Summary
هنا، نقدم بروتوكول تصنيع جهاز ترنزستور (OCMFET) العضوي ذو التأثير الميداني المعدل للشحنة من أجل التشبيك الخلوي المختبري . الجهاز، ودعا مجموعة OCMFET الصغيرة، هو جهاز مرن ومنخفض التكلفة، وأقل مرجعا، والتي سوف تمكن من رصد الأنشطة الكهربائية والتمثيل الغذائي من ثقافات الخلايا الكهربائية.
Abstract
وقد غذت الفيزيولوجيا الكهربائية الحديثة باستمرار من خلال التطوير الموازي للأدوات والمواد المتطورة على نحو متزايد. وفي المقابل، أدت الاكتشافات في هذا المجال إلى إحراز تقدم تكنولوجي في عملية متتالية حددت في نهاية المطاف الإنجازات المثيرة للإعجاب التي تحققت في السنوات الخمسين الماضية. ومع ذلك ، فإن الأجهزة الأكثر استخداما المستخدمة في الاتصال الخلوي (أي صفائف microelectrode والأجهزة الإلكترونية الدقيقة المستندة إلى الترانزستورات) لا تزال تمثل العديد من القيود مثل التكلفة العالية ، وصلابة المواد ، ووجود قطب مرجعي خارجي. للتغلب جزئيا على هذه القضايا، كانت هناك تطورات في مجال علمي جديد يسمى الإلكترونيات الحيوية العضوية، مما أدى إلى مزايا مثل انخفاض التكلفة، ومواد أكثر ملاءمة، وتقنيات التصنيع المبتكرة.
وقد اقترح العديد من الأجهزة العضوية الجديدة مثيرة للاهتمام خلال العقد الماضي لواجهة مريحة مع ثقافات الخلايا. تعرض هذه الورقة بروتوكول تصنيع أجهزة للتشبيك الخلوي استنادا إلى الترانزستور الميداني المعدل للشحن العضوي (OCMFET). تجمع هذه الأجهزة، التي تسمى صفائف OCMFET الدقيقة (MOAs)، بين مزايا الإلكترونيات العضوية والسمات الغريبة ل OCMFET لإعداد أدوات شفافة ومرنة وأقل مرجعية يمكن من خلالها مراقبة كل من الأنشطة الكهربائية والتمثيل الغذائي لخلايا القلب والخلايا العصبية في المختبر ، مما يسمح بتقييم متعدد البارامتريات لنماذج الخلايا الكهربائية.
Introduction
في رصد الجسم الحي للخلايا الكهربائية، مثل الخلايا العصبية وخلايا القلب، يمثل نهجا صالحا وقويا في التطبيقات البحثية الأساسية للدماغ البشري، ودراسات الاتصال الوظيفي، والصيدلة، وعلم السموم. وتستند الأدوات المستخدمة عادة لهذه الدراسات أساسا على صفائف microelectrode (MEAs)1,2,3,4,5 وأجهزة ذات تأثير ميداني أكثر كفاءة وقوة (FEDs)6,7,8,9,10,11,12 . تسمح هاتان العائلتان من الأجهزة بمراقبة وتحفيز النشاط الكهربائي للخلايا العصبية وخلايا القلب في الوقت الفعلي وعادة ما تتميز بالقوة وسهولة الاستخدام والموثوقية. هذه الميزات تجعل MEAs وFEDs المعيار الذهبي للتطبيقات الكهربية، ويجري استخدامها حاليا لواجهة مع الثقافات الخلوية القياسية، شرائح الدماغ organotypic، و organoids ثلاثية الأبعاد13،14،15،16. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع وخصائصها المثيرة للإعجاب ، فإن MEAs و FEDs تمثل بعض القيود مثل التكلفة العالية ، وصلابة المواد ، ووجود قطب مرجعي ضخم عادة ، والذي يجب وضعه في بيئة القياس السائلة وضروري لتشغيل الأجهزة بشكل صحيح.
لاستكشاف حلول بديلة للتشبيك الخلوي ، تم استثمار الكثير من الجهد في العقد الماضي في دراسة الأجهزة الإلكترونية القائمة على المواد العضوية وتقنيات التصنيع المبتكرة17. من بين العديد من الأجهزة العضوية التي تمت دراستها لمعالجة القيود المذكورة أعلاه ، تم اقتراح ترانزستور عضوي غريب يسمى OCMFET مؤخرا كبديل صالح ل MEAs و FEDs18. بالإضافة إلى الميزات القياسية التي توفرها تقنية الإلكترونيات العضوية ، مثل المواد منخفضة التكلفة وتقنيات التصنيع ، والخصائص الميكانيكية والكيميائية المثلى ، والشفافية البصرية ، والتوافق البيولوجي ، يقدم OCMFET أيضا حساسية شحن عالية جدا (بسبب بنيته ذات البوابتين) دون الحاجة إلى قطب مرجعي خارجي. وعلاوة على ذلك، يتمتع هذا المستشعر العضوي بقدرة ملحوظة على استشعار مختلف المعلمات التحليلية/الفيزيائية، اعتمادا على التشغيل الوظيفي المحدد لمنطقة الاستشعار الخاصة به، والتي يتم فصلها عن منطقة الترانزستور19,20. يمكن استغلال كل هذه الميزات بشكل ملائم للحصول على معلمات مختلفة داخل ثقافة الخلوية. على وجه الخصوص ، بالإضافة إلى القدرة على الكشف عن النشاط الكهربائي العصبي / القلب ، فمن الممكن أيضا استغلال حساسية درجة الحموضة العالية للغاية التي يوفرها الهيكل المزدوج المسور الغريب ل OCMFET باستخدام وظيفية بدنية بسيطة21 لمراقبة الاختلافات الطفيفة في درجة الحموضة المحلية الناجمة عن النشاط الأيضي الخلوي بشكل موثوق.
في الخلايا المختبرية الاستشعار الحيوي، ورصد النشاط الأيضي الخلوي هو مؤشر قوي على حالة الثقافة، ويمكن استخدامها لتقييم الاستجابة الخلوية لمختلف المحفزات، مثل إدارة الأدوية والتحفيز الكهربائي22،23. وعلاوة على ذلك، في حالة محددة من التطبيقات العصبية، ورصد كل من الأنشطة الكهربائية والأيضية هو من أهمية كبيرة، لا سيما في علم الصيدلة وعلم السموم24. بهدف معالجة متطلبات الفيزيولوجيا الكهربية الحديثة في المختبر بشكل ملائم وفي الوقت نفسه تقديم جميع مزايا OCMFET ، تم مؤخرا تقديم جهاز يسمى Micro OCMFET Array (MOA). وزارة مكافحة الخلايا هو مجموعة OCMFET المستندة إلى مناطق الاستشعار المتخصصة المصممة خصيصا للتشبيك الخلوي المختبري ، مما يتيح التحليل متعدد البارامترات لثقافات الخلايا الكهربائية. وعلى وجه الخصوص، يوجد في قناتين من قنوات وزارة الرقابة مجالات استشعار أكبر لزيادة حساسيتهما إلى أقصى حد، ويمكن تشغيلهما بشكل انتقائي لرصد بارامترات محددة ذات أهمية، مثل الاختلافات في درجة الحموضة في الوسط الثقافي. OCMFETs الأخرى في الهيكل بمثابة أجهزة استشعار النشاط الكهربائي خارج الخلية. ويبين الشكل 1 هيكل قناة 16 وزارة الأبحاث. هذه القدرة، جنبا إلى جنب مع عدم وجود قطب مرجعي خارجي، يجعل وزارة شؤون الشؤون الخارجية أداة مثيرة جدا للاهتمام للتطبيقات في المختبر . يقدم هذا العمل بروتوكول التصنيع خطوة بخطوة لوزارة مكافحة الأمراض المتعددة الأمراض للكشف في المختبر عن الأنشطة الكهربائية والأيضية للخلايا العصبية وخلايا القلب. يوضح الشكل 2 خطوات التصنيع الرئيسية والمواد المستخدمة وبنية الجهاز.
Protocol
وقد اتبعت جميع المبادئ التوجيهية الدولية والوطنية و/أو المؤسسية المعمول بها لرعاية الحيوانات واستخدامها. وبذلت كل الجهود لتقليل عدد الحيوانات من أجل المشروع والتقليل إلى أدنى حد من معاناتها.
1. إعداد الحل النامية ، وحلول النقش ، والحل أشباه الموصلات العضوية ، وأقنعة فوتوليتوغرافية
- إعداد الحل النامية عن طريق تخفيف الكريات NaOH في الماء deionized بتركيز 175 mM.
ملاحظة: هذا هو رد فعل طارد للحرارة. إذا تم استخدام حاوية بلاستيكية، والحفاظ على التحريض الحاوية حتى يتم حل جميع الكريات تماما. - إعداد محلول حفر التيتانيوم عن طريق تخفيف حمض الهيدروفلوريك (HF) في الماء المؤين (جزء واحد من تركيز 48٪ HF، 49 أجزاء المياه deionized).
تنبيه: يمكن لحمض الهيدروفلوريك اختراق الجلد بسهولة، مما يسبب ضررا شديدا لطبقات الأنسجة العميقة. ومن الضروري تحييد التردد العالي بسرعة لمنع تدمير الأنسجة، الذي قد يستمر لأيام ويؤدي إلى إصابة شديدة أو حتى الموت. تعتمد المخاطر المرتبطة بالHF على التركيز ومدة ملامسة الحمض. استخدام فقط تحت غطاء الدخان باستخدام درع الوجه. ويوصى أيضا gloving مزدوجة بشدة. - إعداد محلول حفر الذهب عن طريق خلط اليود، يوديد البوتاسيوم، والمياه deionized (ل250 غرام من الحل، واستخدام 200 مل من الماء deionized، 20 غرام من KI، 5 غرام من I2). يحرك المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ويترك يستريح بين عشية وضحاها قبل الاستخدام.
- إعداد حل أشباه الموصلات عن طريق حل 6,13-bis (triisopropylsilylethynyl) بنتاسيني (TIPS Pentacene) في أنيزول (1٪ في الوزن) واثارة بلطف لمدة 2 ح على لوحة ساخنة في 80 °C.
ملاحظة: الاحتفاظ agitating هذا الحل. استخدام قوارير الزجاج العنبر و / أو تخزينها في ظروف الإضاءة المنخفضة. - إعداد قناع فوتوليتوغرافي المطلوب مجموعة مع برنامج الرسومات المتجهة. إعداد 5 أقنعة للعملية برمتها: قناع لأنماط البوابات العائمة (FGs)؛ قناع لفتح القنينات ومناطق الاستشعار للتسجيلات الكهربية؛ القناع لعملية المحاذاة الذاتية؛ قناع لأنماط المصدر، واستنزاف ومراقبة الاتصال بوابة أعلى؛ وقناع لتنشيط البلازما من قنوات pH.
ملاحظة: اعتمادا على الدقة الضرورية والإعداد الضوئي محددة، يمكن استخدام أنواع مختلفة من أقنعة. وفي حالة الأجهزة المقترحة (التي تبلغ دقتها الجانبية القصوى 40 ميكرومتر)، تم شراء أقنعة بلاستيكية مرنة بسيطة من متجر محلي للتصوير الفوتوغرافي.
2. اختيار الركيزة وإعداد
- قطع 6 × 6 سم مربع من 250 ميكرومتر البولي ايثيلين تيريفثالات (PET) من ورقة PET البكر.
ملاحظة: ابدأ بركيزة أكبر قليلا من الجهاز النهائي للحصول على هوامش واسعة بما يكفي للسماح بالتلاعب بالملاقط المختبرية القياسية دون إتلافها. - فحص الركيزة مع المجهر البصري لاستبعاد وجود الأخاد العميقة والخدوش. حدد بعناية الركائز أقل خدش كما عيوب أكبر قد يؤدي إلى فشل الجهاز النهائي.
- شطف ركائز PET مع الأسيتون، والكحول isopropyl، والمياه deionized (في هذا الترتيب) وتجفيفها باستخدام تيارات النيتروجين. تخزين الركائز في أطباق بيتري البلاستيك نظيفة / حاويات.
3. FG: ترسب التيتانيوم
- تنظيف الركائز مسبقا بأوكسجين البلازما (30 s في 100 W) ووضعها على حامل الركيزة داخل غرفة فراغ المبخر الحراري.
- ضع 60 ملغ من التيتانيوم في بوتقة، وإغلاق مصراع الكاميرا، وضخ أسفل غرفة التبخر حتى تصل إلى مستوى فراغ أقل من 10-6 تور. زيادة قوة المبخر حتى يضيء بوتقة الأحمر وانتظر لمدة 30 ق. افتح الغالق، وارفع الطاقة إلى 60٪ (أو حتى يضيء البوتقة باللون الأبيض الساطع)، وانتظر حتى 60 s. أغلق الغالق واغلق الطاقة.
- إزالة الركائز من المبخر. تنظيفها باستخدام الأسيتون، الكحول isopropyl، والمياه deionized؛ وتجفيفها باستخدام تيارات النيتروجين. إجراء علاج بلازما الأكسجين الثاني (60 ثانية في 200 W) لتأكسد قليلا سطح التيتانيوم.
4. FG النقش
- وضع ركيزة واحدة في وقت واحد على معطف تدور وضعت داخل غطاء محرك السيارة الدخان. إيداع 4 مل من الكواسير الضوئية على الركيزة باستخدام ماصة بلاستيكية يمكن التخلص منها. استخدم معلمات طلاء الدوران التالية للحصول على طبقة 2 ميكرومتر سميكة من الكواتر الضوئية: سرعة الدوران: 3000 دورة في الدقيقة؛ تدور الوقت: 45 ق; تسارع الوقت: 0.5 s; وقت التباطؤ: 0.5 s.
- خبز ناعمة في فوتوريست عن طريق وضع الركيزة على لوحة ساخنة (70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق). تخزين الركيزة داخل طبق بيتري ملفوفة رقائق الألومنيوم / حاوية بلاستيكية لتجنب التعرض للضوء المباشر.
ملاحظة: تجنب درجة حرارة الخبز المقترحة (100 درجة مئوية لمدة 50 s) لمنع تشوه الركيزة. ومع ذلك، الخبز في درجة حرارة أقل لفترة أطول يضمن نتائج جيدة. - ضع الجهاز في بروموغراف وضع قناع فوتوليتوغرافي البلاستيك مع تخطيط FG المطلوب على الركيزة. تعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) من الأعلى لمدة دقيقة واحدة، وإزالة القناع بعناية، مع الحرص على تقليل الحركات الجانبية للقناع فوق الركيزة لتجنب خدشه.
- يغرق الركيزة لمدة 5 ق في وعاء زجاجي مملوءة الحل النامية (الخطوة 1.1). شطف بسرعة في الماء deionized وتجفيفه تحت النيتروجين. استخدام المجهر البصري للبحث عن البقع المتخلفة / المتخلفة في الركيزة. كرر غمر الركيزة في تطوير الحل في حالة التخلف.
- حفر التيتانيوم المكشوفة عن طريق غمرها في محلول حفر التيتانيوم (الخطوة 1.2) لمدة 15 ثانية، وشطفه بالماء deionized، وتجفيفه باستخدام النيتروجين. فحص بصريا الركيزة وإزالة الكواتر الضوئي باستخدام الأسيتون. شطف الركيزة مع الكحول isopropyl والماء deionized، وتجفيفها مع النيتروجين.
5. بوابة ترسب عازلة
- إعداد غرفة ترسب معطف باريلين عن طريق توزيع 2 مل من المروج التصاق (سيلان - 3-(trimethoxysilyl)بروبيل ميثاكريلات) على جدران غرفة الترسب باستخدام مسح المختبر. مكان 300 ملغ من باريلين C ديمر (المقابلة لسمك النهائي من 150 نانومتر) على معطف باريلين. تعيين قيمة الضغط المنخفض إلى 7 mbar وقيمة الضغط الأعلى إلى 10 mbar. بعد الترسب، وتنظيف الركائز مع الأسيتون، والكحول isopropyl، والمياه deionized، وتجفيفها مع النيتروجين.
6. فتح مناطق الاستشعار في OCMFET لتسجيل النشاط الكهربائي وتشكيل من خلال الوصول إلى الجزء الخلفي من FGs
- إيداع والاسترداد الضوئي على الركائز باستخدام نفس المعلمات من الخطوتين 4.1 و 4.2.
- ضع الجهاز في بروموغراف وضع قناع فوتوليتوغرافيا بلاستيكي على الركيزة للفيانس (فتحات دائرية بقطر 50 ميكرومتر فوق مناطق الاستشعار وفتحات 100 × 100 ميكرومتر2 فوق FGs بعيدا عن مناطق الاستشعار (يشار إليها باسم الاتصال الخلفي ل FGs في الشكل 1 والشكل 2)) تحت مجهر مجسم لتحسين دقة المحاذاة. تعرض للأشعة فوق البنفسجية من الأعلى لمدة دقيقة واحدة، وإزالة بعناية القناع، مع الحرص على تقليل الحركات الجانبية للقناع على الركيزة لتجنب خدشه.
ملاحظة: تعتبر القنينات الموجودة على جانب FGs بعيدا عن منطقة الاستشعار (الموضحة كجهة اتصال خلفية ل FGs في الشكل 1 والشكل 2) ضرورية للاتصال أثناء توصيف الترانزستور. وعلاوة على ذلك، قد يكون الوصول إلى الأجهزة الكهربائية مفيدا جدا لأنواع مختلفة من التشغيل (مثل وضع الأقطاب الكهربائية). - تطوير واريسيست كما سبق وصفه في الخطوة 4.4. فضح الركيزة مع المنقوشة الضوئية (الذي يعمل كقناع هنا) إلى البلازما الأكسجين (180 ق في 200 W) لإزالة C باريلين من مناطق الاستشعار.
ملاحظة: معدل النقش من باريلين C في منظف البلازما متساوي الخواص في 200 W هو تقريبا 90 نانومتر / دقيقة. يتم إجراء الإفراط طفيف حفر لمزيد من تنظيف مناطق الاستشعار. كما يتم حفر وازالة التصوير الضوئي خلال هذه العملية. ومع ذلك، سمكه (2 ميكرومتر) أعلى بكثير من ذلك من باريلين C. - وضع الركائز في وعاء زجاجي مملوءة الأسيتون داخل حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 ق لإزالة وامتلأ تماما. شطف الركائز مع الأسيتون، والكحول isopropyl، والماء وتجفيفها مع النيتروجين.
ملاحظة: استخدام sonication بدلا من مجرد الشطف الركائز مع الأسيتون أمر بالغ الأهمية لمنع طي غير مرغوب فيه وإعادة ترسب شظايا باريلين C على سطح مناطق الاستشعار.
7. المواءمة الذاتية للمصدر واستنزاف مع FG
- إيداع والاسترداد الضوئي على الركائز باستخدام نفس المعلمات من الخطوتين 4.1 و 4.2. ضع الجهاز في بروموغراف ووضع على الركيزة قناع فوتوليتوغرافي بلاستيكي مع مستطيلات سوداء بسيطة تغطي مناطق الترانزستور تماما. تعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقة واحدة من كل من أعلى وأسفل، وإزالة بعناية القناع، مع الحرص على تقليل الحركات الجانبية للقناع على الركيزة لتجنب خدشه.
ملاحظة: مع التعرض على الوجهين، تعمل FGs كأقنعة ضوئية فيما يتعلق بالتعرض السفلي، في حين أن وجود القناع العلوي يضمن أن يبقى فقط جهاز التصوير الموجود على قناة الترانزستورات غير مكشوف. - تطوير واريسيست كما سبق وصفه في الخطوة 4.4.
8. ترسب الذهب، وتشكيل قناة، ونمط من المصادر، والمصارف، وبوابات التحكم
- تنظيف الركائز مع علاج البلازما لطيف (30 ق في 30 واط) لتعزيز التصاق المعدن على C باريلين ووضعها على حامل الركيزة داخل غرفة فراغ المبخر الحراري.
- ضع 30 ملغ من الذهب في بوتقة، وإغلاق مصراع الكاميرا، وضخ أسفل غرفة التبخر حتى تصل إلى 10-5 تور. زيادة قوة المبخر حتى يضيء بوتقة الأحمر وانتظر لمدة 30 ق. افتح الغالق، وارفع الطاقة إلى 40٪ (أو حتى يضيء البوتقة باللون الأبيض الساطع)، وانتظر 60 s، وأغلق الغالق، واغلق الطاقة.
- ضع الركائز في حاوية الأسيتون داخل حمام الموجات فوق الصوتية لمدة 10 ق لرفع قبالة الكواتر الضوئية، وبالتالي إزالة الذهب من قناة الترانزستورات. شطف الركائز مع الأسيتون، والكحول isopropyl، والماء وتجفيفها مع النيتروجين. إيداع والاسترداد الضوئي على الركائز باستخدام نفس المعلمات من الخطوتين 4.1 و 4.2.
- ضع الجهاز في بروموغراف ووضع على الركيزة قناع فوتوليتوغرافي بلاستيكي مع المصادر المطلوبة، والمصارف، وتخطيط بوابة التحكم. تعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقة واحدة من الأعلى، وإزالة بعناية القناع، مع الحرص على تقليل الحركات الجانبية للقناع على الركيزة لتجنب خدشه.
- تطوير واريسيست كما هو موضح في الخطوة 4.4. حفر الذهب المكشوفة عن طريق غمرها في محلول حفر الذهب (الخطوة 1.3) لمدة 10 ق، وشطفه بالماء deionized، وتجفيفه باستخدام النيتروجين. فحص بصريا الركيزة وإزالة الكواتر الضوئي باستخدام الأسيتون. شطف مع الكحول isopropyl والمياه deionized وتجفيفها مع النيتروجين.
9. ترسب وتفعيل الباريلين C للاستشعار الأسكتراسي
- إيداع والاسترداد الضوئي على الركائز باستخدام نفس المعلمات من الخطوتين 4.1 و 4.2.
- ضع الجهاز في بروموغراف ووضع على الركيزة قناع فوتوليتوغرافي بلاستيكي مع فتحات المقابلة لمناطق استشعار الرقم الحموضة من OCMFETs. تعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقة واحدة من الأعلى، وإزالة بعناية القناع، مع الحرص على تقليل الحركات الجانبية للقناع على الركيزة لتجنب خدشه.
- تطوير واريسيست كما هو موضح في الخطوة 4.4. حماية الجهاز كله، باستثناء مناطق استشعار الحموضة، مع شريط العزل البوليميد (انظر جدول المواد). إيداع طبقة من 500 نانومتر من باريلين C (المقابلة ل 1 غرام من باريلين C dimer) على الركيزة باستخدام نفس المعلمات الموصوفة في الخطوة 5.1.
ملاحظة: يبلغ إجمالي سمك باريلين C في مناطق استشعار الأسكH 650 نانومتر. لا حاجة إلى سيلان لهذه الشهادة. - إزالة بعناية الشريط العزل البوليميد. تعريض الركيزة إلى بلازما الأكسجين (5 دقائق و 30 ق في 200 W) لتنشيط C باريلين على مناطق استشعار الأسكH من OCMFETs.
ملاحظة: شريط العزل بوليميد ضروري هنا للحد من ترسب باريلين C. في الواقع، بسيطة الإقلاع باستخدام الكواتر الضوئي لا يعطي نتائج إيجابية نظرا لطبيعة خالية من الثقب تقريبا من طلاء المطابقة التي تم الحصول عليها مع باريلين C. - وضع الركائز في حاوية الأسيتون داخل حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 ق لإزالة تماما من الكوابح الضوئي. شطف الركائز مع الأسيتون والكحول isopropyl (لا ماء) وتجفيفها بالنيتروجين.
10. ترسب أشباه الموصلات، ووضع غرفة زراعة، وقطع النهائي من الجهاز من PET
- ضع الركائز على طبق ساخن عند 50 درجة مئوية. يلقي قطرة (1 ميكرولتر) من محلول أشباه الموصلات (الخطوة 1.4) على كل منطقة القناة، وتغطية الركيزة بأكملها مع غطاء، والسماح لها تجف تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية لمدة 30 دقيقة.
- قم بإعداد غرفة الاستزراع عن طريق طباعة حلقة أكريلونتريل بوتاديين ستايرين بنصف قطر داخلي 15 مم، وسمك 1 مم، وارتفاع 7 مم مع طابعة ثلاثية الأبعاد. الغراء غرفة زراعة على الجزء المركزي من الركيزة باستخدام polydimethylsiloxane (نسبة عامل المعالجة: 15٪ من حيث الوزن). قطع الجهاز من PET إما يدويا أو باستخدام قاطع ليزر.
11. التوصيف الكهربائي الترانزستورات
- تميز كل ترانزستور باستخدام مقياس مصدر18,19,20,21 (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يجب قياس كل من الإخراج وخصائص الإدخال لاستقراء معلمات الترانزستورات (بشكل رئيسي حركة الناقلين، والجهد العتبي، ونسبة ION/IOFF ، ومنحدر الحيازة الفرعية).
Representative Results
وقد تم التحقق من صحة إمكانات وزارة الحسابات هنا لكل من تسجيلات النشاط الكهربائي ورصد النشاط الأيضي. واستند التقدير الدقيق لقدرات الجهاز على الكشف عن إمكانات العمل خارج الخلية على توصيف شامل مع ثقافات خلايا القلب الفئران (لا سيما في خلايا القلب الفئران الأولية التي تقاس في 8 أيام في المختبر [DIV])18. يظهر الشكل 3A MOA كاملة مع 16 OCMFETs. تظهر البداية العلوية مثالا لثقافة خلايا القلب الجرذة الالتقاءية التي تلتزم بسطح MOA. لتسليط الضوء على صحتهم، كانت الخلايا ملطخة بالمناعة للبروتين الساركوميري، تروبوميوسين، بعد جلسة التسجيل. تظهر مجموعة أسفل إشارة عضلة القلب واحدة تقاس مع OCMFET.
ومن المثير للاهتمام أن الجهاز يمكن أن يكشف عن النشاط الكهربائي التلقائي والنشاط الناجم عن إدارة مواد كيميائية مختلفة، كما هو مبين في الشكل 3B. وكان هذا التحقق حاسما لإثبات جدوى استخدام هذا النهج في ربط الخلايا الكهربائية. وبسبب تكوين الصفيف، سمحت وزارة الحسابات أيضا بإعادة بناء سرعة انتشار الإشارة القلبية، مما يدل على مدى ملاءمة النظام لدراسة الشبكات الخلوية (الشكل 3C). لمزيد من التحقق من صحة لتحديد الحد الفعلي للكشف عن الجهاز، كما تم اختبار وزارة الحسابات مع الخلايا العصبية سترياتال (21 DIV)18، مع نتائج مثيرة للاهتمام من حيث سعة الإشارة وموثوقية التسجيلات. وكما رأينا في الشكل 3D، يمكن أن يضخم OCMFET إمكانات مجال الخلايا العصبية مع استقرار ملحوظ، مما يدل على نسب الإشارة إلى الضوضاء (SNRS) تصل إلى 3.2 (في نفس النطاق الذي تم الحصول عليه من SNRs مع MEAs25 القياسية). تألف إعداد التسجيل من إلكترونيات متعددة القنوات مخصصة لتحيز الترانزستور وقراءة الإشارة وتكييفها. كل قناة للتسجيل الكهربائي لديها المرحلة الأولى التي تتكون من محول I / V مع مقاوم ردود الفعل MΩ 1 ومرشح ممر النطاق 150 هرتز -1.3 كيلوهرتز مع كسب الجهد من 110. بالنسبة لجميع القياسات المقدمة، كانت الترانزستورات متحيزة مع VDS = VGS = -1 V. تم إجراء التحويل A/D وتصور البيانات وتخزينها باستخدام لوحة الحصول على البيانات (انظر جدول المواد). أجريت جميع جلسات القياس داخل قفص فاراداي لتقليل الضوضاء الكهربائية والبيئية على النظام.
وكما ذكر سابقا، فإنه من خلال استغلال الوظيفة المادية البسيطة الواردة في البروتوكول، كان من الممكن إعداد أجهزة استشعار درجة الحموضة شديدة الحساسية مع استجابة فائقة التناسخ. بسبب نهج التصنيع المقدم ، يمكن دمج هذه الأجهزة درجة الحموضة في وزارة الرقابة الداخلية واستخدامها لرصد الاختلافات الطفيفة في درجة الحموضة الناجمة عن النشاط الأيضي للخلايا العصبية الأولية للفئران فرس النهر26. وعلى وجه الخصوص، وكما هو مبين في الشكل 4، لم يعمل بصورة انتقائية سوى واحد من اثنين من الأفرقة العاملة المعنية بلاستشعار المنخفض التردد، وذلك لإثبات جدوى هذا النهج. سمح هذا الوظيفي الانتقائي بتقييم استجابة OCMFETs اثنين من الاختلافات الأيضية الناجمة كيميائيا: على وجه الخصوص، يمكن الحصول على حالة التمثيل الغذائي عالية باستخدام بيكوكلين (BIC)، مثبط مستقبلات GABA A27، في حين يمكن أن يكون سبب حالة التمثيل الغذائي منخفضة بإضافة التيترودوتوكسيين (TTX)، الذي يسبب في نهاية المطاف الموت الخلوي28 . وتألف إعداد التسجيل من نفس الأجهزة الإلكترونية متعددة القنوات المخصصة المستخدمة لقياسات النشاط الإلكتروني.
على عكس الحالة السابقة ، تم استخدام قناتين مخصصتين لتسجيل الاختلافات البطيئة الناجمة عن النشاط الأيضي الخلوي. تألفت كل قناة من دائرة بسيطة تتكون من كتلتين رئيسيتين: محول I / V مع مقاوم تغذية مرتدة MΩ 1 ومرشح تمرير منخفض مع تردد قطع 10 هرتز. كانت الترانزستورات متحيزة مع VDS = VGS = -1 V ، وتم إجراء جميع القياسات داخل قفص فاراداي لتقليل تأثير الضوضاء الخارجية على التسجيلات (وهذا جانب مهم بشكل خاص بالنظر إلى التقلبات الحالية المنخفضة الناجمة عن النشاط الأيضي الخلوي). وخلال التجارب، تم الحفاظ على الثقافات في وسط ثقافي منخفض التخزين المؤقت، ووضع النظام بأكمله في بيئة خاضعة للرقابة (37 درجة مئوية وتدفق مستمر CO2/air). وكما هو متوقع، لا يمكن تعديل إلا تيار OCMFET الحساسة ل درجة الحموضة بإضافة 25 ميكرومتر BIC. وقد تأكد ذلك كذلك من خلال تحريض الاختلاف الحالي من خلال الاختلاف المقابل للنشاط الأيضي الخلوي.
تكررت التجربة نفسها بعد إضافة 10 ميكرومتر TTX ، مما أدى إلى تباطؤ تدريجي في عملية التمثيل الغذائي الخلوي. وبعد إضافة TTX، لم تظهر OCMFET الحساسة لفئة الحموضة ولا الاستجابة غير الحساسة لhh أي استجابة، مما يدل على فعالية النهج. وتبين هذه النتائج فعالية العملية المقترحة واستقرارها النسبي لمدة تصل إلى أسبوعين. ومن الاستنتاجات الهامة التي يمكن استخلاصها من التجارب المقترحة (النشاط الكهربائي والنشاط الأيضي على حد سواء) أنه من الممكن إعداد أنواع مختلفة من أجهزة الاستشعار عن طريق التشغيل الانتقائي لمختلف OCMFETs داخل نفس منطقة التجريب. ويمثل هذا الجانب إنجازا غير تافه في مجال الاستشعار البيولوجي للتطبيقات الخلوية لأن القدرة على رصد بارامترات مختلفة داخل نفس ثقافة الخلية أمر بالغ الأهمية لتحسين توصيف تعقيد تلك النظم البيولوجية.
الشكل 1: أعلى عرض من 16 قناة وزارة الرقابة لرصد الأيض والكهرباء من الخلايا الكهربائية. شريط المقياس = 1 سم. الاختصارات: OCMFETs = الترانزستورات العضوية ذات التأثير الميداني المعدلة للشحن؛ FG = البوابة العائمة. S/D = المصدر/التصريف؛ MOA = صفيف OCMFET الصغير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خطوات التصنيع الرئيسية لوزارة الرقابة الداخلية للرصد الأيضي والكهربائي للخلايا الكهربية. (A و B) تم نقش فيلم Ti المتبخر باستخدام عملية فوتوليتوغرافية قياسية لإعداد البوابة العائمة ل OCMFETs. (ج) ترسب 15 نانومتر من باريلين C. هذه الطبقة، جنبا إلى جنب مع أكسيد تي الأصلي، بمثابة عازلة البوابة من الترانزستورات. (D و E) يتم نقش طبقة باريلين C باستخدام علاج الأكسجين البلازما. يتم استخدام طبقة منقوشة من الكواتر الضوئية لكشف مناطق الاستشعار بشكل انتقائي للتسجيلات الكهربائية واتصالات البوابة العائمة مرة أخرى. (F) نقش جهات الاتصال Au أعلى، وهي المصدر، واستنزاف، بوابة التحكم، وبوابة عائمة الاتصال مرة أخرى. يتم استخدام تقنية المحاذاة الذاتية لتحسين الأداء الكهربائي للجهاز. (G-I) ترسب الطبقة الثانية من باريلين C على منطقة الاستشعار من OCMFETs لرصد النشاط الأيضي. بعد التعرض للبلازما الأكسجين، وهذه الطبقة بمثابة غشاء حساسة لhh (J). (ك) المقطع العرضي من وزارة الزراعة كاملة (مع المواد) بعد ترسب أشباه الموصلات العضوية (TIPS Pentacene) ووضع غرفة الثقافة. الاختصارات: OCMFETs = الترانزستورات العضوية ذات التأثير الميداني المعدلة للشحن؛ FG = البوابة العائمة. S/D = المصدر/التصريف؛ MOA = صفيف OCMFET الصغير؛ CG = بوابة التحكم; PET = البولي ايثيلين تيريفثالات; Par C = باريلين C; TIPS = 6,13-bis (ثلاثي البروبيلسيليثيلينيل) بنتاسيني; ABS = أكريلونتريل بوتاديين ستايرين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تسجيلات النشاط الكهربائي الخلوي مع MOA. (أ) ثقافة التقاء خلايا القلب الفئران (8 DIV) التمسك سطح وزارة الرقابة، ثابتة بعد جلسة تسجيل والملطخة بالمناعة للبروتين الساركوميري، تروبوميوسين (inset العليا). أسفل inset: مثال على إشارة عضلة القلب واحدة تقاس مع OCMFET. شريط المقياس = 150 ميكرومتر (ب) ضبط الكيميائية للنشاط الكهربائي لثقافة عضلة القلب. نتج تسارع النشاط عن إضافة 100 مليون م نوردرينالين ، في حين نتج القمع عن إضافة 100 مليون فيراباميل. اليسار: ضرب تعديل التردد؛ اليمين: إحصاءات عن 5 OCMFETs متوسط الانحراف المعياري: ارتفاع العد على 4 دقائق من القاعدية (129 ± 4.6)، النورادرينالين بوساطة (280 ± 28.6) والنشاط بوساطة فيراباميل (15 ± 1.9). (ج) إعادة بناء انتشار إشارة القلب. اليمين: مؤامرة تنقيطية للنشاط التلقائي للثقافة تشير إلى انتشار الإشارة من الموقع 14 إلى الموقع 41 (يمين). (د) إمكانات عمل الخلايا سترياتال من جنين الفئران (21 DIV). وقد تم تعديل هذا الرقم من 18. الاختصارات: OCMFET = الترانزستور العضوي ذو التأثير الميداني المعدل بالشحن؛ MOA = صفيف OCMFET الصغير؛ NE = النورادرينالين; VER = فيراباميل; DIV = أيام في المختبر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تسجيلات النشاط الأيضي مع وزارة الحسابات. استجابة القنوات الحساسة ل درجة الحموضة (A) و(B) غير الحساسة ل درجة الحموضة في وزارة مكافحة ال مصدقة إلى إضافة 25 ميكرومتر BIC قبل وبعد إضافة 10 ميكرومتر من TTX. بعد إضافة TTX سلوك القناة الحساسة ل pH يصبح مشابهة لتلك التي من واحد غير حساسة لhh. على وجه الخصوص ، لا يمكن ملاحظة أي اختلاف حالي بعد إضافة BIC بسبب الوفاة الخلوية الناجمة عن TTX. (ج) وزارة الحسابات لتسجيلات النشاط الأيضي. يتم تحديد PH الحساسة و OCMFETs غير حساسة لhh باللونين الأخضر والأحمر، على التوالي. Inset: الخلايا العصبية فرس النهر صحية مثقف على الجهاز بعد 15 DIV. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من 26. الاختصارات: OCMFET = الترانزستور العضوي ذو التأثير الميداني المعدل بالشحن؛ MOA = صفيف OCMFET الصغير؛ BIC = بيكوكلين; TTX = التيترودوتوكسيين; DIV = أيام في المختبر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
على عكس الطرق السابقة لتصنيع OCMFETs للتطبيقات الخلوية18،29 ، تم تصميم الطريقة المقترحة خصيصا لإعداد MOAs التي يمكنها الكشف عن النشاط الخلوي الكهربائي والأيضي في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج لتحقيق حساسية درجة الحموضة له ميزة التوافق مع بروتوكولات التصنيع القياسية ولا ينطوي على أي تعديل كيميائي لمنطقة الاستشعار (يضمن هذا الجانب التوافق البيولوجي للجهاز بأكمله). يتم تحقيق حساسية الأسهاء باستخدام نفس المادة المستخدمة كبوابة عازلة (أي الباريلين C المتوافق بيولوجيا) ، مما يجعل هذا النهج سريعا وقابلا للاستنساخ.
والنتيجة النهائية لهذا النهج هي أداة عضوية مرنة وشفافة ومنخفضة التكلفة ومتعددة السن للتطبيقات الخلوية في المختبر . وحقيقة أنه يمكن الحصول على ذلك باستخدام بنية ترانزستور واحدة وتعديل مادي بسيط لمنطقة الاستشعار تضيف إلى المزايا التي يتيحها استخدام المواد والأساليب الإلكترونية العضوية. وعلاوة على ذلك، لأن مبدأ النقل من OCMFET لا يعتمد بشكل صارم على أشباه الموصلات محددة أو المواد FG، يمكن تعديل العملية برمتها والارتقاء بها اعتمادا على تطبيق معين.
وهناك جانب حاسم من التقنية المقترحة يرتبط بإعادة إنتاج تقنية تنشيط البلازما. للحصول على نتائج متسقة، يجب التحكم في كل من سمك باريلين C ومعدل النقش. المعايرة المتكررة لعملية ترسب باريلين C ومنظف البلازما ضرورية للغاية. الجوانب الحاسمة الأخرى، والتي تسهم أيضا في استنساخ العملية، هي التعامل الدقيق مع الجهاز وترسب أشباه الموصلات العضوية. تم استخدام تقنية بسيطة لإسقاط الصب هنا ، والتي تشكل في جوهرها قيود الاستنساخ. ولتقليل هذه المسائل إلى أدنى حد، كما هو موضح في الخطوة 10-1 من البروتوكول، ينبغي استخدام نفس الكمية من محلول أشباه الموصلات في كل مرة، وينبغي توحيد تبخر المذيبات قدر الإمكان. الحفاظ على درجة حرارة ثابتة باستخدام لوحة ساخنة وتغطي الركيزة بعد كل ترسب قطرة سوف يساعد في إبطاء عملية التبخر. ولتقليل هذه المشكلة إلى أدنى حد ممكن، يمكن تبديل تقنية الترسب (مثل استخدام أسلوب طباعة نافث للحبر) 30.
10- وينبع تقييد البروتوكول المقترح من طبيعة تشغيل نظام OCMFET لاستشعار الحموضة. يقتصر استقرار أجهزة استشعار الحموضة على بضعة أسابيع26. ومع ذلك ، فإن نافذة الاستقرار للنهج المقترح كبيرة بما يكفي لتغطية أوقات الحضانة القياسية اللازمة لنمو ثقافة الخلايا العصبية (2-3 أسابيع). وينبغي النظر في أنواع أخرى من وظائف منطقة الاستشعار للتجارب الأطول. يستخدم بروتوكول التصنيع جهة اتصال خلفية مخصصة ، مما يسمح بالوصول الكهربائي إلى FGs. ويمكن استغلال هذا الاتصال، الذي يترك عائما أثناء التشغيل العادي للجهاز، من أجل التوصيف الكهربائي للجهاز وتشغيل مناطق الاستشعار باستخدام تقنيات مختلفة (مثل وضع الأقطاب الكهربائية).
يمثل هذا الإجراء طريقة مريحة لإعداد جهاز استشعار متعدد للتطبيقات الخلوية دون الحاجة إلى مواد توسعية أو مرافق غرفة نظيفة. على الرغم من قيود الأداء والاستقرار بسبب استخدام أشباه الموصلات العضوية والتشغيل الفيزيائي (وليس الكيميائي) لمنطقة الاستشعار ، يمكن استخدام نهج مماثلة لإعداد أجهزة استشعار وأجهزة استشعار بيولوجية منخفضة التكلفة (ويمكن التخلص منها) ومرنة ميكانيكيا وشفافة بصريا ، والتي يمكن أن توفر للباحثين في البيولوجيا الخلوية وهندسة الأنسجة وعلم الأعصاب أدوات متخصصة جديدة لدراسة الأنظمة الخلوية في المختبر.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.
Acknowledgments
ويعترف المؤلفون بتمويل برنامج أفق 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاق المنحة رقم 882897-Search&,Rescue ومشروع PON "TEX-STYLE" ARS01_00996، PNR 2015-2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
| 3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
| ABS filament | |||
| Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
| Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
| Gold | Local seller | ||
| Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
| Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
| Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
| Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
| Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
| NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
| Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
| PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
| PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
| PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
| Petri dishes | |||
| Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
| Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
| Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
| Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
| Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
| Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
| Thermal evaporator unit | |||
| TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
| Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
| Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |
References
- Hubel, D. H. Tungsten microelectrode for recording from single units. Science. 125 (3247), 549-550 (1957).
- Verzeano, M., Negishi, K., Angeles, L. Neuronal activity in cortical and thalamic networks. A study with multiple microelectrodes. Journal of General Physiology. 43 (6), 177-195 (1960).
- Thomas, C. A. Jr, Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74 (1), 61-66 (1972).
- Grattarola, M., Martinoia, S. Modeling the neuron-microtransducer junction: from extracellular to patch recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (1), 35-41 (1993).
- Wallace, K., Strickland, J. D., Valdivia, P., Mundy, W. R., Shafer, T. J. A multiplexed assay for determination of neurotoxicant effects on spontaneous network activity and viability from microelectrode arrays. NeuroToxicology. 49, 79-85 (2015).
- Bergveld, P. Development, operation, and application of the tool for electrophysiology. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 19 (5), 342-351 (1972).
- Bergveld, P., Wiersma, J., Meertens, H. Extracellular potential recordings by means of a field effect transistor without gate metal, called OSFET. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 23 (2), 136-144 (1976).
- Fromherz, P., Offenhausser, A., Vetter, T., Weis, J. A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor. Science. 252 (5010), 1290-1293 (1991).
- Martinoia, S., et al. Development of ISFET array-based microsystems for bioelectrochemical measurements of cell populations. Biosensors and Bioelectronics. 16 (9-12), 1043-1050 (2001).
- Heer, F., et al. CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogenic cells. Biosensors and Bioelectronics. 20 (2), 358-366 (2004).
- Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab on a Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
- Maccione, A., et al. Multiscale functional connectivity estimation on low-density neuronal cultures recorded by high-density CMOS micro electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 161-171 (2012).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Scientific Reports. 4, 5489 (2014).
- Zuo, L., Yu, S., Briggs, C. A., Kantor, S., Pan, J. Y. Design and fabrication of a three-dimensional multi-electrode array for neuron electrophysiology. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (12), (2017).
- Spanu, A., et al. A three-dimensional micro-electrode array for in-vitro neuronal interfacing. Journal of Neural Engineering. 17 (3), 036033 (2020).
- Spanu, A., Martines, L., Bonfiglio, A. Interfacing cells with organic transistors: a review of in vitro and in vivo applications. Lab on a Chip. 21 (5), 795-820 (2021).
- Spanu, A., et al. An organic transistor-based system for reference-less electrophysiological monitoring of excitable cells. Scientific Reports. 5, 8807 (2015).
- Viola, F. A., Spanu, A., Ricci, P. C., Bonfiglio, A., Cosseddu, P. Ultrathin, flexible and multimodal tactile sensors based on organic field-effect transistors. Scientific Reports. 8, 8073 (2018).
- Napoli, C., et al. Electronic detection of DNA hybridization by coupling organic field-effect transistor-based sensors and hairpin-shaped probes. Sensors. 18 (4), 990 (2018).
- Spanu, A., et al. A reference-less pH sensor based on an organic field effect transistor with tunable sensitivity. Organic Electronics. 48, 188-193 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Zhang, Y. S., et al. Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2293-2302 (2017).
- Yu, H., et al. A novel design of multifunctional integrated cell-based biosensors for simultaneously detecting cell acidification and extracellular potential. Biosensors and Bioelectronics. 24 (5), 1462-1468 (2009).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring. APL Bioengineering. 2 (4), 046105 (2018).
- Díaz-García, C. M., et al. Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake. Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).
- Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia. Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).
- Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring. IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).
- Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors. Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).
