Summary
इस प्रोक्टोल का उद्देश्य इन विट्रो और वीवो माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग इन एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में एक विधि प्रदान करना है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + साइटोसोलिक सीए2 + बफरिंग, ऊर्जा चयापचय और सेलुलर सिग्नल ट्रांसडक्शन को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + की ओवरलोडिंग न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में न्यूरोडिजेनरेशन और एपोप्टिक सेल डेथ सहित विभिन्न रोग स्थितियों में योगदान देती है। यहां हम एस्ट्रो में और वीवो में एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग के लिए आणविक दृष्टिकोण को लक्षित करने वाले सेल-प्रकार विशिष्ट और माइटोकॉन्ड्रिया प्रस्तुत करते हैं। हमने डीएनए प्लाज्मिड्स एन्कोडिंग माइटोकॉन्ड्रिया-टार्गेटिंग जेनेटिकली एन्कोडेड सीए2 + संकेतक (जीईसीआई) GCaMP5G या GCaMP6s (GCaMP5G/6s) का निर्माण किया, जिसमें एस्ट्रोसाइट और न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटर gfaABC1D और CaMKII और mitochondria-targeting (mito-) के साथ । इन विट्रो माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग के लिए, प्लाज्मिड को GCaMP5G/6s व्यक्त करने के लिए सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में संक्रमित किया गया था। वीवो माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग में, एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर (एएवी) को एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया में GCaMP5G/6s व्यक्त करने के लिए तैयार किया गया था और माउस दिमाग में इंजेक्ट किया गया था। हमारा दृष्टिकोण एस्ट्रोसॉलिक और माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + सिग्नलिंग के साथ-साथ एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शन के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + गतिशीलता को छवि देने के लिए एक उपयोगी साधन प्रदान करता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया गतिशील उपकोशिकीय ऑर्गेनेल्स हैं और ऊर्जा उत्पादन के लिए सेल पावरहाउस के रूप में माने जाते हैं। दूसरी ओर, माइटोकॉन्ड्रिया स्थानीय या साइटोसोलिक सीए2 + उगता के जवाब में मैट्रिक्स के लिए सीए2 + ले जा सकते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को प्रभावित करता है, जिसमें मेटाबॉलिक प्रक्रियाएं शामिल हैं जैसे ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड (टीसीए) चक्र और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन में प्रतिक्रियाएं, और शारीरिक परिस्थितियों1,2,3,4 के तहत सीए2 +-संवेदनशीलप्रोटीन कोनियंत्रितकरता है। माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + ओवरलोडिंग भी कोशिका मृत्यु के लिए एक निर्धारक है, जिसमें विभिन्न मस्तिष्क विकारों में परिगलन और एपोप्टोसिस शामिल हैं5,6,7। यह माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्रों (एमपीटीपी) के उद्घाटन और कैस्पे कोफैक्टर की रिहाई का कारण बनता है, जो एपोप्टोटिक सेल डेथ शुरू करता है। इसलिए, सेलुलर फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी को बेहतर ढंग से समझने के लिए जीवित कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + गतिशीलता और हैंडलिंग का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है।
माइटोकॉन्ड्रिया सीए2 + तेज और efflux के बीच एक संतुलन के माध्यम से मैट्रिक्स Ca2 + होमोस्टेसिस बनाए रखते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + यूनिपोर्टर्स (एमसीयू) द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जबकि माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + एफ्लक्स को ना +-सीए2 +-ली+ एक्सचेंजर्स (एनसीएलएक्स) और एच +/Ca2 + एक्सचेंजर्स (mHCXs)8द्वारा मध्यस्थता की जाती है। जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) 9 की उत्तेजना के माध्यम से संतुलन को बेफिक्र किया जासकताहै । माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + होमोसटासिस भी अघुलनशील xCa2 +-xPO 4 x-xOH परिसरों 8 केगठनसे माइटोकॉन्ड्रियल बफरिंग से प्रभावित है ।
सीए 2 + एकाग्रता ([सीए2 + +]) में इंट्रासेलुलर और माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तनों का मूल्यांकन फ्लोरोसेंट या ल्यूमिनेसेंट सीए2 + संकेतकों द्वारा किया जा सकता है। Ca2 + संकेतकों के लिए बाध्यकारी स्पेक्ट्रल संशोधनों का कारण बनता है, जो जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में मुफ्त सेलुलर [सीए2 +] की रिकॉर्डिंग करने की अनुमति देता है। कोशिकाओं में सीए2 + परिवर्तनों की निगरानी के लिए वर्तमान में दो प्रकार की जांच उपलब्ध है: कार्बनिक रासायनिक संकेतक और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतक (जीईसीआई)। आम तौर पर, विभिन्न सीए2 + एफ़िनिटीज (केडीके आधार पर), स्पेक्ट्रल गुण (उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य), गतिशील पर्वतमाला, और संवेदनशीलता के साथ विभिन्न वेरिएंट जांच के तहत जैविक प्रश्नों के लिए उपलब्ध हैं। यद्यपि साइटोसोलिक सीए2 + इमेजिंग के लिए कई सिंथेटिक ऑर्गेनिक सीए2 + संकेतकों का उपयोग किया गया है, लेकिन माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग के लिए माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में केवल कुछ ही चुनिंदा रूप से लोड किए जा सकते हैं, जिसमें रोड-2 सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है (समीक्षा के लिए10,11देखें)। हालांकि, रोड-2 में लंबे समय तक चलने वाले प्रयोगों के दौरान रिसाव की एक बड़ी खामी है; इसके अलावा, इसे माइटोकॉन्ड्रिया, अन्य ऑर्गेनेल्स और साइटोसोल के बीच विभाजित किया जाता है, जिससे विभिन्न उपविभाग में पूर्ण माप मुश्किल हो जाता है। इसके विपरीत, सेल-प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों और उपकोशिकीय डिब्बे लक्ष्यीकरण दृश्यों का उपयोग करके, जीईसीआई को सेल-और कंपार्टमेंट-विशिष्ट सीए2 + इमेजिंग इन विट्रो या वीवो के लिए विभिन्न सेल प्रकारों और उपकोशिकीय डिब्बों में व्यक्त किया जा सकताहै। एकल तरंगदैर्ध्य फ्लोरेसेंस तीव्रता आधारित जीसीएएमपी सीए2 + संकेतक हाल ही में प्रमुख जीईसीआई12, 13, 14,15,16के रूप में उभरे हैं। इस लेख में, हम एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में GCaMP5G और GCaMP5G/6s की माइटोकॉन्ड्रिया-टार्गेटिंग और सेल-प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इन सेल प्रकारों में तेज करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया में GCaMP6G/6s की अभिव्यक्ति का पता चला जा सकता है, और एकल माइटोकॉन्ड्रियल रिज़ॉल्यूशन में सीए2 + तेज को एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स इन विट्रो और वीवो मेंप्राप्त किया जा सकता है।
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Protocol
मिसौरी-कोलंबिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा जानवरों से जुड़ी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई है ।
1. डीएनए प्लाज्मिड का निर्माण
नोट: इन विट्रो और वीवो इमेजिंग में, डीएनए प्लाज्मिड्स एस्ट्रोसाइट-और न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटरों और माइटोकॉन्ड्रियल टार्गेटिंग दृश्यों के साथ GCaMP5G/6s एन्कोडिंग कर रहे हैं ।
- माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स (एमएम) को लक्षित अनुक्रम (मिंटो-) एटीजीटी सीसीजीटीसीटीसीजीसीटीसीजीटीसी जीटीसीजीजीसीसीएए गैटैकटीसीजीटीसी टीटीजी टीसीटीसी टीटीजी1 7 एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) प्लाज्मिड पीज़ाक 2.1 की रीढ़ में क्लोनिंग साइटों इकोरी और बाम्ही में एस्ट्रोसाइटिक गफाबीसी 1 डी प्रमोटर या न्यूरोनल कामकेआईआई प्रमोटर18,19,20वाले प्लाज्मिड प्राप्त करने के लिए।
- क्लोनिंग साइटों में सबक्लोन GCaMP5G/6s, बाम I और उपरोक्त प्लाज्मिड्स में 1 नहीं नए प्लाज्मिड्स pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G प्राप्त करने के लिए /6s और pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s कि एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स20, 21 (चित्रा 1A)में माइटोकॉन्ड्रिया में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति लक्ष्य ।
- इन विट्रो अध्ययन (धारा 2) के लिए ट्रांसफैक्शन के लिए pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G और pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s डीएनए प्लाज्मिड्स तैयार करें। वीवो अध्ययन18 (धारा 3) में के लिए न्यूरॉन्स के लिए एस्ट्रोसाइट्स और सेरोटाइप 9 के लिए सेरोटाइप 5 के साथ एएवी वैक्टर का उत्पादन करें।
2. इन विट्रो माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग इन एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स
- E15-16 भ्रूण 18,22, 23, 24के प्रांतस्थासे पी 1 नवजात चूहों और प्राथमिक न्यूरॉन्स के प्रांतस्था से प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स तैयार करें, और उन्हें 12 मिमी व्यास ग्लास पर संस्कृति दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) का उपयोग करके 24-अच्छी प्लेटों में कवरलिप्स जिनमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और न्यूरोनल बेसल माध्यम (एनबीएम) 2% B27 युक्त हैं, क्रमशः।
- न्यूरॉन्स 18,20,21के माइटोकॉन्ड्रिया में एस्ट्रोसाइट्स और जीसीएएमपी5जी के माइटोकॉन्ड्रिया में GCaMP6s व्यक्त करने के लिए लिपिड आधारित ट्रांसफैक्शन रीएजेंट का उपयोग करके pZac-gfaABC1D-GCaMP6s और pZac-CaMKII-GCaMP5G प्लाज्मिड्स के साथ ट्रांसफेक्ट परिपक्व एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स। प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं को डीएनए के 0.5 माइक्रोग्राम के साथ स्थानांतरित करें, और बाद में माध्यम 6 घंटे बदलें।
नोट: एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स ट्रांसफैक्शन के 1-2 दिन बाद इमेजिंग के लिए तैयार हैं। - ट्रांसफैक्शन के1-2 दिन बाद विट्रो माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 + इमेजिंग में प्रदर्शन करें।
- एस्ट्रोसाइट्स या न्यूरॉन्स के साथ सुसंस्कृत ग्लास कवरस्लिप को एक एपिफ्लोरेसेंस या दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत पीएच-1 परफ्यूजन कक्ष में स्थानांतरित करें।
- एसीएसएफ में 100 माइक्रोन एटीपी के साथ एस्ट्रोसाइटिक माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज को उत्तेजित करें, या 100 माइक्रोन ग्लूटामेट/10 माइक्रोन ग्लाइसिन20,25 (चित्र 2 और चित्रा 3)के साथ न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया को उत्तेजित करें।
नोट: एसीएसएफ से एटीपी-और ग्लूटामेट/ग्लाइसिन युक्त एसीएसएफ में समाधान परिवर्तन एक ALA-VM8 परफ्यूजन सिस्टम21द्वारा नियंत्रित किए जाते हैं । समाधान परिवर्तन की गति एक वाल्व को समायोजित करके 1-2 मिलीलन/मिनट पर नियंत्रित की जाती है।
3. विवो माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग में एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में
- एएवी की तैयारी।
- धारा 1 में तैयार डीएनए प्लाज्मिड्स का उपयोग करके निम्नलिखित रिकॉम्बिनेंट एडेनो-संबद्ध वायरस (आरएवी) वैक्टर तैयार करें: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G और rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s वेक्टर ।
नोट: इस प्रयोग में, एस्ट्रोटाइप 5 के आरएवी वैक्टर एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रिया में GCaMP5G व्यक्त करने के लिए तैयार किए गए थे और सेरोटाइप 9 के आरएवी वैक्टर को न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया में GCaMP6s व्यक्त करने के लिए तैयार किया गया था।
- धारा 1 में तैयार डीएनए प्लाज्मिड्स का उपयोग करके निम्नलिखित रिकॉम्बिनेंट एडेनो-संबद्ध वायरस (आरएवी) वैक्टर तैयार करें: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G और rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s वेक्टर ।
- स्टीरियोटैक्सिक एएवी इंजेक्शन।
- माउस को 3% आइसोफ्लुनान के साथ एनेस्थेटाइज करें।
नोट: बाद में सर्जरी के दौरान, आइसोफ्लुने का स्तर 2% तक कम हो जाता है। - माउस संज्ञाहरण के एक शल्य स्तर तक पहुंचने के बाद, के रूप में पूंछ और अंगुली चुटकी द्वारा निर्धारित, सर्जरी साइट, मोटर या सोमाटोसेंसरी प्रांतस्था पर बाल दाढ़ी, एक बाल ट्रिमर के साथ ।
- माउस स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस पर माउस की स्थिति और कान सलाखों के साथ सिर को ठीक करें। सर्जरी के दौरान इनकी सुरक्षा के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं। सर्जरी के दौरान माउस के शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए हीटिंग पैड का इस्तेमाल करें।
नोट: एसेप्टिक प्रक्रियाओं का उपयोग कर सर्जरी करें। सभी सर्जिकल उपकरणों को या तो ऑटोक्लेविंग या एक गर्म मनका स्टरलाइजर द्वारा निष्फल करने की आवश्यकता होती है। - माउस को स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस पर चढ़ने के बाद, बारी आयोडीन आधारित स्क्रब और 70% इथेनॉल तीन बार के साथ खोपड़ी को निष्फल करें। इंजेक्शन साइट का पर्दाफाश करने के लिए खोपड़ी के मिडलाइन में एक चीरा बनाएं।
- कट ब्रेग्मा-लैमडा अक्ष में त्वचा को खोलें और मोटर या सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स के इच्छित इंजेक्शन स्थान पर उच्च गति ड्रिल के साथ ~ 1 मिमी व्यास बर्र होल बनाएं।
- एडेनो से जुड़े वायरस वाले 33 जी हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करें (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G वैक्टर [1 x 1011 जीसी ] या rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s वैक्टर [1 x 1011 जीसी]) लक्ष्य क्षेत्र में वायरस के 1 μL तक इंजेक्ट करने के लिए ।
नोट: उदाहरण के लिए, कॉर्टिकल वायरल डिलीवरी के लिए, वायरस समाधान को कई चरणों में दो गहराई पर इंजेक्ट करें। सबसे पहले, दुरा से 1 मिमी की गहराई तक सुई डालें और मस्तिष्क को ठीक करने के लिए 5 मिनट की अनुमति दें। फिर, सुई को ~700 माइक्रोन गहराई तक ले जाएं और माइक्रोसिरिंग पंप कंट्रोलर द्वारा नियंत्रित हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करके 10 एनएल/एस की एक इंजेक्शन गति से वायरस समाधान के 500 एनएल इंजेक्ट करें। इंजेक्शन पूरा होने के बाद, वायरस को मस्तिष्क में फैलाना करने की अनुमति देने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। फिर, सुई को 300 माइक्रोन की गहराई पर दूसरे इंजेक्शन स्थान तक ले जाएं। यहां, वायरस समाधान का एक अतिरिक्त 500 nL इंजेक्ट करें। वायरस को मस्तिष्क में फैलाना करने की अनुमति देने के लिए 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें। - एक ऊतक चिपकने वाला का उपयोग कर खोपड़ी और त्वचा को बंद करें। चूहों को हीटिंग पैड पर ठीक होने दें। वसूली के बाद चूहों को पशु सुविधा के लिए वापस भेजें।
- माउस को 3% आइसोफ्लुनान के साथ एनेस्थेटाइज करें।
- कपाल-खिड़की इंस्टॉलेशन और वीवो टू-फोटॉन (2-पी) इमेजिंग में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + सिग्नल।
नोट: कपाल खिड़की प्रत्यारोपण मोटर या सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स26 , 27 , 28,29पर एएवी इंजेक्शन के 3 सप्ताह बाद कियाजाताहै । सर्जरी से पहले संभावित दर्द से राहत प्रदान करने के लिए कारप्रोफेन (10 मिलीग्राम/किलो) को चमड़े के इंजेक्शन दिया जाता है । कपाल खिड़की शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं एएवी इंजेक्शन शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के समान हैं और aseptic परिस्थितियों में किया जाता है।- माउस को 3% आइसोफ्लुनान के साथ एनेस्थेटाइज करें।
नोट: यह प्रारंभिक खुराक है और बाद में सर्जरी के लिए 2% तक कम हो जाती है। इमेजिंग के दौरान एनेस्थीसिया के लिए 130 एमजी केटामाइन/10 एमजी जाइलाज़ीन/किलोग्राम शरीर के वजन का इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन लगाया जाता है। - माउस स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस पर माउस की स्थिति और कान सलाखों के साथ सिर को ठीक करें। आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं। सर्जरी के दौरान माउस के शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए हीटिंग पैड का इस्तेमाल करें।
नोट: सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों को निष्फल करने की आवश्यकता है। - खोपड़ी के मिडलाइन में 5-8 मिमी लंबा चीरा लगाएं और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके त्वचा का एक पल्ला हटा दें।
- खोपड़ी के उजागर होने के बाद, वायरस इंजेक्शन क्षेत्र (यानी, मोटर कॉर्टेक्स या सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स, चित्रा 1B) पर एक उच्च गति ड्रिल का उपयोग करके 2.0-3.0 मिमीव्यास क्रैनिओटॉमी करें। सबसे पहले, चार छोटे छेद बनाते हैं, और फिर छेद को जोड़ने वाले सर्कल में ड्रिल करते हैं। इसके बाद तेज कैंची से हड्डी को उठाकर निकाल लें। उजागर ड्यूरा मेटर को हटाया जा सकता है या कपाल खिड़की के आवेग के लिए बरकरार रखा जा सकता है।
- क्रैनिओटॉमी पर एक पारदर्शी सिलिकॉन ले जाने वाले व्यास में 3-5 मिमी का ग्लास कवरलिप रखें। कपाल खिड़की को धीरे-धीरे मस्तिष्क की सतह पर धकेलने के लिए टूथपिक का प्रयोग करें। फिर, सिलिकॉन चिपकने वाली थोड़ी मात्रा के साथ किनारे को सील करें।
नोट्स: वैकल्पिक रूप से, सिलिकॉन डिस्क के बजाय, कवर ग्लास और मस्तिष्क ऊतक के बीच 1.2% कम पिघलने वाले बिंदु एगर उठे जेल का उपयोग किया जा सकता है। - अंत में, डेंटल सीमेंट के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें। मजबूत बॉन्डिंग के लिए कपाल खिड़की के किनारे पर सीमेंट को थोड़ा-थोड़ा लगाने का ध्यान रखें। दंत सीमेंट के साथ खोपड़ी के लिए एक कस्टम निर्मित धातु सिर प्लेट संलग्न करें।
नोट: धातु की प्लेट का उपयोग इमेजिंग सत्र(चित्रा 1C)के दौरान माउस के सिर को 2-पी माइक्रोस्कोप के चरण में ठीक करने के लिए किया जाता है। - इमेजिंग के दौरान पानी विसर्जन के लिए कपाल खिड़की पर कवरस्लिप पर ACSF समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें।
- कपाल खिड़की(चित्रा 1C)18, 20,27के माध्यम से 910 एनएम तरंगदैर्ध्य के साथ न्यूरॉन्स में एस्ट्रोसाइट्स और मिटो-जीसीएएमपी 6एस में मिटो-जीएएमपी5जी की वीवो 2-पीइमेजिंग में समय-चूक करें।
नोट: इमेजिंग के दौरान, चूहों शारीरिक तापमान बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड पर हैं। इमेजिंग सत्र पूरा होने के तुरंत बाद चूहों की बलि दी जाएगी। - कोलोकैलाइजेशन निर्धारित करने के लिए आवश्यक होने पर सल्फोरहोडामाइन 101 (एसआर101) के साथ वीवो में एस्ट्रोसाइट्स लेबल करें।
- चरण 3.3.4 के अंत में, 1-5 मिनट के लिए कॉर्टिकल सतह पर ACSF में 100 माइक्रोन 100 माइक्रोन एसआर 101 लागू करें।
- अनबाउंड SR101 को धोने के लिए ACSF के साथ सतह कुल्ला। 2-पी इमेजिंग का उपयोग करना, एस्ट्रोसाइट्स में मिटो-जीएमपी5जी और एसआर 101 की सह-लेबलिंग 45-60 मिनट बाद(चित्रा 4A)देखी जा सकती है।
- माउस को 3% आइसोफ्लुनान के साथ एनेस्थेटाइज करें।
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Representative Results
इस अध्ययन का उद्देश्य एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स इन विट्रो और वीवोमें जीईसीआई का उपयोग करके छवि माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + संकेतों को एक पद्धति प्रदान करना था। इन विट्रो और वीवो माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग दोनों के परिणाम यहां प्रस्तुत किए गए हैं।
इन विट्रो माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में सिग्नलिंग
एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज एटीपी एप्लिकेशन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, और न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज को पर्फ्यूजन सिस्टम के माध्यम से ग्लूटामेट और ग्लाइसिन एप्लिकेशन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। चित्रा 2 और चित्रा 3 शो GCaMP6s क्रमशः न्यूरॉन्स में सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स और GCaMP5G में व्यक्त किया जाता है। एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज को एकल माइटोकॉन्ड्रियल रिज़ॉल्यूशन(चित्रा 2B-D)के साथ 100 माइक्रोनएम एटीपी द्वारा प्राप्त किया गया था। न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + अपेक्स को एकल माइटोकॉन्ड्रियल रिज़ॉल्यूशन(चित्रा 3B-D)के साथ 100 माइक्रोन ग्लूटामेट और 10 माइक्रोन ग्लाइसिन द्वारा प्राप्त किया गया था।
एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में GCaMP5G या 6S की माइटोकॉन्ड्रियल अभिव्यक्ति की वीवो 2-पी इमेजिंग में
इमेजिंग एक अल्टिमा 2-पी माइक्रोस्कोप प्रणाली के साथ एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरेसेंस संकेतों के वीवो 2-पी इमेजिंग में समय-चूक एकत्र करके किया जाता है। हम 880-910 एनएम उत्तेजन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें। चित्रा 4 माउस कॉर्टेक्स में एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रिया में GCaMP5G की अभिव्यक्ति दिखाता है। GCaMP5G की एस्ट्रोसाइट-विशिष्ट अभिव्यक्ति की पुष्टि GCaMP5G के साथ SR101 के कोलोकैलाइजेशन द्वारा की गई थी, जिसमें एकल माइटोकॉन्ड्रियल रिज़ॉल्यूशन(चित्रा 4 ए)और व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया में सहज सीए2 + परिवर्तन देखे जा सकते हैं(चित्रा 4B-ई)। चित्रा 5A न्यूरोनल मार्कर न्यून के साथ कोलोकैलाइज्ड मिटो-जीसीएएमपी 6एस की न्यूरॉन-विशिष्ट अभिव्यक्ति दिखाता है। न्यूरॉन्स में मिटो-जीसीएएमपी 6एस का फ्लोरेसेंस डेन्ड्रिट्स(चित्रा 5B)में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान दिखाता है। डेंड्राइट्स में सहज माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + वृद्धि देखी जा सकतीहै (चित्रा 5C-F)।
माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + संकेतों का विश्लेषण
एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में सेल शरीर या व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के मतलब पिक्सेल तीव्रता की गणना करके फ्लोरोसेंट संकेतों की मात्रा निर्धारित करें। Ca2 + परिवर्तन ओवरटाइम (टी) एफ/फो (टी) मूल्यों बनाम समय के रूप में व्यक्त किए जाते हैं, जहां एफओ पृष्ठभूमि घटाया बेसलाइन फ्लोरेसेंस है और एफ बेसलाइन घटाया फ्लोरेसेंस परिवर्तन20,21है । Ca 2 + संकेतों के आयाम की तुलना करने के लिए चोटीएफ/फो मूल्यों का उपयोग करें।
चित्रा 1:एस्ट्रोसाइट-और न्यूरॉन-विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रिया-टार्गेटिंग ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के लिए डीएनए निर्माण, और वीवो 2-पी इमेजिंग में। (ए)पीजेडएबीसी1 डी (अप) और केएमकेआईआई (कम) प्रमोटरों के साथ पीजेडएसी 2.1 प्लाज्मिड में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2+ संकेतक GCaMP5G या GcaMP6s का डीएनए निर्माण क्रमशः एस्ट्रोसाइटिक और न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स को डिलीवरी के लिए। माइटोकॉन्ड्रिया-लक्ष्यीकरण फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एन-टर्मिनस से संलग्न माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स (एमएम) विशिष्ट अनुक्रम (माइटो) का उपयोग करके हासिल किया जाता है। (ख)माउस के कॉर्टेक्स पर एक क्रेनिओटॉमी। (ग)माउस की खोपड़ी 2-पी माइक्रोस्कोप के चरण पर तय पोस्ट से जुड़ी धातु की प्लेट से जुड़ी होती है । इनसेट खोपड़ी से जुड़ी धातु की प्लेट के साथ कपाल खिड़की दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स की माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग। (ए-बी)एक एस्ट्रोसाइट की 2-पी छवि, जो मिटो-जीसीएएमपी 6एस(ए)व्यक्त करती है और संकेतित समय(बी)पर 100 माइक्रोनएम एटीपी की उत्तेजना के प्रति इसकी प्रतिक्रिया है। (ग)एटीपी उत्तेजना के बाद अलग-अलग समय पर चार व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया (ए, सर्कल में) में मिटो-जीसीएएमपी 6एस की छवियां। (घ)एटीपी उत्तेजना के बाद चार व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया में मिटो-जीसीएएमपी6एस फ्लोरेसेंस के समय पाठ्यक्रम, एएफ/एफओ के रूप में प्लॉट किए गए हैं। लाल तीर इमेजिंग के शुरुआती समय को इंगित करता है। छद्म रंग का पैमाना इस और अन्य आंकड़ों में फ्लोरेसेंस तीव्रता का एक रैखिक प्रतिनिधित्व है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग। (A-B) माइटो-जीसीएएमपी5जी की 2-पी छवि जो न्यूरॉन(ए)को व्यक्त करती है और संकेत समय(बी)पर 100 माइक्रोन ग्लूटामेट और 10 माइक्रोन ग्लाइसिन के लिए इसकी प्रतिक्रिया है। (ग)ग्लूटामेट उत्तेजना के बाद अलग-अलग समय पर चार व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया (ए, सर्कल में) में मिटो-जीएएमपी5जी की छवियां। (घ)माइटो-जीसीएएमपी5जी फ्लोरेसेंस के समय पाठ्यक्रम चार व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया में बदलते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए 2 + सिग्नलिंग के वीवो 2-पी इमेजिंग में। (A)2-P छवियां मिटो-जीसीएएमपी5जी एसआर101 के साथ एस्ट्रोसाइट्स कोल्टोकैलाइज्ड। (B-C)सहज सीए 2 + वृद्धि के विश्लेषण के लिए mito-GCaMP5G व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट की2-पी छवि। (सी-ई) एस्ट्रोसाइट (बी, सर्कल में) में चार व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया में मिटो-जीसीएएमपी5जी की छवियां अलग-अलग समय (सी) और मिटो-जीसीएएमपी5जी फ्लोरेसेंस परिवर्तनों के समय पाठ्यक्रम, चार व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया (ई) में ΤitoF/Fo के रूप में प्लॉट किए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: वीवो 2-पी इमेजिंग ऑफ माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + न्यूरॉन्स में सिग्नलिंग। (ए)मस्तिष्क में न्यूरोनल मार्कर न्यून (मध्य) के साथ GCaMP6s (ऊपरी) का कोलोकैलाइजेशन। (ख)माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के साथ GCaMP6s व्यक्त करने वाले डेंड्रिट्स की उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियां (* एस द्वारा इंगित)। (C)GCaMP6s न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया में व्यक्त किया गया। (D-F) न्यूरॉन्स में सहज माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + वृद्धि का विश्लेषण। माइटोकॉन्ड्रिया की छद्म रंग 2-पी छवि अलग-अलग समय(डी)में सी में मिटो-GCaMP6s व्यक्त करती है। सी (हलकों) में चार व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया मेंअलग-अलगसमय(ई-एफ)और मिटो-जीसीएएमपी 6 के समय पाठ्यक्रमों में माइटो-जीसीएएमपी 6एस फ्लोरेसेंस परिवर्तन, चार व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया(एफ)में एमिटो-जीसीएएमपी 6एस की छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
फिल्म: माइटोकॉन्ड्रियल Ca2 + वृद्धि GCaMP5G फ्लोरेसेंस परिवर्तन के जवाब में १०० μएम एटीपी के जवाबमें सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स में । कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
इस लेख में, हम एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + सिग्नल के लिए एक विधि और प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हमने GECI GCaMP5G/6s को व्यक्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-टारगेटिंग और सेल प्रकार-विशिष्ट रणनीतियों को लागू किया। माइटोकॉन्ड्रिया में GCaMP5G/6s को लक्षित करने के लिए, हमने प्लाज्मिड्स में एक माइटोकॉन्ड्रिया-टारगेटिंग अनुक्रम शामिल किया। वीवोमें एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में GCaMP5G/6s व्यक्त करने के लिए, हमने प्लाज्मिड्स में एक एस्ट्रोसाइट-विशिष्ट प्रमोटर gfaABC1D और न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटर CaMKII डाला। एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में GCaMP5G/6s की सेल-टाइप विशिष्ट अभिव्यक्ति एस्ट्रोसाइट्स और न्यून के साथ न्यूरॉन्स के इम्यूनोस्टेटिंग में SR101 लेबलिंग द्वारा पुष्टि की जा सकती है। हमारे डेटा से, ये रणनीतियां माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + इमेजिंग इन एस्ट्रोसाइट्स और वीवो मेंन्यूरॉन्स के लिए एक विश्वसनीय सेल प्रकार विशिष्ट दृष्टिकोण प्रदान करती हैं।
जीईसीआई अभिव्यक्ति के लिए एक संभावित समस्या यह है कि यह सीए2 + बफरिंग का कारण बन सकता है क्योंकि यह सीए2 + बाध्यकारी द्वारा मुफ्त सीए2 + को कम कर सकता है। एक और समस्या है कि ध्यान दिया जा सकता है वायरस इंजेक्शन की मात्रा है । यदि अत्यधिक वायरस इंजेक्ट किया जाता है तो जीईसीआई व्यक्त करने वाली व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान नहीं की जा सकती है। इन समस्याओं को एएवी के टाइटर को कम करके प्रभावी ढंग से सुधारा जा सकता है। फोटोब्लैचिंग भी एक मुद्दा हो सकता है। सैद्धांतिक रूप से, सभी फ्लोरोसेंट संकेतक फोटोब्लैचिंग के अधीन हैं। GCaMP5G/6s काफी स्थिर हैं, लेकिन वे उत्तेजन प्रकाश के लिए नित्य जोखिम के तहत ब्लीच होगा । फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए एक सामान्य अभ्यास लेजर प्रकाश के ऊतकों के जोखिम समय को कम करना है, जबकि पर्याप्त फ्लोरेसेंस सुनिश्चित करना एकत्र किया जाता है। यदि उच्च संवेदनशीलता पीएमटी और उच्च प्रकाश पारेषण उद्देश्यों का उपयोग किया जाता है तो इसे प्राप्त किया जा सकता है। छवियों के बीच शटर बंद करके फोटोब्लैचिंग को भी कम किया जा सकता है।
वीवो 2-पी इमेजिंग में हमारे परिणामों में, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स दोनों में सहज माइटोकॉन्ड्रियल वृद्धि देखी जा सकती है। विशेष रूप से, इन माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + यात्रियों की लंबी अवधि(चित्रा 4E और चित्रा 5E)है, जो गोबेल एट अल30की हालिया रिपोर्ट के अनुरूप है। इस घटना का अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट नहीं है, लेकिन आगे आगे ले जाया जा रहा लायक है । साइटोसोलिक सीए2 + वृद्धि के लिए, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में अलग-अलग तंत्र होते हैं। जी-प्रोटीन रिसेप्टर उत्तेजनाओं के कारण एस्ट्रोसाइट्स में ईआर में सीए2 + वृद्धि होती है जबकि वोल्टेज गेटेड सीए2 + चैनलों या ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की सक्रियता से न्यूरॉन्स में साइटोसोलिक सीए2 + वृद्धि होती है, जिसे माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा आगे बढ़ाया जा सकता है। हमारे पिछले अध्ययन20में, हमने पाया कि जब mito-GCaMP5G आईपी3 5-फॉस्फेट (5ppase) सुसंस्कृत एस्ट्रोसाइट्स, एटीपी-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + वृद्धि से सहसंचरणित किया गया था, काफी हद तक समाप्त किया जा सकता है । हालांकि, 5ppase के दो म्यूटेंट, यानी, R343A और R343A/R350A 5ppase, जो एंजाइमेटिक गतिविधि की कमी है, एटीपी उत्तेजना के बाद माइटोकॉन्ड्रियल Ca2 + वृद्धि को प्रभावित नहीं किया । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि साइटोसोलिक और माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + स्तर अत्यधिक युग्मित हैं, क्योंकि एस्ट्रोसाइट्स में ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच अंतरंग शारीरिक संबंध की संभावना है, साइटोसोल सीए2 + डिलीवरी के लिए मध्यस्थ नाली के रूप में सेवारत है। हमने यह भी पाया कि ग्लूटामेट उत्तेजना के कारण न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + वृद्धि हुई, जिससे ग्लूटामेट रिसेप्टर्स को बाह्य अंतरिक्ष से सीए2 + प्रवेश में भूमिका निभाने का सुझाव दिया गया। भविष्य में, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में संवेदी संचालित माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + वृद्धि का अध्ययन करना दिलचस्प होगा।
हमारे दृष्टिकोण का उपयोग एक ही सेल प्रकार में साइटोसोलिक और माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + संकेतों को एक साथ छवि देने के लिए किया जा सकता है जब विभिन्न फ्लोरेसेंस तरंगदैर्ध्य के दो जीईसीआई व्यक्त किए जाते हैं, उदाहरण के लिए, साइटोप्लाज्म में एक लाल फ्लोरोसेंस जीईसीआई आरसीएमपी और माइटोकॉन्ड्रिया में जीसीएएमपी, या इसके विपरीत31। इस दृष्टिकोण का उपयोग फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी में एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शन के वीवो अध्ययन के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें एस्ट्रोसाइट्स और आरएसपी में न्यूरॉन्स में आरसीएमपी में व्यक्त किया गया था, या इसके विपरीत।
जीसीएएमपी एक जीएफपी-आधारित एकल तरंगदैर्ध्य फ्लोरोफोर जीसीआई है। वर्तमान में, GCaMPs उनके उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) और बड़ी गतिशील पर्वतमाला (DR) के कारण सबसे पसंदीदा सीए2 + संकेतक हैं। हाल ही में, GGCaMP7 सेंसर, GCaMP6 के अनुकूलित संस्करण, व्यक्तिगत स्पाइक्स16के लिए बेहतर संवेदनशीलता के साथ सूचित किया गया । GCaMP7 सेंसर आसानी से माइटोकॉन्ड्रियल Ca2 + इमेजिंग के लिए हमारे प्लाज्मिड्स में उपकस्त किया जा सकता है। संक्षेप में, हमने यहां प्रस्तुत की गई रणनीतियों का उपयोग वीवो में एकल माइटोकॉन्ड्रियल स्तर पर सीए2 + परिवर्तनों को हल करने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता के साथ न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज और हैंडलिंग की छवि के लिए किया जा सकताहै। यह प्रोटोकॉल एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स में साइटोसोलिक और माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + सिग्नलिंग के साथ-साथ एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी साधन का प्रतिनिधित्व करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर्स एंड स्ट्रोक (एनआईएनएस) ग्रांट R01NS069726 और R01NS094539 द्वारा एसडी को समर्थन दिया गया था । हम ऑडियो रिकॉर्डिंग के लिए एरिका DeMers शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
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