Utveckling av en cellkokulturmodell för att efterlikna hjärt ischemi / reperfusion in vitro

Summary

Rumsligt avstånd är en nyckelparameter för att bedöma hypoxi / reoxygeneringsskada i en samodlingsmodell av separata endotel- och kardiomyocytcellskikt, vilket för första gången tyder på att optimering av samodlingsmiljön är nödvändig för att tillhandahålla en gynnsam in vitro-modell för att testa endotelcellernas roll i kardiomyocytskydd.

Abstract

Ischemisk hjärtsjukdom är den främsta orsaken till dödsfall och funktionshinder över hela världen. Reperfusion orsakar ytterligare skada utöver ischemi. Endotelceller (ECs) kan skydda kardiomyocyter (CM) från reperfusionsskada genom cell-cellinteraktioner. Samkulturer kan hjälpa till att undersöka rollen som cell-cellinteraktioner. En blandad samodling är det enklaste tillvägagångssättet men är begränsat eftersom isolerade behandlingar och nedströms analyser av enskilda celltyper inte är möjliga. För att undersöka om ECs kan dosberoende dämpa CM-cellskador och om detta skydd kan optimeras ytterligare genom att variera kontaktavståndet mellan de två cellinjerna, använde vi Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells och Adult Mouse Cardiomyocytes för att testa tre typer av cellodlingsinsatser som varierade i deras intercellskiktavstånd vid 0,5, 1,0 respektive 2,0 mm. Endast i CM ökade cellskada enligt bedömning av laktatdehydrogenasfrisättning (LDH) signifikant under hypoxi och vidare vid reoxygenering när avståndet var 2,0 mm jämfört med 0,5 och 1,0 mm. När EG och CM var i nästan direktkontakt (0,5 mm) fanns det bara en mild dämpning av reoxygeneringsskadan hos CM efter hypoxi. Denna dämpning ökade signifikant när det rumsliga avståndet var 1,0 mm. Med 2,0 mm avstånd dämpade ECs CM-skada under både hypoxi och hypoxi / reoxygenering, vilket indikerar att tillräcklig kulturdistans är nödvändig för att ECs ska kunna överhörna med CM, så att utsöndrade signalmolekyler kan cirkulera och fullt stimulera skyddsvägar. Våra resultat tyder för första gången på att optimering av EC / CM-samkulturens rumsliga miljö är nödvändig för att tillhandahålla en gynnsam in vitro-modell för att testa EC: s roll i CM-skydd mot simulerad ischemi / reperfusionsskada. Målet med denna rapport är att tillhandahålla en steg-för-steg-strategi för utredare att använda denna viktiga modell till sin fördel.

Introduction

Ischemisk hjärtsjukdom är den främsta orsaken till dödsfall och funktionshinder över hela världen ^1,2. Behandlingsprocessen för reperfusion kan emellertid i sig orsaka kardiomyocytdöd, känd som myokardiell ischemi / reperfusion (IR) skada, för vilken det fortfarande inte finns något effektivt botemedel³. Endotelceller (EK) har föreslagits skydda kardiomyocyter (CM) genom utsöndring av parakrin signaler, liksom cell-till-cell-interaktioner⁴.

Cellodlingsmodeller har använts i stor utsträckning för att undersöka rollen av autokrina och / eller parakrina cell-cellinteraktioner på cellfunktion och differentiering. Bland samodlingsmodeller är blandad samodling den enklaste, där två olika typer av celler är i direktkontakt inom ett enda odlingsfack vid ett önskat cellförhållande⁵. Separata behandlingar mellan celltyper och nedströmsanalys av en enda celltyp är dock inte lätt genomförbara med tanke på den blandade populationen.

Tidigare studier visade att hypoxiska och ischemiska förolämpningar orsakar signifikant skada på cellmembranets integritet mätt genom frisättning av laktatdehydrogenas (LDH). Denna skada förvärras vid reoxygenering, som efterliknar reperfusionsskada ^6,7,8. Målet med det nuvarande protokollet var att testa hypoteserna att närvaron av ECs kan dosberoende dämpa cellmembranläckage av CM orsakad av hypoxi och reoxygenering (HR) och att den skyddande effekten av ECs kan optimeras genom att variera kontaktavståndet mellan de två cellinjerna. Således använde vi tre typer av cellodlingsinsatser och mus primära kranskärlsendotelceller och vuxna muskardiomyocyter. Insatserna, märkta av Corning, Merck Millipore och Greiner Bio-One gjorde det möjligt för oss att skapa tre olika cellodlingsöverhörningsförhållanden med intercellinjeavstånd på 0,5, 1,0 respektive 2,0 mm. 100 000 EP:er pläterades per insats i varje enskilt fall.

För att avgöra om densiteten hos EC i samodling bidrar till HR-skadedämpning i denna modell studerade vi dessutom dos-responsförhållandet mellan EG-koncentration och LDH-frisättning av CM. EC-ämnen pläterades till 25 000, 50 000 respektive 100 000 per insats i 2,0 mm-insatsen.

Denna rapport ger en steg-för-steg-strategi för utredare att använda denna viktiga modell till sin fördel.

Protocol

1. Experimentell beredning/plätering

1. Underhåll CM och EM enligt tillverkarens instruktioner.
   1. Tina båda cellinjerna när de kommer från leverantörer. Platta i T25-kolvar efter att ha tvättats med färska medier. Det rekommenderas att köpa varje cellodlingsmedia från samma leverantörer som cellerna köptes från. Nästa dag, uppdatera cellerna med media och använd när de är sammanflytande.
   2. Håll cellodlingsinkubatorn vid 37 °C med 21 %_O2, 5 %_CO2, 74 %_N2 och håll den fuktad.
      OBS: Musens primära kranskärlsendotelceller som används i detta protokoll isoleras från kransartärer hos C57BL / 6-möss, och vuxna muskardiomyocyter isoleras från vuxna C57BL / 6J-mushjärtan och erhålls kommersiellt (se Materialtabell).
2. Platta CM under sterila förhållanden på botten av 24-brunnsplattor (sämre lager). 24 timmar senare, platta ECs i skäret (eller överlägsen del) av samodlingsbrunnen. 24 timmar efter EG-plätering, placera EG-insatser på CM-plattbaser och starta samodlingsperioden. Låt cellerna samkulturera i minst 12-24 timmar före användning. Dessa steg beskrivs i detalj nedan.
   1. Uppskatta CM-cellinjekonfluens under ett ljusmikroskop. När celler verkar vara 90% -100% sammanflytande i odlingskolvar, fortsätt med experimentell plätering.
   2. Ta bort mediet från kolvarna som innehåller sammanflytande cellkulturer och trypsinisera med 3-5 ml trypsin/etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för T25-kolvar. Agitera kolven försiktigt, inkubera vid 37 °C i 2–5 minuter och bedöm sedan de enzymatiska framstegen under ett ljusmikroskop. När cellerna börjar runda upp, använd en cellskrapa för att lossa cellerna från ytan.
   3. Efter lossning, inaktivera trypsinlösningen genom att tillsätta trypsin/celllösningen till ett 50 ml rör innehållande 10 ml media för T25-kolvar. Centrifugera cellsuspensionen vid 120 x g i 2 min för att erhålla en mjukcellspellet. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelletsen i 5 ml media.
   4. För att utföra cellräkning och bekräfta cellens livskraft, blanda en alikvot på 10 μL resuspenderade celler och 10 μL trypanblått färgämne. Räkna de levande cellerna med hjälp av en cellräknare. Späd cellerna med färska regelbundna medier för att uppnå önskade sådddensiteter. Volymerna beräknas beroende på önskad frödensitet och cellkoncentration av stamlösningar. All plätering bör utföras under sterila förhållanden.
   5. Platta CM vid sådddensiteter på 300 000 per brunn på botten av en 24-brunnsplatta förbelagd med extracellulär matris. Håll cellerna vid 37 ° C med 21%_{O2 och} 5% CO₂ över natten.
   6. Efter 24 timmar ska plåtas ECs i skär med en optimal pläteringsdensitet på 100 000 per skär (odlingsarea är 33,6 mm²) (Figur 1). Efter 24 timmars EC-plätering, placera EC-insatser inuti CM-brunnarna och initiera samkultur. Låt celler samkulturera i 12-24 timmar innan du utför experimenten.
   7. Se till att både CM och EK har nått 80% -90% sammanflöde när experimenten utförs.

2. Hypoxi/reoxygenering för att simulera ischemi/reperfusionsskada In Vitro

OBS: Följande steg måste utföras enligt beskrivningen, pausa inte däremellan.

1. Förbered det hypoxiska mediet genom att hälla ~ 25 ml media i ett 50 ml koniskt rör. Lufttäta toppen med ett silikonmembran och använd en steriliserad pipett för att stansa ett hål. Skapa ytterligare ett hål, den här gången lämnar pipetten nedsänkt ungefär 2/3 i media.
2. Spola mediet med hypoxisk gas (0,0125%_O2, 5% CO₂, 94,99%_N2) i 5 min vid en flödeshastighet på 30 L/min. Detta minimerar_O2 upplöst i media när hypoxi börjar (steg 2.5).
3. Kassera mediet från 24-brunnsplattorna eller odlingsinsatserna som innehåller bifogade celler och tvätta med 100 μL / brunn av 10% fosfatbuffrad saltlösning (PBS) mycket försiktigt. Tillsätt därefter 500 μL av det nyberedda hypoxiska mediet till varje brunn på plattorna eller insatserna.
   OBS: Hypoxi i media avbryts så kort som möjligt under detta steg innan sann hypoxi för celler och media börjar i steg 2.5.
   1. I den normoxiska kontrollgruppen, ersätt det ursprungliga mediet med färska normala medier som innehåller glukos och serum.
4. Befukta hypoxikammaren genom att placera en petriskål fylld med sterilt vatten i kammaren. Placera sedan plattorna som består av de hypoxiska grupperna i kammaren.
5. Spola hypoxikammaren med hypoxisk gas (0,0125%_O2, 5% CO₂, 94,99%_N2) i 5 min vid ett flöde av 30 L / min. Placera kammaren i 37 ° C inkubatorn i 24 timmar.
6. Efter hypoxi, odla CM och ECs under normala förhållanden. För att göra detta, kassera det gamla mediet på plattorna/insatserna, ersätt det med normala medier (innehållande glukos och serum; 500 μL av varje brunn/insats) och förvara det i inkubatorn under normala odlingsförhållanden (21 %_O2, 5 % CO₂, 74 %_N2, 37 °C) i 2 timmar för att efterlikna reperfusion.
7. För att kontrollera eventuella effekter av mediersättning, ändra mediet för normoxiska celler samtidigt som det hypoxiska mediet ändras.
   OBS: Figur 2 ger en schematisk översikt över detta protokoll.

3. Bedömning av slutpunkt

1. Överför cellodlingsmediet från 24-brunnsplattan till en 96-brunnsplatta. Använd 200 μL media från varje brunn på 24-brunnsplattan och fördela lika i fyra brunnar på 96-brunnsplattan, i enlighet därmed. Använd en platta vardera för normoxi kontra hypoxi kontra HR.
2. Bestäm graden av cellulär skada, t.ex. genom att mäta absorbans för LDH med hjälp av ett cytotoxicitetsanalyskit enligt tillverkarens instruktioner. Utför analysen i en 96-brunnsplatta enligt instruktionerna i analysprotokollet.

4. Statistik

1. Visa parametriska data som medelvärde/standardavvikelse och icke-parametriska data som rutdiagram med median-/interkvartilintervall. Adekvata parametriska kontra icke-parametriska multipeljämförelsetester med acceptabla post-hoc-tester för att minska risken för ett typ-1-fel bör utföras. Signifikansen är vanligtvis inställd på en alfa på 0,05 (två-tailed).
2. För alla experiment som utförs i den aktuella studien, utför minst tre väl replikerade inom ett experiment. Det fanns tre till sex repetitioner av varje experiment som användes för statistisk analys.

Representative Results

Alla tre typer av insatser (A, B, C) som används i detta experiment har samma porstorlek på 0,4 μm. Den enda skillnaden mellan dem är insats-till-bashöjden, vilket gör att avstånden mellan de två samodlingade cellskikten kan vara 0,5, 1,0 respektive 2,0 mm (figur 3) och att de kommer från olika leverantörer (för detaljer se Materialtabell).

För att etablera en in vitro-samodlingsmodell med separata lager av två cellinjer som genomgår HR för att simulera IR-skada, undersökte vi cellmembranintegriteten hos CM: er som samodlingades med eller utan EG. Genom att använda en separat insats för EG som kan placeras på olika avstånd ovanför CM-skiktet kunde vi också bedöma de differentiella effekterna av cellskiktsavstånd på svårighetsgraden av membranskador i CM: erna. I en separat uppsättning experiment varierade vi densiteten hos EG och därmed förhållandet mellan EG och CM. För att skilja simulerad ischemi från simulerad IR-skada utfördes dessutom experiment under förhållanden av 1) normoxi, 2) endast hypoxi och 3) HR. För denna modell använde vi 24 h hypoxi, följt av 2 h reoxygenering.

Varierande avstånd
0,5 mm avstånd mellan cellskikten (Infoga A)
När CM odlades ensamt ledde hypoxi till en signifikant ökad LDH-frisättning jämfört med normoxi, i överensstämmelse med våra tidigare studier (figur 4A)⁶. LDH ökade dock endast milt ytterligare vid 2h-reoxygenering jämfört med gruppen med enbart hypoxi. När EG och CM samodlingades tillsammans på ett avstånd av 0,5 mm dämpades inte ökningen av LDH-frisättningen endast genom hypoxi, vilket indikerar att EG: erna inte visade någon skyddande effekt (jämfört med CM: s ensamma grupp under hypoxi-endast förhållanden). EG utövade dock ett milt men betydande skydd på CM under HR.

1,0 mm avstånd mellan cellskikten (Infoga B)
Samma experiment utfördes som ovan, förutom att avståndet mellan de två cellskikten ökades till 1,0 mm (figur 4B). Vi fann att LDH-frisättningen också ökade signifikant i CM- endast genom hypoxi. Men till skillnad från i 0,5 mm-insatsen förstärktes LDH-ökningen av endast CM av HR över endast hypoxi. Dessutom hämmades denna potentiering mer och nästan avskaffades av närvaron av EK under reoxygenering jämfört med gruppen med endast CM.

2,0 mm avstånd mellan cellskikten (Infoga C)
När samodlingsinsatser som skapar ett avstånd på 2,0 mm mellan de två cellinjerna (figur 4C) användes, fann vi också en signifikant ökning av LDH-frisättning av CM endast under hypoxi, i samma grad som i 0,5 mm- och 1,0 mm-experimenten. Intressant nog var dock den ytterligare ökningen av LDH-frisättning genom reoxygenering ännu mer uttalad än i 1,0 mm-experimenten. Båda dessa ökningar dämpades, men avskaffades inte, av närvaron av EK, vilket indikerar att ekvarna, till skillnad från att använda 0,5 eller 1,0 mm skär, avsevärt skyddade CM från skador under både hypoxi- och HR-förhållanden.

Variabla EG-intensiteter
I en annan uppsättning experiment titrerades koncentrationen av EG pläterade i 2,0 mm skär till 25 000, 50 000 respektive 100 000 celler per insats. LDH-frisättningen mättes efter 24 timmars hypoxi följt av 2 timmars reoxygenering. Våra resultat visade att ökad EG-intensitet i samkulturen ledde till en dosberoende dämpning av LDH-frisättning orsakad av HR (figur 5); ingen sådan effekt sågs under normoxiska förhållanden.

Figur 1: Schematisk insats inuti brunnen. Skären med EK (upp till 100 000 celler per insats) överförs till 24-brunnsplattorna med CM(300 000 per brunn) på botten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Experimentell design. Celler odlas under normala syreförhållanden (21%_O2) och delas sedan upp i två grupper: en normoxisk kontrollgrupp fortsätter att odlas under normala förhållanden i ytterligare 24 timmar, medan hypoxigruppen kommer att odlas i en hypoxikammare i 24 timmar med endast 0,01%_O2 och ingen glukos. Efter dessa 24 timmars interventioner uppdateras båda grupperna av celler med media och odlas kontinuerligt i en 21%_O2-miljö i ytterligare 2 timmar, reoxygeneringsfasen, innan slutpunktsanalysen eller slutpunktsanalyserna slutligen genomförs, t.ex. LDH-analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Bilder och scheman över de tre olika infogningarna. Avståndet mellan endotelcellerna i insatsen och kardiomyocyterna i botten av brunnen kan varieras genom att använda olika insatser. Alla tre typer av skär som används här har samma porstorlek på 0,4 μm. Den enda skillnaden mellan dem är insatsen till bashöjden, vilket gör att avstånden mellan de två samodlingade cellskikten kan vara 0,5 (A), 1,0 (B) respektive 2,0 mm (C). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Jämförelse av tre typer av odlingsinsatser vid bedömning av frisättningen av laktatdehydrogenas (LDH; i absorbansenheter [au]) under normoxisk (vänster), endast hypoxi (centrum) och hypoxi/reoxygeneringsförhållanden (höger) för enbart kardiomyocyter (CM; vita), endotelceller ensamma (EC; svart) och samkulturer av CM med EC (kontrollmönster). (A) 0,5 mm avstånd, (B) 1,0 mm avstånd, (C) 2,0 mm avstånd mellan de två olika cellskikten. ECs pläterades med en densitet av 100 000 celler per insats, CM med en densitet av 300 000 celler per brunn. Data är medelvärde ± standardavvikelse, n = 4 per grupp. Statistik: ANOVA följt av Student-Newman-Keuls post-hoc-test. P < 0,05 (tvåstjärtad) indikerad med horisontella staplar mellan varje jämfört par. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Koncentration av samodlade endotelceller (EC; 25: 25 000 celler per insats; 50: 50 000 celler per insats; 100: 100 000 celler per insats) dosberoende påverkat skydd av kardiomyocyter (CM) mot hypoxi/reoxygeneringsskada (höger) jämfört med normoxiska tillstånd (vänster), vilket framgår av frisättning av laktatdehydrogenas (LDH; i absorbansenheter [au]). ECs hade ingen effekt på LDH-frisättning under normoxiska förhållanden. Data är medelvärde ± standardavvikelse, n = 4 per grupp. Statistik: ANOVA följt av Student-Newman-Keuls post-hoc-test. P < 0,05 (tvåstjärtad) indikerad med horisontella staplar mellan varje jämfört par. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Kritiska steg i protokollet
Cellkokulturmodeller har använts för att studera cellulära mekanismer för hjärtskydd. Hur man skapar två separata lager med ett meningsfullt avstånd mellan dem är därför avgörande för utvecklingen av en lämplig samkulturmodell. En utmaning med att studera simulerad IR, dvs HR, skada är att inte bara ischemi (hypoxi) i sig utan också reperfusion (reoxygenering) förvärrar cellulär dysfunktion. Därför måste en realistisk modell återspegla dessa egenskaper genom att till exempel visa tillräckligt ökad skada genom reoxygenering efter hypoxi i motsats till enbart hypoxi, men ändå tillåta dämpning av skada med cellskyddande läkemedel eller strategier som, i vårt fall, förekomsten av EG. Intressant nog verkar avståndet mellan de två cellskikten spela en viktig roll för att utveckla en lämplig samodlingsmodell. Vi kunde visa att ett avstånd på 1,0 mm och 2,0 mm mellan EG och CM tillät det förväntade HR-skadesvaret, men ännu viktigare, att endast 2,0 mm gav ett konsekvent gynnsamt resultat för cellulärt skadeskydd genom närvaron av EG under både hypoxiska och HR-förhållanden.

Ändringar och felsökning av metoden
Cell-cellinteraktioner i samodlingsmodeller påverkas av flera variabler såsom antalet distinkta samkulturerade populationer, graden av likhet mellan celltyperna, graden av fysisk separation mellan dem, skillnaden mellan befolkningens lokala miljöer, kulturvolymen och tidshänsyn av samkulturen 9,10,11,12 . Det finns avvägningar mellan dessa faktorer. Dessa interaktioner påverkas starkt av miljön, som i sin tur bestäms av protokollet och upplägget. Det är viktigt att utveckla experimentella modeller som är replikerbara, mätbara och jämförbara. Vårt tillvägagångssätt var att kontrollera och begränsa antalet variabler som kan störa konsistensen av de data som erhållits från olika experiment utförda vid olika tidpunkter genom plätering av ett exakt antal celler, med samma förhållande mellan två samodlingslinjer, samma volymer av cellodlingsmediet och analysreagenser etc., med undantag för de tre olika cellodlingsinsatserna.

Begränsningar av metoden
Vår modell fungerar bra med ECs och CMs, sannolikt på grund av den allestädes närvarande närvaron av ECs i hjärt-kärlsystemet. Hur väl andra typer av cellinjer av potentiellt intresse interagerar med CM, neuroner eller andra celler av intresse som ska studeras in vitro är ännu inte utvärderat eftersom olika cellinjer kan interagera olika i samodlingsmiljön. En skillnad mellan de samodlingade cellpopulationerna kan vara deras ekologiska förhållande, t.ex. om de är naturliga konkurrenter eller kooperatörer. Liksom i alla andra in vitro-cellmodeller kanske den genererade cellulära skadan i experimentet inte representerar det faktiska patofysiologiska tillståndet för skada in vivo. Dessutom är vi medvetna om att de testade avstånden mellan CC och CM på 0,5, 1,0 och 2,0 mm inte återger deras avstånd in vivo. för den givna in vitro-modellen , Våra resultat beskriver dock konsekvenserna av optimal distansering mellan två celllager som ska studeras av forskare som vill dra nytta av denna teknik.

Metodens betydelse med avseende på befintliga/alternativa metoder
De befintliga/alternativa samodlingsmetoderna innefattar direkt blandning av cellinjer eller skapande av separerad miljö med en grad av separation, såsom användning av transbrunnsplattor¹³, mikrofluidiska plattformar¹⁴ eller tredimensionella byggnadsställningar¹⁵, bland vilka transbrunnsplattor är de billigaste och enklaste tillgängliga. Trots naturliga begränsningar är samkulturer mycket relevanta för läkemedelsforskning eftersom de ger en mer representativ in vivo-liknande vävnadsmodell och möjliggör testning med hög genomströmning och djupgående övervakning av läkemedelseffekter på cell-cellinteraktioner¹⁶. Vår modell kalibrerades exakt med hjälp av väldefinierade rumsliga avstånd mellan EG och CM, istället för en komplett och okontrollerad blandning av två olika typer av celler. Dessutom tillåter denna modell separata behandlingar och analyserar enskilda typer av celler, vilket är omöjligt att uppnå i en blandad samkultur, för att inte tala om in vivo. Eftersom IR-skada involverar separata HR-processer är denna modell väl lämpad för att studera de cellulära mekanismerna för ischemi / hypoxi vs reperfusion / reoxygeneringsskada separat. Våra data tyder på att det kan vara en mycket värdefull och effektiv cellsamodlingsmodell som ska användas i simulerade IR-skadestudier. Våra observationer visar tydligt att ett optimalt rumsligt avstånd, i vårt fall 2,0 mm, är nödvändigt för att ECs ska kunna överhörna med CM i denna specifika samodlingsmodell, så att potentiellt utsöndrade signalmolekyler från EK: erna kan cirkulera effektivt till olagligt skydd av CM mot skada av endast hypoxi och / eller HR.

Metodernas betydelse och potentiella tillämpningar inom specifika forskningsområden
Vår modell indikerar betydelsen av att kombinera muskranskärls-ECs med mus-CM för att förbättra utredningen av skyddsåtgärder mot HR-skada; att varierande rumsligt avstånd för samkulturer visar ett effektivt sätt att bättre förstå de rumsliga förhållanden som påverkar EK: s skyddsåtgärder vid CM-skador orsakade av HR; och att tätheten av EC eller förhållandet mellan EG och CM är positivt korrelerat med omfattningen av skyddet mot personskador.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested