizomal (+Eto) ve mitokondriyal yağ asidi β-oksidasyonunu tahmin etmek için ayarlanan reaksiyonların ASM fraksiyonunda geri kazanılan toplam CPM. Bu veriler, herhangi bir düzeltme (arka plan, hücre numarası veya protein seviyeleri için) veya başka hesaplamalar uygulanmadan önce gösterilir. (B) (A)'daki veriler, arka plan için düzeltilmiş, tahlilin toplam hacmi, 1 milyon canlı hücreye normalleştirilmiştir ve beslenen ve oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde palmitik asidin oksitlenme hızı olarak ifade edilmiştir. (C) Kullanılan tahmini 750.000 hepatosit/tahliline karşılık gelen toplam protein. (D) (A)'daki veriler (B)'deki gibi düzeltilmiş, ancak mg proteine normalleştirilmiştir. Veriler, SEM ± bireysel hepatosit preparatları (daireler) üzerindeki ölçümlerin ortalaması (çubukları) olarak bildirilmiştir. Beslenen ve oruç tutan farelerden izole edilen hepatositler, eşleşmemiş iki kuyruklu bir Öğrenci t-testi kullanılarak karşılaştırılmıştır. * p < 0.05; ** p 0,01 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karaciğer perfüzyonu sırasında, karaciğerdeki mikrokılcal damarları bloke ettiklerinden, tampon dolaşımını önledikleri veya kısıtladıkları ve genel olarak hepatosit verimini ve canlılığını azalttıkları için hava kabarcıklarının girmesini önlemek çok önemlidir20,21. IVC'nin kanülasyonundan önce tampon dolu giriş hattının yakından incelenmesi ve burada açıklandığı gibi Tampon 2'ye geçmek için Tampon 1'i içeren tüpten giriş hattının kaldırılmasından kaçınılması gibi önlemler, başarısız perfüzyon sayısını başarılı bir şekilde azaltabilir (canlılık <%70). Perfüzyon sisteminde kabarcık tuzaklarının kullanılması da bu riski önemli ölçüde azaltabilir20,21.
Kollajenaz aktivitesi, hepatositlerin izolasyonu için bir başka kritik parametredir ve tarihsel olarak12,20 elde edilen her yeni partinin test edilmesini ve optimizasyonunu gerektirir. Yüksek oranda saflaştırılmış ve tanımlanmış bir kollajenaz karışımının kullanılması, partiden partiye değişkenliği önemli ölçüde azaltarak her yeni partiyi test etme ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, bu karışımlar kullanıldığında, kullanılan hacimdeki küçük ayarlamalar (±10-20 μL), hepatosit preparatlarının yüksek verimini veya canlılığını geri kazanmak için genellikle yeterlidir.
Hepatositler hassas hücrelerdir. Tüm yeniden süspansiyon ve dağıtım adımları, kesme hasarını ve lizizi azaltmak için yavaşça döndürülerek veya pipetlenerek nazikçe yapılmalıdır. Geniş delikli uçların kullanımı da hepatosit hasarını daha da aza indirebilir. Tahlilin 2.2.2 ve 2.2.7 adımlarındaki vorteksing, bileşenlerin hala iyi bir şekilde karıştırılmasını sağlayan mümkün olan en düşük ayarda yapılmalıdır.
Geleneksel protokoller 20,21,22 ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan hepatosit izolasyon prosedüründe getirilen en büyük değişikliklerden biri, intravenöz kateter yerleştirme ve ligasyonun, operatör tarafından pozisyonda tutulan hipodermik bir iğnenin yerleştirilmesiyle değiştirilmesidir. Bu değişiklik iki ana avantaj sağlar. İlk olarak, intravenöz kateterin ucunu hatta bağlarken hava kabarcıkları sokma riskini azaltır, çünkü hipodermik iğne IVC'ye yerleştirildiğinde tampon zaten akmaktadır. İkincisi, iğnenin geri çekilmesi veya dikişlerle sabitlenmesi gibi kateterin manipülasyonları sırasında IVC'nin delinme riskini azaltır. Bu modifikasyonun dezavantajlarından biri, prosedürün tutarlı başarısını sağlamak için iğneyi perfüzyon süresince elle pozisyonda tutmanın genellikle gerekli olmasıdır. Bu, ameliyatı yapan kişi için yorucu olabilir ve bir seansta yapılabilecek ardışık perfüzyon sayısını sınırlayabilir. IVC'nin yanlışlıkla delinmesine neden olabilecek iğneyi tutan kişinin hareketlerini sınırlamak için, ameliyatı yürüten bir kişi ve perfüzyon tamponlarını perfüzyonda kesinti olmadan değiştiren başka bir kişi ile çiftler halinde çalışmanız önerilir. Çoklu arka arkaya perfüzyonlar, tamamlanan her hepatosit izolasyonundan 1-2 dakika içinde yağ asidi β-oksidasyon testine başlamak için üçüncü bir kişiyi gerektirecektir.
Diğer hepatosit izolasyon yöntemlerine benzer şekilde, burada açıklanan prosedür, ek metabolik yollar ve çeşitli tedavilere bağlı gen ekspresyonundaki değişiklikler de dahil olmak üzere çeşitli diğer karaciğer süreçlerini değerlendirmek için süspansiyonda veya kültürde kullanılabilecek hepatositler verir23,24,25. Hepatositleri kültürlemek için, 1.2.20-1.2.21 basamakları, hücreleri uygun ortamda yeniden askıya alarak, ardından hücre kültürü kaplarında kaplama ve inkübasyon20,22,26 ile kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, β-oksidasyon testi için gerekli olmasa da, diğer uygulamalar tarafından ihtiyaç duyulursa, ölü hücrelerin bir Percoll tabakası22,26 yoluyla çıkarılmasıyla canlı hepatositlerin yüzdesi arttırılabilir.
Sonuç olarak, bu protokol, sağlam hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyon oranını ölçmek ve eksojen kofaktörlerin eklenmesi olmadan, böylece bu yolun endojen düzenleyici mekanizmalarını korumak için sağlam bir tahlil tanımlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Roberta Leonardi'ye R35GM119528 hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
References
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E.
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), Pt 1 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, Pt 1 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
