Summary
Her præsenterer vi fabrikationsprotokollen for en organisk charge-moduleret felteffekttransistor (OCMFET)-baseret enhed til in vitro cellulær interfacing. Enheden, kaldet en mikro OCMFET array, er en fleksibel, billig, og reference-mindre enhed, som vil gøre det muligt at overvåge de elektriske og metaboliske aktiviteter af elektroaktive cellekulturer.
Abstract
Moderne elektrofysiologi er konstant blevet næret af den parallelle udvikling af stadig mere sofistikerede værktøjer og materialer. Til gengæld har opdagelser på dette område drevet teknologiske fremskridt i en frem og tilbage proces, der i sidste ende bestemmes de imponerende resultater i de sidste 50 år. De mest anvendte anordninger, der anvendes til cellulær interfacing (nemlig mikroelektrodesystemerne og mikroelektroniske anordninger baseret på transistorer), frembyder dog stadig flere begrænsninger såsom høje omkostninger, materialernes stivhed og tilstedeværelsen af en ekstern referenceelektrode. For delvis at løse disse problemer har der været udviklinger inden for et nyt videnskabeligt område kaldet organisk bioelektronik, hvilket har resulteret i fordele som lavere omkostninger, mere bekvemme materialer og innovative fabrikationsteknikker.
Flere interessante nye organiske enheder er blevet foreslået i løbet af det seneste årti til bekvemt interface med cellekulturer. Dette papir præsenterer protokollen for fremstilling af enheder til cellulær interfacing baseret på den organiske charge-moduleret felt-effekt transistor (OCMFET). Disse enheder, kaldet mikro OCMFET arrays (MOAs), kombinerer fordelene ved organisk elektronik og de særlige træk ved OCMFET for at forberede gennemsigtige, fleksible og referenceløse værktøjer, hvormed det er muligt at overvåge både de elektriske og metaboliske aktiviteter af kardiomyocytter og neuroner in vitro, hvilket giver mulighed for en multiparametrisk evaluering af elektrogene cellemodeller.
Introduction
In vivo overvågning af elektroaktive celler, såsom neuroner og kardiomyocytter, repræsenterer en gyldig og kraftfuld tilgang i grundforskning applikationer til den menneskelige hjerne, funktionelle forbindelsesundersøgelser, farmakologi, og toksikologi. De værktøjer, der normalt anvendes til sådanne undersøgelser, er hovedsagelig baseret på mikroelektrodesystemer (MEAs)1,2,3,4,5 og stadig mere effektive og kraftfulde felteffektenheder (FED'er)6,7,8,9,10,11,12 . Disse to familier af enheder tillader realtid overvågning og stimulering af den elektriske aktivitet af neuroner og kardiomyocytter og er normalt karakteriseret ved robusthed, brugervenlighed og pålidelighed. Disse funktioner gør MEAs og FEDs guldstandarden for elektrofysiologiske applikationer, der i øjeblikket anvendes til at kommunikere med standard cellulære kulturer, organotypic hjerne skiver, og tridimensionale organoider13,14,15,16. På trods af deres udbredte brug og deres imponerende funktioner, frihandelsaftaler og LYSD'er præsentere nogle begrænsninger såsom høje omkostninger, stivhed af materialerne, og tilstedeværelsen af en normalt voluminøse reference elektrode, som skal placeres i måling flydende miljø og er nødvendig for korrekt drift af enhederne.
For at udforske alternative løsninger til cellulær interfacing er der i det seneste årti blevet investeret en stor indsats i studiet af elektroniske enheder baseret på organiske materialer og innovative fremstillingsteknikker17. Blandt de flere organiske enheder, der er undersøgt for at løse de ovennævnte begrænsninger, er en ejendommelig organisk transistor kaldet OCMFET for nylig blevet foreslået som et gyldigt alternativ til frihandelsaftaler og FED'er18. Ud over de standardfunktioner, der tilbydes af den organiske elektronikteknologi, såsom billige materialer og fremstillingsteknikker, optimale mekaniske og kemiske egenskaber, optisk gennemsigtighed og biokompatibilitet, tilbyder OCMFET også en ultrahøj opladningsfølsomhed (på grund af sin dobbeltporterede struktur) uden behov for en ekstern referenceelektrode. Desuden har denne organiske sensor den bemærkelsesværdige evne til at fornemme forskellige analysand / fysiske parametre, afhængigt af den specifikke funktionalisering af dens sensorområde, som er adskilt fra transistorområdet19,20. Alle disse funktioner kan bekvemt udnyttes til erhvervelse af forskellige parametre inden for en cellulær kultur. Især ud over at være i stand til at opdage den neuronale / hjerte elektriske aktivitet, er det også muligt at udnytte den ultrahøje pH-følsomhed, der tilbydes af OCMFET's ejendommelige dobbeltportede struktur ved hjælp af en simpel fysisk funktionalisering21 til pålideligt at overvåge de små lokale pH-variationer forårsaget af cellulær metabolisk aktivitet.
I in vitro-celle biosensing er overvågningen af cellulær metabolisk aktivitet en stærk indikator for kulturens tilstand og kan bruges til at vurdere den cellulære reaktion på forskellige stimuli, såsom lægemiddeladministration og elektrisk stimulation22,23. Desuden er overvågning af både de elektriske og metaboliske aktiviteter i det specifikke tilfælde af neurale applikationer af stor interesse, især i farmakologi og toksikologi24. Med den hensigt bekvemt at imødekomme kravene i moderne in vitro elektrofysiologi og samtidig tilbyde alle fordelene ved OCMFET, en enhed kaldet Micro OCMFET Array (MOA) er for nylig blevet indført. MOA er et OCMFET-baseret array med specialiserede sensingområder specielt designet til in vitro cellulær interfacing, der muliggør multiparametrisk analyse af elektrogene celler kulturer. Især to MOA-kanaler har større sensingområder for at maksimere deres følsomhed og kan selektivt funktionaliseres til at overvåge specifikke parametre af interesse, såsom pH-variationer af kulturmediet. De andre OCMFET'er i strukturen fungerer som ekstracellulære elektriske aktivitetssensorer. Figur 1 viser strukturen af en 16 kanal MOA. Denne evne, kombineret med fraværet af en ekstern referenceelektrode, gør MOA til et meget interessant værktøj til in vitro-applikationer. Dette arbejde præsenterer den trinvise fabrikation protokol af en multisensing MOA for in vitro påvisning af de elektriske og metaboliske aktiviteter af neuroner og kardiomyocytter. Figur 2 viser de vigtigste fabrikationstrin, de anvendte materialer og enhedens struktur.
Protocol
Alle gældende internationale, nationale og/eller institutionelle retningslinjer for pleje og anvendelse af dyr blev fulgt. Alle bestræbelser blev gjort for at reducere antallet af dyr til projektet og for at minimere deres lidelser.
1. Forberedelse af udviklingsløsningen, ætsningsløsningerne, den organiske halvlederopløsning og de fotolitografiske masker
- Klargør den udviklende opløsning ved at fortynde NaOH-pellets i deioniseret vand i en koncentration på 175 mM.
BEMÆRK: Dette er en exoterm reaktion. Hvis der anvendes en plastbeholder, skal du fortsætte med at omrøre beholderen, indtil alle pellets er helt opløst. - Titan ætsning opløsning ved fortynding af flussyre (HF) i deioniseret vand (1 del af koncentreret 48% HF, 49 dele deioniseret vand).
FORSIGTIG: Flussyre kan nemt trænge ind i huden og forårsage alvorlig skade på dybe vævslag. Hurtig neutralisering af HF er nødvendig for at forhindre vævsdestruktion, som kan fortsætte i dagevis og resultere i alvorlig skade eller endda død. De risici, der er forbundet med HF, afhænger af koncentrationen og varigheden af kontakten med syren. Brug kun under en røghætte ved hjælp af et ansigtsskærm. Dobbelt gloving anbefales også stærkt. - Forbered guld ætsning opløsning ved at blande jod, kalium jod, og deioniseret vand (for 250 g opløsning, bruge 200 mL af deioniseret vand, 20 g KI, 5 g I2). Rør opløsningen ved stuetemperatur i 1 time og lad den hvile natten over før brug.
- Halvlederopløsningen opløses ved at opløse pentacene (6,13 bis(triisopropylsilylethynyl) (TIPS Pentacene) i anisol (1 % i vægt) og forsigtigt omrøres i 2 timer på en kogeplade ved 80 °C.
BEMÆRK: Bliv ved med at omrøre denne løsning. Brug ravglasglasglas og/eller opbevar dem under dårlige lysforhold. - Forbered det ønskede fotolitografiske maskesæt med en vektorgrafiksoftware. Forbered 5 masker til hele processen: masken til mønstre af de flydende porte (FGs); masken til åbning af vias og sansningsområder for de elektrofysiologiske optagelser masken til selvjusteringsprocessen masken til mønstre af kilden, afløb og kontrol gate top kontakt og masken til plasmaaktivering af pH-kanalerne.
BEMÆRK: Afhængigt af den nødvendige opløsning og den specifikke fotolitografiske opsætning kan der anvendes forskellige slags masker. For de foreslåede anordninger (som har en maksimal sideopløsning på 40 μm) er der købt enkle fleksible plastmasker i en lokal fotokopibutik.
2. Substrat udvælgelse og forberedelse
- Skær en 6 x 6 cm2 kvadrat af 250 μm polyethylen terephthalat (PET) fra en uberørt PET ark.
BEMÆRK: Start med et lidt større substrat end den endelige enhed til at have brede nok margener til at muliggøre manipulation med standard lab pincet uden at beskadige det. - Undersøg substratet med et optisk mikroskop for at udelukke tilstedeværelsen af dybe riller og ridser. Vælg omhyggeligt de mindre ridsede substrater, da større mangler kan føre til svigt af den endelige enhed.
- Skyl PET substrater med acetone, isopropylalkohol, og deioniseret vand (i denne rækkefølge) og tørre dem ved hjælp af strømme af kvælstof. Opbevar substraterne i rene petriskåle/beholdere af plast.
3. FG: titanium deposition
- Forrens substraterne med plasma oxygen (30 s ved 100 W) og læg dem på underlaget holder inde i vakuumkammeret af den termiske fordamper.
- Placer 60 mg titanium i diglen, luk lukkeren, og pump ned fordampningskammeret, indtil det når et vakuum niveau lavere end 10-6 Torr. Forøg fordamperens kraft, indtil diglen lyser rødt og vent i 30 s. Åbn lukkeren, øge strømmen til 60% (eller indtil diglen lyser lyse hvid), og vente i 60 s. Luk lukkeren og skru ned for strømmen.
- Fjern substraterne fra fordamperen; rense dem ved hjælp af acetone, isopropylalkohol, og deioniseret vand; og tørre dem ved hjælp af kvælstofstrømme. Udfør en anden iltplasmabehandling (60 s ved 200 W) for at oxidere titaniumoverfladen lidt.
4. FG-mønstre
- Placer et substrat ad gangen på spin coater placeret inde i en røghætte. Aflejr 4 mL fotoresisten på substratet ved hjælp af en engangsplastpipette. Brug følgende spin coating parametre til at opnå en 2 μm-tyk fotoresist lag: spin hastighed: 3000 rpm; spin tid: 45 s; accelerationstid: 0,5 s; decelerationstid: 0,5 s.
- Blød bages fotoresisten ved at placere substratet på en kogeplade (70 °C i 5 min). Opbevar substratet inde i en aluminiumsfolieindpakket petriskål /plastbeholder for at undgå direkte lyseksponering.
BEMÆRK: Undgå den foreslåede bagetemperatur (100 °C i 50 s) for at forhindre substrat deformation. Bagning ved en lavere temperatur i længere tid sikrer dog gode resultater. - Anbring enheden i en bromograf, og placer plastfotoliografisk maske med det ønskede FG-layout på substratet. Eksponer for ultraviolet (UV) lys fra toppen i 1 min, og fjern forsigtigt masken, idet du sørger for at minimere maskens laterale bevægelser over substratet for at undgå at ridse den.
- Dyk underlaget i 5 s i en glasbeholder fyldt med den udviklende opløsning (trin 1.1). Skyl det hurtigt i deioniseret vand og tør det under nitrogen. Brug et optisk mikroskop til at lede efter underudviklede/overudviklede pletter i substratet. Gentag nedsænkningen af substratet i at udvikle opløsning i tilfælde af underudvikling.
- Ætse den eksponerede titanium ved at nedsænke det i titanium ætsning opløsning (trin 1.2) for 15 s, skyl det med deioniseret vand, og tør det ved hjælp af kvælstof. Undersøg underlaget optisk og fjern fotoresisten ved hjælp af acetone. Skyl substratet med isopropylalkohol og deioniseret vand, og tør det med nitrogen.
5. Gate dielektrisk deposition
- Parylencoaterens aflejringskammer ved at fordele 2 mL af adhæsionspromotoren (silan - 3(trimethoxysilyl)propylmethacrylat) på depositionskammerets vægge ved hjælp af en laboratorievise. Placer 300 mg Parylen C dimer (svarende til en endelig tykkelse på 150 nm) på Parylen coater. Indstil den lavere trykværdi til 7 mbar og den højere trykværdi til 10 mbar. Efter aflejringen skal substraterne rengøres med acetone, isopropylalkohol og deioniseret vand og tørre dem med nitrogen.
6. Åbning af teledataområderne i OCMFET for registrering og dannelse af vias med henblik på at få adgang til bagsiden af FG'erne
- Aflejr fotoresisten på substraterne ved hjælp af de samme parametre i trin 4.1 og 4.2.
- Anbring anordningen i en bromograf, og placer den fotolitografiske plastmaske på vias (cirkulære åbninger med en diameter på 50 μm over sansningsområdet og 100 x 100 μm2 åbninger over FG'erne væk fra sansningsområdet (kaldet rygkontakt af FG'erne i figur 1 og figur 2)) under et stereoskopisk mikroskop for at forbedre justeringspræcisionen. Eksponer for UV-lys fra toppen i 1 min, og fjern forsigtigt masken, idet du sørger for at minimere maskens sidebevægelser over substratet for at undgå at ridse den.
BEMÆRK: Vias på siden af FGs væk fra sensing området (vist som tilbage kontakt af FGs i figur 1 og figur 2) er nødvendige for kontakt under karakterisering af transistor. Desuden kan det være meget nyttigt at have elektrisk adgang til FG'erne for forskellige former for funktionalisering (f.eks. elektrodeposition). - Udvikle fotoresisten som tidligere beskrevet i trin 4.4. Eksponer substratet med den mønstrede fotoresist (som fungerer som en maske her) for iltplasma (180 s ved 200 W) for at fjerne Parylen C fra sensingområderne.
BEMÆRK: Ætsningen af Parylen C i en isotropisk plasmarenser ved 200 W er ca. 90 nm/min. Der udføres en lille over-æts for yderligere at rense sensingområderne. Fotoresisten er også ætset under processen. Tykkelsen (2 μm) er dog meget højere end Parylen C's. - Placer substraterne i en glasbeholder fyldt med acetone inde i ultralydsbadet i 10 s for at fjerne fotoresisten helt. Skyl substraterne med acetone, isopropylalkohol og vand og tør dem med nitrogen.
BEMÆRK: Brug sonikering i stedet for blot at skylle substraterne med acetone er afgørende for at forhindre uønsket foldning og re-deposition af Parylen C fragmenter på overfladen af sensing områder.
7. Selvjustering af kilde og afløb med FG
- Aflejr fotoresisten på substraterne ved hjælp af de samme parametre i trin 4.1 og 4.2. Placer enheden i en bromograf og placer på substratet en plastik fotolitografisk maske med enkle sorte rektangler, der helt dækker transistorens områder. Eksponer for UV-lys i 1 minut fra både toppen og bunden, og fjern forsigtigt masken, idet du sørger for at minimere maskens sidebevægelser over substratet for at undgå at ridse den.
BEMÆRK: Med den dobbeltsidede eksponering fungerer FG'erne som fotolitografiske masker med hensyn til den nederste eksponering, mens tilstedeværelsen af den øverste maske sikrer, at kun fotoresisten, der er til stede på transistorernes kanal, forbliver ueksponeret. - Udvikle fotoresisten som tidligere beskrevet i trin 4.4.
8. Guldaflejring, kanaldannelse og mønstre af kilder, afløb og kontrolporte
- Rengør substraterne med en skånsom plasmabehandling (30 s ved 30 W) for at fremme vedhæftningen af metallet på Parylen C og placere dem på underlagets holder inde i vakuumkammeret på den termiske fordamper.
- Placer 30 mg guld i diglen, luk lukkeren, og pump ned fordampningskammeret, indtil det når 10-5 Torr. Forøg fordamperens kraft, indtil diglen lyser rødt og vent i 30 s. Åbn lukkeren, øge strømmen til 40% (eller indtil diglen lyser lyse hvid), vente i 60 s, lukke lukkeren, og skru ned for strømmen.
- Placer substraterne i en acetonebeholder inde i ultralydsbadet i 10 s for at løfte fotoresisten og dermed fjerne guldet fra transistorernes kanal. Skyl substraterne med acetone, isopropylalkohol og vand og tør dem med nitrogen. Aflejr fotoresisten på substraterne ved hjælp af de samme parametre i trin 4.1 og 4.2.
- Placer enheden i en bromograf og placere på substratet en plastik fotolitografisk maske med de ønskede kilder, afløb, og kontrol gate layout. Eksponer for UV-lys i 1 minut fra toppen, og fjern forsigtigt masken, idet du sørger for at minimere maskens sidebevægelser over substratet for at undgå at ridse den.
- Udvikle fotoresisten som beskrevet i trin 4.4. Ætse det eksponerede guld ved at nedsænke det i guld ætsning opløsning (trin 1,3) for 10 s, skyl det med deioniseret vand, og tørre det ud ved hjælp af kvælstof. Undersøg underlaget optisk og fjern fotoresisten ved hjælp af acetone. Skyl med isopropylalkohol og deioniseret vand og tør det med nitrogen.
9. Aflejring og aktivering af Parylen C til pH-sensing
- Aflejr fotoresisten på substraterne ved hjælp af de samme parametre i trin 4.1 og 4.2.
- Anbring apparatet i en bromograf, og placer den på substratet en fotolitografisk plastmaske med åbninger svarende til ocmfeternes pH-sensingområder. Eksponer for UV-lys i 1 minut fra toppen, og fjern forsigtigt masken, idet du sørger for at minimere maskens sidebevægelser over substratet for at undgå at ridse den.
- Udvikle fotoresisten som beskrevet i trin 4.4. Beskyt hele enheden, bortset fra pH-sensingområderne, med polyimidisoleringstape (se materialetabellen). Læg et lag på 500 nm Parylen C (svarende til 1 g Parylen C dimer) på substratet ved hjælp af de samme parametre, der er beskrevet i trin 5.1.
BEMÆRK: Den samlede Parylen C tykkelse på pH-sensing områder er 650 nm. Der kræves ingen silan til denne deposition. - Fjern forsigtigt polyimidisoleringstape. Udsæt substratet for oxygenplasma (5 min. og 30 s ved 200 W) for at aktivere Parylen C på pH-sensingområderne i OCMFET'erne.
BEMÆRK: Polyimidisoleringstape er nødvendigt her for at begrænse Parylen C-aflejringen. Faktisk giver en simpel lift-off ved hjælp af fotoresisten ikke positive resultater på grund af den næsten pinhole-fri karakter af den conformal belægning opnået med Parylene C. - Placer substraterne i en acetonebeholder inde i ultralydsbadet i 10 s for helt at fjerne fotoresisten. Skyl substraterne med acetone og isopropylalkohol (intet vand) og tør dem med nitrogen.
10. Halvlederdeposition, dyrkning af kammerplacering og endelig udskæring af anordningen fra PET
- Anbring underlaget på en kogeplade ved 50 °C. Støbt en dråbe (1 μL) halvlederopløsning (trin 1.4) på hvert kanalområde, dæk hele substratet med låg, og lad det tørre ud under en kemisk hætte i 30 min.
- Forbered dyrkningskammeret ved at trykke en acrylonitrile butadiene styrenring med en indvendig radius på 15 mm, en tykkelse på 1 mm og en højde på 7 mm med en 3D-printer. Lim dyrkningskammeret på den centrale del af substratet ved hjælp af polydimethylsiloxan (forholdet mellem hærdningsmidlet: 15 vægtprocent). Skær enheden ud af PET enten manuelt eller ved hjælp af en laserskærer.
11. Elektrisk karakterisering af transistorer
- Karakterisere hver transistor ved hjælp af et kildemeter18,19,20,21 (se materialetabellen).
BEMÆRK: Både output- og inputegenskaberne bør måles for at ekstrapolere transistorernes parametre (hovedsagelig transportvirksomhedernes mobilitet, tærskelspænding, ION/IOFF-forhold og hældning under tre steder).
Representative Results
Potentialet i MOA er blevet valideret her for både elektriske aktivitet optagelser og metabolisk aktivitet overvågning. Den præcise vurdering af enhedens evne til at detektere ekstracellulære handlingspotentialer var baseret på en grundig karakterisering med rotte kardiomyocytter kulturer (især i primære rotte kardiomyocytter målt ved 8 dage in vitro [DIV])18. Figur 3A viser en komplet MOA med 16 OCMFET'er. Den øverste indsat viser et eksempel på en sammenflyttet rotte kardiomyocyt kultur klæber til overfladen af MOA. For at fremhæve deres helbred er cellerne blevet immunplettet for det sarkomiske protein, tropomyosin, efter optagelsessessionen. Den nederste indsat viser en enkelt kardiomyocyt signal målt med en OCMFET.
Interessant nok kunne enheden registrere spontan elektrisk aktivitet og den aktivitet, der blev induceret ved administration af forskellige kemikalier, som vist i figur 3B. Denne validering var afgørende for at påvise, at det var muligt at anvende denne metode til interfacing af elektrogene celler. På grund af arraykonfigurationen gav MOA også mulighed for genopbygning af hjertesignalets formeringshastighed, hvilket demonstrerede systemets egnethed til undersøgelse af cellulære netværk (Figur 3C). For yderligere validering for at bestemme den faktiske detektionsgrænse for enheden blev MOA også testet med striatale neuroner (21 DIV)18 med interessante resultater med hensyn til signal amplitud og pålideligheden af optagelserne. Som det ses i figur 3D, kunne OCMFET forstærke neuronale feltpotentialer med bemærkelsesværdig stabilitet og vise signal-til-støj-forhold (SNRS) på op til 3,2 (i samme interval som for SNR'er opnået med standard MEAs25). Optagelsesopsætningen bestod af brugerdefineret multikanalelektronik til transistor biasing og signaludlæsning og konditionering. Hver kanal til den elektriske optagelse har en første fase bestående af en I / V konverter med en 1 MΩ feedback modstand og en 150 Hz-1,3 kHz bandpass filter med en spænding gevinst på 110. For alle de præsenterede målinger var transistorerne forudindtaget med VDS = VGS = -1 V. A/D-konverteringen og datavisualiseringen og lagringen blev udført ved hjælp af et dataindsamlingsforum (se Materialetabellen). Alle målesessioner blev udført inde i et Faraday-bur for at minimere den elektriske, miljømæssige støj på systemet.
Som tidligere nævnt var det ved at udnytte den enkle fysiske funktionalisering, der blev præsenteret i protokollen, muligt at forberede meget følsomme pH-sensorer med et supernernstisk respons. På grund af den præsenterede fabrikationsmetode kunne disse pH-enheder integreres i en MOA og bruges til at overvåge de små pH-variationer forårsaget af den metaboliske aktivitet af primære hippocampale rotte neuroner26. Navnlig, som det fremgår af figur 4, blev kun en af de to OCMFET'er, der var beregnet til lavfrekvent sensing, selektivt funktionaliseret for at påvise, om tilgangen var gennemførlig. Denne selektive funktionalisering gjorde det muligt at vurdere de to OCMFET'ers respons på kemisk inducerede metaboliske variationer: især kan der opnås en høj metabolisk tilstand ved hjælp af bikukulin (BIC), en hæmmer af GABA A-receptorer27, mens en lav metabolisk tilstand kan fremkaldes ved tilsætning af tetrodotoxin (TTX), som i sidste ende forårsager cellulær død28 . Optagelsesopsætningen bestod af den samme brugerdefinerede multikanalelektronik, der blev brugt til de elektroniske aktivitetsmålinger.
I modsætning til det foregående tilfælde blev to dedikerede kanaler brugt til at registrere de langsomme variationer forårsaget af den cellulære metaboliske aktivitet. Hver kanal bestod af et simpelt kredsløb bestående af to hovedblokke: en I / V-konverter med en 1 MΩ feedback modstand og et low-pass filter med en cut-off frekvens på 10 Hz. Transistorerne var forudindtaget med VDS = VGS = -1 V, og alle målinger blev udført inde i et Faraday bur for at minimere virkningen af ekstern støj på optagelserne (dette er et særligt vigtigt aspekt i betragtning af de lave aktuelle udsving forårsaget af den cellulære metaboliske aktivitet). Under forsøgene blev kulturerne opretholdt i et lavbufferet kulturmedium, og hele systemet blev placeret i et kontrolleret miljø (37 °C og en kontinuerlig CO2/luftstrøm). Som forventet kunne kun strømmen af det pH-følsomme OCMFET moduleres ved tilsætning af 25 μM BIC. Dette blev yderligere bekræftet af induktionen af den nuværende variation ved den tilsvarende variation af den cellulære metaboliske aktivitet.
Det samme eksperiment blev gentaget efter tilsætning af 10 μM TTX, hvilket resulterede i en gradvis opbremsning af den cellulære metabolisme. Efter tilføjelsen af TTX viste hverken den pH-følsomme OCMFET eller den pH-ufølsomme nogen reaktion, hvilket viste effekten af tilgangen. Disse resultater viser effektiviteten af den foreslåede funktionalisering og dens relative stabilitet i op til 2 uger. En vigtig konklusion, der kan drages af de foreslåede eksperimenter (både den elektriske aktivitet og den metaboliske aktivitet), er, at det er muligt at forberede forskellige former for sensorer ved selektivt at functionalisere forskellige OCMFET'er inden for samme dyrkningsområde. Dette aspekt repræsenterer en ikke-triviel præstation i biosensing for cellulære applikationer, fordi det at være i stand til at overvåge forskellige parametre inden for den samme cellekultur er afgørende for bedre karakterisering af kompleksiteten af disse biologiske systemer.
Figur 1: Topvisning af en 16-kanals MOA til metabolisk og elektrisk overvågning af elektroaktive celler. Skalastang = 1 cm. Forkortelser: OCMFETS = organiske lademodulerede felteffekttransistorer; FG = flydende port; S/D = kilde/afløb; MOA = mikro OCMFET array. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Hovedfabrikationstrin for en MOA til metabolisk og elektrisk overvågning af elektroaktive celler. (A og B) Den fordampede Ti-film er mønstret ved hjælp af en standard fotolitografisk proces til at forberede OCMFET'ernes flydende port. c) Aflejring af 15 nm Parylen C. Dette lag, sammen med den indfødte Tioxid, fungerer som gate dielektrisk af transistorer. (D og E) Parylen C-laget er mønstret ved hjælp af plasma oxygenbehandling. Et mønstret fotoresistlag bruges til selektivt at eksponere sensingområderne for de elektriske optagelser og den flydende port tilbage kontakter. (F) Mønstre af Au top kontakter, nemlig kilde, afløb, kontrol gate, og flydende gate tilbage kontakt. En selvjusteringsteknik bruges til at forbedre enhedens elektriske ydeevne. (G-I) Aflejring af det andet lag af Parylen C på sanseområdet af OCMFET'erne til metabolisk aktivitetsovervågning. Efter iltplasmaeksponeringen vil dette lag fungere som den pH-følsomme membran (J). (K) Tværsnit af en komplet MOA (med materialer) efter aflejringen af den organiske halvleder (TIPS Pentacene) og kulturkammerets positionering. Forkortelser: OCMFETS = organiske lademodulerede felteffekttransistorer; FG = flydende port; S/D = kilde/afløb; MOA = mikro OCMFET array; CG = kontrolport; PET = polyethylen terephthalat; Par C = Parylen C; TIPS = 6,13 bis(triisopropylsilylethynyl) pentacene; ABS = acrylonitrile butadiene styren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Cellulære elektriske aktivitetsoptagelser med en MOA. (A) En sammenflydningskultur af rottediomyocytter (8 DIV), der klæber til overfladen af en MOA, der er fastgjort efter en optagelsessession og immunfarvet til sarkomisk protein, tropomyosin (øvre debut). Bundindsæt: eksempel på et enkelt kardiomyocytsignal målt med en OCMFET. Skalastang = 150 μm. (B) Kemisk tuning af den elektriske aktivitet af en kardiomyocytkultur. Aktivitetsaccelerationen skyldtes tilsætning af 100 mM noradrenalin, mens undertrykkelse skyldtes tilsætning af 100 mM verapamil. Til venstre: slå frekvens graduering; til højre: statistik over 5 OCMFET'er-gennemsnit og standardafvigelse: spike-count på 4 min basal (129 ± 4,6), noradrenalinmedieret (280 ± 28,6) og verapamil-medieret aktivitet (15 ± 1,9). (C) Rekonstruktion af udbredelsen af et hjertesignal. Til højre: rasterplot af kulturens spontane aktivitet, der angiver udbredelsen af signalet fra sted 14 til sted 41 (højre). d) Striatale cellers virkningspotentialer fra rottefostre (21 DIV). Dette tal er blevet ændret fra 18. Forkortelser: OCMFET = organisk lademoduleret felteffekttransistor; MOA = mikro OCMFET array; NE = noradrenalin; VER = verapamil; DIV = dage in vitro. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Metabolisk aktivitetsoptagelser med en MOA. Respons på (A) pH-følsomme og (B) pH-ufølsomme kanaler i en MOA til tilsætning af 25 μM BIC før og efter tilsætning af 10 μM TTX. Efter TTX-tilføjelsen bliver den pH-følsomme kanals adfærd den samme som den pH-ufølsomme. Især kan der ikke observeres nogen aktuel variation efter BIC-tilføjelsen på grund af den TTX-inducerede cellulære død. (C) MOA for metaboliske aktivitetsoptagelser. De pH-følsomme og pH-ufølsomme OCMFET'er er henholdsvis beskrevet med grønt og rødt. Indsat: sunde hippocampale neuroner, der dyrkes på enheden efter 15 DIV. Skalabar = 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra 26. Forkortelser: OCMFET = organisk lademoduleret felteffekttransistor; MOA = mikro OCMFET array; BIC = bikukulin; TTX = tetrodotoxin; DIV = dage in vitro. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
I modsætning til tidligere metoder til fremstilling af OCMFETs til cellulære applikationer18,29, den foreslåede metode er specielt designet til at forberede MOAs, der samtidig kan opdage elektrisk og metabolisk cellulær aktivitet. Desuden har denne tilgang til opnåelse af pH-følsomhed den fordel, at den er kompatibel med standardfabrikationsprotokoller og ikke indebærer nogen kemisk ændring af sensingområdet (dette aspekt sikrer hele enhedens biokompatibilitet). pH-følsomheden opnås ved hjælp af det samme materiale, der anvendes som en gate dielektrisk (dvs. den biokompatibile Parylen C), hvilket gør denne tilgang hurtig og reproducerbar.
Det endelige resultat af denne tilgang er et fleksibelt, gennemsigtigt, billigt og multisensing organisk værktøj til in vitro cellulære applikationer. Det faktum, at dette kan opnås ved hjælp af en enkelt transistorstruktur og en simpel fysisk ændring af sensingområdet, øger fordelene ved brugen af organiske elektroniske materialer og metoder. Da OCMFET's transduktionsprincip ikke udelukkende afhænger af det specifikke halvleder- eller FG-materiale, kan hele processen ændres og opskaleres afhængigt af den specifikke anvendelse.
Et kritisk aspekt af den foreslåede teknik er relateret til reproducerbarheden af plasmaaktiveringsteknikken. For at opnå ensartede resultater skal både Parylen C-tykkelsen og dens ætsningshastighed kontrolleres. Hyppig kalibrering af Parylen C-aflejringsprocessen og plasmarenseren er absolut nødvendig. Andre kritiske aspekter, som også bidrager til reproducerbarheden af processen, er omhyggelig håndtering af enheden og aflejringen af den organiske halvleder. En simpel drop-casting teknik blev brugt her, som i sig selv udgør reproducerbarhed begrænsninger. For at minimere disse problemer, som beskrevet i protokoltrin 10.1, skal den samme mængde halvlederopløsning anvendes hver gang, og fordampningen af opløsningsmidlerne bør standardiseres så meget som muligt. Holde en konstant temperatur ved hjælp af en kogeplade og dækker substratet efter hver dråbe aflejring vil bidrage til at bremse fordampning proces. For yderligere at minimere dette problem kan depositionsteknikken (f.eks. ved hjælp af en inkjetudskrivningsmetode) skiftes30.
En begrænsning af den foreslåede protokol skyldes karakteren af funktionaliseringen af OCMFET til pH-sensing. Stabiliteten af pH-sensorerne er begrænset til et par uger26. Stabilitetsvinduet i den foreslåede tilgang er imidlertid tilstrækkeligt stort til at dække de standardinkubationstider, der er nødvendige for neuronal kulturvækst (2-3 uger). Andre former for sensing område funktionalisering bør overvejes for længere eksperimenter. Fabrikationsprotokollen bruger en dedikeret tilbagekontakt, der giver elektrisk adgang til FG'erne. Denne kontakt, som efterlades flydende under enhedens normale drift, kan udnyttes til elektrisk karakterisering af enheden og funktionalisering af sensingområderne ved hjælp af forskellige teknikker (f.eks. elektrodeposition).
Denne procedure er en praktisk måde at forberede en multi-sensing enhed til cellulære applikationer uden behov for ekspansive materialer eller renrum faciliteter. På trods af præstations- og stabilitetsbegrænsningerne på grund af ansættelsen af en organisk halvleder og fysisk (ikke kemisk) funktionalisering af sensorområdet kan lignende tilgange bruges til at forberede billige (og potentielt engangs), mekanisk fleksible og optisk gennemsigtige sensorer og biosensorer, som kan give forskere i cellulær biologi, vævsteknik og neurovidenskab nye specialiserede værktøjer til at studere cellulære systemer in vitro.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender finansiering fra EU's Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale nr. 882897-Search&Rescue-projektet og PON-projektet "TEX-STYLE" ARS01_00996, PNR 2015-2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
| 3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
| ABS filament | |||
| Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
| Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
| Gold | Local seller | ||
| Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
| Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
| Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
| Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
| Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
| NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
| Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
| PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
| PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
| PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
| Petri dishes | |||
| Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
| Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
| Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
| Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
| Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
| Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
| Thermal evaporator unit | |||
| TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
| Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
| Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |
References
- Hubel, D. H. Tungsten microelectrode for recording from single units. Science. 125 (3247), 549-550 (1957).
- Verzeano, M., Negishi, K., Angeles, L. Neuronal activity in cortical and thalamic networks. A study with multiple microelectrodes. Journal of General Physiology. 43 (6), 177-195 (1960).
- Thomas, C. A. Jr, Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74 (1), 61-66 (1972).
- Grattarola, M., Martinoia, S. Modeling the neuron-microtransducer junction: from extracellular to patch recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (1), 35-41 (1993).
- Wallace, K., Strickland, J. D., Valdivia, P., Mundy, W. R., Shafer, T. J. A multiplexed assay for determination of neurotoxicant effects on spontaneous network activity and viability from microelectrode arrays. NeuroToxicology. 49, 79-85 (2015).
- Bergveld, P. Development, operation, and application of the tool for electrophysiology. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 19 (5), 342-351 (1972).
- Bergveld, P., Wiersma, J., Meertens, H. Extracellular potential recordings by means of a field effect transistor without gate metal, called OSFET. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 23 (2), 136-144 (1976).
- Fromherz, P., Offenhausser, A., Vetter, T., Weis, J. A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor. Science. 252 (5010), 1290-1293 (1991).
- Martinoia, S., et al. Development of ISFET array-based microsystems for bioelectrochemical measurements of cell populations. Biosensors and Bioelectronics. 16 (9-12), 1043-1050 (2001).
- Heer, F., et al. CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogenic cells. Biosensors and Bioelectronics. 20 (2), 358-366 (2004).
- Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab on a Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
- Maccione, A., et al. Multiscale functional connectivity estimation on low-density neuronal cultures recorded by high-density CMOS micro electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 161-171 (2012).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Scientific Reports. 4, 5489 (2014).
- Zuo, L., Yu, S., Briggs, C. A., Kantor, S., Pan, J. Y. Design and fabrication of a three-dimensional multi-electrode array for neuron electrophysiology. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (12), (2017).
- Spanu, A., et al. A three-dimensional micro-electrode array for in-vitro neuronal interfacing. Journal of Neural Engineering. 17 (3), 036033 (2020).
- Spanu, A., Martines, L., Bonfiglio, A. Interfacing cells with organic transistors: a review of in vitro and in vivo applications. Lab on a Chip. 21 (5), 795-820 (2021).
- Spanu, A., et al. An organic transistor-based system for reference-less electrophysiological monitoring of excitable cells. Scientific Reports. 5, 8807 (2015).
- Viola, F. A., Spanu, A., Ricci, P. C., Bonfiglio, A., Cosseddu, P. Ultrathin, flexible and multimodal tactile sensors based on organic field-effect transistors. Scientific Reports. 8, 8073 (2018).
- Napoli, C., et al. Electronic detection of DNA hybridization by coupling organic field-effect transistor-based sensors and hairpin-shaped probes. Sensors. 18 (4), 990 (2018).
- Spanu, A., et al. A reference-less pH sensor based on an organic field effect transistor with tunable sensitivity. Organic Electronics. 48, 188-193 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Zhang, Y. S., et al. Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2293-2302 (2017).
- Yu, H., et al. A novel design of multifunctional integrated cell-based biosensors for simultaneously detecting cell acidification and extracellular potential. Biosensors and Bioelectronics. 24 (5), 1462-1468 (2009).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring. APL Bioengineering. 2 (4), 046105 (2018).
- Díaz-García, C. M., et al. Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake. Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).
- Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia. Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).
- Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring. IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).
- Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors. Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).
