Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تقنيات تحضير الأنسجة للتصوير المقطعي المحوسب الجزئي المعزز بالتباين لنماذج قلب الثدييات الكبيرة المصابة بأمراض مزمنة

Published: February 8, 2022 doi: 10.3791/62909
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2
1Centre de recherche Cardio-Thoracique de Bordeaux, Univ. Bordeaux, 2IHU Liryc, Electrophysiology and Heart Modeling Institute, Fondation Bordeaux Univ., 3Electrophysiology and Ablation Unit, Bordeaux University Hospital (CHU)

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للحصول على صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيق عالية الدقة لقلوب الثدييات الكبيرة الصحية والمرضية مع تعزيز التباين الانتقائي للكولاجين.

Abstract

إعادة التشكيل الهيكلي هي نتيجة شائعة للضغوط المرضية المزمنة المفروضة على القلب. يعد فهم الخصائص المعمارية والتركيبية للأنسجة المريضة أمرا بالغ الأهمية لتحديد تفاعلاتها مع السلوك غير المنتظم. تظهر إعادة تشكيل الأنسجة المجهرية ، دون الدقة السريرية ، كمصدر مهم لعدم انتظام ضربات القلب القاتل ، مع انتشار مرتفع بين الشباب. لا تزال هناك تحديات في الحصول على تباين تصوير عال بدقة ميكروسكيل كافية للنماذج قبل السريرية ، مثل قلوب الثدييات الكبيرة الكاملة. علاوة على ذلك ، لا يزال هناك نقص في تحسين التباين الانتقائي لتكوين الأنسجة للتصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة. يظهر التصوير غير المدمر باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق وعدا بالتصوير عالي الدقة. وكان الهدف هو تخفيف المعاناة من الأشعة السينية على التوهين في العينات البيولوجية الكبيرة. تم استخراج القلوب من الخنازير السليمة (N = 2) ، والأغنام (N = 2) إما مع احتشاء عضلة القلب المزمن الناجم وتشكيل ندبة ليفية أو الرجفان الأذيني المزمن المستحث. تم استئصال القلوب مع: محلول ملحي مكمل بعامل تبريد أيون الكالسيوم وموسع للأوعية الدموية ، والإيثانول في الجفاف التسلسلي ، وسداسي ميثيل ديسيليزان تحت الفراغ. هذا الأخير عزز بنية القلب أثناء تجفيف الهواء لمدة 1 أسبوع. كانت الأنسجة المهيمنة على الكولاجين مرتبطة بشكل انتقائي بعامل تعزيز تباين الأشعة السينية ، وهو حمض الفوسفوموليبديك. كان تكوين الأنسجة مستقرا في الهواء ، مما سمح لعمليات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق طويلة الأجل بالحصول على صور عالية الدقة (20.7 ميكرومتر متساوي الخواص). أظهر تحميل عامل التباين الأمثل عن طريق الانتشار تعزيزا انتقائيا للتباين للطبقة الظهارية وألياف Purkinje شبه الشغافية في البطينين الخنازير الصحيين. أظهرت قلوب الرجفان الأذيني (AF) تراكما معززا للتباين في الجدران الخلفية والزوائد من الأذينين، ويعزى ذلك إلى زيادة محتوى الكولاجين. أظهرت قلوب احتشاء عضلة القلب تباينا متزايدا بشكل انتقائي في مناطق تليف القلب ، مما مكن من تحديد ألياف عضلة القلب المتشابكة الباقية على قيد الحياة. مكنت مستحضرات الأنسجة المجففة بالهواء المعززة بالتباين من التصوير المجهري لقلب الثدييات الكبير السليم وتعزيز التباين الانتقائي لمكونات المرض الأساسية.

Introduction

تمثل أمراض القلب الهيكلية غالبية الوفيات المرتبطة بالقلب في جميع أنحاء العالم1. إعادة تشكيل بنية القلب يؤثر على بيئة عضلة القلب والفضاء الخلالي. نظرا لأن كل من الوظيفة الكهربائية والميكانيكية للقلب تعتمد على تنظيم الخلايا العضلية ، يمكن أن يؤدي الاضطراب إلى عدم انتظام ضربات القلب الذي لا يطاق ، وضعف إجراءات ضخ الدم ، وفشل القلب2،3،4،5،6،7،8،9. تطورات العلاجات العلاجية لأمراض القلب الهيكلية تفوق بكثير انتشار المرض 2,5. على هذا النحو ، تظهر أعداد متزايدة من النماذج قبل السريرية لأمراض القلب الهيكلية لفهم أفضل للملامح التشريحية المورفولوجية والتسبب الناتج عن عدم انتظام ضربات القلب 10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20 ، 21,22,23. لوحظ عبر طيف الأمراض الهيكلية هو زيادة تنظيم التليف الخلالي ، وأكثر شيوعا في الحالات المتعلقة بنقص التروية ، استبدال عضلة القلب بالتليف والأنسجة الدهنية18. يمكن أن يتيح الفهم المورفولوجي للمكونات المرضية خارج الخلية تحديد الركائز المحتملة لعدم انتظام ضربات القلب. يوفر توزيع المرض ومداه مؤشرات قوية على خطر عدم انتظام ضربات القلب. ومع ذلك ، لا تزال هناك تحديات لتصوير ملامح الأمراض بشكل شامل من خلال دمج المقاييس الكلية والدقيقة في القلب السليم.

يظهر التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (microCT) ، القائم على الأشعة السينية ، كأداة قوية لاستجواب البنية المجهرية للأنسجة البيولوجية الرخوة باستخدام عوامل التباين. تم الحصول على خرائط تشريحية مفصلة للغاية للقلوب من القوارض الصغيرة 24،25،26 وعينات تشريح صغيرة من قلوب الثدييات الكبيرة27،28. ومع ذلك ، فإن التصوير على مستوى العضو بأكمله لقلوب الثدييات الكبيرة يعرض أطوال مسار مفرطة يتم من خلالها تخفيف فوتونات الأشعة السينية باستخدام تقنيات تحضير الأنسجة التقليدية. وهذا ينطوي على تحميل الأنسجة على النقيض من ذلك وغمر العينة في مذيب عامل التباين أثناء الاستحواذ. وتفرض زيادة حجم العينة ودقتها إطالة أمد إجمالي وقت الاقتناء. لذلك يصبح استقرار الأنسجة أمرا بالغ الأهمية لإعادة بناء الصور القابلة للاستخدام ، مما يعني أنه يجب منع تشوه الأنسجة الناتج عن التجفيف. ومع ذلك ، فإن استخدام سائل الغمر له عيوب: (i) تصبح كثافة إشارة الخلفية الإجمالية غير ضئيلة و (ii) تعزز تخفيف جزيئات التباين المرتبطة بالأنسجة. يساهم كل من هذين العاملين في تقليل تباين الصورة.

تفصل هذه الدراسة خط أنابيب جديد لمعالجة الأنسجة للتخفيف من توهين الفوتون في الخلفية وتحسين النطاق الديناميكي الذي توفره عوامل تعزيز التباين. يقترح استخدام نهج تجفيف الهواء للأنسجة مع تعزيز الأنسجة الكيميائية للحد من تشوه الأنسجة29. لذلك يمكن أن تظل عينات الأنسجة مستقرة في الهواء لعمليات الاستحواذ الطويلة وحذف مساهمات الخلفية من سوائل الغمر. يوفر خط أنابيب المنهجية هذا: (أ) بروتوكول شامل لمعالجة الأنسجة والتصوير الأمثل باستخدام قلوب الخنازير الكاملة. (ii) تقييم تركيز التباين وتقنيات التحميل، و (iii) تطبيق خط الأنابيب هذا في نموذجين متميزين من الأمراض المزمنة من الرجفان الأذيني واحتشاء عضلة القلب في قلوب الأغنام. تم وصف تطوير نماذج الأمراض المزمنة في مكان آخر لكل نموذج من نماذج أمراض القلب المزمنة ، واحتشاء عضلة القلب الناجم عن انصمام الشريان التاجي عن طريق الجلد13 والرجفان الأذيني المستدام ذاتيا30.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في التوجيه 2010/63/EU الصادر عن البرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية. تمت الموافقة على البروتوكولات الحيوانية من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية (CEEA50) في جامعة بوردو. تم الحصول على القلوب من ثلاثة نماذج كبيرة من الثدييات ، بما في ذلك (i) الخنازير البيضاء الكبيرة الصحية (N = 2 ، 2 أشهر من العمر) ؛ (ii) الأغنام (N = 1 ، 2 سنة) مع احتشاء عضلة القلب المستحث13 و (iii) الأغنام (N = 1 ، 7 سنوات) مع الرجفان الأذيني المستحث30.

1. إعداد الحل:

  1. محلول الشلل القلبي: تحضير 3 لتر من الماء المقطر وإضافة كلوريد الصوديوم (110 ملليمتر) ، كلوريد البوتاسيوم (16 ملليمتر) ، بيكربونات الصوديوم (10 ملليمتر) ، D-(+)-الجلوكوز (9 ملليمتر) ، محلول كلوريد الكالسيوم (1.2 ملليمتر) ومحلول كلوريد المغنيسيوم (16 ملليمتر). في النهاية ، أضف 500 ميكرولتر / لتر من الصوديوم الهيبارين. حافظ على هذا الحل عند 4 درجات مئوية.
  2. محلول ملحي مخزن بالفوسفات - محلول EDTA (PBS-EDTA).
    1. أولا ، أضف حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) إلى 1 لتر من الماء المقطر للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ملليمتر. زيادة والحفاظ على درجة الحموضة محلول من 12 باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم (1 M) لإذابة EDTA.
    2. بمجرد إذابة EDTA بالكامل ، اخفض الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. أضف كيسا واحدا من الرقائق المالحة العازلة بالفوسفات للحصول على محلول عند 0.01 M (كلوريد الصوديوم ، 0.138 M ؛ كلوريد البوتاسيوم ، 0.0027 M) والرقم الهيدروجيني 7.4. حافظ على هذا الحل في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. محلول عامل تباين الإيثانول - حمض الفوسفوموليبديك (PMA): تحضير 1 لتر من الإيثانول المطلق وإضافة PMA للحصول على محلول عند 1٪ من التركيز. حافظ على هذا الحل في RT.

2. مصدر الأنسجة

  1. القتل الرحيم للحيوان واستخراج القلب وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية المحلية. اغمر القلب بسرعة في محلول شلل القلب البارد وقم بتدليك البطينين بلطف للشطف الأولي.
  2. تأكد من قطع الشريان الأورطي أسفل قوس الأبهر وربط جانبين من جدار الشرايين باستخدام حاملات الإبرة.
  3. تعليق القلب بواسطة حاملات الإبر ، أدخل قنية الأبهر في جذر الأبهر ، مع الحرص على عدم الاتصال أو البروز من خلال الصمامات الأبهرية. لف خيطة قياس 0 حول قوس الأبهر على مستوى القنية واربط القنية بإحكام في مكانها.
  4. باستخدام محاقن 50 مل ، حقن 200 مل من محلول القلب البارد (4 درجات مئوية). إزالة تجمع الدم الزائد في التجاويف عن طريق قلب القلب على جانبه الخلفي لتصريفه عبر الأوردة الرئوية.
  5. اغمري القلب المغسول واحفظيه في محلول قلبي بارد مخزن على الثلج حتى يصبح جاهزا للتشريح.

3. إعداد الأنسجة:

  1. قم بإعداد خزان سعة 1 لتر مدعوم ب 80 سم فوق طبق تشريح. قم بإقران أنبوب بلاستيكي حراري بطول 80 سم وقطر داخلي 3.2 مم وقطر خارجي 4.8 مم إلى منفذ تصريف الخزان.
  2. قم بإصلاح صنبور ثلاثي الاتجاهات على أنابيب الصرف الصحي وقم بإقران أنابيب بلاستيكية حرارية أخرى (20 سم وقطر داخلي 1.6 مم وقطر خارجي 3.2 مم) لكل منفذ حر على الصنبور ثلاثي الاتجاهات. قم بإصلاح الصنابير ثنائية الاتجاه إلى نهايات الرسوم للأنابيب.
  3. املأ الخزان بمحلول الشلل القلبي المكمل بالهيبارين (2500 وحدة). افتح الصنابير للسماح للمحلول القلبي بتصريف وإزالة جميع فقاعات الهواء ، ثم أغلق الصنابير ثنائية الاتجاه.
  4. تحضير قنية لأوستيا الشريان التاجي الأيسر والأيمن باستخدام أنابيب البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) (قطر داخلي 1 مم وقطر خارجي 2 مم).
    1. قطع 5 سم من الأنابيب وتسخين طرف واحد عن طريق وضع الطرف بجانب لهب عارية. بمجرد أن يبدأ 1 مم من الطرف في الذوبان ويصبح شفافا ، اضغط على الطرف ضد سطح مقاوم للحرارة الصلبة لتشكيل سلسلة من التلال عند طرف القنية لمنع القنية من الانزلاق من الأوعية.
    2. أدخل 1 سم من الطرف غير المسخن لكل قنية في طرفي أنابيب تصريف خزان الصرف.
  5. إزالة قنية الأبهر. تحت محلول القلب البارد ، قم بتوطين أوستيا اليسرى واليمنى للشرايين التاجية.
  6. باستخدام مقص مدبب ، افصل بعناية جذر الأبهر عن الأنسجة المحيطة فوق وأسفل أوستيا الشريان التاجي لتمكين خيوط خياطة حريرية 0 غرام تحت الوعاء التاجي.
  7. افتح الصنابير ثنائية الاتجاه وأدخل أطراف القنية في أوستيا الشريان التاجي. مع أطراف القنية التي تمتد 1-2 سم إلى أوستيا وخارج وضع الخيط ، اربط الكانيولا.
  8. شطف القلب أثناء تدليك البطينين بلطف لمدة 15 دقيقة حتى يتم تطهير القلب من الدم.
  9. بعد الشطف ، أغلق الصنابير ثنائية الاتجاه وافصلها عن الصنبور ثلاثي الاتجاهات. انقل القلب إلى حاوية بلاستيكية مقاومة للمواد الكيميائية سعة 1 لتر تحتوي على 500 مل من محلول PBS-EDTA.
  10. أعد تدوير محلول PBS-EDTA في أنابيب اللدائن الحرارية تحت غطاء الدخان باستخدام مضخة تمعجية مع قناتين. قم بتعبئة أنبوب المضخة حتى تغيب الأنابيب عن فقاعات الهواء ، ثم قم بفحص كل قنية شريان تاجي عن طريق إعادة التدوير في RT لمدة 2 ساعة عند 80 مل / دقيقة.
  11. تأكد من أن غطاء الدخان يعمل. أوقف المضخة ، واستنزف المحلول من الحاوية واستبدله بالفورمالين (10٪) للتثبيت لمدة 1 ساعة في RT عند 80 مل / دقيقة.
  12. استبدل محلول الفورمالين ب PBS لشطف المثبت ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما عند 80 مل / دقيقة.

4. جفاف الأنسجة وتجفيفها:

ملاحظة: استخدم نفس معدل التروية (80 مل / دقيقة) واترك الأنسجة تبقى في RT طوال الوقت.

  1. استبدل محلول PBS بالإيثانول بنسبة 20٪ ، المخفف في الماء فائق النقاء ، وقم بتشغيله لمدة لا تقل عن 3 ساعات.
  2. قم بدمج القلب باستخدام سلسلة من تركيزات الإيثانول المتزايدة.
    1. ابدأ باستبدال محلول الإيثانول بنسبة 20٪ بالإيثانول المخفف إلى 30٪ وبيرفيس لمدة 2 ساعة.
    2. كرر التروية عن طريق زيادة تركيز الإيثانول في كل تكرار من خلال 40٪ ، 50٪ ، 60٪ ، 65٪ ، 70٪ ، 75٪ ، 80٪ ، 95٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 99٪ ، و 100٪ لمدة لا تقل عن 1 ساعة في كل خطوة (تركيز).
      ملاحظة: قد تستريح عينات القلب دون تدفق التروية بين عشية وضحاها عند أي تخفيف للإيثانول إذا حدث الحد الأدنى من التروية لمدة 15 دقيقة لهذا التركيز.
  3. اختياري: في حالة تطبيق عوامل التباين عن طريق التروية ، قم بدمج القلب مع الإيثانول بنسبة 100٪ مع عامل التباين PMA ، 1٪ لمدة 48 ساعة. شطف عامل التباين عن طريق التروية مع الإيثانول 100٪ لمدة 2 ساعة.
  4. لتعزيز أنسجة القلب قبل التجفيف الهوائي ، أعد تدوير مزيج 50:50 من الإيثانول وسداسي ميثيل ديسيلازان (HMDS) لمدة 10 دقائق. اتبع هذا بنسبة 100٪ HMDS لمدة 2 ساعة أخرى.
    تحذير: HMDS مادة شديدة السمية وضارة. يتم إطلاق رائحة قوية من الأمونيا في اتصال مع الهواء. علاوة على ذلك ، فإن الشكل السائل من HMDS متقلب للغاية ويتم تحفيزه بواسطة عوامل تحتوي على اليود.
  5. افصل القنية عن الأنابيب القلب من خياطة الأبهر داخل غطاء الدخان.
  6. حرك كيس بسحاب بعناية فوق القلب وأغلق ختم الكيس فوق الخيط لتقليل تعرض القلب للهواء المتداول. اترك القلب ليجف من خلال التبخر لمدة 1 أسبوع.
  7. اختياري: بالنسبة لعوامل التباين التي يتم تحميلها على الانتشار، اغسل القلب بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 15 دقيقة أثناء التحريض. غمر القلب في 100 ٪ الإيثانول المكمل مع PMA ، 1 ٪ ، لمدة 48 ساعة تحت فراغ. كرر الخطوة 4.6.

5. ميكرو سي تي:

ملاحظة: تم استخدام نظام microCT للأشعة السينية لسطح المكتب لتصوير قلوب الخنازير.

  1. قم بتركيب القلب المجفف بالهواء على حامل عينات مناسب. منع أي حركة أثناء قياسات التصوير المقطعي المحوسب المجهري بالأشعة السينية باستخدام مشبك مثبت على حامل العينة وتأمين القلب عبر الشريان الأورطي المجفف والصلب.
  2. قم بمحاذاة مركز عينة القلب بدقة على طول محورها الطولي مع مركز مجال رؤية التصوير لزوايا دوران 0 درجة و 90 درجة. لتحقيق ذلك في جميع الاتجاهات، القلب في الهواء عبر مشبك الأبهر المثبت على دعم العينة.
  3. بعد فتح البرنامج وبدء تشغيل نظام microCT للأشعة السينية ، قم بتطبيق مرشح الأشعة السينية الألومنيوم ، 1 مم ، جهد مصدر الأشعة السينية إلى 60 كيلو فولت والتيار إلى 120 ميكرو أمبير.
  4. اسحب حامل العينة خارج مجال الرؤية ومعايرة صورة الخلفية ووقت التعرض للأشعة السينية من خلال الحصول على تصحيح حقل مسطح. تأكد من أن متوسط انتقال الأشعة السينية في الخلفية أكبر من 80٪.
  5. صور انتقال الأشعة السينية الكشفية على طول الدعم لتحديد مجال التصوير الكلي في المحور الطولي للقلب. للمسح الضوئي، استخدم خطوة دوران تبلغ 0.18 درجة، وإطارا يبلغ متوسطه 5، ودوران عينة يبلغ 180 درجة. حدد وضع المسح الضوئي للإزاحة لتصوير العرض الكامل لدعم العينة.
    ملاحظة: تم اختيار معلمات الاكتساب المشار إليها في هذا القسم لتحسين جودة صورة تكوين قلب المجموعة.
  6. بعد المسح الضوئي ، استخدم البرنامج لإعادة البناء المقطعي لحجم صورة ثلاثي الأبعاد متساوي الخواص. لتطبيق برنامج NRecon ، استخدم تصحيح القطع الأثرية المتعلقة بالاقتناء ، بما في ذلك تأثيرات تصلب الحزم بنسبة 10٪ وتقليل القطع الأثرية الحلقية بنسبة 8.
  7. لتحسين قيود تخزين البيانات، قم بتطبيق الحد الأدنى من المنطقة المستطيلة ذات الأهمية التي تشمل voxels الصور الخاصة بالقلب. تصدير الصور بتنسيق نقطي 8 بت كمكدس صور.
  8. تصور مكدس البيانات المعاد إنشاؤه باستخدام برنامج DataViewer. قم بتوجيه العينة رقميا داخل حدود الصورة لإعادة محاذاة محاور العينة الطويلة والقصيرة مع المحاور الرئيسية الثلاثة لحجم الصورة.
  9. اقتصاص حجم الصورة في جميع المحاور الثلاثة لإزالة طبقات الخلفية الخارجية للصورة، لتقليل الحجم الإجمالي للصورة إلى أقصى حد.

Representative Results

إن تحضير قلوب الثدييات الكبيرة باستخدام طريقة الجفاف والتجفيف بالهواء يزيل كل محتوى الماء من العينة. يمكن ملاحظة أدلة على عدم كفاية استبدال المياه بالإيثانول أثناء تحميل HMDS (انظر البروتوكول ، الخطوة 4.4). وجود الماء تحت HMDS سيخلق فقاعات ترتفع من الأنسجة. في حالة ارتفاع مستويات المياه ، يمكن أن يحدث ارتفاع في درجة حرارة سائل الغمر. يمكن أن يؤدي إبقاء غرفة الغمر محاطة بالجليد أثناء تحميل HMDS الأولي إلى تقليل الآثار السيئة لتسخين الأنسجة. بعد تجفيف القلوب بالهواء في حالة عدم وجود عوامل تباين ، ستظهر العينة بيضاء اللون (انظر البروتوكول ، الخطوة 4.6). غالبا ما كان السطح الخارجي جافا ومستقرا هيكليا قبل الطبقات الداخلية. الشطف في الإيثانول قبل تحميل عامل التباين أزال الرواسب البيضاء (انظر البروتوكول ، الخطوة 4.7). يكشف التقطيع عبر الأنسجة باستخدام شفرة حادة عن ألياف عضلية فردية مجهرية مع فصل واضح. عانى تحميل التباين عن طريق غمر عينات القلب في وسط عامل التباين من القطع الأثرية التي تحد من الانتشار في المناطق السميكة والعضلية العالية من العينة. وفر تحميل تباين الانتشار تحت الفراغ تلوينا أكثر تجانسا في العضلات (عينة القلب رقم 1 ، انظر الجدول 1 لمعرفة أوقات تحميل عامل التباين). من الناحية العيانية ، أظهر توزيع عامل التباين السطحي تلطيخا متجانسا بين عضلة القلب والمناطق المكونة في المقام الأول من مكونات خارج الخلية ، ولا سيما الدهون والأنسجة الضامة. حافظت عينات الأنسجة المجففة بالهواء ، إما قبل أو بعد تحميل عامل التباين ، على السلامة الهيكلية المستقرة.

كان الوقت اللازم لمسح العرض الكامل للعينة بدقة 20 ميكرومتر تحت microCT باستخدام معلمات المسح المذكورة أعلاه ووقت التعرض البالغ 1700 مللي ثانية هو 6 ساعات و 34 دقيقة. اعتمادا على حجم العينة في المحور العملاق للماسح الضوئي ، تم ضرب هذه المدة في عدد المواضع اللازمة لالتقاط الطول الكامل للعينة. بالنسبة لقلوب الخنازير والأغنام في هذه الدراسة ، تم استخدام ثلاثة إلى أربعة مواضع. قام برنامج NRecon بتبليط عمليات المسح متعددة المواضع والإزاحة لتشكيل صورة إسقاط أشعة سينية واحدة لكل خطوة دوران لمصدر الأشعة السينية وكاشفها. في المجموع ، يتم تخزين 1000 إسقاط كصور 16 بت ، مما يولد 30-40 غيغابايت من البيانات. كانت الصور الحجمية المعاد بناؤها 52-70 جيجابايت.

كان من السهل التعرف على المعالم التشريحية الرئيسية، بما في ذلك تجاويف البطينين، والحاجز، والجدران الحرة للبطينين، من خلال تصوير انتقال الأشعة السينية لقلوب الخنازير المجففة بالهواء الملطخة بعامل تباين عن طريق تحميل الانتشار (الشكل 1A). وعلاوة على ذلك، لوحظت أيضا مناطق عالية النسيج تشير إلى التنظيم الهيكلي المجهري، مثل اتجاه ألياف عضلة القلب، بسبب تخفيف/انتقال الأشعة السينية الحساسة (الشكل 1 باء). أظهرت عمليات إعادة البناء المقطعي لأحجام الصور ثلاثية الأبعاد فصلا متميزا بين الأنسجة والخلفية عند كل من الحدود البطانية والبطانية (الشكل 1D). من الناحية الداخلية ، لوحظ تباين منخفض وتدرج انتشار كثافة فوكسل في جميع أنحاء المناطق السميكة عبر الجدارية من الأنسجة. على الرغم من ذلك ، كانت ألياف الأوعية الدموية وعضلة القلب المفصولة بطائرات الانقسام لا تزال قابلة للتحديد بسهولة. ولوحظ عرض نطاق ترددي ثان أعلى كثافة للتباين في الطبقة القصوى من الشريان وفي المناطق دون الشغافية المثقوبة. كان تعزيز التباين أكبر في المواقع التي تراكمت فيها المكونات خارج الخلية ، وخاصة النسيج الضام فوق القلب ، والدهون فوق القلبية وغمد النسيج الضام لشبكة ألياف Purkinje. أظهرت توزيعات كثافة إشارة Voxel انفصالا عاليا عن الخلفية ذات الكثافة الصفرية (الهواء) ومجموعتين مهيمنتين من الأنسجة منخفضة وعالية التباين (الشكل 1D).

للتحقق من صحة تعزيز التباين في عمليات إعادة بناء صور التصوير المقطعي المحوسب المجهري والانتقائية لمقصورات الكولاجين في عينات القلب ، تم استخدام علم الأنسجة والمجهر الميداني الساطع والمجهر الفلوري (الشكل 2). تم إعداد كتلة عبر جدارية من الأنسجة البطينية من قلب مجفف بالهواء دون تحميل عامل تباين مسبق لتضمين البارافين وتقسيمه. تمت معالجة شرائح الأنسجة المجاورة المثبتة على شرائح المجهر إما عن طريق تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان ، أو بدون علاج ، أو 48 ساعة من PMA (1٪). أدى غمر مقاطع الأنسجة المثبتة على الشرائح إلى القضاء على آثار تدرج الانتشار لعملية التلطيخ التي لوحظت في عينات القلب بأكملها. أظهر تلطيخ ميسون ثلاثي الألوان تلطيخا إيجابيا للكولاجين في الطبقات الظهارية والبطانية ، حول الأوعية الدموية في الأنسجة تحت القلب ، وغمد النسيج الضام المحيط بألياف Purkinje حرة التشغيل بارزة في تجويف البطين الأيسر (الشكل 2A). أظهرت إضاءة المجال الساطع تلوينا أغمق في هياكل الكولاجين بعد تلطيخ PMA ، مما يدعم التراكم التفضيلي ل PMA (الشكلان 2B و C). علاوة على ذلك ، فقد ثبت سابقا أن علاج PMA يروي التألق الذاتي لمجمعات الكولاجين الجزيئية الكبيرة31. كانت الصور الفلورية لأقسام الأنسجة البطينية تعاني من فقدان التألق الناجم عن PMA في مواقع الكولاجين (الشكل 2D مقابل 2E ، الشكل 2D "مقابل 2E" والشكل 2D "مقابل 2E"). في كل من التصوير الميداني الساطع والفلورسنت ، لم يتم تغيير المقصورات الخلوية بواسطة علاج PMA ، وكان للكولاجين تراكم انتقائي لتلطيخ PMA وإخماد التألق الذاتي.

تم تلطيخ عينة القلب رقم 2 بعامل تباين عن طريق التروية قبل التجفيف الهوائي. كشفت إعادة بناء الصورة عن تلطيخ غير مكتمل للغاية داخل حجرة عضلة القلب (الشكل 3A). بدا تعزيز التباين غير انتقائي لتكوين الأنسجة ، مع عدم وجود مزيد من التعزيز لشدة الإشارة في المناطق الشرجية أو شبه الشغافية. وعلاوة على ذلك، أظهرت الأنسجة منخفضة التباين انفصالا ضعيفا عن كثافة الخلفية (الشكل 3 باء).

تم تحفيز التليف البطيني بسبب احتشاء عضلة القلب ونقص التروية المزمن (عينة القلب رقم 3). تم تشكيل ندبة أمامية قمية عن طريق استبدال الخلايا العضلية برواسب ليفية دهنية في الأنسجة في اتجاه مجرى النهر إلى موقع الانصمام الوعائي. تم إعداد عينة القلب رقم 3 وتصويرها من إسفين بطيني تشريحي يغطي البطين الأيسر الأمامي والحاجز وجدار البطين الأيمن الحر. تم وصف إعداد تكوين الوتد البطيني هذا سابقا32 وتم مراجعة تطبيق الأوتاد لتصوير القلب بالتفصيل33. كان مورفولوجيا الندبة عابرة للحدود ولكنها غير متجانسة (الشكل 4). كانت آفة ليفية كثيفة مركزية محاطة بمنطقة حدودية فضفاضة وغير متجانسة (الشكل 4A). كان التحضير البطيني ملطخا بتحميل الانتشار بعد التجفيف في الهواء وفي فراغ. يوضح الشكل 4B-E أكبر كثافة إشارة لأحجام صور microCT المعاد بناؤها عند حدود الأنسجة ومناطق الندبات. عوامل التباين تلطخ عضلة القلب الصحية بشكل سيئ ، ومع ذلك تم الاحتفاظ بالتباين الهيكلي الدقيق (الشكل 4C'). في المنطقة الحدودية ، تخللت أنسجة ندبة مع عضلة القلب الباقية على قيد الحياة (الشكل 4D'). وظهر التليف الكثيف عبر الجدارية ولكنه محكم، مما يشير إلى وجود اختلافات في التركيب (الشكل 4E). تم استخدام أجزاء الأنسجة في منطقة البطين الأيسر عبر الجدارية من إعداد الأنسجة المجففة بالهواء والملطخة ب PMA للتحقق من انتقائية PMA للكولاجين في الأنسجة المرضية من خلال مقارنتها مع تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان (الشكل 4F). كان تلطيخ PMA انتقائيا للكولاجين (sub-epicardium و endocardium الفرعي) وغائبا في مناطق عضلة القلب الباقية على قيد الحياة (الشكل 4G).

تم تجفيف عينة القلب رقم 4 مع الرجفان الأذيني المستمر المستحث بالهواء مع الحفاظ على الشكل الأصلي للتجويف الأذيني. لم يلاحظ انهيار الزائدة الأذينية. يمكن تحديد المعالم التشريحية الرئيسية من الناحية المورفولوجية من الصور التي أعيد بناؤها (الحاجز الأذيني ، عضلات البكتينات ، الجيوب الأنفية التاجية ، أوستيا الوريد الرئوي ، الوريد الأجوف و cristae terminalis). أدى تلطيخ الانتشار تحت الفراغ إلى تعزيز التباين في جذر الأبهر والصمامات الأذينية البطينية والمناطق المنفصلة من عضلة القلب العاملة. تم تقييد تعزيز تلطيخ العضلات بالزوائد الأذينية والجدران الخلفية لكل من الأذينين الأيسر والأيمن (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: التصوير المقطعي المحوسب المجهري لقلب خنزير مجفف بالهواء معالج بعامل تباين PMA عن طريق الانتشار تحت الفراغ. (ب) ملف انتقال مستخرج من الخط الأحمر في A. (C) شريحة قصيرة المحور من البطينين من حجم ثلاثي الأبعاد أعيد بناؤه مقطعيا. تشير الأسهم الصفراء إلى مناطق التباين المثقوبة المنسوبة إلى ألياف Purkinje شبه الشغافية. تشير الأسهم الزرقاء إلى الأوعية الدموية. (د) توزيع كثافة الإشارة لشريحة الصورة المعاد بناؤها الموضحة في C. LV: البطين الأيسر و RV: البطين الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحقق من انتقائية PMA للكولاجين . (أ) تلطيخ ماسون ثلاثي اللون لقسم الأنسجة عبر الجدارية من البطينين في قلب مجفف بالهواء. عضلة القلب ملطخة باللون الأحمر ويظهر الكولاجين مع تلوين أخضر. تم تصوير أقسام الأنسجة المجاورة (B) الغائبة عن التلطيخ أو (C) الملطخة ب PMA (1٪) بإضاءة المجال الساطع لتقييم توحيد التلوين. (د) تم تصوير مقاطع الأنسجة الغائبة عن التلطيخ أو (E) الملطخة بواسطة PMA بواسطة المجهر الفلوري. اللوحات D ' (مربع أحمر صلب) و E ' (مربع أحمر متقطع) هي مناظر مكبرة لل epicardium الفرعي للأقسام غير الملطخة و PMA. الألواح D' ' (مربع أزرق صلب) و E' ' (مربع أزرق متقطع) هي مناظر موسعة مقابلة للشغاف الفرعي وألياف Purkinje التي تعمل بحرية. تشير الأسهم إلى مواقع محتوى الكولاجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحميل التروية ل PMA قبل التجفيف الهوائي والتصوير المقطعي المحوسب MicroCT . (أ) شريحة قصيرة المحور من حجم صورة أعيد بناؤها للبطينين من قلب خنزير. تشير الأسهم الزرقاء إلى الأوعية الدموية. (ب) توزيع كثافة الإشارة لشريحة الصورة من اللوحة A. LV: البطين الأيسر و RV: البطين الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التصوير المقطعي المحوسب المجهري لقلب الأغنام الذي يعاني من احتشاء عضلة القلب المزمن. (أ) تشكلت ندبة كثيفة في المنطقة القمية (انظر الصورة المضمنة). تم تعيين حجم تجسيد للمنطقة القمية من منظور الشغاف بناء على كثافة الصورة (الأحمر المقابل للأنسجة الندبية وعضلة القلب باللون الأخضر). تظهر الشرائح المتعامدة من شدة التدرج الرمادي توزيع الندبات الكثيفة وحدود عضلة القلب الباقية على قيد الحياة. الفصل بين الأنسجة الليفية وعضلة القلب يتوافق مع مناطق الأنسجة الدهنية. (ب) صورة فوتوغرافية لتحضير إسفين بطيني مجفف بالهواء من خروف مصاب بندوب قمية بعد احتشاء عضلة القلب. تعبر الشرائح المائلة لحجم صورة microCT المعاد بناؤها البطينين على المستوى المتوسط بين القاعدة والقمة والقريبة إلى موقع انسداد الأوعية الدموية (C- الخط الأحمر في اللوحة B) ، (D) المنطقة المحيطة بالاحتشاء المتاخمة للندبة الكثيفة وعضلة القلب الصحية (D- الخط الأزرق في اللوحة B) و (E) منطقة التليف الكثيف (E - الخط الأخضر في اللوحة B). (ج') عرض موسع لمنطقة الحاجز المحددة بمربع أحمر متقطع في C. (د') عرض موسع لمنطقة الاحتشاء في قمة البطين اليمنى (مربع متقطع أزرق في اللوحة D). (ه') عرض موسع لمنطقة الاحتشاء في قمة البطين الأيسر (مربع أخضر متقطع في اللوحة E). LV: تجويف البطين الأيسر. RV: تجويف البطين الأيمن. MB: فرقة المشرف. بابا: عضلة حليمية. يشير السهم الأصفر إلى الشريان الهابط الأمامي الأيسر. (و) تلطيخ ماسون ثلاثي اللون لمقطع نسيجي مقطوع من البطين الأيسر المجفف بالهواء الملطخ ب PMA. الكولاجين ملطخ باللون الأزرق وعضلة القلب ملطخة باللون الوردي / البنفسجي. (ز) قسم الأنسجة المقابل لتوزيع تلطيخ سلطة النقد الفلسطينية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صورة MicroCT لقلب الأغنام بعد الرجفان الأذيني المستحث المزمن. (أ) تجسيد حجم الأذينين مع تعيين التلوين كما في الشكل 4A. (ب) شريحة صورة التصوير المقطعي المحوسب المجهري ثنائي الأذين في المحور الطويل للقلب. تم استخراج شرائح قصيرة المحور على مستوى (C) الصمامات الأذينية البطينية (C- الخط الأحمر في اللوحة B) ، (D) الجذر الأبهري (D- الخط الأزرق في اللوحة B) و (E) السقف الأذيني الأيسر (E- الخط الأخضر في اللوحة B). لوس أنجلوس: الأذينين الأيسر. RA: الأذينين الأيمن. LAA: الزائدة الأذينية اليسرى. RAA: الزائدة الأذينية اليمنى; LV: البطين الأيسر. RV: البطين الأيمن. LVOT: مسار تدفق البطين الأيسر. RVOT: مجرى تدفق البطين الأيمن و PA: الشريان الرئوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عينة # 1 2 3 4
جنس خنزير خنزير غنم غنم
وزن الجسم (كجم) 32.4 31.2 47.2 53.4
وزن القلب (غ) 191.2 186.2 202.4 207.6
علم الأمراض - - MI المزمن الرجفان الأذيني المزمن
إعداد العينات القلب كله القلب كله إسفين القلب الأمامي القلب كله
طريقة تحميل التباين انتشار التروية انتشار انتشار
التعرض لعامل التباين (h) 48 24 48 48

الجدول 1: عينات القلب وعلاج عامل التباين.

Discussion

تم وضع بروتوكول مفصل لمستحضرات الأنسجة الكبيرة باستخدام قلوب كاملة من الثدييات الكبيرة للتصوير الهيكلي عالي الدقة اللاحق. أزال نهج تجفيف الهواء تأثيرات توهين الأشعة السينية في الخلفية وتحسين الأنسجة إلى أقصى حد: تباين الخلفية29. باستخدام هذا النهج ، تم تحقيق دقة متساوية في حدود 20 ميكرومتر للتصوير الحجمي عبر عينات يصل قطرها إلى 7.2 سم. ومع ذلك ، يعتمد MicroCT للأنسجة الرخوة عادة على استخدام عوامل تباين غير محددة لتحسين امتصاص الأشعة السينية وحساسية أنظمة microCT34. على الرغم من أن عوامل تباين الأشعة السينية تحسن التوهين العام للأشعة السينية وتعزيز تصوير الأنسجة الرخوة ، إلا أن فصل مكونات الأنسجة على أساس التركيب الكيميائي الحيوي لا يزال يمثل تحديا. ومع ذلك ، لوحظ أن استخدام القلوب المجففة بالهواء مع عامل تباين الأشعة السينية الشائع في الإعداد المختبري ، PMA ، ملطخ بشكل انتقائي مكونات خارج الخلية. تم تعزيز النسيج الضام المرتبط بعضلة القلب الصحية وإعادة التشكيل الهيكلي المرضي في الأمراض المزمنة.

تتطلب عملية تجفيف الأنسجة البيولوجية بالهواء تدخلا لمقاومة تشوه العينة. إعداد عينة للمجهر الإلكتروني له متطلبات مماثلة. عادة ، يتم استخدام طريقة تجفيف النقاط الحرجة ، والتي تستخدم توازنا بين وسط غمر الأنسجة ودرجة الحرارة والضغط للقضاء على التوتر السطحي لمحتوى السائل في الأنسجة ، والذي يسبب تشوها على المستوى الجزيئي عند التبخر35. يتطلب هذا النهج استبدالا موحدا لمحتوى الماء في العينة بثاني أكسيد الكربون السائل ، وهو أكثر موثوقية في العينات الصغيرة والقابلة للانتشار بسهولة. بدلا من ذلك ، يمكن تحسين السلامة الهيكلية للأنسجة وتجفيف الهواء ، أي يمكن تطبيق مرحلة التبخر على مدى فترة أطول لتقليل التشوه الكلي. يخضع جزيء HMDS للسيليل لتشكيل سقالة قائمة على السيليكون لتعزيز واستقرار التنظيم الجزيئي لعينة الأنسجة36. يتم إطالة أمد التبخر عن طريق الحد من التيارات الهوائية المتداولة من البيئة ، وكذلك لتجنب التبخر غير المتجانس ، خاصة بين سطح العينة والطبقات الداخلية.

تم استخدام العديد من عوامل التباين سابقا للتصوير المقطعي المحوسب للأنسجة الرخوة. الأكثر شيوعا هي اليود وحمض الفوسفوتونجستيك (PTA) و PMA. وقد استخدم اليود على وجه الخصوص بسبب ارتفاع معدل الانتشار 34،37،38. ومع ذلك ، يعمل اليود كمحفز لسيليلات كاشف HMDS36. التفاعل المحفز عدواني وطارد للحرارة ، مع وجود خطر كبير لتدمير العينة ومخاطر السلامة إذا بقيت HMDS المتبقية بسبب الجفاف غير الكامل للعينة. يمكن استخدام كل من PTA و PMA المذاب في الإيثانول بأمان بالتزامن مع HMDS. وقد ثبت أن PTA و PMA يوفران قوة حل أكبر للهياكل الدقيقة في الأقراص الفقرية غير المعدنية عند مقارنتها بتلطيخ اليود38. في التصوير المقطعي المحوسب المجهري لعينات الثدييات ، تم استخدام PTA و PMA لتلطيخ أجنة الفئران39 ، ونظام القلب والأوعية الدموية للفئران37 ، وعضلات الأرانب والدماغ40 ، والأوردة الخنازير41. PTA لديه كتلة جزيئية أعلى وكثافة في محلول من PMA. ويرجع ذلك جزئيا إلى ارتفاع الكتلة الذرية للتنغستن (العدد الذري هو 74 جم / مول) ، وهو العنصر الموهن الرئيسي في PTA. وبالمقارنة، فإن أثقل عنصر في PMA، الموليبدينوم، لديه عدد ذري يبلغ 42 جم/مول. كل من الكتلة الذرية وكثافة العينة تكمن وراء توهين الأشعة السينية ، بالإضافة إلى سمك العينة42. زيادة طول مسار الأشعة السينية عن طريق زيادة أحجام العينات، يصبح توهين الأشعة السينية أكثر حساسية لزيادة كثافة العينة. لذلك ، تم اختيار عامل تباين PMA منخفض الكثافة لتقليل خطر التوهين الزائد وتحسين النطاق الديناميكي لتباين الصور للقلوب ذات الحجم الشبيه بالإنسان. وقد أظهرت أدلة أخرى أن تحميل الانتشار من PMA يعطي تلطيخا أكثر تجانسا من الجزيء الأكبر PTA في أنسجة القلب43.

تؤثر طريقة توصيل عامل التباين على توحيد توزيع عامل التباين في أنسجة القلب (الشكل 3). أظهر تروية عوامل التباين في القلب المجفف بالإيثانول مستويات تلطيخ خلفية غير مكتملة من PMA بسبب مقاومة الأوعية الدموية المتغيرة. في القلب المجفف بالهواء ، يتم التأكيد على البنية الصفائحية للعضلات من خلال عملية تجفيف العينة ، مما يزيد من الفصل الرقائقي للعضلات. أدى ذلك في النهاية إلى تحسين النفاذية الكلية للأنسجة لتحميل عامل التباين القائم على الانتشار. ونتيجة لذلك، سهل تجفيف الهواء الأنسجة: تباين الهواء على المستويات الصفائحية وداخل الصفيحة (الشكل 4). علاوة على ذلك ، يمكن تسهيل تحميل الانتشار عن طريق التطبيق تحت فراغ. وقد تبين كذلك أن انكماش الأنسجة من العينات غير المجففة يعتمد على تركيز عامل التباين40. ومع ذلك ، فإن التثبيت المورفولوجي السابق للعينة عن طريق تجفيف الهواء يمنع آثار انكماش الأنسجة29.

تنتج صور microCT عالية الدقة لأعضاء كاملة بطبيعتها كميات كبيرة من البيانات. تتيح طبيعة تقنيات التصوير المقطعي التصور ومعالجة الصور على أساس كل شريحة على حدة ، مما يخفف من معالجة الكمبيوتر وعبء الذاكرة. ومع ذلك ، لتصور مكدسات الصور ثلاثية الأبعاد ، على سبيل المثال ، لتقديم أحجام العينات في تمثيلات ثلاثية الأبعاد ، فإن الحد الأدنى الموصى به من مواصفات الكمبيوتر هو 128 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي وسرعة المعالج 3 غيغاهرتز.

يوفر ظهور التصوير المقطعي المحوسب المصغر في مجال القلب العديد من المزايا للدراسات الانتقالية والتحقق السريري. وقد أظهرت مزايا التصوير ثلاثي الأبعاد والميكرومتري بالفعل تطبيقات في تحديد العبء الخثاري لمرضى نقص تروية عضلة القلب ST-elevation44,45. يعتمد رسم خرائط المصادر المحتملة لعدم انتظام ضربات القلب لدى مرضى أمراض القلب الهيكلية إلى حد كبير على تحديد توزيع النسيج الندبي الليفي وتوطين المسارات المتشابكة لعضلة القلب الباقية على قيد الحياة. تستخدم مناهج الخط الثاني لتشخيص عدم انتظام ضربات القلب البطيني التصوير بالرنين المغناطيسي46. يمكن أن يحدد موقع التليف الكثيف بقوة ولكنه يقتصر على التوصيف المورفولوجي منخفض الدقة ويقدم نظرة محدودة على إعادة تشكيل البنية الدقيقة والتوزيعات المنتشرة للآفات الليفية47. الفحص عالي الدقة لتوزيع الندوب وتوصيفها لديه إمكانات هائلة لتحسين فهمنا لإعادة تشكيل القلب الهيكلي وخطر الإصابة بقصور القلب. على وجه الخصوص ، ستستفيد الدراسات البحثية الأساسية أو تحقيقات ما بعد الوفاة من الصور الهيكلية الداعمة لرسم الخرائط الكهربائية لعدم انتظام ضربات القلب.

في الختام ، يمكن تلطيخ القلوب المعززة بمعالجة HMDS وتجفيف الهواء لاحقا بعامل تباين الأشعة السينية لتعزيز توهين الأشعة السينية للمكونات خارج الخلية. على وجه التحديد ، في عضلة القلب الصحية ، يحدث تراكم PMA في الظهارة ، والأنسجة الصمامية ، ومقصورات نظام التوصيل البطيني المغلف بالنسيج الضام مما أدى إلى تعزيز توهين الأشعة السينية. علاوة على ذلك ، في عضلة القلب المريضة هيكليا ، كان التباين المعزز انتقائيا أكثر للتليف.

Disclosures

اي

Acknowledgments

تلقت هذه الدراسة دعما ماليا من الحكومة الفرنسية كجزء من برنامج "استثمارات المستقبل" الذي تديره الوكالة الوطنية للبحوث (ANR) ، ومرجع المنح ANR-10-IAHU-04 ، ومؤسسة Leducq (شبكة RHYTHM) ، بالإضافة إلى مرجع المنح ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC] ، والتمويل من منطقة الأبحاث الأوروبية في أمراض القلب والأوعية الدموية (ERA-CVD) ، ومرجع المنح H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] والتمويل من المنطقة الفرنسية Nouvelle Aquitaine ، مراجع المنح 2016 - 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 و ANR-19-ECVD-0006-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Diapath F0043
Calcium chloride solution Honeywell 21114
Canulation Tubing PTFE VWR DENE3400102
Constant Head 1L Reservoir Harvard Apparatus 50-0496
D-(+)-Glucose Sigma G5767
Ethanol absolute VWR 20821.330
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma 796881
Heparin sodium (5000 U/mL) Panpharma 3400891287301.
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma 440191-1L
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% Sigma 258148
Magnesium chloride solution Honeywell 63020
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P5368
Phosphomolybdic acid hydrate Fisher Scientific 417895000
Potassium Chloride Sigma P5405
Pump Tubing, 3-Stop Ismatec FV-96328-48
SkyScan, 1276 Bruker micro CT
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium Chloride Sigma S3014
Sodium hydroxide solution 50% in H2O Sigma 415413
Tube Connector Kits Harvard Apparatus 72-1407
Tubing pump Ismatec ISM 1089
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm VWR 228-1279
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm VWR 228-1283
Two-part single-use syringes 50 mL Norm-Ject 4850001000 Pyrogen-free, PVC-free

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Srinivasan, N. T., Schilling, R. J. Sudden cardiac death and arrhythmias. Arrhythmia & Electrophysiology Review. 7 (2), 111-117 (2018).
  2. Szumowski, L., et al. Mapping and ablation of polymorphic ventricular tachycardia after myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 44 (8), 1700-1706 (2004).
  3. Bode, K., et al. Ablation of polymorphic ventricular tachycardias in patients with structural heart disease. PACE - Pacing and Clinical Electrophysiology. 31 (12), 1585-1591 (2008).
  4. Enjoji, Y., et al. Catheter ablation of fatal ventricular tachyarrhythmias storm in acute coronary syndrome-role of Purkinje fiber network. Journal of Interventional Cardiac Electrophysiology. 26 (3), 207-215 (2009).
  5. Sinha, A. M., et al. Role of left ventricular scar and purkinje-like potentials during mapping and ablation of ventricular fibrillation in dilated cardiomyopathy. PACE - Pacing and Clinical Electrophysiology. 32 (3), 286-290 (2009).
  6. Peichl, P., Čihák, R., Koželuhová, M., Wichterle, D., Vančura, V., Kautzner, J. Catheter ablation of arrhythmic storm triggered by monomorphic ectopic beats in patients with coronary artery disease. Journal of Interventional Cardiac Electrophysiology. 27 (1), 51-59 (2010).
  7. Marrouche, N. F., et al. Mode of initiation and ablation of ventricular fibrillation storms in patients with ischemic cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1715-1720 (2004).
  8. Bänsch, D., et al. Successful catheter ablation of electrical storm after myocardial infarction. Circulation. 108 (24), 3011-3016 (2003).
  9. Yokoshiki, H., Mitsuyama, H., Watanabe, M., Mizukami, K., Tsutsui, H. Suppression of ventricular fibrillation by electrical modification of the Purkinje system in hypertrophic cardiomyopathy. Heart and Vessels. 29 (5), 709-717 (2014).
  10. Agress, C. M., Rosenberg, M. J., Jacobs, H. I., Binder, M. J., Schneiderman, A., Clark, W. G. Protracted shock in the closed-chest dog following coronary embolization with graded microspheres. The American journal of physiology. 170 (3), 536-549 (1952).
  11. Bolukoglu, H., Liedtke, A. J., Nellis, S. H., Eggleston, A. M., Subramanian, R., Renstrom, B. An animal model of chronic coronary stenosis resulting in hibernating myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 20-29 (1992).
  12. Capone, R. J., Most, A. S., Sydlik, P. A. Precordial ST segment mapping. A sensitive technique for the evaluation of myocardial injury. CHEST. 67 (5), 577-582 (1975).
  13. Dib, N., Diethrich, E. B., Campbell, A., Gahremanpour, A., McGarry, M., Opie, S. R. A percutaneous swine model of myocardial infarction. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 53 (3), 256-263 (2006).
  14. Dogné, J. M., et al. Characterization of an original model of myocardial infarction provoked by coronary artery thrombosis induced by ferric chloride in pig. Thrombosis Research. 116 (5), 431-442 (2005).
  15. Eldar, M., Ohad, D., Bor, A., Varda-Bloom, N., Swanson, D. K., Battler, A. A closed-chest pig model of sustained ventricular tachycardia. Pacing and Clinical Electrophysiology. 17 (10), 1603-1609 (1994).
  16. Elzinga, W. E. Ameroid constrictor: uniform closure rates and a calibration procedure. Journal of applied physiology. 27 (3), 419-421 (1969).
  17. Hughes, G. C., Post, M. J., Simons, M., Annex, B. H. Translational physiology: Porcine models of human coronary artery disease: Implications for preclinical trials of therapeutic angiogenesis. Journal of Applied Physiology. 94 (5), 1689-1701 (2003).
  18. Lichtig, C., Brooks, H., Chassagne, G., Glagov, S., Wissler, R. W. Basic fuchsin picric acid method to detect acute myocardial ischemia. An experimental study in swine. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 99 (3), 158-161 (1975).
  19. Näslund, U., Häggmark, S., Johansson, G., Pennert, K., Reiz, S., Marklund, S. L. Effects of reperfusion and superoxide dismutase on myocardial infarct size in a closed chest pig model. Cardiovascular Research. 26 (2), 170-178 (1992).
  20. Reffelmann, T., et al. A novel minimal-invasive model of chronic myocardial infarction in swine. Coronary Artery Disease. 15 (1), 7-12 (2004).
  21. Reimer, K. A., Lowe, J. E., Rasmussen, M. M., Jennings, R. B. The wavefront phenomenon of ischemic cell death. 1. Myocardial infarct size vs duration of coronary occlusion in dogs. Circulation. 56 (5), 786-794 (1977).
  22. Salazar, A. E. Experimental myocardial infarction. Induction of coronary thrombosis in the intact closed-chest dog. Circulation research. 9, 1351-1356 (1961).
  23. Takahashi, M., et al. Effects of angiotensin I-converting enzyme inhibitor and angiotensin II type 1 receptor blocker on the right ventricular sarcoglycans and dystrophin after left coronary artery ligation. European Journal of Pharmacology. 522 (1-3), 84-93 (2005).
  24. Gonzalez-Tendero, A., et al. Whole heart detailed and quantitative anatomy,myofibre structure and vasculature from X-ray phase-contrast synchrotron radiation-basedmicro computed tomography. European Heart Journal Cardiovascular Imaging. 18 (7), 732-741 (2017).
  25. Teh, I., et al. Resolving fine cardiac structures in rats with high-resolution diffusion tensor imaging. Scientific Reports. 6, 30573 (2016).
  26. Teh, I., et al. Validation of diffusion tensor MRI measurements of cardiac microstructure with structure tensor synchrotron radiation imaging. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 19 (1), 31 (2017).
  27. Abouezzeddine, O., et al. Relevance of endocavitary structures in ablation procedures for ventricular tachycardia. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (3), 245-254 (2010).
  28. Pambrun, T., et al. Epicardial course of the septopulmonary bundle: Anatomical considerations and clinical implications for roof line completion. Heart Rhythm. 18 (3), 349-357 (2021).
  29. Pallares-Lupon, N., et al. Optimizing large organ scale micro computed tomography imaging in pig and human hearts using a novel air-drying technique. bioRxiv. , (2021).
  30. Martins, R. P., et al. Dominant frequency increase rate predicts transition from paroxysmal to long-term persistent atrial fibrillation. Circulation. 129 (14), 1472-1482 (2014).
  31. Puchtler, H., Waldrop, F. S., Valentine, L. S. Fluorescence microscopic distinction between elastin and collagen. Histochemie. 35 (1), 17-30 (1973).
  32. Walton, R. D., et al. Compartmentalized Structure of the Moderator Band Provides a Unique Substrate for Macroreentrant Ventricular Tachycardia. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (8), 005913 (2018).
  33. Di Diego, J. M., Sicouri, S., Myles, R. C., Burton, F. L., Smith, G. L., Antzelevitch, C. Optical and electrical recordings from isolated coronary-perfused ventricular wedge preparations. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 54, 53-64 (2013).
  34. Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).
  35. Mulet, A. Book Review: Modern Drying Technology, Volume 3: Product Quality and Formulation , edited by E. Tsotsas and A. S. Mujumdar. Drying Technology. 32 (2), 244-245 (2014).
  36. Karimi, B., Golshani, B. Mild and highly efficient method for the silylation of alcohols using hexamethyldisilazane catalyzed by iodine under nearly neutral reaction conditions. Journal of Organic Chemistry. 65 (21), 7228-7230 (2000).
  37. Dunmore-Buyze, P. J., et al. Three-dimensional imaging of the mouse heart and vasculature using micro-CT and whole-body perfusion of iodine or phosphotungstic acid. Contrast Media and Molecular Imaging. 9 (5), 383-390 (2014).
  38. Disney, C. M., Madi, K., Bodey, A. J., Lee, P. D., Hoyland, J. A., Sherratt, M. J. Visualising the 3D microstructure of stained and native intervertebral discs using X-ray microtomography. Scientific Reports. 7 (1), 16279 (2017).
  39. Descamps, E., Sochacka, A., de Kegel, B., Van Loo, D., Hoorebeke, L., Adriaens, D. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-ct scanning. Belgian Journal of Zoology. 144 (1), (2014).
  40. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  41. Nierenberger, M., Rémond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus - Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
  42. Speck, U. General principles of x-ray contrast media. X-Ray Contrast Media. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2018).
  43. Rajasekar, A., Trew, M. L., Sands, G. B. Understanding and enhancing the use of micro-computed tomography in soft tissue. , University of Auckland. Auckland. (2015).
  44. Karagiannidis, E., et al. Micro-CT-based quantification of extracted thrombus burden characteristics and association with angiographic outcomes in patients with ST-elevation myocardial infarction: The QUEST-STEMI Study. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 646064 (2021).
  45. Karagiannidis, E., et al. Serum ceramides as prognostic biomarkers of large thrombus burden in patients with stemi: A micro-computed tomography study. Journal of Personalized Medicine. 11 (2), 89 (2021).
  46. Hennig, A., et al. High-resolution three-dimensional late gadolinium-enhanced cardiac magnetic resonance imaging to identify the underlying substrate of ventricular arrhythmia. Europace : European Pacing, Arrhythmias, and Cardiac Electrophysiology: Journal of the Working Groups on Cardiac Pacing, Arrhythmias, and Cardiac Cellular Electrophysiology of the European Society of Cardiology. 20, 179-191 (2018).
  47. Lorgis, L., et al. Relationship between fragmented QRS and no-reflow, infarct size, and peri-infarct zone assessed using cardiac magnetic resonance in patients with myocardial infarction. Canadian Journal of Cardiology. 30 (2), 204-210 (2014).

Tags

الطب، العدد 180،
تقنيات تحضير الأنسجة للتصوير المقطعي المحوسب الجزئي المعزز بالتباين لنماذج قلب الثدييات الكبيرة المصابة بأمراض مزمنة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pallares-Lupon, N., Bayer, J. D.,… More

Pallares-Lupon, N., Bayer, J. D., Guillot, B., Caluori, G., Ramlugun, G. S., Kulkarni, K., Loyer, V., Bloquet, S., El Hamrani, D., Naulin, J., Constantin, M., Dos Santos, P., Bernus, O., Jaïs, P., Pasdois, P., Walton, R. D. Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease. J. Vis. Exp. (180), e62909, doi:10.3791/62909 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter