Denna proctocol syftar till att tillhandahålla en metod för in vitro och in vivo mitokondriell Ca2 + imaging i astrocyter och nervceller.
Mitokondriell Ca2+ spelar en avgörande roll för att kontrollera cytosolisk Ca2 + buffring, energimetabolism och cellulär signaltransduktion. Överbelastning av mitokondriell Ca2+ bidrar till olika patologiska tillstånd, inklusive neurodegeneration och apoptotisk celldöd vid neurologiska sjukdomar. Här presenterar vi en celltypspecifik och mitokondrier inriktad på molekylär metod för mitokondriell Ca2 + avbildning i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo. Vi konstruerade DNA-plasmider som kodar mitokondrier-inriktning genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) GCaMP5G eller GCaMP6s (GCaMP5G/6s) med astrocyt- och neuronspecifika promotorer gfaABC1D och CaMKII och mitokondrier-målsekvens (mito-). För in vitro mitokondriell Ca2 + imaging, var plasmiderna transfected i odlade astrocyter och nervceller att uttrycka GCaMP5G/6s. För in vivo mitokondriell Ca2 + imaging, adeno-associerade viral vektorer (AAV) förbereddes och injiceras i mushjärnorna att uttrycka GCaMP5G/6s i mitokondrier i astrocyter och nervceller. Vårt tillvägagångssätt ger ett användbart sätt att avbilda mitokondriell Ca2 + dynamik i astrocyter och nervceller för att studera förhållandet mellan cytosolic och mitokondriell Ca2 + signalering, liksom astrocyt-neuron interaktioner.
Mitokondrier är dynamiska subcellulära organeller och anses vara cellkraftverk för energiproduktion. Å andra sidan kan mitokondrier ta upp Ca2+ till matrisen som svar på lokala eller cytosoliska Ca2 + ökningar. Mitokondriell Ca2+ upptag påverkar mitokondriell funktion, inklusive metaboliska processer såsom reaktioner i trikarboxylsyra (TCA) cykeln och oxidativ fosforylering, och reglerar Ca2+känsliga proteiner under fysiologiska förhållanden1,2,3,4. Mitokondriell Ca2 + överbelastning är också en avgörande faktor för celldöd, inklusive nekros och apoptos i olika hjärnsjukdomar5,6,7. Det orsakar öppnandet av mitokondriell permeabilitet övergång pores (mPTPs) och frisättningen av caspase cofactor, som initierar apoptotic cell död. Därför är det viktigt att studera mitokondriell Ca2 + dynamik och hantering i levande celler för att bättre förstå cellulär fysiologi och patologi.
Mitokondrier upprätthåller matris ca2+ homeostas genom en balans mellan Ca2+ upptag och efflux. Mitokondriell Ca2+ upptaget förmedlas huvudsakligen av mitokondriella Ca2+ uniporters (MCUs), medan mitokondriell Ca2 + efflux förmedlas av Na+-Ca2 +-Li+ växlare (NCLXs) och H+/ Ca2 + växlare (mHCXs)8. Balansen kan störas genom stimulering av G-proteinkopplade receptorer (GPCRs)9. Mitokondriell Ca2 + homeostas påverkas också av mitokondriell buffring genom bildandet av olösliga xCa2+-xPO4x-xOH-komplex8.
Intracellulära och mitokondriella förändringar i Ca2+ koncentration ([Ca2+]) kan utvärderas med fluorescerande eller självlysande Ca2+ indikatorer. Ca2+ bindning till indikatorer orsakar spektraländringar, vilket gör det möjligt att registrera gratis cellulära [Ca2 +] i realtid i levande celler. Två typer av sonder finns för närvarande tillgängliga för att övervaka Ca2+ förändringar i celler: organiska kemiska indikatorer och genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs). I allmänhet finns olika varianter med olika Ca2 + affiniteter (baserat på Kd), spektralegenskaper (excitation och emissionsvåglängder), dynamiska intervall och känsligheter tillgängliga för de biologiska frågor som undersöks. Även om många syntetiska organiska Ca2 + indikatorer har använts för cytosolisk Ca2 + imaging, kan endast ett fåtal selektivt laddas i mitokondriell matris för mitokondriell Ca2 + imaging, med Rhod-2 är den mest använda (för recensioner se10,11). Rhod-2 har dock en stor nackdel med läckage under långa tidsvägsexperiment; Dessutom är det delat mellan mitokondrier, andra organeller och cytosol, vilket gör absoluta mätningar i olika underparter svåra. Genom att använda celltypsspecifika promotorer och subcellulära fackinriktningssekvenser kan GECIs uttryckas i olika celltyper och subcellulära fack för cell- och fackspecifika Ca2+ imaging in vitro eller in vivo. Envågiga fluorescensintensitetsbaserade GCaMP Ca2+-indikatorer har nyligen dykt upp som stora GECIs12,13,14,15,16. I den här artikeln tillhandahåller vi ett protokoll för mitokondrier-inriktning och celltyp specifika uttryck för GCaMP5G och GCaMP6s (GCaMP5G/6s) i astrocyter och nervceller, och imaging mitokondriell Ca2 + upptag i dessa celltyper. Med hjälp av detta protokoll kan uttrycket av GCaMP6G/6s i enskilda mitokondrier avslöjas, och Ca2 + upptag i en enda mitokondriell upplösning kan uppnås i astrocyter och nervceller in vitro och in vivo.
I den här artikeln tillhandahåller vi en metod och protokoll för avbildning mitokondriell Ca2 + signaler i astrocyter och nervceller. Vi implementerade mitokondrier-inriktning och celltypspecifika strategier för att uttrycka GECI GCaMP5G/6s. För att rikta in sig på GCaMP5G/6s i mitokondrier inkluderade vi en mitokondrier-målsekvens i plasmiderna. För att uttrycka GCaMP5G/6s i astrocyter och nervceller in vivo, satte vi in en astrocytspecifik promotor gfaABC1D och neuron-specifika promotorn CaM…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) bidrag R01NS069726 och R01NS094539 till SD. Vi tackar Erica DeMers för ljudinspelningen.
Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |