Summary
Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.
Abstract
MitochondrialesCa2+ spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der zytosolischenCa2+-Pufferung, des Energiestoffwechsels und der zellulären Signaltransduktion. Die Überlastung des mitochondrialen Ca2+ trägt zu verschiedenen pathologischen Zuständen bei, einschließlich Neurodegeneration und apoptotischem Zelltod bei neurologischen Erkrankungen. Hier stellen wir einen zelltypspezifischen und auf Mitochondrien abzielenden molekularen Ansatz für die mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivovor. Wir konstruierten DNA-Plasmide, die für Mitochondrien kodieren, die auf genetisch kodierte Ca2+ Indikatoren (GECIs) GCaMP5G oder GCaMP6s (GCaMP5G/6s) mit astrozyten- und neuronenspezifischen Promotoren gfaABC1D und CaMKII und mitochondrien-Targeting-Sequenz (mito-) abzielen. Für die in vitro mitochondriale Ca2+ Bildgebung wurden die Plasmide in kultivierten Astrozyten und Neuronen transfiziert, um GCaMP5G/6s zu exprimieren. Für die in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung wurden adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs) hergestellt und in das Gehirn der Maus injiziert, um GCaMP5G/6s in Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen zu exprimieren. Unser Ansatz bietet ein nützliches Mittel, um die mitochondrialeCa2+-Dynamik in Astrozyten und Neuronen abzubilden, um die Beziehung zwischen zytosolischer und mitochondrialerCa2+-Signalgebung sowie Astrozyten-Neuronen-Interaktionen zu untersuchen.
Introduction
Mitochondrien sind dynamische subzelluläre Organellen und gelten als Zellkraftwerke für die Energieproduktion. Auf der anderen Seite können MitochondrienCa2+ in die Matrix aufnehmen, als Reaktion auf lokale oder zytosolischeCa2+ Anstiege. Die mitochondrialeCa2+-Aufnahme beeinflusst die mitochondriale Funktion, einschließlich Stoffwechselprozesse wie Reaktionen im Tricarbonsäurezyklus (TCA) und oxidative Phosphorylierung, und reguliertCa2+-empfindlicheProteine unter physiologischenBedingungen 1,2,3,4. Mitochondriale Ca2+ Überlastung ist auch eine Determinante für den Zelltod, einschließlich Nekrose und Apoptose bei verschiedenen Hirnerkrankungen5,6,7. Es verursacht die Öffnung von mitochondrialen Permeabilitätsübergangsporen (mPTPs) und die Freisetzung von Caspase-Cofaktor, die den apoptotischen Zelltod einleiten. Daher ist es wichtig, die mitochondrialeCa2+-Dynamik und -Handhabung in lebenden Zellen zu untersuchen, um die zelluläre Physiologie und Pathologie besser zu verstehen.
Mitochondrien erhalten die MatrixCa2+ Homöostase durch ein Gleichgewicht zwischen Ca2+ Aufnahme und Efflux. Die mitochondrialeCa2+-Aufnahme wird hauptsächlich durch mitochondrialeCa2+-Uniporter (MCUs) vermittelt, während der mitochondrialeCa2+-Efflux durch die Na+-Ca2+-Li+-Austauscher (NCLXs) und dieH+/Ca2+-Austauscher(mHCXs)8vermittelt wird. Das Gleichgewicht kann durch die Stimulation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gestört werden9. MitochondrialeCa2+ Homöostase wird auch durch mitochondriale Pufferung durch die Bildung von unlöslichenxCa2+-xPO4x-xOH-Komplexenbeeinflusst 8.
Intrazelluläre und mitochondriale Veränderungen derCa2+-Konzentration ([Ca2+])können durch fluoreszierende oder lumineszierendeCa2+-Indikatoren bewertet werden. Die Bindung von Ca2+ an Indikatoren verursacht spektrale Modifikationen, die es ermöglichen, freie zelluläre [Ca2+] in Echtzeit in lebenden Zellen aufzuzeichnen. Derzeit stehen zwei Arten von Sonden zur Verfügung, um Ca2+-Veränderungen in Zellen zu überwachen: organisch-chemische Indikatoren und genetisch kodierteCa2+-Indikatoren (GECIs). Im Allgemeinen stehen für die untersuchten biologischen Fragestellungen unterschiedliche Varianten mit unterschiedlichenCa2+-Affinitäten (basierend auf Kd),spektralen Eigenschaften (Anregungs- und Emissionswellenlängen), Dynamikbereichen und Sensitivitäten zur Verfügung. Obwohl viele synthetische organische Ca2+-Indikatoren für die zytosolischeCa2+-Bildgebung verwendet wurden, können nur wenige selektiv in die mitochondriale Matrix für die mitochondrialeCa2+-Bildgebung geladen werden, wobei Rhod-2 am weitesten verbreitet ist (für Reviews siehe10,11). Rhod-2 hat jedoch einen großen Nachteil der Leckage bei langen Zeitverlaufsexperimenten; Darüber hinaus ist es zwischen Mitochondrien, anderen Organellen und dem Zytosol aufgeteilt, was absolute Messungen in verschiedenen Unterkompartimenten erschwert. Im Gegensatz dazu können GECIs durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren und subzellulären Kompartiment-Targeting-Sequenzen in verschiedenen Zelltypen und subzellulären Kompartimenten für die zell- und kompartimentspezifischeCa2+-Bildgebung in vitro oder in vivoexprimiert werden. Einwellenlängen-Fluoreszenzintensitäts-basierte GCaMP Ca2+ Indikatoren haben sich kürzlich als Haupt-GECIs12,13,14,15,16herausgestellt. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für das Mitochondria-Targeting und die zelltypspezifische Expression von GCaMP5G und GCaMP6s (GCaMP5G/6s) in Astrozyten und Neuronen sowie die Abbildung der mitochondrialen Ca2+-Aufnahme in diesen Zelltypen zur Verfügung. Mit diesem Protokoll kann die Expression von GCaMP6G/6s in einzelnen Mitochondrien aufgedeckt werden, und ca2+ Aufnahme in einzelner mitochondrialer Auflösung kann in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivoerreicht werden.
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Protocol
Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Missouri-Columbia genehmigt.
1. Aufbau von DNA-Plasmiden
HINWEIS: Für die In-vitro- und In-vivo-Bildgebung werden DNA-Plasmide konstruiert, die für GCaMP5G/6s mit Astrozyten- und Neuronen-spezifischen Promotoren und mitochondrialen Targeting-Sequenzen kodieren.
- Einfügen der mitochondrialen Matrix (MM)-Targeting-Sequenz (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 in die Klonierungsstellen EcoRI und BamHI im Rückgrat des Adeno-assoziierten Virus (AAV) Plasmids pZac2.1, um Plasmide zu erhalten, die astrozytäre gfaABC1D Promotor oder neuronalen CaMKII Promotor18,19,20enthalten.
- Subklone GCaMP5G/6s in die Klonierungsstellen BamH I und Not 1 in den oben genannten Plasmiden, um neue Plasmide zu erhalten pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s und pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s, die auf die Transgenexpression in Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen abzielen20,21 (Abbildung 1A).
- pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G und pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA-Plasmide für die Transfektion für in vitro Studien vorbereiten (Abschnitt 2). Herstellung von AAV-Vektoren mit Serotyp 5 für Astrozyten und Serotyp 9 für Neuronen für die In-vivo-Studie 18 (Abschnitt 3).
2. In vitro mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen
- Präpariere primäre Astrozyten aus dem Kortex von P1-Neugeborenenmäusen und primären Neuronen aus dem Kortex der E15-16-Embryonen18,22,23,24und kulturiere sie auf Glasdecklippen mit einem Durchmesser von 12 mm in 24-Well-Platten unter Verwendung von Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% fetales Rinderserum (FBS) und neuronales Basalmedium (NBM) mit 2% B27 enthält. beziehungsweise.
- Transfizieren Sie reife Astrozyten und Neuronen mit pZac-gfaABC1D-GCaMP6s und pZac-CaMKII-GCaMP5G-Plasmiden unter Verwendung von lipidbasiertem Transfektionsreagenz, um GCaMP6s in den Mitochondrien von Astrozyten und GCaMP5G in den Mitochondrien von Neuronen zu exprimieren18,20,21. Transfizieren Sie Zellen in jeder Vertiefung mit 0,5 μg DNA und wechseln Sie das Medium 6 h später.
HINWEIS: Die Astrozyten und Neuronen sind 1-2 Tage nach der Transfektion bereit für die Bildgebung. - Führen Sie in vitro mitochondriale Ca2+ Bildgebung 1-2 Tage nach der Transfektion durch.
- Übertragen Sie die mit Astrozyten oder Neuronen kultivierten Glasdeckgläser unter einem Epifluoreszenz- oder Zwei-Photonen-Mikroskop in die PH-1-Perfusionskammer.
- Stimulieren Sie die astrozytäre mitochondriale Ca2+ Aufnahme mit 100 μM ATP in ACSF oder stimulieren Sie neuronale Mitochondrien mit 100 μM Glutamat / 10 μM Glycin20,25 (Abbildung 2 und Abbildung 3).
HINWEIS: Lösungswechsel von ACSF zu ATP- und Glutamat/Glycin-haltigem ACSF werden durch ein ALA-VM8-Perfusionssystem21gesteuert. Die Geschwindigkeit des Lösungswechsels wird durch Einstellen eines Ventils mit 1-2 ml/min gesteuert.
3. In vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen
- AAV-Vorbereitungen.
- Herstellung der folgenden rekombinanten Adeno-assoziierten Virusvektoren (rAAV) unter Verwendung der in Abschnitt 1 hergestellten DNA-Plasmide: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G und rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s-Vektoren.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden rAAV-Vektoren des Serotyps 5 hergestellt, um GCaMP5G in Mitochondrien in Astrozyten zu exprimieren, und rAAV-Vektoren des Serotyps 9 wurden hergestellt, um GCaMP6s in Mitochondrien in Neuronen zu exprimieren.
- Herstellung der folgenden rekombinanten Adeno-assoziierten Virusvektoren (rAAV) unter Verwendung der in Abschnitt 1 hergestellten DNA-Plasmide: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G und rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s-Vektoren.
- Stereotaxische AAV-Injektion.
- Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran.
HINWEIS: Später während der Operation werden die Isofluranspiegel auf 2% reduziert. - Nachdem die Maus ein chirurgisches Anästhesieniveau erreicht hat, das durch Schwanz- und Zehendrücken bestimmt wird, rasieren Sie die Haare mit einem Haarschneider über die Operationsstelle, den motorischen oder somatosensorischen Kortex.
- Positionieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Mausgerät und fixieren Sie den Kopf mit Ohrbügeln. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um sie während der Operation zu schützen. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur der Maus während der gesamten Operation bei 37 ° C zu halten.
HINWEIS: Führen Sie eine Operation mit aseptischen Verfahren durch. Alle chirurgischen Werkzeuge müssen entweder durch Autoklavieren oder einen Heißperlensterilisator sterilisiert werden. - Nachdem die Maus auf dem stereotaktischen Gerät montiert ist, sterilisieren Sie die Kopfhaut dreimal mit abwechselnd jodbasiertem Peeling und 70% Ethanol. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut, um die Injektionsstelle freizulegen.
- Schneiden Sie die Haut in der Bregma-Lamda-Achse auf und erstellen Sie mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer ein ~ 1 mm Durchmessergratloch an der vorgesehenen Injektionsstelle des motorischen oder somatosensorischen Kortex.
- Verwenden Sie eine 33 G Hamilton-Spritze mit Adeno-assoziiertem Virus (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G-Vektoren [1 x 1011 GC] oder rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s-Vektoren [1 x 1011 GC]), um bis zu 1 μL Virus im Zielbereich zu injizieren.
HINWEIS: Für die kortikale Virusabgabe injizieren Sie beispielsweise die Viruslösung in zwei Tiefen in mehreren Schritten. Führen Sie zuerst die Nadel bis zu einer Tiefe von 1 mm von der Dura ein und lassen Sie 5 Minuten für das Gehirn warten, um sich zu erholen. Bewegen Sie dann die Nadel bis zu ~ 700 μm Tiefe und injizieren Sie 500 nL der Viruslösung mit einer Injektionsgeschwindigkeit von 10 nL / s mit einer Hamilton-Spritze, die von einem Mikrospritzenpumpenregler gesteuert wird. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, warten Sie 5 Minuten, damit das Virus in das Gehirn diffundieren kann. Bewegen Sie dann die Nadel bis zur zweiten Injektionsstelle in einer Tiefe von 300 μm. Hier werden zusätzlich 500 nL der Viruslösung injiziert. Warten Sie 10 Minuten, damit das Virus in das Gehirn diffundieren kann. - Schließen Sie die Kopfhaut und die Haut mit einem Gewebekleber. Lassen Sie die Mäuse sich auf dem Heizkissen erholen. Schicken Sie Mäuse nach der Genesung zurück in die Tiereinrichtung.
- Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran.
- Kraniale Fensterintstallation und in vivo Zwei-Photonen (2-P) Bildgebung von mitochondrialen Ca2+ Signalen.
HINWEIS: Die Kranialfensterimplantation erfolgt 3 Wochen nach der AAV-Injektion über den motorischen oder somatosensorischen Kortex26,27,28,29. Carprofen (10 mg/kg) wird subkutan injiziert, um mögliche Schmerzen vor der Operation zu lindern. Die kranialen Fensterchirurgieverfahren sind identisch mit den chirurgischen Eingriffen der AAV-Injektion und werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.- Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran.
HINWEIS: Dies ist die Anfangsdosis und reduzieren Sie sie auf 2% für die spätere Operation. Während der Bildgebung wird eine intraperitoneale (IP) Injektion von 130 mg Ketamin /10 mg Xylazin/kg Körpergewicht, gelöst in ACSF, zur Anästhesie verwendet. - Positionieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Mausgerät und fixieren Sie den Kopf mit Ohrbügeln. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur der Maus während der gesamten Operation bei 37 ° C zu halten.
HINWEIS: Alle chirurgischen Werkzeuge müssen sterilisiert werden. - Machen Sie einen Schnitt von 5-8 mm Länge in der Mittellinie der Kopfhaut und entfernen Sie einen Hautlappen mit einer Schere.
- Nachdem der Schädel freigelegt wurde, führen Sie eine Kraniotomie mit einem Durchmesser von 2,0-3,0 mm mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer über dem vom Virus injizierten Bereich (d. h. motorischer Kortex oder somatosensorischer Kortex, Abbildung 1B) durch. Machen Sie zuerst vier kleine Löcher und bohren Sie dann in einem Kreis entlang, der die Löcher verbindet. Heben und entfernen Sie dann den Knochen mit einer scharfen Schere und entfernen Sie ihn. Die freiliegende Dura mater kann entfernt oder intakt gehalten werden, um das Schädelfenster zu bewirken.
- Legen Sie einen Glasdecker von 3-5 mm Durchmesser mit einem transparenten Silikon über die Kraniotomie. Verwenden Sie einen Zahnstocher, um das Schädelfenster sanft auf die Oberfläche des Gehirns zu drücken. Versiegeln Sie dann die Kante mit einer kleinen Menge Silikonkleber.
HINWEISE: Alternativ kann anstelle einer Silikonscheibe ein 1,2% iges Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt zwischen dem Deckglas und dem Hirngewebe verwendet werden. - Zum Schluss versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Zahnzement. Achten Sie darauf, den Zement leicht am Rand des Schädelfensters aufzutragen, um eine starke Verklebung zu gewährleisten. Befestigen Sie eine maßgefertigte Kopfplatte aus Metall mit Zahnzement am Schädel.
HINWEIS: Die Metallplatte wird verwendet, um den Kopf der Maus während der Bildgebungssitzung auf der Stufe des 2-P-Mikroskops zu fixieren (Abbildung 1C). - Fügen Sie 0,5 ml ACSF-Lösung über den Deckglas am Schädelfenster hinzu, um während der Bildgebung in Wasser einzutauchen.
- Durchführung einer Zeitraffer-in-vivo-2-P-Bildgebung von Mito-GCaMP5G in Astrozyten und Mito-GCaMP6s in Neuronen mit 910 nm Wellenlänge durch das Schädelfenster (Abbildung 1C)18,20,27.
HINWEIS: Während der Bildgebung befinden sich Mäuse auf dem Heizkissen, um die physiologische Temperatur aufrechtzuerhalten. Die Mäuse werden unmittelbar nach Abschluss der Bildgebungssitzung geopfert. - Markieren Sie Astrozyten in vivo mit Sulforhodamin 101 (SR101), wenn es notwendig ist, die Kolokalisation zu bestimmen.
- Am Ende von Schritt 3.3.4 tragen Sie 100 μL 100 μM SR101 in ACSF für 1-5 min auf die kortikale Oberfläche auf.
- Spülen Sie die Oberfläche mit ACSF ab, um den ungebundenen SR101 wegzuspülen. Mittels 2-P-Bildgebung kann die Co-Markierung von Mito-GCaMP5G und SR101 in Astrozyten 45-60 min später beobachtet werden (Abbildung 4A).
- Betäuben Sie die Maus mit 3% Isofluran.
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Representative Results
Ziel dieser Studie war es, eine Methodik zur Abbildung mitochondrialer Ca2+-Signale unter Verwendung von GECIs in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivo bereitzustellen. Ergebnisse der in vitro und in vivo mitochondrialen Ca2+ Bildgebung werden hier vorgestellt.
In vitro mitochondriale Ca2+ Signalisierung in kultivierten Astrozyten und Neuronen
Die mitochondrialeCa2+-Aufnahme in Astrozyten kann durch ATP-Anwendung hervorgerufen werden, und mitochondrialeCa2+-Aufnahme in Neuronen kann durch Glutamat- und Glycin-Applikation durch ein Perfusionssystem hervorgerufen werden. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen, dass GCaMP6s in kultivierten Astrozyten bzw. GCaMP5G in Neuronen exprimiert wird. Die mitochondrialeCa2+-Aufnahme in Astrozyten wurde durch 100 μM ATP mit einer einzelnen mitochondrialen Auflösung hervorgerufen (Abbildung 2B-D). Mitochondriale Ca2+ Aufnahme in Neuronen wurde durch 100 μM Glutamat und 10 μM Glycin mit einzelner mitochondrialer Auflösung hervorgerufen (Abbildung 3B-D).
In vivo 2-P Bildgebung der mitochondrialen Expression von GCaMP5G oder 6S in Astrozyten und Neuronen
Die Bildgebung erfolgt durch Die Erfassung von Zeitraffer-in-vivo-2-P-Bildgebung von mitochondrialen Fluoreszenzsignalen in Astrozyten und Neuronen mit einem Ultima 2-P-Mikroskopsystem. Wir verwenden die Anregungswellenlänge 880-910 nm. Abbildung 4 zeigt die Expression von GCaMP5G in Mitochondrien in Astrozyten im Mauskortex. Die astrozytenspezifische Expression von GCaMP5G wurde durch Kolokalisierung von SR101 mit GCaMP5G mit einzelner mitochondrialer Auflösung bestätigt (Abbildung 4A), und spontaneCa2+-Veränderungen in einzelnen Mitochondrien können beobachtet werden (Abbildung 4B-E). Abbildung 5A zeigt die neuronenspezifische Expression von mito-GCaMP6s kolokalisiert mit dem neuronalen Marker NeuN. Die Fluoreszenz von Mito-GCaMP6s in Neuronen zeigt die mitochondriale Morphologie in Dendriten (Abbildung 5B). Spontane mitochondrialeCa2+ Erhöhungen der Dendriten können beobachtet werden (Abbildung 5C-F).
Analyse der mitochondrialen Ca2+ Signale
Quantifizieren Sie die Fluoreszenzsignale, indem Sie die mittleren Pixelintensitäten des Zellkörpers oder einzelner Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen mit einer Bildanalysesoftware berechnen. Ca2+ Änderungen im Laufe der Zeit (t) werden als F/Fo(t)-Werte gegenüber der Zeit ausgedrückt, wobei Fo die subtrahierte Hintergrundfluoreszenz der Basislinie und F die subtrahierte Fluoreszenzänderung der Basislinie20,21ist. Verwenden Sie die Spitzenwerte F/Fo, um die Amplitude von Ca2+ Signalen zu vergleichen.
Abbildung 1: DNA-Konstrukte für die Astrozyten- und neuronenspezifische Mitochondrien-Targeting-Transgenexpression und in vivo 2-P-Bildgebung. (A) DNA-Konstrukte von genetisch kodierten Ca2+ Indikator GCaMP5G oder GcaMP6s in pZac2.1-Plasmid mit gfaABC1D (up) und CaMKII (low) Promotoren für die Abgabe an die astrozytäre bzw. neuronale mitochondriale Matrix. Das Mitochondria-Targeting wird unter Verwendung einer mitochondrialen Matrix (MM) spezifischen Sequenz (Mito) erreicht, die an den N-Terminus der fluoreszierenden Proteine angehängt wird. (B) Eine Kraniotomie über dem Kortex einer Maus. (C) Der Schädel einer Maus ist an einer Metallplatte befestigt, die mit dem Pfosten verbunden ist, der auf der Stufe des 2-P-Mikroskops befestigt ist. Der Einschub zeigt das Schädelfenster mit einer Metallplatte, die am Schädel befestigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mitochondriale Ca2+ Bildgebung von kultivierten Astrozyten. (A-B) Ein 2-P-Bild eines Astrozyten, der Mito-GCaMP6s (A) exprimiert, und seine Reaktion auf die Stimulation von 100 μM ATP zum angegebenen Zeitpunkt (B). (C) Bilder von Mito-GCaMP6s in den vier einzelnen Mitochondrien (in A, Kreisen) zu den verschiedenen Zeiten nach der ATP-Stimulation. (D) Die Zeitverläufe von Mito-GCaMP6s Fluoreszenzänderungen, dargestellt als ΔF/Fo, in den vier einzelnen Mitochondrien nach ATP-Stimulation. Der rote Pfeil zeigt die Startzeit der Bildgebung an. Die Pseudofarbskala ist eine lineare Darstellung der Fluoreszenzintensität in dieser und anderen Figuren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mitochondriale Ca2+ Bildgebung von kultivierten Neuronen. (A-B) Ein 2-P-Bild von Mito-GCaMP5G exprimierendem Neuron (A) und seine Reaktion auf 100 μM Glutamat und 10 μM Glycin zum angegebenen Zeitpunkt (B). (C) Bilder von Mito-GCaMP5G in den vier einzelnen Mitochondrien (in A, Kreisen) zu verschiedenen Zeiten nach Glutamatstimulation. (D) Die Zeitverläufe von Mito-GCaMP5G-Fluoreszenzänderungen in den vier einzelnen Mitochondrien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: In vivo 2-P-Bildgebung der mitochondrialen Ca2+-Signalgebung in Astrozyten. (A) 2-P-Aufnahmen von Mito-GCaMP5G-exprimierenden Astrozyten, die mit SR101 kolokalisiert sind. (B-C) 2-P-Aufnahme eines Astrozyten, der Mito-GCaMP5G zur Analyse des spontanenCa2+-Anstiegs exprimiert. (C-E) Bilder von Mito-GCaMP5G in den vier einzelnen Mitochondrien im Astrozyten (in B, Kreisen) zu den verschiedenen Zeiten (C) und den Zeitverläufen von mito-GCaMP5G Fluoreszenzveränderungen, gezeichnet als ΔF/Fo, in den vier einzelnen Mitochondrien (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: In vivo 2-P Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Signalisierung in Neuronen. (A) Kolokalisierung von GCaMP6s (oben) mit neuronalem Marker NeuN (Mitte) im Gehirn. (B) Hochauflösende Bilder von Dendriten, die GCaMP6s mit mitochondrialer Morphologie exprimieren (angezeigt durch *s). (C) GCaMP6s, die in neuronalen Mitochondrien exprimiert werden. (D-F) Analyse des spontanen mitochondrialen Ca2+ Anstiegs in Neuronen. Pseudocolor 2-P-Bild der Mitochondrien, die mito-GCaMP6s in C zu verschiedenen Zeiten exprimieren (D). Bilder von Mito-GCaMP6s in den vier einzelnen Mitochondrien in C (Kreisen) zu den verschiedenen Zeiten (E-F) und den Zeitverläufen von Mito-GCaMP6s Fluoreszenzveränderungen, gezeichnet als ΔF/Fo, in den vier einzelnen Mitochondrien (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Film: Mitochondrial Ca2+ steigt basierend auf GCaMP5G-Fluoreszenzänderungen als Reaktion auf 100 μM ATP in kultivierten Astrozyten. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
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Discussion
In diesem Artikel stellen wir eine Methode und ein Protokoll zur Abbildung mitochondrialer Ca2+-Signale in Astrozyten und Neuronen zur Verfügung. Wir implementierten Mitochondria-Targeting- und zelltypspezifische Strategien, um GECI GCaMP5G/6s zu exprimieren. Um GCaMP5G/6s in Mitochondrien anzugreifen, haben wir eine Mitochondrien-Targeting-Sequenz in die Plasmide aufgenommen. Um GCaMP5G/6s in Astrozyten und Neuronen in vivo zu exprimieren,haben wir einen Astrozyten-spezifischen Promotor gfaABC1D und neuronenspezifischen Promotor CaMKII in die Plasmide eingefügt. Die zelltypspezifische Expression von GCaMP5G/6s in Astrozyten und Neuronen kann durch SR101-Markierung in Astrozyten und Immunfärbung von Neuronen mit NeuN bestätigt werden. Aus unseren Daten geht hervor, dass diese Strategien einen zuverlässigen zelltypspezifischen Ansatz für die mitochondriale Ca2+-Bildgebung in Astrozyten und Neuronen in vivobieten.
Ein potenzielles Problem für den GECI-Ausdruck besteht darin, dass er eine Ca2+-Pufferung verursachen kann, da er die freieCa2+-Bindung durchCa2+-Bindung reduzieren kann. Ein weiteres Problem, auf das geachtet werden könnte, ist die Menge des injizierten Virus. Einzelne Zellen, die GECI exprimieren, können nicht identifiziert werden, wenn ein übermäßiges Virus injiziert wird. Diese Probleme können effektiv gelindert werden, indem der Titer von AAV reduziert wird. Photobleaching könnte auch ein Problem sein. Theoretisch unterliegen alle Fluoreszenzindikatoren einem Photobleichen. GCaMP5G/6s sind ziemlich stabil, aber sie bleichen unter ständiger Einwirkung von Anregungslicht aus. Eine allgemeine Praxis zur Vermeidung von Photobleichen besteht darin, die Expositionszeit des Gewebes gegenüber Laserlicht zu verkürzen und gleichzeitig sicherzustellen, dass genügend Fluoreszenz gesammelt wird. Dies kann erreicht werden, wenn hochempfindliche PMTs und hohe Lichttransmissionsziele verwendet werden. Photobleaching kann auch reduziert werden, indem der Verschluss zwischen den Bildern geschlossen wird.
In unseren Ergebnissen der in vivo 2-P-Bildgebung können spontane mitochondriale Erhöhungen sowohl in Astrozyten als auch in Neuronen beobachtet werden. Bemerkenswert ist, dass diese mitochondrialen Ca2+ Transienten eine lange Dauer haben (Abbildung 4E und Abbildung 5E), die mit einem kürzlich veröffentlichten Bericht von Gobel et al.30übereinstimmt. Der diesem Phänomen zugrunde liegende Mechanismus ist nicht klar, aber es lohnt sich, weiter verfolgt zu werden. Für den zytosolischenCa2+ Anstieg haben Astrozyten und Neuronen unterschiedliche Mechanismen. G-Protein-Rezeptor-Stimulationen verursacheneinen Anstieg der ER in Astrozyten, während die Aktivierungen von spannungsgesteuerten Ca2+-Kanälen oder Glutamatrezeptoren einen zytosolischenCa2+-Anstieg der Neuronen verursachen, der von Mitochondrien aufgenommen werden kann. In unserer vorherigen Studie20fanden wir heraus, dass, wenn Mito-GCaMP5G mit IP3 5-Phosphatase (5ppase) kultivierten Astrozyten kotransfiziert wurde, ATP-induzierte mitochondriale Ca2+ Erhöhung weitgehend aufgehoben werden konnte. Die beiden Mutanten von 5ppase, d.h. R343A und R343A/R350A 5ppase, denen die enzymatische Aktivität fehlt, beeinflussten jedoch nicht den mitochondrialen Ca2+ Anstieg nach ATP-Stimulation. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zytosolische und mitochondriale Ca2+-Spiegel stark gekoppelt sind, wahrscheinlich aufgrund der intimen physikalischen Verbindung zwischen dem ER und den Mitochondrien in Astrozyten, wobei das Zytosol als Zwischenkanal für dieCa2+-Abgabe dient. Wir fanden auch heraus, dass die Glutamatstimulation einen mitochondrialen Anstieg von Ca2+ in Neuronen verursachte, was darauf hindeutet, dass Glutamatrezeptoren eine Rolle beim Eintritt von Ca2+ aus dem extrazellulären Raum spielen. In Zukunft wird es interessant sein, sensorisch getriebene mitochondriale Ca2+ Erhöhungen in Astrozyten und Neuronen zu untersuchen.
Unser Ansatz kann verwendet werden, um gleichzeitig zytosolische und mitochondriale Ca2+-Signale im selben Zelltyp abzubilden, wenn zwei GECIs unterschiedlicher Fluoreszenzwellenlängen exprimiert werden, z. B. eine rote Blüte GECI RCaMP in Zytoplasma und GCaMP in Mitochondrien oder umgekehrt31. Dieser Ansatz kann auch für die In-vivo-Untersuchung von Astrozyten-Neuronen-Interaktionen in Physiologie und Pathologie mit GCaMP in Astrozyten und RCaMP in Neuronen oder umgekehrt verwendet werden.
GCaMP ist ein GFP-basiertes Einwellenlängen-Fluorophor GECI. Derzeit sind GCaMPs aufgrund ihres hohen Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) und ihres großen Dynamikbereichs (DR) die am meisten bevorzugten Ca2+-Indikatoren. Kürzlich wurden jGCaMP7-Sensoren, die optimierte Version von GCaMP6, mit verbesserter Empfindlichkeit gegenüber einzelnen Spikes berichtet16. GCaMP7-Sensoren können einfach in unsere Plasmide für die mitochondriale Ca2+ Bildgebung subkloniert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Strategien, die wir hier vorgestellt haben, verwendet werden können, um die mitochondriale Ca2+-Aufnahme und -Handhabung in Neuronen und Astrozyten mit ausreichender Empfindlichkeit abzubilden, umCa2+-Veränderungen auf einzelner mitochondrialer Ebene in vivoaufzulösen. Dieses Protokoll stellt ein nützliches Mittel dar, um zytosolische und mitochondriale Ca2+-Signale in Astrozyten und Neuronen sowie Astrozyten-Neuron-Interaktionen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health unterstützt Das National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) gewährt R01NS069726 und R01NS094539 an SD. Wir danken Erica DeMers für die Audioaufnahme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
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