Summary
Aqui, apresentamos o protocolo de fabricação de um dispositivo orgânico de efeito de campo modulado por carga (OCMFET) para interligação celular in vitro . O dispositivo, chamado de micro OCMFET array, é um dispositivo flexível, de baixo custo e sem referência, que permitirá o monitoramento das atividades elétricas e metabólicas das culturas de células eletroativas.
Abstract
A eletrofisiologia moderna tem sido constantemente alimentada pelo desenvolvimento paralelo de ferramentas e materiais cada vez mais sofisticados. Por sua vez, as descobertas neste campo impulsionaram o progresso tecnológico em um processo de ida e volta que finalmente determinou as impressionantes conquistas dos últimos 50 anos. No entanto, os dispositivos mais utilizados para interligação celular (ou seja, as matrizes de microeletrodos e dispositivos microeletrônicos baseados em transistores) ainda apresentam várias limitações, como alto custo, rigidez dos materiais e a presença de um eletrodo de referência externa. Para superar parcialmente essas questões, houve desenvolvimentos em um novo campo científico chamado bioeletrônica orgânica, resultando em vantagens como menor custo, materiais mais convenientes e técnicas inovadoras de fabricação.
Vários novos dispositivos orgânicos interessantes foram propostos durante a última década para interface conveniente com culturas celulares. Este artigo apresenta o protocolo para a fabricação de dispositivos para interligação celular com base no transistor de efeito de campo modulado por carga orgânica (OCMFET). Esses dispositivos, chamados de micro os arrays OCMFET (MOAs), combinam as vantagens da eletrônica orgânica e as características peculiares do OCMFET para preparar ferramentas transparentes, flexíveis e sem referência com as quais é possível monitorar tanto as atividades elétricas quanto as metabólicas de cardiomiócitos e neurônios in vitro, permitindo assim uma avaliação multiparamétrica de modelos de células eletrogênicas.
Introduction
O monitoramento in vivo de células eletroativas, como neurônios e cardiomiócitos, representa uma abordagem válida e poderosa em aplicações fundamentais de pesquisa para o cérebro humano, estudos de conectividade funcional, farmacologia e toxicologia. As ferramentas geralmente empregadas para tais estudos são baseadas principalmente em matrizes de microeletrísmo (MEAs)1,2,3,4,5 e cada vez mais eficientes e poderosos dispositivos de efeito de campo (FEDs)6,7,8,9,10,11,12 . Essas duas famílias de dispositivos permitem o monitoramento em tempo real e a estimulação da atividade elétrica de neurônios e cardiomiócitos e geralmente são caracterizadas por robustez, facilidade de uso e confiabilidade. Essas características fazem dos MEAs e dos FEDs o padrão ouro para aplicações eletrofisiológicas, sendo atualmente empregados para interagir com culturas celulares padrão, fatias cerebrais organotipadas e organoides tridimensionais13,14,15,16. Apesar de seu uso generalizado e suas características impressionantes, MEAs e FEDs apresentam algumas limitações como alto custo, rigidez dos materiais e a presença de um eletrodo de referência geralmente volumoso, que deve ser colocado no ambiente líquido de medição e é necessário para o bom funcionamento dos dispositivos.
Para explorar soluções alternativas para o interligamento celular, muito esforço foi investido na última década no estudo de dispositivos eletrônicos baseados em materiais orgânicos e técnicas inovadoras de fabricação17. Entre os diversos dispositivos orgânicos estudados para abordar as limitações acima mencionadas, um transistor orgânico peculiar chamado OCMFET foi recentemente proposto como uma alternativa válida aos MEAs e FEDs18. Além das características padrão oferecidas pela tecnologia eletrônica orgânica, como materiais de baixo custo e técnicas de fabricação, ótimas propriedades mecânicas e químicas, transparência óptica e biocompatibilidade, o OCMFET também oferece uma sensibilidade de carga ultra-alta (devido à sua estrutura de dupla entrada) sem a necessidade de um eletrodo de referência externa. Além disso, este sensor orgânico tem a notável capacidade de detectar diferentes parâmetros analito/físico, dependendo da funcionalidade específica de sua área de sensoriamento, que é separada da área transistor19,20. Todos esses recursos podem ser convenientemente explorados para a aquisição de diferentes parâmetros dentro de uma cultura celular. Em particular, além de ser capaz de detectar a atividade elétrica neuronal/cardíaca, também é possível explorar a sensibilidade de pH ultra-alta oferecida pela peculiar estrutura de dois portões do OCMFET usando uma simples funcionalidade física21 para monitorar de forma confiável as pequenas variações locais de pH causadas pela atividade metabólica celular.
Na biosensagem de células in vitro, o monitoramento da atividade metabólica celular é um poderoso indicador do estado da cultura e pode ser usado para avaliar a resposta celular a diversos estímulos, como administração de medicamentos e estimulação elétrica22,23. Além disso, no caso específico das aplicações neurais, o monitoramento tanto das atividades elétricas quanto das metabólicas é de grande interesse, particularmente em farmacologia e toxicologia24. Com a intenção de atender convenientemente aos requisitos da eletrofisiologia in vitro moderna e, ao mesmo tempo, oferecer todas as vantagens do OCMFET, um dispositivo chamado Micro OCMFET Array (MOA) foi recentemente introduzido. O MOA é uma matriz baseada em OCMFET com áreas de sensoriamento especializadas especificamente projetadas para interligação celular in vitro, permitindo a análise multiparamétrica das culturas de células eletrogênicas. Em particular, dois canais MOA possuem áreas de sensoriamento maiores para maximizar sua sensibilidade e podem ser seletivamente funcionalizados para monitorar parâmetros específicos de interesse, como as variações de pH do meio de cultura. Os outros OCMFETs na estrutura atuam como sensores de atividade elétrica extracelular. A Figura 1 mostra a estrutura de um MOA de 16 canais. Essa capacidade, combinada com a ausência de um eletrodo de referência externa, faz do MOA uma ferramenta muito interessante para aplicações in vitro. Este trabalho apresenta o protocolo passo-a-passo de um MOA multissenso para a detecção in vitro das atividades elétricas e metabólicas de neurônios e cardiomiócitos. A Figura 2 mostra as principais etapas de fabricação, os materiais utilizados e a estrutura do dispositivo.
Protocol
Foram seguidas todas as diretrizes internacionais, nacionais e/ou institucionais aplicáveis para o cuidado e o uso de animais. Todos os esforços foram feitos para reduzir o número de animais para o projeto e minimizar seu sofrimento.
1. Preparação da solução em desenvolvimento, das soluções de gravura, da solução orgânica de semicondutores e das máscaras fotolithográficas
- Prepare a solução em desenvolvimento diluindo pelotas NaOH em água deionizada a uma concentração de 175 mM.
NOTA: Esta é uma reação exotérmica. Se um recipiente plástico for usado, continue agitando o recipiente até que todas as pelotas estejam completamente dissolvidas. - Prepare a solução de gravura de titânio diluindo o ácido fluorídrico (HF) em água deionizada (1 parte de 48% de HF concentrado, 49 partes de água desionizada).
ATENÇÃO: O ácido fluorídrico pode penetrar facilmente na pele, causando danos graves em camadas profundas de tecido. A neutralização rápida do HF é necessária para evitar a destruição de tecidos, que podem continuar por dias e resultar em ferimentos graves ou até mesmo morte. Os riscos associados ao HF dependem da concentração e da duração do contato com o ácido. Use apenas sob um capô de fumaça usando um escudo facial. O amor duplo também é fortemente recomendado. - Prepare a solução de gravura de ouro misturando iodo, iodeto de potássio e água deionizada (para 250 g de solução, use 200 mL de água deionizada, 20 g de KI, 5 g de I2). Mexa a solução à temperatura ambiente por 1h e deixe descansar durante a noite antes de usar.
- Prepare a solução de semicondutores dissolvendo pentacento de 6,13 bis (triisopropylsilylethynyl) (TIPS Pentacene) em anisole (1% de peso) e mexendo suavemente por 2h em uma placa quente a 80 °C.
NOTA: Continue agitando esta solução. Use frascos de vidro âmbar e/ou armazene-os em condições de baixa luz. - Prepare o conjunto de máscara fotolithográfica desejado com um software gráfico vetorial. Prepare 5 máscaras para todo o processo: a máscara para a padronização dos portões flutuantes (FGs); a máscara para a abertura das vias e das áreas de sensoriamento para as gravações eletrofisiológicas; a máscara para o processo de auto-alinhamento; a máscara para a padronização da fonte, dreno e controle do contato superior do portão; e a máscara para a ativação plasmática dos canais de pH.
NOTA: Dependendo da resolução necessária e da configuração fotolithográfica específica, diferentes tipos de máscaras poderiam ser usadas. No caso dos dispositivos propostos (que têm uma resolução lateral máxima de 40 μm), máscaras simples de plástico flexível foram compradas em uma loja local de fotocópia.
2. Seleção e preparação de substratos
- Corte um quadrado de 6 x 6 cm2 de 250 μm de tereftalato de polietileno (PET) de uma folha PET intocada.
NOTA: Comece com um substrato ligeiramente maior do que o dispositivo final para ter margens largas o suficiente para permitir manipulação com pinças de laboratório padrão sem danificá-lo. - Inspecione o substrato com um microscópio óptico para excluir a presença de sulcos e arranhões profundos. Selecione cuidadosamente os substratos menos riscados, pois imperfeições maiores podem levar à falha do dispositivo final.
- Enxágüe os substratos PET com acetona, álcool isopropílico e água deionizada (nesta ordem) e seque-os usando correntes de nitrogênio. Armazene os substratos em pratos/recipientes de petri de plástico limpo.
3. FG: deposição de titânio
- Limpe previamente os substratos com oxigênio plasmá plasma (30 s a 100 W) e coloque-os no suporte do substrato dentro da câmara de vácuo do evaporador térmico.
- Coloque 60 mg de titânio no cadinho, feche o obturador e bombeie para baixo a câmara de evaporação até atingir um nível de vácuo inferior a 10-6 Torr. Aumente a potência do evaporador até que o cadinho brilhe vermelho e espere por 30 s. Abra o obturador, aumente a potência para 60% (ou até que o cadinho brilhe branco brilhante) e espere por 60 s. Feche o obturador e desligue a energia.
- Remover os substratos do evaporador; limpá-los usando acetona, álcool isopropílico e água deionizada; e secá-los usando fluxos de nitrogênio. Realize um segundo tratamento de plasma de oxigênio (60 s a 200 W) para oxidar ligeiramente a superfície de titânio.
4. Padronização FG
- Coloque um substrato de cada vez no revestimento de giro colocado dentro de um capô de fumaça. Deposite 4 mL de fotoresist no substrato usando uma pipeta de plástico descartável. Use os seguintes parâmetros de revestimento de giro para obter uma camada fotoresista de 2 μm de espessura: velocidade de giro: 3000 rpm; tempo de rotação: 45 s; tempo de aceleração: 0,5 s; tempo de desaceleração: 0,5 s.
- Asse suavemente o fotoresist, colocando o substrato em uma placa quente (70 °C por 5 min). Armazene o substrato dentro de uma placa de Petri/recipiente plástico embrulhado em papel alumínio para evitar exposição direta à luz.
NOTA: Evite a temperatura sugerida do cozimento (100 °C para 50 s) para evitar a deformação do substrato. No entanto, assar a uma temperatura mais baixa por mais tempo garante bons resultados. - Coloque o dispositivo em um bromógrafo e posicione a máscara fotolithográfica de plástico com o layout FG desejado no substrato. Exponha à luz ultravioleta (UV) da parte superior por 1 min, e remova cuidadosamente a máscara, tomando cuidado para minimizar os movimentos laterais da máscara sobre o substrato para evitar arranhá-la.
- Mergulhe o substrato por 5 s em um recipiente de vidro cheio com a solução em desenvolvimento (etapa 1.1). Enxágüe-o rapidamente em água deionizada e seque-a sob nitrogênio. Use um microscópio óptico para procurar manchas subdesenvolvidas/superdesenvolvidas no substrato. Repita a imersão do substrato no desenvolvimento da solução em caso de subdesenvolvimento.
- Etch o titânio exposto submergindo-o na solução de gravura de titânio (passo 1.2) para 15 s, enxágüe-o com água deionizada e seque-o usando nitrogênio. Inspecione o substrato e remova o fotoresist usando acetona. Enxágüe o substrato com álcool isopropílico e água deionizada, e seque-o com nitrogênio.
5. Deposição dielétrica do portão
- Prepare a câmara de deposição do casaco parileno distribuindo 2 mL do promotor de adesão (silano - 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate) nas paredes da câmara de deposição usando um lenço de laboratório. Coloque 300 mg de murcho Parileno C (correspondente a uma espessura final de 150 nm) no revestimento parileno. Defina o menor valor de pressão para 7 mbar e o maior valor de pressão para 10 mbar. Após o depoimento, limpe os substratos com acetona, álcool isopropílico e água deionizada, e seque-os com nitrogênio.
6. Abertura das áreas de sensoriamento do OCMFET para registro de atividade elétrica e formação das vias para acesso à parte traseira dos FGs
- Deposite o fotoresist nos substratos usando os mesmos parâmetros das etapas 4.1 e 4.2.
- Coloque o dispositivo em um bromógrafo e posicione a máscara fotolithográfica de plástico sobre o substrato para as vias (aberturas circulares com diâmetro de 50 μm sobre as áreas de sensoriamento e aberturas de 100 x 100 μm2 sobre os FGs longe das áreas de detecção (referidas como contato traseiro dos FGs na Figura 1 e Figura 2)) sob um microscópio estereoscópico para melhorar a precisão do alinhamento. Exponha à luz UV da parte superior por 1 min, e remova cuidadosamente a máscara, tomando cuidado para minimizar os movimentos laterais da máscara sobre o substrato para evitar arranhá-la.
NOTA: As vias na lateral dos FGs longe da área de detecção (mostrada como contato de volta dos FGs na Figura 1 e Figura 2) são necessárias para o contato durante a caracterização do transistor. Além disso, ter acesso elétrico aos FGs pode ser muito útil para diferentes tipos de funcionalização (por exemplo, eletrodeposição). - Desenvolva o fotoresistista como descrito anteriormente na etapa 4.4. Exponha o substrato com o fotoresist padronizado (que age como uma máscara aqui) ao plasma de oxigênio (180 s a 200 W) para remover o Parileno C das áreas de sensoriamento.
NOTA: A taxa de gravação de Parileno C em um limpador de plasma isotrótrópico a 200 W é de aproximadamente 90 nm/min. Um leve sobre-etch é realizado para limpar ainda mais as áreas de detecção. O fotoresist também é gravado durante o processo. No entanto, sua espessura (2 μm) é muito maior do que a do Parileno C. - Coloque os substratos em um recipiente de vidro cheio de acetona dentro do banho ultrassônico por 10 s para remover completamente o fotoresist. Enxágüe os substratos com acetona, álcool isopropílico e água e seque-os com nitrogênio.
NOTA: O uso da sônica em vez de simplesmente enxaguar os substratos com acetona é crucial para evitar a dobra indesejada e a reposição de fragmentos de Parileno C na superfície das áreas de detecção.
7. Auto-alinhamento da fonte e dreno com o FG
- Deposite o fotoresist nos substratos usando os mesmos parâmetros das etapas 4.1 e 4.2. Coloque o dispositivo em um bromógrafo e posicione sobre o substrato uma máscara fotolithográfica de plástico com simples retângulos pretos que cobrem completamente as áreas do transistor. Exponha à luz UV por 1 minuto tanto da parte superior quanto da parte inferior, e remova cuidadosamente a máscara, tomando cuidado para minimizar os movimentos laterais da máscara sobre o substrato para evitar arranhá-la.
NOTA: Com a exposição de dois lados, os FGs atuam como máscaras fotolithográficas em relação à exposição inferior, enquanto a presença da máscara superior garante que apenas o fotoresist presente no canal dos transistores permanece não exposto. - Desenvolva o fotoresistista como descrito anteriormente na etapa 4.4.
8. Deposição de ouro, formação de canal e padronização das fontes, drenos e portões de controle
- Limpe os substratos com um tratamento de plasma suave (30 s a 30 W) para promover a adesão do metal no Parileno C e coloque-os no suporte do substrato dentro da câmara de vácuo do evaporador térmico.
- Coloque 30 mg de ouro no cadinho, feche o obturador e bombeie a câmara de evaporação até atingir 10-5 Torr. Aumente a potência do evaporador até que o cadinho brilhe vermelho e espere por 30 s. Abra o obturador, aumente a potência para 40% (ou até que o cadinho brilhe branco brilhante), espere por 60 s, feche o obturador e desligue a energia.
- Coloque os substratos em um recipiente de acetona dentro do banho ultrassônico por 10 s para decolar o fotoresist, removendo assim o ouro do canal dos transistores. Enxágüe os substratos com acetona, álcool isopropílico e água e seque-os com nitrogênio. Deposite o fotoresist nos substratos usando os mesmos parâmetros das etapas 4.1 e 4.2.
- Coloque o dispositivo em um bromógrafo e posicione sobre o substrato uma máscara fotolithográfica de plástico com as fontes, drenos e layout do portão de controle desejados. Exponha à luz UV por 1 min do topo e remova cuidadosamente a máscara, tomando cuidado para minimizar os movimentos laterais da máscara sobre o substrato para evitar arranhá-la.
- Desenvolva o fotoresist, conforme descrito na etapa 4.4. Etch o ouro exposto submergindo-o na solução de gravura de ouro (passo 1.3) para 10 s, enxágüe-o com água deionizada e seque-o usando nitrogênio. Inspecione o substrato e remova o fotoresist usando acetona. Enxágüe com álcool isopropílico e água desionizada e seque-a com nitrogênio.
9. Depoimento e ativação do Parileno C para sensoriamento de pH
- Deposite o fotoresist nos substratos usando os mesmos parâmetros das etapas 4.1 e 4.2.
- Coloque o dispositivo em um bromógrafo e posicione sobre o substrato uma máscara fotolithográfica de plástico com aberturas correspondentes às áreas de sensor de pH dos OCMFETs. Exponha à luz UV por 1 min do topo e remova cuidadosamente a máscara, tomando cuidado para minimizar os movimentos laterais da máscara sobre o substrato para evitar arranhá-la.
- Desenvolva o fotoresist, conforme descrito na etapa 4.4. Proteja todo o dispositivo, exceto as áreas de sensoriamento de pH, com fita de isolamento de poliimida (veja a Tabela de Materiais). Deposite uma camada de 500 nm de Parileno C (correspondente a 1 g de dimer Parileno C) no substrato utilizando os mesmos parâmetros descritos na etapa 5.1.
NOTA: A espessura total de Parileno C nas áreas de detecção de pH é de 650 nm. Não é necessário silane para este depoimento. - Remova cuidadosamente a fita de isolamento de poliimida. Exponha o substrato ao plasma de oxigênio (5 min e 30 s a 200 W) para ativar o Parileno C nas áreas de sensoriamento de pH dos OCMFETs.
NOTA: A fita de isolamento de poliimida é necessária aqui para limitar o depoimento de Parileno C. Na verdade, uma simples decolagem usando o fotoresist não dá resultados positivos devido à natureza quase livre de pinhole do revestimento conformal obtido com Parylene C. - Coloque os substratos em um recipiente de acetona dentro do banho ultrassônico por 10 s para remover completamente o fotoresist. Enxágüe os substratos com acetona e álcool isopropílico (sem água) e seque-os com nitrogênio.
10. Depoimento de semicondutor, colocação da câmara de cultivo e recorte final do dispositivo do PET
- Coloque os substratos em uma placa quente a 50 °C. Lance uma gota (1 μL) de solução semicondutor (passo 1.4) em cada área do canal, cubra todo o substrato com uma tampa e deixe-o secar sob uma capa química por 30 minutos.
- Prepare a câmara de cultivo imprimindo um anel de estireno de acrilonitrilo butadieno com um raio interno de 15 mm, uma espessura de 1 mm e uma altura de 7 mm com uma impressora 3D. Cole a câmara de cultivo na parte central do substrato utilizando polidimetilsiloxano (razão do agente de cura: 15% em peso). Corte o dispositivo do PET manualmente ou usando um cortador a laser.
11. Caracterização elétrica de transistores
- Caracterize cada transistor utilizando um medidor de origem18,19,20,21 (ver a Tabela de Materiais).
NOTA: Tanto a saída quanto as características de entrada devem ser medidas para extrapolar os parâmetros dos transistores (principalmente a mobilidade dos transportadores, a tensão limiar, a razão ION/IOFF e a inclinação de sublocações).
Representative Results
O potencial do MOA foi validado aqui tanto para registros de atividade elétrica quanto para monitoramento de atividades metabólicas. A estimativa precisa das capacidades do dispositivo para detectar potenciais de ação extracelular foi baseada em uma caracterização completa com culturas de cardiomiócitos de ratos (particularmente em cardiomiócitos primários de ratos medidos em 8 dias in vitro [DIV])18. A Figura 3A mostra um MOA completo com 16 OCMFETs. O inset superior mostra um exemplo de uma cultura de cardiomiócito de rato confluente aderindo à superfície do MOA. Para destacar sua saúde, as células foram imunostificas para a proteína sarcomerica, tropomyosina, após a sessão de gravação. O inset inferior mostra um único sinal de cardiomiócito medido com um OCMFET.
Curiosamente, o dispositivo poderia detectar atividade elétrica espontânea e a atividade induzida na administração de diferentes produtos químicos, como mostrado na Figura 3B. Essa validação foi crucial para demonstrar a viabilidade do uso dessa abordagem para o interligamento de células eletrogênicas. Por causa da configuração do array, o MOA também permitiu a reconstrução da velocidade de propagação do sinal cardíaco, demonstrando assim a adequação do sistema para o estudo das redes celulares (Figura 3C). Para posterior validação para determinar o limite real de detecção do dispositivo, o MOA também foi testado com neurônios striatais (21 DIV)18, com resultados interessantes em termos de amplitude de sinal e confiabilidade das gravações. Como visto na Figura 3D, o OCMFET poderia amplificar potenciais de campo neuronais com notável estabilidade, mostrando relações sinal-ruído (SNRS) de até 3,2 (na mesma faixa que a dos SNRs obtidos com MEAs25 padrão). A configuração de gravação consistia em eletrônica multicanal personalizada para o viés transistor e a leitura e condicionamento do sinal. Cada canal para gravação elétrica tem um primeiro estágio composto por um conversor de I/V com um resistor de feedback de 1 MΩ e um filtro de bandpass de 150 Hz-1,3 kHz com um ganho de tensão de 110. Para todas as medidas apresentadas, os transistores foram tendenciosos com VDS = VGS = -1 V. A conversão de A/D e a visualização e armazenamento de dados foram realizadas por meio de uma placa de aquisição de dados (ver tabela de materiais). Todas as sessões de medição foram realizadas dentro de uma gaiola de Faraday para minimizar o ruído elétrico e ambiental no sistema.
Como mencionado anteriormente, explorando a simples funcionalidade física apresentada no protocolo, foi possível preparar sensores de pH altamente sensíveis com uma resposta supernernsiana. Devido à abordagem de fabricação apresentada, esses dispositivos de pH poderiam ser integrados a um MOA e usados para monitorar as pequenas variações de pH induzidas pela atividade metabólica dos neurônios primários de ratos hipocampais26. Em particular, como mostrado na Figura 4, apenas um dos dois OCMFETs dedicados à detecção de baixa frequência foi seletivamente funcionalizado para demonstrar a viabilidade da abordagem. Essa funcionalidade seletiva permitiu a avaliação da resposta dos dois OCMFETs a variações metabólicas quimicamente induzidas: em particular, um estado metabólico elevado pode ser obtido usando bicuculina (BIC), um inibidor dos receptores GABA A27, enquanto um estado metabólico baixo pode ser induzido pela adição de tetrodotoxina (TTX), que eventualmente causa morte celular28 . A configuração de gravação consistia nos mesmos eletrônicos multicanais personalizados utilizados para as medições de atividade eletrônica.
Ao contrário do caso anterior, dois canais dedicados foram utilizados para registrar as variações lentas induzidas pela atividade metabólica celular. Cada canal consistia em um circuito simples composto por dois blocos principais: um conversor de I/V com um resistor de feedback de 1 MΩ e um filtro de baixa passagem com uma frequência de corte de 10 Hz. Os transistores foram tendenciosos com VDS = VGS = -1 V, e todas as medidas foram realizadas dentro de uma gaiola faraday para minimizar o impacto do ruído externo nas gravações (este é um aspecto particularmente importante considerando as baixas flutuações de corrente induzidas pela atividade metabólica celular). Durante os experimentos, as culturas foram mantidas em um meio de cultura de baixa proteção, e todo o sistema foi colocado em um ambiente controlado (37 °C e um fluxo contínuo de CO2/ar). Como esperado, apenas a corrente do OCMFET sensível ao pH poderia ser modulada pela adição de 25 μM BIC. Isso foi confirmado ainda pela indução da variação atual pela variação correspondente da atividade metabólica celular.
O mesmo experimento foi repetido após a adição de 10 μM TTX, o que resultou em uma desaceleração gradual do metabolismo celular. Após a adição do TTX, nem o OCMFET sensível ao pH nem o insensível pH apresentaram qualquer resposta, demonstrando assim a eficácia da abordagem. Esses resultados demonstram a eficácia da funcionalização proposta e sua relativa estabilidade por até 2 semanas. Uma conclusão importante que pode ser extraída dos experimentos propostos (tanto a atividade elétrica quanto a atividade metabólica) é que é possível preparar diferentes tipos de sensores, funcionalizando seletivamente diferentes OCMFETs dentro da mesma área de cultivo. Esse aspecto representa uma conquista não trivial na biosensagem para aplicações celulares, pois ser capaz de monitorar diferentes parâmetros dentro da mesma cultura celular é crucial para uma melhor caracterização da complexidade desses sistemas biológicos.
Figura 1: Vista superior de um MOA de 16 canais para monitoramento metabólico e elétrico de células eletroativas. Barra de escala = 1 cm. Abreviaturas: OCMFETs = transistores orgânicos modulados por carga; FG = portão flutuante; S/D = fonte/drenagem; MOA = micro OCMFET array. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Principais etapas de fabricação de um MOA para monitoramento metabólico e elétrico de células eletroativas. (A e B) A película Ti evaporada é padronizada usando um processo fotolithográfico padrão para preparar o portão flutuante dos OCMFETs. (C) Depoimento de 15 nm de Parileno C. Esta camada, juntamente com o óxido de Ti nativo, age como a dielétrica do portão dos transistores. (D e E) A camada de Parileno C é padronizada usando tratamento de oxigênio plasmôniológico. Uma camada fotoresistista padronizada é usada para expor seletivamente as áreas de sensoriamento para as gravações elétricas e os contatos de volta do portão flutuante. (F) Padronização dos contatos superiores de Au, ou seja, a fonte, drenagem, portão de controle e contato de volta do portão flutuante. Uma técnica de auto-alinhamento é usada para melhorar o desempenho elétrico do dispositivo. (G-I) Deposição da segunda camada de Parileno C na área de sensoriamento dos OCMFETs para monitoramento da atividade metabólica. Após a exposição ao plasma de oxigênio, esta camada agirá como a membrana sensível ao pH (J). (K) Seção transversal de um MOA completo (com materiais) após a deposição do semicondutor orgânico (TIPS Pentacene) e o posicionamento da câmara de cultura. Abreviaturas: OCMFETs = transistores orgânicos modulados por carga; FG = portão flutuante; S/D = fonte/drenagem; MOA = micro OCMFET array; CG = portão de controle; PET = tereftalato de polietileno; Par C = Parileno C; DICAS = pentaceno de 6,13 bis (triisopropylsilylethynyl); ABS = estireno de butadieno de acrilonitrilo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gravações de atividade elétrica celular com um MOA. (A) Uma cultura confluente de cardiomiócitos de rato (8 DIV) aderindo à superfície de um MOA, fixada após uma sessão de gravação e imunos detida para a proteína sarcomerica, tropomyosina (inset superior). Entrada inferior: exemplo de um único sinal de cardiomiócito medido com um OCMFET. Barra de escala = 150 μm. (B) Ajuste químico da atividade elétrica de uma cultura cardiomiócito. A aceleração da atividade resultou da adição de 100 mM de norepinefrina, enquanto a supressão resultou da adição de 100 mM verapamil. Esquerda: modulação de frequência de batida; direito: estatísticas sobre 5 OCMFETs-média e desvio padrão: spike-count em 4 min de basal (129 ± 4,6), norepinefrita mediada (280 ± 28,6) e atividade mediada por verapamil (15 ± 1,9). (C) Reconstrução da propagação de um sinal cardíaco. Direito: raster enredo da atividade espontânea da cultura indicando a propagação do sinal do local 14 para o local 41 (à direita). (D) Potencialidades de ação de células estriais do embrião de rato (21 DIV). Este número foi modificado de 18. Abreviaturas: OCMFET = transistor de efeito de campo modulado por carga orgânica; MOA = micro OCMFET array; NE = norepinefrina; VER = verapamil; DIV = dias in vitro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Gravações de atividade metabólica com um MOA. Resposta dos canais (A) sensíveis ao pH e (B) pH-insensíveis de um MOA à adição de 25 μM BIC antes e depois da adição de 10 μM de TTX. Após a adição do TTX, o comportamento do canal sensível ao pH torna-se semelhante ao do pH insensível. Em particular, nenhuma variação atual pode ser observada após a adição de BIC devido à morte celular induzida por TTX. (C) MOA para gravações de atividade metabólica. Os OCMFETs sensíveis ao pH e o pH-insensível são delineados em verde e vermelho, respectivamente. Inset: neurônios hipocampais saudáveis cultivados no dispositivo após 15 DIV. Barra de escala = 50 μm. Este número foi modificado de 26. Abreviaturas: OCMFET = transistor de efeito de campo modulado por carga orgânica; MOA = micro OCMFET array; BIC = bicucullina; TTX = tetrodotoxina; DIV = dias in vitro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Ao contrário dos métodos anteriores para a fabricação de OCMFETs para aplicações celulares18,29, o método proposto é especificamente projetado para preparar MOAs que podem detectar simultaneamente atividade celular elétrica e metabólica. Além disso, essa abordagem para alcançar a sensibilidade ao pH tem a vantagem de ser compatível com protocolos de fabricação padrão e não envolve qualquer modificação química da área de sensoriamento (este aspecto garante a biocompatibilidade de todo o dispositivo). A sensibilidade ao pH é alcançada utilizando-se o mesmo material usado como um dielétrico de portão (ou seja, o parileno C biocompatível), tornando essa abordagem rápida e reprodutível.
O resultado final dessa abordagem é uma ferramenta orgânica flexível, transparente, de baixo custo e multissensante para aplicações celulares in vitro . O fato de que isso pode ser obtido utilizando uma única estrutura transistor e uma simples modificação física da área de sensoriamento soma-se às vantagens oferecidas pelo uso de materiais e métodos eletrônicos orgânicos. Além disso, como o princípio da transdução do OCMFET não depende estritamente do semicondutor específico ou do material FG, todo o processo pode ser modificado e upscale, dependendo da aplicação específica.
Um aspecto crítico da técnica proposta está relacionado à reprodutibilidade da técnica de ativação plasmática. Para obter resultados consistentes, tanto a espessura do Parileno C quanto sua taxa de gravura devem ser controladas. Calibração frequente do processo de deposição de Parileno C e do limpador de plasma são absolutamente necessários. Outros aspectos críticos, que também contribuem para a reprodutibilidade do processo, são o manuseio cuidadoso do dispositivo e a deposição do semicondutor orgânico. Aqui foi utilizada uma simples técnica de fundição de gotas, que intrinsecamente apresenta limitações de reprodutibilidade. Para minimizar esses problemas, conforme descrito na etapa 10.1 do protocolo, a mesma quantidade de solução de semicondutores deve ser usada sempre, e a evaporação do solvente deve ser padronizada o máximo possível. Manter uma temperatura constante usando uma placa quente e cobrir o substrato após cada deposição de gotícula ajudará a retardar o processo de evaporação. Para minimizar ainda mais esse problema, a técnica de deposição (por exemplo, usando um método de impressão a jato de tinta) poderia ser trocada30.
A limitação do protocolo proposto decorre da natureza da funcionalidade do OCMFET para a detecção de pH. A estabilidade dos sensores de pH é limitada a algumas semanas26. No entanto, a janela de estabilidade da abordagem proposta é suficientemente grande para cobrir os tempos padrão de incubação necessários para o crescimento da cultura neuronal (2-3 semanas). Outros tipos de funcionalização da área de sensoriamento devem ser considerados para experimentos mais longos. O protocolo de fabricação utiliza um contato traseiro dedicado, permitindo acesso elétrico aos FGs. Esse contato, que é deixado flutuando durante o funcionamento normal do dispositivo, pode ser explorado para a caracterização elétrica do dispositivo e a funcionalidade das áreas de sensoriamento utilizando diferentes técnicas (por exemplo, eletrodeposição).
Este procedimento representa uma maneira conveniente de preparar um dispositivo multi-sensoriamento para aplicações celulares sem a necessidade de materiais expansivos ou instalações de limpeza. Apesar das limitações de desempenho e estabilidade devido ao emprego de uma funcionalização orgânica de semicondutores e físicos (não químicos) da área de sensoriamento, abordagens semelhantes poderiam ser usadas para preparar sensores e biosensores de baixo custo (e potencialmente descartáveis), mecanicamente flexíveis e opticamente transparentes, que podem fornecer aos pesquisadores em biologia celular, engenharia de tecidos e neurociência com novas ferramentas especializadas para o estudo de sistemas celulares in vitro.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção nº 882897-Search&Rescue e do projeto PON "TEX-STYLE" ARS01_00996, PNR 2015-2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
| 3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
| ABS filament | |||
| Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
| Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
| Gold | Local seller | ||
| Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
| Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
| Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
| Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
| Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
| NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
| Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
| PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
| PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
| PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
| Petri dishes | |||
| Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
| Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
| Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
| Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
| Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
| Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
| Thermal evaporator unit | |||
| TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
| Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
| Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |
References
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