Summary
Bu proktokol, astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.
Abstract
Mitokondriyal Ca2+, sitozolitik Ca2+ arabelleğe alma, enerji metabolizması ve hücresel sinyal transdüksiyonunu kontrol etmede kritik bir rol oynar. Mitokondriyal Ca2+'nın aşırı yüklenmesi, nörolojik hastalıklarda nörodejenerasyon ve apoptotik hücre ölümü de dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumlara katkıda bulunur. Burada astrositlerde ve nöronlarda mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için moleküler yaklaşımı hedefleyen hücre tipi spesifik ve mitokondriler in vitro ve in vivo sunuyoruz. Genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergelerini (GECI'ler) GCaMP5G veya GCaMP6'ları (GCaMP5G/6s) astrosit ve nörona özgü promotörler gfaABC1D ve CaMKII ve mitokondri hedefleme dizisi (mito-) ile kodlayan DNA plazmidleri inşa ettik. İn vitro mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için plazmidler GCaMP5G/6'ları ifade etmek için kültürlü astrositlerde ve nöronlarda transkripsiyon edildi. In vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için adeno ilişkili viral vektörler (AAV' ler) hazırlandı ve astrositlerde ve nöronlarda mitokondrilerde GCaMP5G/6'ları ifade etmek için fare beyinlerine enjekte edildi. Yaklaşımımız, astrosit ve nöronlardaki mitokondriyal Ca2+ dinamiklerini, sitosolik ve mitokondriyal Ca2+ sinyallerinin yanı sıra astrosit-nöron etkileşimleri arasındaki ilişkiyi incelemek için yararlı bir araç sağlar.
Introduction
Mitokondriler dinamik hücre altı organellerdir ve enerji üretimi için hücre güç merkezleri olarak kabul edilir. Öte yandan, mitokondriler lokal veya sitozolitik Ca2+ yükselmelerine yanıt olarak Ca2+'yı matrise alabilir. Mitokondriyal Ca2+ alımı, trikarboksilik asit (TCA) döngüsündeki reaksiyonlar ve oksidatif fosforilasyon gibi metabolik süreçler de dahil olmak üzere mitokondriyal fonksiyonu etkiler ve fizyolojik koşullar altında Ca2+duyarlı proteinleri düzenler 1,2,3,4. Mitokondriyal Ca2+ aşırı yükleme, çeşitli beyin bozukluklarında nekroz ve apoptoz da dahil olmak üzere hücre ölümü için de belirleyicidir5,6,7. Mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin (mPTP' ler) açılmasına ve apoptotik hücre ölümünü başlatan caspase kofaktörün salınmamasına neden olur. Bu nedenle hücresel fizyolojiyi ve patolojiyi daha iyi anlamak için canlı hücrelerde mitokondriyal Ca2+ dinamiklerinin ve elleçlemenin incelenmesi önemlidir.
Mitokondri, Ca2+ alımı ve efflux arasındaki denge ile matris Ca2+ homeostazını korur. Mitokondriyal Ca2+ alımı esas olarak mitokondriyal Ca2+ uniporterler (MCU' lar) tarafından aracılık edilirken, mitokondriyal Ca2+ efflux Na+-Ca2+-Li+ eşanjörleri (NCLXs) ve H+/ Ca2+ eşanjörleri (mHCXs)8ile aracılık eder. Denge, G-protein bağlantılı reseptörlerin (GPCR) uyarılması yoluyla bozunabilir9. Mitokondriyal Ca2+ homeostaz da çözünmeyen xCa2+-xPO4x-xOH komplekslerinin oluşumu ile mitokondriyal tamponlamadan etkilenir8.
Ca2+ konsantrasyonundaki hücre içi ve mitokondriyal değişiklikler ([Ca2+]) floresan veya lüminesan Ca2+ göstergeleri ile değerlendirilebilir. Göstergelere ca2+ bağlama spektral değişikliklere neden olur ve canlı hücrelerde gerçek zamanlı olarak ücretsiz hücresel [Ca2+] kaydedilmeye izin verir. Hücrelerdeki Ca2+ değişikliklerini izlemek için şu anda iki tür prob mevcuttur: organik kimyasal göstergeler ve genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergeleri (GECI'ler). Genellikle, incelenmektedir biyolojik sorular için farklı Ca2+ benzeşimlerine (Kd'yedayalı), spektral özelliklere (uyarlama ve emisyon dalga boyları), dinamik aralıklara ve hassasiyetlere sahip farklı varyantlar mevcuttur. Sitosolic Ca2+ görüntüleme için birçok sentetik organik Ca2+ göstergesi kullanılmış olsa da, sadece birkaçı mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için mitokondriyal matrise seçici olarak yüklenebilir ve Rhod-2 en yaygın kullanılandır (incelemeler için bkz.10,11). Bununla birlikte, Rhod-2 uzun süreli denemeler sırasında sızıntının büyük bir dezavantajı vardır; ek olarak, mitokondriler, diğer organeller ve sitozol arasında bölünür ve farklı alt bölümlerde mutlak ölçümleri zorlaştırır. Buna karşılık, hücre tipine özgü promotörler ve hücre altı bölme hedefleme dizileri kullanılarak, GECI'ler hücre ve bölmeye özgü Ca2+ görüntüleme in vitro veya in vivo için farklı hücre tiplerinde ve hücre altı bölmelerdeifade edilebilir. Tek dalga boyu floresan yoğunluğuna dayalı GCaMP Ca2+ göstergeleri son zamanlarda majörGECI'ler 12 , 13,14,15,16olarak ortayaçıkmıştır. Bu makalede, astrositlerde ve nöronlarda GCaMP5G ve GCaMP6s'ın (GCaMP5G/6s) mitokondri hedeflemesi ve hücre tipi spesifik ekspresyonu ve bu hücre tiplerinde mitokondriyal Ca2+ alımını görüntüleme protokolü sunuyoruz. Bu protokol kullanılarak, bireysel mitokondrilerde GCaMP6G / 6s ifadesi ortaya çıkarılabilir ve tek mitokondriyal çözünürlükte Ca2 + alımı astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren prosedürler Missouri-Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. DNA plazmidlerinin yapımı
NOT: İn vitro ve in vivo görüntüleme için, Astrosit ve nörona özgü promotörler ve mitokondriyal hedefleme dizileri ile GCaMP5G/6'ları kodlayan DNA plazmidleri oluşturulur.
- Mitokondriyal matris (MM)- hedefleme sırası (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGGGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17'yi klona ekleyin adeno ilişkili virüs (AAV) plazmid pZac2.1 omurgasındaki EcoRI ve BamHI siteleri astrositik gfaABC 1 D promotörü veya nöronal CaMKII promotörü18,19,20içeren plazmidler elde etmek için.
- Yeni plazmidler elde etmek için yukarıdaki plazmidlerde BamH I ve Not 1 klonlama sitelerine GCaMP5G/6s altlığı pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/Astrosit ve nöronlarda mitokondrilerde transgene ekspresyon hedefleyen 6s ve pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s20,21 (Şekil 1A).
- İn vitro çalışma için transfeksiyon için pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G ve pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA plazmidlerini hazırlayın (Bölüm 2). Astrositler için serotip 5 ve in vivo çalışma18 için nöronlar için serotip 9 ile AAV vektörleri üretin (Bölüm 3).
2. Astrositlerde ve nöronlarda in vitro mitokondriyal Ca2+ görüntüleme
- P1 yenidoğan farelerinin korteksinden primer astrositler ve E15-16 embriyolarının korteksinden primer nöronlar hazırlayın18,22,23,24ve bunları 12 mm çapında cam kapaklarda kültürlendir %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) ve %2 B27 içeren nöronal bazal ortam (NBM) kullanılarak 24 kuyu plakalarında, sırasıyla.
- Lipid bazlı transf kullanarak pZac-gfaABC1D-GCaMP6s ve pZac-CaMKII-GCaMP5G plazmidleri ile olgun astrositleri ve nöronları transfect Astrositlerin mitokondrisinde GCaMP6'ları ve nöronların mitokondrisinde GCaMP5G'yi ifade etmek için reaksiyon reaktifi18,20,21. Her kuyudaki hücreleri 0,5 μg DNA ile transfect ve orta 6 saat sonra değiştirin.
NOT: Astrositler ve nöronlar transfeksiyondan 1-2 gün sonra görüntülemeye hazırdır. - Transfeksiyondan1-2 gün sonra in vitro mitokondriyal Ca 2+ görüntüleme gerçekleştirin.
- Astrositler veya nöronlarla kültürlenmiş cam kapakları bir epifluoresans veya iki foton mikroskobu altında PH-1 perfüzyon odasına aktarın.
- ACSF'de 100 μM ATP ile astrositik mitokondriyal Ca2+ alımını uyarın veya 100 μM glutamat/ 10 μM glisin20,25 (Şekil 2 ve Şekil 3)ile nöronal mitokondrileri uyarın.
NOT: ACSF'den ATP'ye ve glutamat/glisin içeren ACSF'ye kadar çözelti değişiklikleri bir ALA-VM8 perfüzyon sistemi21ile kontrol edilir. Çözelti değişiminin hızı, bir vana ayarlanarak 1-2 mL/dk'da kontrol edilir.
3. Astrositlerde ve nöronlarda in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme
- AAV hazırlıkları.
- Bölüm 1'de hazırlanan DNA plazmidlerini kullanarak aşağıdaki rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) vektörlerini hazırlayın: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G ve rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vektörleri.
NOT: Bu deneyde, serotip 5'in rAAV vektörleri astrositlerde mitokondride GCaMP5G'yi ifade etmek için, serotip 9'un rAAV vektörleri ise nöronlarda mitokondrideki GCaMP6'ları ifade etmek için hazırlanmıştır.
- Bölüm 1'de hazırlanan DNA plazmidlerini kullanarak aşağıdaki rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) vektörlerini hazırlayın: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G ve rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vektörleri.
- Stereotaksik AAV enjeksiyonu.
- Fareyi% 3 izofluran ile uyuşturun.
NOT: Ameliyat sırasında izofluran düzeyleri %2'ye düşürülür. - Fare cerrahi anestezi seviyesine ulaştıktan sonra, kuyruk ve parmak sıkışması ile belirlendiği gibi, saçları bir saç düzeltici ile ameliyat bölgesi, motor veya somatosensör korteks üzerinde tıraş edin.
- Fareyi fare stereotaksik cihazına yerleştirin ve başı kulak çubuklarıyla sabitleyin. Ameliyat sırasında onları korumak için gözlere oftalmik merhem uygulayın. Ameliyat boyunca farenin vücut sıcaklığını 37 °C'de tutmak için bir ısıtma yastığı kullanın.
NOT: Aseptik prosedürler kullanarak ameliyat gerçekleştirin. Tüm cerrahi aletlerin otoklavlama veya sıcak boncuk sterilizatörü ile sterilize edilmesi gerekir. - Fare stereotaksik cihaza monte edildikten sonra, kafa derisini alternatif iyot bazlı ovma ve% 70 etanol ile üç kez sterilize edin. Enjeksiyon bölgesini ortaya çıkarmak için kafa derisinin orta hattında bir kesi yapın.
- Bregma-lamda ekseninde cildi kesin ve motorun veya somatosensör korteksin hedeflenen enjeksiyon yerinde yüksek hızlı bir matkapla ~1 mm çapında bir çapak deliği oluşturun.
- Adeno ile ilişkili virüs içeren 33 G Hamilton şırıng (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G vektörleri [1 x 1011) kullanın VEYA rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vektörleri [1 x 1011 GC]) hedef bölgeye 1 μL'ye kadar virüs enjekte etmek için.
NOT: Örneğin, kortikal viral doğum için, virüs çözeltisini birden fazla adımda iki derinlikte enjekte edin. İlk olarak, iğneyi duradan 1 mm derinliğe yerleştirin ve beynin iyileşmesi için 5 dakika izin verin. Ardından, iğneyi ~700 μm derinliğe kadar hareket ettirin ve bir mikrosyringe pompa kontrolörü tarafından kontrol edilen bir hamilton şırıngası kullanarak 10 nL / s enjeksiyon hızında virüs çözeltisinin 500 nL'lik bir kısmını enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, virüsün beyne yayılmasına izin vermek için 5 dakika bekleyin. Ardından, iğneyi 300 μm derinlikte ikinci enjeksiyon konumuna kadar hareket ettinin. Burada, virüs çözeltisinin ek bir 500 nL enjekte edin. Virüsün beyne yayılmasına izin vermek için 10 dakika bekleyin. - Bir doku yapıştırıcısı kullanarak kafa derisini ve cildi kapatın. Farelerin ısıtma yastığında iyileşmesine izin verin. İyileştikten sonra fareleri hayvan tesisine geri gönderin.
- Fareyi% 3 izofluran ile uyuşturun.
- Kranial pencere intstallation ve mitokondriyal Ca 2+ sinyallerinin in vivo iki foton(2-P) görüntüleme.
NOT: Kranial pencere implantasyonu motor veya somatosensör korteks üzerine AAV enjeksiyonu sonrası 3 hafta sonra yapılır26,27,28,29. Karprofen (10 mg/kg) ameliyat öncesi potansiyel ağrıdan kurtulmak için deri altından enjekte edilir. Kranial pencere cerrahi işlemleri AAV enjeksiyon cerrahi prosedürleri ile aynıdır ve aseptik koşullar altında gerçekleştirilir.- Fareyi% 3 izofluran ile uyuşturun.
NOT: Bu başlangıç dozudur ve daha sonra ameliyat için% 2'ye düşürün. Görüntüleme sırasında anestezi için ACSF'de çözünen 130 mg ketamin/10 mg ksilazin/kg vücut ağırlığında intraperitoneal (IP) enjeksiyon kullanılır. - Fareyi fare stereotaksik cihazına yerleştirin ve başı kulak çubuklarıyla sabitleyin. Gözlere oftalmik merhem uygulayın. Ameliyat boyunca farenin vücut sıcaklığını 37 °C'de tutmak için bir ısıtma yastığı kullanın.
NOT: Tüm cerrahi aletlerin sterilize edilmesi gerekir. - Kafa derisinin orta hattında 5-8 mm uzunluğunda bir kesi yapın ve bir makas kullanarak bir deri kapağını çıkarın.
- Kafatası açığa çıktıktan sonra, virüs enjekte edilen alan (örneğin, motor korteks veya somatosensör korteks, Şekil 1B) üzerinde yüksek hızlı bir matkap kullanarak 2.0-3.0mm çapında kraniyotomi gerçekleştirin. İlk olarak, dört küçük delik açın ve ardından delikleri birbirine bağlayan bir daire içinde delin. Daha sonra, keskin makasla kemiği kaldırıp çıkarın ve çıkarın. Maruz kalan dura mater, kraniyal pencerenin impantasyonu için çıkarılabilir veya bozulmadan tutulabilir.
- Kraniyotomi üzerine şeffaf bir silikon taşıyan 3-5 mm çapında bir cam kapak kılıfı yerleştirin. Kafatası penceresini beynin yüzeyine hafifçe itmek için bir kürdan kullanın. Ardından, kenarı az miktarda silikon yapıştırıcı ile kapatın.
NOTLAR: Alternatif olarak kapak camı ile beyin dokusu arasında silikon disk yerine %1,2 düşük erime noktası agarose jel kullanılabilir. - Son olarak, kapak kapağının kenarlarını diş çimentosu ile kapatın. Güçlü yapıştırma için çimentoyu kranial pencerenin kenarına hafifçe uygulamaya özen göster. Diş çimentosu ile kafatasına özel yapım metal bir kafa plakası takın.
NOT: Metal plaka, görüntüleme seansı sırasında farenin başını 2-P mikroskop aşamasına sabitlemek için kullanılır (Şekil 1C). - Görüntüleme sırasında suya daldırılmak için kranial penceredeki kapak kapağının üzerine 0,5 mL ACSF çözeltisi ekleyin.
- Kraniyal pencereden 910 nm dalga boyuna sahip nöronlarda astrositlerde ve mito-GCaMP6'larda mito-GCaMP5G'nin vivo 2-P görüntülemesini gerçekleştirin (Şekil 1C)18,20,27.
NOT: Görüntüleme sırasında, fareler fizyolojik sıcaklığı korumak için ısıtma yastığındadır. Görüntüleme seansı tamamlandıktan hemen sonra fareler kurban edilecektir. - Kolokalizasyonun belirlenmesi gerektiğinde astrositleri sülforhodamin 101 (SR101) ile in vivo olarak etiketleyin.
- 3.3.4 adımının sonunda, kortikal yüzeye 1-5 dakika boyunca ACSF'de 100 μL 100 μM SR101 uygulayın.
- İlişkisiz SR101'i yıkamak için yüzeyi ACSF ile durulayın. 2-P görüntüleme kullanılarak, astrositlerde mito-GCaMP5G ve SR101'in ortak etiketlemesi 45-60 dakika sonra gözlenebilir (Şekil 4A).
- Fareyi% 3 izofluran ile uyuşturun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmanın amacı astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivoolarak GECI'ler kullanarak mitokondriyal Ca2+ sinyallerinin görüntülenerek bir metodoloji sağlamaktı. Hem in vitro hem de in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme sonuçları burada sunulmuştur.
Kültürlü astrositlerde ve nöronlarda in vitro mitokondriyal Ca2+ sinyali
Astrositlerde Mitokondriyal Ca2+ alımı ATP uygulaması ile, nöronlarda mitokondriyal Ca2+ alımı ise bir perfüzyon sistemi ile glutamat ve glisin uygulaması ile ortaya çıkarılabilir. Şekil 2 ve Şekil 3, GCaMP6s'ın nöronlarda sırasıyla kültürlü astrositler ve GCaMP5G ile ifade edildiğini göstermektedir. Astrositlerde Mitokondriyal Ca2+ alımı, tek mitokondriyal çözünürlükte 100 μM ATP ile ortaya çıktı (Şekil 2B-D). Nöronlarda mitokondriyal Ca2+ alımı, tek mitokondriyal çözünürlüğe sahip 100 μM glutamat ve 10 μM glisin ile ortaya çıktı (Şekil 3B-D).
Astrositlerde ve nöronlarda GCaMP5G veya 6S'in mitokondriyal ekspresyonunun in vivo 2-P görüntülemesi
Görüntüleme, Ultima 2-P mikroskop sistemi ile astrositlerde ve nöronlarda mitokondriyal floresan sinyallerinin vivo 2-P görüntülemesinde zaman atlamalı olarak toplanır. Biz excitation dalga boyu 880-910 nm kullanın. Şekil 4, fare korteksinde astrositlerde mitokondrilerde GCaMP5G ifadesini göstermektedir. GCaMP5G'nin astrositlere özgü ekspresyonu, SR101'in GCaMP5G ile tek mitokondriyal çözünürlükte(Şekil 4A)kolokalizasyonu ile doğrulandı ve bireysel mitokondrilerde spontan Ca2+ değişiklikleri gözlenebilir (Şekil 4B-E). Şekil 5A, nöronal belirteç NeuN ile kolokalize edilmiş mito-GCaMP6s'ın nörona özgü ekspresyonını göstermektedir. Nöronlarda mito-GCaMP6s floresan dendritlerde mitokondriyal morfoloji gösterir (Şekil 5B). Dendritlerde spontan mitokondriyal Ca2+ artışları gözlenebilir (Şekil 5C-F).
Mitokondriyal Ca2+ sinyallerinin analizi
Bir görüntü analiz yazılımı kullanarak astrositlerde ve nöronlarda hücre gövdesinin veya bireysel mitokondrilerin ortalama piksel yoğunluklarını hesaplayarak floresan sinyalleri ölçün. Ca2+ değişiklikleri fazla mesai (t) zamana karşı F/Fo (t) değerleri olarak ifade edilir; Ca2+ sinyallerinin genliğini karşılaştırmak için en yüksek F/Fo değerlerini kullanın.
Şekil 1: Astrosit ve nörona özgü mitokondri hedefleme transgene ekspresyonu için DNA yapıları, ve in vivo 2-P görüntüleme. (A) A ) Astrositik ve nöronal mitokondriyal matrise teslim için gfaABC 1 D (yukarı) ve CaMKII (düşük) promotörleri ile pZac2.1 plazmidinde genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi GCaMP5G veya GcaMP6s'ın DNA yapıları. Mitokondri hedeflemesi, floresan proteinlerin N-terminuslarına eklenen bir mitokondriyal matris (MM) spesifik dizisi (mito) kullanılarak elde edilir. (B) Bir farenin korteksi üzerinde kraniyotomi. (C) Bir farenin kafatası, 2-P mikroskop aşamasına sabitlenmiş direğe bağlı metal bir plakaya tutturulur. Giriş, kafatasına bağlı metal bir plaka ile kranial pencereyi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mitokondriyal Ca2+ kültürlü astrositlerin görüntülenmesi. (A-B) Mito-GCaMP6s (A) ve belirtilen zamanda 100 μM ATP'nin uyarılmasına verdiği tepkiyi ifade eden bir astrositin 2-P görüntüsü (B). (C) ATP stimülasyonundan sonra farklı zamanlarda dört ayrı mitokondrideki (A, dairelerde) mito-GCaMP6'ların görüntüleri. (D) MITO-GCaMP6s floresanlarının zaman kursları, ATP stimülasyonundan sonraki dört ayrı mitokondride ΔF/Fo olarak çizilir. Kırmızı ok, görüntülemenin başlangıç saatini gösterir. Psödoklor ölçeği, bu ve diğer rakamlardaki floresan yoğunluğunun doğrusal bir gösterimidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kültürlü nöronların Mitokondriyal Ca2+ görüntülenmesi. (A-B) Mito-GCaMP5G'nin nöronu(A)ifade eden 2-P görüntüsü ve belirtilen zamanda(B)100 μM glutamat ve 10 μM glisine yanıtı. (C) Glutamat stimülasyonundan sonra farklı zamanlarda dört ayrı mitokondride (A, dairelerde) mito-GCaMP5G görüntüleri. (D) Mito-GCaMP5G floresanlarının zaman kursları dört ayrı mitokondride değişir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Astrositlerde mitokondriyal Ca 2+ sinyalinin in vivo 2-P görüntülemesi. (A) SR101 ile kolokalize edilmiş astrositleri ifade eden mito-GCaMP5G'nin 2-P görüntüleri. (B-C) spontan Ca 2+ artışının analizi için mito-GCaMP5G'yi ifade eden bir astrositin2-P görüntüsü. (C-E) Farklı zamanlarda (C) astrositteki dört ayrı mitokondrideki (B, dairelerde) mito-GCaMP5G görüntüleri ve dört ayrı mitokondride (E) ΔF/Fo olarak çizilen mito-GCaMP5G floresan değişikliklerinin zaman kursları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Nöronlarda mitokondriyal Ca2+ sinyalinin in vivo 2-P görüntülenmesi. (A) Beyinde nöronal belirteç NeuN (ortada) ile GCaMP6s'ın (üst) kolokalizasyonu. (B) Mitokondriyal morfoloji ile GCaMP6s ifade eden dendritlerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri (*s ile gösterilir). (C) GCaMP6s nöronal mitokondri ile ifade edilir. (D-F) Nöronlarda spontan mitokondriyal Ca2+ artışının analizi. Mito-GCaMP6s'ı farklı zamanlarda C olarak ifade eden mitokondrilerin psödokolor 2-P görüntüsü (D). Farklı zamanlarda (E-F) C (daireler) dört ayrı mitokondri mito-GCaMP6s görüntüleri ve mito-GCaMP6s floresan zaman değişiklikleri zaman kursları, ΔF / Fo olarak çizilir, dört bireysel mitokondri (F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film: Mitokondriyal Ca2+ kültürlü astrositlerde 100 μM ATP'ye yanıt olarak GCaMP5G floresan değişikliklerine göre artar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda astrosit ve nöronlarda mitokondriyal Ca2+ sinyallerinin görüntülenmesi için bir yöntem ve protokol sunuyoruz. GECI GCaMP5G/6'ları ifade etmek için mitokondri hedefleme ve hücre tipine özgü stratejiler uyguladık. Mitokondrilerde GCaMP5G/6'ları hedeflemek için plazmidlere mitokondri hedefleme dizisi dahil ettik. GCaMP5G/6'ları astrositlerde ve nöronlarda ifadeetmek için in vivo , plazmidlere astrositlere özgü bir promotör gfaABC1D ve nörona özgü promotör CaMKII yerleştirdik. Astrositlerde ve nöronlarda GCaMP5G/6'ların hücre tipi spesifik ekspresyolü, astrositlerde SR101 etiketlemesi ve NeuN ile nöronların immünostainingi ile doğrulanabilir. Verilerimizden, bu stratejiler astrositlerde ve nöronlarda mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için güvenilir bir hücre tipi spesifik yaklaşım sağlar.
GECI ifadesi için olası bir sorun, ca2+ arabelleğe alma neden olabilir çünkü ca2+ bağlama tarafından ücretsiz Ca2 + azaltabilir. Dikkat edilmesi gereken bir diğer sorun da enjekte edilen virüs miktarıdır. Aşırı bir virüs enjekte edilirse GECI'yi ifade eden bireysel hücreler tanımlanamayabilir. Bu problemler AAV'nin titresi azaltılarak etkili bir şekilde düzeltilebilir. Fotobleaching de bir sorun olabilir. Teorik olarak, tüm floresan göstergeler fotobleachinge tabidir. GCaMP5G/6'lar oldukça kararlıdır, ancak uyarı ışığına sürekli maruz kalma altında ağartacaklardır. Fotobleaching önlemek için genel bir uygulama yeterli floresan toplanmasını sağlarken lazer ışığına doku maruz kalma süresini azaltmaktır. Yüksek hassasiyetli PMT'ler ve yüksek ışık iletim hedefleri kullanılırsa bu başarılabilir. Fotobleaching, görüntüler arasındaki deklanşör kapatılarak da azaltılabilir.
In vivo 2-P görüntüleme sonuçlarımızda hem astrositlerde hem de nöronlarda spontan mitokondriyal artışlar gözlenebilir. Özellikle, bu mitokondriyal Ca2+ geçicileri uzun sürelere sahiptir (Şekil 4E ve Şekil 5E), Gobel ve ark.30tarafından yayınlanan yeni bir raporla tutarlı . Bu fenomenin altında yer alan mekanizma açık değildir, ancak daha fazla takip edilmeye değer. Sitosit Ca2+ artışı için astrositler ve nöronlar farklı mekanizmalara sahiptir. G-protein reseptör stimülasyonları astrositlerde ER'de Ca2+ artışına neden olurken, voltaj kapılı Ca2+ kanallarının veya glutamat reseptörlerinin aktivasyonları, mitokondriler tarafından yükseltilebilen nöronlarda sitosolik Ca2+ artışına neden olur. Önceki çalışmamızda20, mito-GCaMP5G IP3 5-fosfataz (5ppase) kültürlü astrositlerle kotrans enfekte olduğunda, ATP kaynaklı mitokondriyal Ca2+ artışının büyük ölçüde kaldırılabileceğini bulduk. Bununla birlikte, enzimmatik aktiviteden yoksun 5ppase, yani R343A ve R343A/R350A 5ppase'nin iki mutantları, ATP stimülasyonundan sonra mitokondriyal Ca2+ artışını etkilemedi. Bu sonuçlar, sitosolik ve mitokondriyal Ca2+ seviyelerinin, muhtemelen Astrositlerde ACIL ve mitokondri arasındaki samimi fiziksel bağlantı nedeniyle, sitozolun Ca2+ teslimatı için bir aracı kanal görevi gördüğü için yüksek oranda birleştiği göstermektedir. Ayrıca glutamat stimülasyonunun nöronlarda mitokondriyal Ca2+ artışına neden olduğunu ve glutamat reseptörlerinin hücre dışı uzaydan Ca2+ girişinde rol oynadığını öne sürdük. Gelecekte, astrositlerde ve nöronlarda duyusal tahrikli mitokondriyal Ca2+ artışlarını incelemek ilginç olacaktır.
Yaklaşımımız, farklı floresan dalga boylarındaki iki GECI ifade edildiğinde aynı hücre tipinde sitozolik ve mitokondriyal Ca2+ sinyallerini aynı anda görüntüleyebilmede kullanılabilir, örneğin, sitoplazmada kırmızı floresan GECI RCaMP ve mitokondrilerde GCaMP veya tam tersi31. Bu yaklaşım, nöronlarda astrositler ve RCaMP ile ifade edilen GCaMP ile fizyoloji ve patolojide astrosit-nöron etkileşimlerinin in vivo çalışması için de kullanılabilir.
GCaMP, GFP tabanlı tek dalga boyu florofor GECI'dir. Şu anda, GCaMP'ler yüksek sinyal-gürültü oranı (SNR) ve geniş dinamik aralıkları (DR) nedeniyle en çok tercih edilen Ca2+ göstergeleridir. Son zamanlarda, JGCaMP7 sensörleri, GCaMP6'nın optimize edilmiş sürümü, bireysel ani artışlara karşı geliştirilmiş hassasiyet ile bildirilmiştir16. GCaMP7 sensörleri mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için plazmidlerimize kolayca alt kavunlanabilir. Özetle, burada sunduğumuz stratejiler, mitokondriyal Ca2+ alımını ve işlenmesini, ca2+ değişikliklerini tek mitokondriyal düzeyde çözmek için yeterli hassasiyete sahip nöronlarda ve astrositlerde görüntülemekiçin kullanılabilir vivo . Bu protokol, astrositlerde ve nöronlarda sitosolik ve mitokondriyal Ca2+ sinyallerinin yanı sıra astrosit-nöron etkileşimlerini incelemek için yararlı bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) tarafından desteklenmiştir R01NS069726 ve R01NS094539 SD'ye hibe eder. Erica DeMers'a ses kaydı için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
