Summary
Fedtsyre β-oxidation er en væsentlig metabolisk vej, der er ansvarlig for at generere energi i mange forskellige celletyper, herunder hepatocytter. Her beskriver vi en metode til måling af fedtsyre β-oxidation i frisk isolerede primære hepatocytter ved anvendelse af 14C-mærket palmitinsyre.
Abstract
Fedtsyre β-oxidation er en vigtig metabolisk vej til at imødekomme leverens energibehov og tilvejebringe substrater og cofaktorer til yderligere processer, såsom ketogenese og glukoneogenese, som er afgørende for at opretholde hele kroppen glucosehomeostase og understøtte ekstra-leverorganfunktion i fastende tilstand. Fedtsyre β-oxidation forekommer inden for mitokondrier og peroxisomer og reguleres gennem flere mekanismer, herunder optagelse og aktivering af fedtsyrer, enzymekspressionsniveauer og tilgængelighed af cofaktorer såsom coenzym A og NAD +. I assays, der måler fedtsyre β-oxidation i leverhomogenater, maskerer cellelyseis og den almindelige tilsætning af suprafysiologiske niveauer af cofaktorer virkningerne af disse reguleringsmekanismer. Desuden er integriteten af organellerne i homogenaterne svær at kontrollere og kan variere betydeligt mellem præparaterne. Målingen af fedtsyre β-oxidation i intakte primære hepatocytter overvinder ovenstående faldgruber. Denne protokol beskriver en metode til måling af fedtsyre β-oxidation i en suspension af frisk isolerede primære musehepatocytter inkuberet med 14C-mærket palmitinsyre. Ved at undgå timer til dage med kultur har denne metode fordelen ved bedre at bevare proteinekspressionsniveauer og metabolisk vejaktivitet i den oprindelige lever, herunder aktivering af fedtsyre β-oxidation observeret i hepatocytter isoleret fra fastende mus sammenlignet med fodrede mus.
Introduction
Fedtsyre β-oxidation er en vigtig proces i lipidmetabolisme, hvilket giver en katabolisk vej til at balancere fedtsyresyntese og indtag fra kosten. Denne proces genererer energi til flere organer, herunder hjertemusklen, nyrebarken og fastende lever, og udnytter fedtsyrer opnået fra kosten, fedtvævslipolyse og interne triglyceridlagre 1,2.
Oxidation af fedtsyre gennem β-oxidationsvejen resulterer i sekventiel forkortelse af fedt acylkæden med to carbonatomer ad gangen, frigivet som acetyl-CoA, og denne proces forekommer både i mitokondrierne og peroxisomerne. Mens de fleste fedtsyrer kun gennemgår β-oxidation, oxideres nogle ved forskellige carbonatomer, før de kommer ind i denne vej. For eksempel gennemgår 3-methylsubstituerede fedtsyrer, såsom phytaninsyre, fjernelse af et kulstof ved α-oxidation i peroxisomerne, inden de kommer ind i β-oxidationsvejen. Tilsvarende omdannes nogle fedtsyrer først til dicarboxylfedtsyrer ved oxidation af den terminale methylgruppe (ω-oxidation) i det endoplasmatiske retikulum, før de fortrinsvis oxideres i peroxisomerne ved β-oxidation3.
Uanset den specifikke organel skal en fedtsyre først omdannes til en coenzym A (CoA) thioester eller acyl-CoA, der skal oxideres gennem β-oxidationsvejen. β-oxidation af langkædede acyl-CoA'er i mitokondriematrixen kræver carnitin-shuttle til deres translokation, hvor carnitinpalmeitoyltransferase 1 (CPT1) katalyserer omdannelsen af acyl-CoAs til acylcarnitiner og er det hastighedsbegrænsende enzym i denne proces4. Når de er translokeret til mitokondriematrixen, omformes acyl-CoA'erne og tjener som substrater for mitokondrie- β-oxidationsmaskineriet. I fastende tilstand kanaliseres acetyl-CoA produceret gennem β-oxidation i lever mitokondrier primært til ketogenese. Peroxisomer tjener som det primære sted for β-oxidation af meget langkædede, forgrenede og dicarboxylfedtsyrer. Peroxisomer kræver ikke carnitin shuttle til at importere fedtsyre substrater, i stedet importere korrespondent acyl-CoAs gennem aktiviteten af ATP-bindende kassette (ABC) transportører ABCD1-35. Inden for peroxisomerne oxideres acyl-CoAs derefter af et dedikeret sæt enzymer, der adskiller sig fra mitokondriefedtsyren β-oxidationsmaskineriet. Både mitokondrier og peroxisomer kræver også en forsyning af NAD + og fri CoA for at oxidere fede acylkæder. CoA-niveauer i leveren har vist sig at stige som reaktion på faste, hvilket understøtter den øgede hastighed af fedtsyreoxidation, der forekommer i denne tilstand6. Desuden resulterer øget CoA-nedbrydning i peroxisomerne i et selektivt fald i peroxisomal fedtsyreoxidation7. Derfor reguleres processen med fedtsyreoxidation i cellen af ekspressionsniveauer og aktiviteter af enzymer involveret i aktivering, transport og oxidation af fedtsyrer samt koncentrationerne af cofaktorer og andre metabolitter gennem flere subcellulære rum.
Procedurer, der bruger vævshomogenater til måling af fedtsyreoxidation, ødelægger den cellulære arkitektur, der regulerer og understøtter denne proces, hvilket fører til en indsamling af data, der ikke nøjagtigt afspejler in vivo-metabolismen. Mens teknikker, der bruger belagte primære hepatocytter, bevarer dette system, resulterer dyrkning af isolerede celler i længere tid i et tab af in vivo-genekspressionsprofilen, der var til stede i cellerne, da de stadig levede i dyret 8,9. Følgende protokol beskriver en metode til at isolere primære hepatocytter og analysere deres kapacitet for fedtsyre β-oxidation umiddelbart efter isolering og i suspension ved anvendelse af [1-14C] palmitinsyre. Assayet er baseret på måling af den radioaktivitet, der er forbundet med de syreopløselige metabolitter (ASM) eller produkter, som acetyl-CoA, produceret ved β-oxidation af [1-14C] palmitinsyre10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer på mus (C57BL /6J, mænd, 9-11 uger gamle) blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) ved West Virginia University.
1. Hepatocytisolering
- Præparation
- I dagene før hepatocytisoleringen skal du forberede bufferne og cellekulturmedierne, der er anført i tabel 1. Opret et vandbad med temperaturen indstillet til 37 ° C tæt på, hvor operationen skal udføres.
- På dagen for hepatocytisoleringen overføres 35 ml buffer 1 til et sterilt 50 ml centrifugerør og 70 ml buffer 2 til et 100 ml sterilt bægerglas eller flaske under en laminær flowhætte.
- Tilsæt antibiotika gentamicin (50 μg/ml) og penicillin/streptomycin (1x) til begge buffere.
- 20 ml buffer 2 som beskrevet i trin 1.1.3 overføres til en 100 mm cellekulturskål og anbringes på is.
- De resterende 50 ml Buffer 2 overføres til et sterilt 50 ml centrifugerør. Anbring de 50 ml rør, der indeholder de antibiotika-supplerede buffere 1 og 2, i et vandbad indstillet ved 37 ° C, og lad dem varme op i mindst 15 minutter, før perfusionen påbegyndes.
BEMÆRK: Hvis der udføres flere hepatocytterisolationer i en session, skal du opskalere antallet af antibiotika-supplerede aliquoter af buffere 1 og 2 for at forberede i overensstemmelse hermed. - Optø en aliquot af collagenaseopløsning og hold på is.
BEMÆRK: Hvis det opbevares korrekt, er der ikke noget signifikant tab af enzymaktivitet i collagenaseopløsninger, der er frosset og optøet op til 3 gange og anvendes inden for 3 uger fra tilberedningen. - Forbered de kirurgiske instrumenter og peristaltisk pumpe. Steriliser linjerne i den peristaltiske pumpe ved at cirkulere 15 ml 70% ethanol efterfulgt af 15 ml sterilt vand.
- Tilslut en 22 G nål til udgangsledningen (figur 1A). Det udhulede filter af et kateter fungerer godt som et stik. Fyld linjerne med Buffer 1, og kontroller linjerne, stikket og nålen for at sikre, at ingen luftbobler er fanget.
Figur 1: Perfusionsapparat og perfunderet lever. (A) Peristaltisk pumpe med udløbsledning forbundet til nålen, der bruges til at cannulatere og gennemsuge leveren. (B) Vellykket kannulation er indikeret ved øjeblikkelig og homogen blanchering af leveren. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Leverperfusion og dissociation
- Bedøv en mus via isofluranindånding med luft af medicinsk kvalitet som bæregas ved hjælp af 4% isofluran til induktion og 1,5% isofluran for at opretholde anæstesi. Kontroller dybden af anæstesi ved at vurdere tabet af pedalrefleks.
- Når der ikke er noget svar på tåknibning, skal du placere musen i en liggende stilling på et operationsbræt, strække lemmerne ud og fastgøre dem til brættet med stifter.
- Sprøjt liberalt musens mave og bryst med 70% ethanol.
- Brug pincet til at trække huden og mavevæggen op nær bunden af maven og skære sideværts på hver side af midterlinjen og op til membranen for at udsætte organerne.
- Udsæt den ringere vena cava (IVC) ved at flytte tarmene til højre side og forsigtigt vende leverens lobes op. Indsæt en lille cylindrisk genstand, såsom en nålehætte, under bagsiden af musen for at vippe IVC let og lette dens kannulering (figur 1B).
- Start pumpen med den laveste hastighed, og indsæt nålen i IVC'en med Buffer 1 flydende.
- Skær portalvenen for at lette trykket og tillade dræning af blod og perfusionsbuffere, og øg derefter straks strømningshastigheden til 7 ml / min. Hvis det gøres korrekt, blancheres leveren ensartet inden for få sekunder (figur 1B).
- For mere ensartede resultater skal du holde nålen på plads i hånden i hele perfusionens varighed.
- Gennemfør leveren med varm buffer 1. For at undgå at indføre luftbobler skal du sikre dig, at linjen, der er indsat i røret indeholdende Buffer 1, forbliver kontinuerligt nedsænket.
- Mens perfusion forekommer, tilsættes 130 μL collagenaseopløsning til Buffer 2 og blandes ved pipettering op og ned eller omrøring med en 5 ml eller 10 ml serologisk pipette.
- Da volumenet i røret, der indeholder Buffer 1, falder til ca. 5 ml, tilsættes langsomt 5 ml buffer 2 til buffer 1 ved pipettering på siden af røret. Målet er at undgå at indføre luftbobler i linjen, mens der skiftes fra buffer 1 til buffer 2.
- Vent, indtil lydstyrken falder igen til 5 ml, og tilsæt langsomt yderligere 5 ml buffer 2. Gentag en gang til. Da buffer 2 erstatter buffer 1, og dissociationen starter, vil leveren svulme op.
- Tilsæt den resterende Buffer 2 til røret, der oprindeligt indeholdt Buffer 1. Stop perfusionen, når der er ca. 5-10 ml buffer 2 tilbage i røret.
BEMÆRK: Mens Buffer 2 perfuserer leveren, kan portalvenen periodisk fastspændes med tang i 5 s. Dette trin er valgfrit, men den resulterende stigning i tryk i hele leveren kan forbedre dets dissociation og dermed det endelige hepatocytudbytte. - Udskær forsigtigt leveren og overfør den til 100 mm kulturskålen indeholdende 20 ml iskold buffer 2, der er afsat i trin 1.1.4.
- Under den laminære flowhætte skal du forsigtigt bryde leveren fra hinanden ved hjælp af kirurgisk saks og pincet.
- Der tilsættes ca. 20 ml iskold M199 til hepatocytsuspensionen, og den filtreres gennem en 100 μm cellesi ved hjælp af stemplet på en sprøjte for forsigtigt at fremme frigivelsen af yderligere hepatocytter fra større leverstykker.
- 100 mm kulturskålen og cellesien vaskes med yderligere M199, indtil opsamlingsrøret er fyldt.
- Suspensionen centrifugeres ved 50 x g i 2 minutter ved 4 °C. Opsuge forsigtigt supernatanten og resuspender forsigtigt hepatocytpillen i 30 ml kold M199 ved hvirvling.
- Hepatocytterne pelleteres som nævnt i trin 1.2.18. Gentag vasken en gang til.
- Resuspend hepatocytterne i 10 ml varm M199 og bestem levedygtigheden og udbyttet ved hjælp af trypan blue exclusion-metoden og et hæmocytometer12.
- Fortynd cellerne i M199 opvarmet til 37 ºC til en slutkoncentration på 1,0 x 106 levedygtige celler / ml og start straks analysen.
2. Fedtsyre β-oxidationsassay
BEMÆRK: Analysen udføres i tre eksemplarer, og hver reaktionsblanding indeholder 750.000 celler, 1,35 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 100 μM palmitinsyre og 0,4 μCi [1-14C]palmitinsyre i et endeligt volumen på 2 ml.
FORSIGTIG: Radioaktive forbindelser er farlige. Køb, håndter, opbevar og disponer radioaktivt materiale i overensstemmelse med institutionelle, statslige og føderale regler.
- Præparation
- I dagene før analysen forberedes palmitinsyre- og BSA-opløsningerne (tabel 1) og opbevares ved -20 °C.
- På dagen for analysen skal du udføre trin 2.1.3-2.1.9, inden leverperfusionen påbegyndes.
- Optø palmitinsyre- og BSA-opløsningerne. Substratblandingen forberedes til flere reaktioner plus et overskud på 20%-30% med en typisk assayopsætning vist i tabel 2.
- Aliquot 13,5 μL BSA-opløsning pr. reaktion i et mikrocentrifugerør og varm til 41 °C, og der tilsættes derefter 1 μL af 200 mM palmitinsyreopløsningen (BSA: palmitinsyremolærforhold = 1:5) pr. reaktion.
BEMÆRK: Det foretrækkes at dispensere opløsninger fremstillet ved anvendelse af organiske opløsningsmidler, såsom de radioaktive og ikke-radioaktive palmitinsyreopløsninger, med en positiv forskydningspipette og passende spidser. - Vortex kraftigt og inkuberes ved 41 °C for at lette dannelsen af den opløselige palmitinsyre: BSA-kompleks. Vortex lejlighedsvis i inkubationsperioden.
- Blandingen vil i første omgang fremstå uklar, men vil klare sig helt efter 20-30 minutters inkubation ved 41 °C. Opbevar den ved 41 °C, indtil den er klar til at starte reaktionerne.
- Aliquot 133 μL 1 M perchlorsyre i 1,5 ml mikrocentrifugerør for at stoppe reaktionerne.
FORSIGTIG: Perchlorsyre er en stærk syre og en stærk oxidant. Passende beskyttelsesudstyr er påkrævet til håndtering af denne forbindelse. - Aliquot 485,5 μL M199 pr. reaktion i et rør og holde det ved 37 °C for at fortynde det radioaktive BSA: palmitinsyrekompleks fremstillet i trin 2.1.4-2.1.6, inden reaktionerne påbegyndes.
- Dispenser 750 μL M199 i lige så mange 14 ml rundbundede rør som prøverne. Hvis det ønskes, tilsættes hæmmere af fedtsyre β-oxidation, såsom etomoxir, rotenon og antimycin, herunder en køretøjskontrol (tabel 2).
- Under hepatocytvasktrinnene, 10-15 minutter før reaktionerne påbegyndes, overføres rørene, der er forberedt i trin 2.1.9, til et rystevandsbad indstillet til 37 ° C og omrystning ved 180-200 o / min.
- Start, stop og analyse af fedtsyren β-oxidationsreaktioner
- Hvis hepatocytternes levedygtighed er acceptabel (typisk ≥ 75 %, figur 2), overføres 0,8 μL [1-14 C]palmitinsyre (0,5 mCi/ml) for hver reaktion til mikrocentrifugerøret indeholdende den klarede BSA: palmitinsyreopløsning (trin 2.1.4-2.1.6). Vortex og vende tilbage til vandbadet ved 41 °C.
- For at afbalancere hepatocytterne til 37 °C og for at præinkubere dem med inhibitorer (hvis til stede) umiddelbart efter den endelige hepatocytredupension (trin 1.2.21) overføres 750 μL af hepatocytsuspensionen med en 1 ml pipette til hvert af de 14 ml rundbundede rør i det rystende vandbad (trin 2.1.9-2.1.10) og hvirvel kortvarigt ved lav hastighed for at blande.
- Forskyd hver tilføjelse med 30 s og inkuber i 15 min. For at gemme en prøve til proteinbestemmelse overføres en anden aliquot af hepatocytter til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og spindes ved 3.000 x g i 5 minutter.
BEMÆRK: Under dispensering skal hepatocytsuspensionen kontinuerligt hvirvles eller forsigtigt omrøres med dispenseringspipetten på 1 ml for at forhindre bundfældning og stor variation i celleantal på tværs af prøver. - Supernatanten fjernes, og pelleten opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til at måle den samlede mængde protein i prøven for at normalisere resultaterne (figur 3).
- Mens hepatocytterne er under præinkubation ved 37 °C, tilsættes det radioaktive BSA: palmitinsyrekompleks til det varme medium i 2.1.8 og opbevares ved 37 °C, indtil reaktionerne er klar til at starte. Dette er den endelige substratblanding.
- For at starte reaktionerne skal du fjerne hepatocytterne fra vandbadet og tilsætte 500 μL substratblanding.
- Vortex ved lav hastighed i 5 s for helt at genoplive cellerne og vende tilbage til vandbadet. Gentag med alle prøverne, svimlende med 30 s.
- Inkuberes i 15 min. Start et sæt reaktioner, og stop straks (se trin 2.2.10-2.2.11) for at bestemme baggrundsradioaktiviteten (tabel 2).
- Duplikerede alikvoter (200-250 μL) af den resterende substratblanding overføres til 6 ml hætteglas med scintillation, og afsættes til at tælle. Disse tællinger anvendes til at beregne radioaktiviteten svarende til de samlede nmoler af palmitinsyre, der er til rådighed til oxidation i 500 μL substratblanding.
- For at stoppe reaktionerne skal du fjerne hepatocytterne fra vandbadet, resuspender hepatocytterne ved hvirvel ved moderat hastighed og derefter overføre 400 μL hepatocytsuspensionen til mikrocentrifugerørene indeholdende perchlorsyre.
- Dæk straks rørene. Gentag denne sekvens for alle prøverne, svimlende med 30 s.
- Kraftigt hvirvel de 1,5 ml mikrocentrifuge rør og spin dem ned 1,5 ml mikrocentrifuge rør ved 13.000 x g i 10 min.
- 300 μL af supernatanten overføres til et hætteglas med 6 ml scintillation, der tilsættes 4 ml scintillationsvæske, og radioaktiviteten i prøverne og substratet blandes aliquoter (trin 2.2.9) i en scintillationstæller.
FORSIGTIG: Efter centrifugering åbnes rørene under en røghætte for at undgå at indånde de 14C-CO2 , der produceres ved fuldstændig oxidation af 14C-acetyl-CoA genereret af fedtsyre β-oxidation og frigivet af de sure forhold.
| Buffere/mediekomponenter | Beløb | Endelig koncentration | Instruktioner |
| Løsning C | |||
| KCl | 1,79 g | 480 mM | Tilsæt vand til 50 ml. Opbevares ved 4 °C |
| MgSO4 heptahydrat | 1,48 g | 120 mM | |
| KH2PO4 | 0,81 g | 119 mM | |
| Krebs-Henseleit Buffer (KHB), calciumfri | |||
| NaCl | 7,0 g | 120 mM | Tilsæt vand til 900 ml, juster pH til 7,4, og bring det endelige volumen til 1 L. Opbevares ved 4 ° C |
| NaHCO3 | 2,0 g | 24 mM | |
| 1 M HEPES pH 7,45 | 5 ml | 5 mM | |
| Glukose | 1 eller 2 g | 5,6 eller 11 mM | |
| Løsning C | 10 ml | ||
| Buffer 1 | |||
| Khb | 500 ml | Bland komponenter og filtrerilisere. Opbevares ved 4 °C | |
| 50 mM EGTA | 1,0 ml | 0,1 mM | |
| Buffer 2 | |||
| Khb | 500 ml | Bland komponenter og filtrerilisere. Opbevares ved 4 °C | |
| 1 M CaCl2 dihydrat | 686 μL | 1,4 mM | |
| Gentamicin opløsning | |||
| Gentamicinsulfat | 0,5 g | 50 mg/ml | Tilsæt vand til 10 ml og filtreriliser. Aliquot og opbevares ved -20 °C |
| Collagenase opløsning | |||
| Collagenase I og II blanding | 10 mg | 7 mg/ml | Opløs hele indholdet af hætteglasset i 1,43 ml vand. Aliquot og opbevares ved -20 °C |
| M199 | |||
| M199 | 1 pose | Tilsæt vand til 900 ml og juster pH til 7,2-7,4. Bring det endelige volumen til 1 L og filtreriliser. Opbevares ved 4 °C | |
| NaHCO3 | 2,2 g | 26 mM | |
| 1 M HEPES (cellekulturkvalitet) | 25 ml | 25 mM | |
| Ekstra glukose (kun til fodrede mus) | 1 g | 11 mM | |
| BSA-løsning | |||
| Fedtsyrefri BSA | 400 mg | 20% (w/v) | Opløs i 2 ml vand. Aliquot og opbevares ved -20 °C |
| Ikke-radioaktiv palmitinsyreopløsning | |||
| Palmitinsyre | 103 mg | 200 mM | Opløs i 2 ml ethanol, opbevares ved -20 °C |
| 1 M perchlorsyre | |||
| 70% perchlorsyre | 3,5 ml | 1 mio. | Fortynd til 40 ml med vand. Opbevares ved stuetemperatur |
Tabel 1: Buffere, medier og andre opløsninger, der kræves til hepatocytisolering og fedtsyre β-oxidationsassay
| Reaktionsnummer | M199 ± hæmmere | Hepatocyt suspension (μL) | Substrat blanding (μL) | ||||
| Volumen (μL) | Etomoxir | ||||||
| 1 | 750 | - | Forvarm ved 37 °C | 750 | Forinkuber ved 37 °C i 15 min | 500 | Inkuberes ved 37 °C i 15 min |
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | + | ||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | + | Stop straks | |||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
Tabel 2: Eksempel på den eksperimentelle opsætning for en hepatocytsuspension analyseret i tre eksemplarer i nærvær og fravær af etomoxir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leverperfusionen beskrevet her giver typisk 30-40 millioner celler / lever med en gennemsnitlig levedygtighed på 80%, som estimeret ved trypan blå udelukkelse (figur 2). Den typiske koncentration af glucose i Krebs-Henseleit-bufferen (KHB), som bruges til at forberede perfusionsbuffere 1 og 2, er 11 mM. Ved måling af fedtsyre β-oxidation i hepatocytter isoleret fra fastende mus, kan koncentrationen af glucose i KHB sænkes for bedre at repræsentere den fastende tilstand. Som vist i figur 2 har sænkning af glucosekoncentrationen til 5,6 mM ingen negativ indvirkning på hepatocytternes udbytte eller levedygtighed.
Tabel 2 viser en typisk eksperimentel opsætning for en hepatocytsuspension analyseret i tre eksemplarer i nærvær og fravær af etomoxir, en potent hæmmer af CPT1 og dermed mitokondriefedtsyreoxidation10,13. I nærvær af denne eller andre hæmmere af mitokondriefedtsyreoxidation kan enhver resterende 14C-mærket produkt genereret ved [1-14C] palmitinsyreoxidation tilskrives den første cyklus af β-oxidation i peroxisomerne. Således kan bidraget fra mitokondriefedtsyreoxidation til total fedtsyre β-oxidation beregnes som forskellen mellem total (-etomoxir) og peroxisomal (+ etomoxir) fedtsyreoxidation 7,14,15 (figur 3).
For hepatocytter findes mere end 95% af radioaktiviteten forbundet med produkterne fra β-oxidationen af [1-14C] palmitinsyre i ASM, og resten frigives som 14C-CO210. Tællingerne pr. minut (CPM) forbundet med baggrundsradioaktivitet varierer med batchen af [1-14C] palmitinsyre. De er dog stadig signifikant lavere end CPM opnået i prøver, der får lov til at inkubere med substratblandingen i 15 minutter (figur 3A). Som forventet viser hepatocytter isoleret fra fastende mus en robust stigning i hastigheden af både mitokondrie og peroxisomal fedtsyre β-oxidation, i overensstemmelse med den kendte aktivering af disse veje 16,17,18,19.
Figur 2: Levedygtighed og udbytte af hepatocytter isoleret ved hjælp af den procedure, der er beskrevet heri. Hepatocytter blev isoleret fra hanmus fodret ad libitum eller fastede natten over i 16-18 timer med fri adgang til vand. (A) Hepatocyt levedygtighed og (B) udbytte pr. Lever. Data rapporteres som gennemsnittet (søjler) af målinger på individuelle hepatocytpræparater (cirkler) ± SEM. Hepatocytter isoleret fra fodrede og fastende mus blev sammenlignet ved hjælp af en uparret to-halet Student's t-test. * p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fedtsyre β-oxidationskapacitet i hepatocytter isoleret fra fodrede og fastede hanmus og analyseret i suspension. Frisk isolerede hepatocytter blev præinkuberet med etomoxir (45 μM, +Eto) eller DMSO (køretøj, -Eto) før tilsætning af substratblandingen. (A) Samlet CPM indført i hvert assay og genvundet i ASM-fraktionen af reaktioner, der er oprettet for at estimere baggrundsradioaktivitet, total (-Eto), peroxisomal (+ Eto) og mitokondriefedtsyre β-oxidation. Disse data vises, før nogen korrektion (for baggrund, cellenummer eller proteinniveauer) eller andre beregninger blev anvendt. (B) Data i (A) korrigeret for baggrunden, det samlede volumen af assayet, normaliseret til 1 million levedygtige celler og udtrykt som den hastighed, hvormed palmitinsyre oxideres i hepatocytter isoleret fra fodrede og fastende mus. (C) Samlet protein svarende til de anslåede 750.000 anvendte hepatocytter/assay. (D) Data i (A) korrigeret som i (B), men normaliseret til mg protein. Data rapporteres som gennemsnittet (søjler) af målinger på individuelle hepatocytpræparater (cirkler) ± SEM. Hepatocytter isoleret fra fodrede og fastende mus blev sammenlignet ved hjælp af en uparret to-halet Student's t-test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under leverperfusionen er det afgørende at undgå introduktion af luftbobler, da de blokerer mikrokapitalillærerne i leveren, forhindrer eller begrænser buffercirkulationen og generelt reducerer hepatocytudbyttet og levedygtigheden20,21. Forholdsregler, såsom nøje inspektion af den bufferfyldte indløbsledning før cannulation af IVC og undgå at løfte indløbsledningen fra røret indeholdende Buffer 1 for at skifte til Buffer 2, som beskrevet heri, kan med succes reducere antallet af mislykkede perfusioner (levedygtighed <70%). Brugen af boblefælder i perfusionssystemet kan også reducere denne risiko betydeligt20,21.
Collagenaseaktiviteten er en anden kritisk parameter for isolering af hepatocytter, der historisk kræver test og optimering af hver ny batch erhvervet 12,20. Brugen af en stærkt oprenset og defineret blanding af collagenaser reducerer dramatisk variationen fra batch til batch, hvilket eliminerer behovet for at teste hver ny batch. Når disse blandinger anvendes, er små justeringer i det anvendte volumen (±10-20 μL) normalt tilstrækkelige til at genoprette høje udbytter eller levedygtighed af hepatocytpræparaterne.
Hepatocytter er sarte celler. Alle resuspensions- og dispenseringstrin skal udføres forsigtigt ved at hvirvle eller pipettere langsomt for at reducere forskydningsskader og lysis. Brugen af brede borespidser kan også yderligere minimere hepatocytskader. Hvirveldannelse i trin 2.2.2 og 2.2.7 i analysen skal udføres ved den lavest mulige indstilling, der stadig sikrer god blanding af komponenterne.
Sammenlignet med traditionelle protokoller 20,21,22 er en af de største ændringer, der er indført i hepatocytisoleringsproceduren, der er beskrevet her, udskiftning af intravenøs kateterindsættelse og ligering med indsættelse af en hypodermisk nål, der holdes på plads af operatøren. Denne ændring giver to hovedfordele. For det første mindsker det risikoen for at indføre luftbobler, når man forbinder enden af det intravenøse kateter til linjen, da bufferen allerede flyder, når den hypodermiske nål indsættes i IVC. For det andet mindsker det risikoen for perforering af IVC under manipulationer af kateteret, såsom tilbagetrækning af nålen eller dens fastgørelse med suturer. En af ulemperne ved denne ændring er, at det normalt er nødvendigt at holde nålen på plads i hånden i perfusionens varighed for at sikre procedurens konsekvente succes. Dette kan være trættende for den person, der udfører operationen og kan begrænse antallet af på hinanden følgende perfusioner, der kan udføres i en session. For at begrænse bevægelserne af den person, der holder nålen, hvilket kan forårsage utilsigtet perforering af IVC, er det tilrådeligt at arbejde parvis, hvor en person udfører operationen og en anden person ændrer perfusionsbuffere uden afbrydelser i perfusionen. Flere back-to-back perfusioner ville kræve en tredje person til at starte fedtsyre β-oxidationsassay inden for 1-2 minutter efter hver afsluttet hepatocytisolering.
I lighed med andre hepatocytisoleringsmetoder giver den her beskrevne procedure hepatocytter, der kan anvendes i suspension eller i kultur til at vurdere en række andre leverprocesser, herunder yderligere metaboliske veje og ændringer i genekspression på grund af forskellige behandlinger 23,24,25. Til dyrkning af hepatocytterne kan trin 1.2.20-1.2.21 let modificeres ved at genoplive cellerne i det passende medium efterfulgt af plettering i cellekulturskåle og inkubation 20,22,26. Selvom det ikke er nødvendigt for β-oxidationsassay, hvis det er nødvendigt af andre applikationer, kan procentdelen af levedygtige hepatocytter øges ved at fjerne de døde celler gennem et Percoll-lag 22,26.
Afslutningsvis beskriver denne protokol et robust assay til måling af hastigheden af fedtsyre β-oxidation i intakte hepatocytter og uden tilsætning af eksogene cofaktorer, hvorved de endogene reguleringsmekanismer for denne vej bevares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-bevillingen R35GM119528 til Roberta Leonardi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
References
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E.
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), Pt 1 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, Pt 1 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
