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Biology

आवर्ती गर्भपात में चार एंडोमेट्रियल इम्यून सेल प्रकारों के मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग

Published: August 4, 2021 doi: 10.3791/62931
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1, 1,4, 1,5, 3, 1
1Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, Shenzhen Baoan Women’s and Children’s Hospital, Shenzhen University, 4School of Medicine, Faculty of Medicine and Health Sciences, Keele University, 5Li Ka Shing Institute of Health Sciences; School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong

Summary

मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग में प्रगति के बावजूद, एंडोमेट्रियम में एक साथ प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिकाओं के घनत्व और क्लस्टरिंग की विशेषता एक चुनौती बनी हुई है। यह पेपर एंडोमेट्रियम में चार प्रतिरक्षा सेल प्रकारों के एक साथ स्थानीयकरण के लिए एक विस्तृत मल्टीप्लेक्स धुंधला प्रोटोकॉल और इमेजिंग का वर्णन करता है।

Abstract

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैविक अनुसंधान और नैदानिक निदान में ऊतक एंटीजन की पहचान और दृश्य के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधि है। इसका उपयोग विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं या विकृतियों की विशेषता के लिए किया जा सकता है, जैसे घाव-उपचार, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, ऊतक अस्वीकृति, और ऊतक-बायोमटेरियल इंटरैक्शन। हालांकि, पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) धुंधला का उपयोग करके एक ही ऊतक अनुभाग में कई एंटीजन (विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए) का दृश्य और मात्राकरण असंतोषजनक बना हुआ है। इसलिए, हाल के वर्षों में एक ऊतक नमूने या विभिन्न ऊतक नमूनों के एक कलाकारों की टुकड़ी में कई जैविक मार्कर की पहचान करने के लिए मल्टीप्लेक्स प्रौद्योगिकियों को पेश किया गया था ।

ये प्रौद्योगिकियां प्रत्यारोपण के दौरान आवर्ती गर्भपात के साथ उपजाऊ महिलाओं और महिलाओं के बीच एंडोमेट्रियम के भीतर प्रतिरक्षा सेल-टू-सेल इंटरैक्शन में परिवर्तन को अलग करने में विशेष रूप से उपयोगी हो सकती हैं। यह पत्र भ्रूण प्रत्यारोपण के दौरान ठीक समय पर एंडोमेट्रियल नमूनों में एक साथ चार प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के घनत्व और क्लस्टरिंग की जांच करने के लिए मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस आईएचसी धुंधला के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । इस विधि में नमूना तैयारी, प्रतिरक्षा कोशिका उपप्रकारों के लिए मार्कर के साथ मल्टीप्लेक्स अनुकूलन, और स्लाइडों की स्कैनिंग, डेटा विश्लेषण के बाद, एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने के लिए विशिष्ट संदर्भ के साथ शामिल है।

इस विधि का उपयोग करके, एंडोमेट्रियम में चार प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के घनत्व और क्लस्टरिंग का एक साथ एक ही ऊतक अनुभाग में विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, यह पेपर लागू की जा रही फ्लोरोसेंट जांच के बीच संभावित फ्लोरोफोर हस्तक्षेप को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण कारकों और समस्या निवारण पर चर्चा करेगा। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस मल्टीप्लेक्स स्टेनिंग तकनीक के परिणाम भ्रूण प्रत्यारोपण के दौरान इम्यूनोलॉजिक इंटरैक्शन और नियमन की गहराई से समझ प्रदान करने में मदद कर सकते हैं ।

Introduction

गर्भकाल1के 24 सप्ताह से पहले दो या अधिक गर्भधारण के नुकसान के रूप में आवर्ती गर्भपात (आरएम) को परिभाषित किया जा सकता है। बार - बार प्रजनन की यह स्थिति दुनिया भर में 1% तक जोड़ों को प्रभावित करती है2,3. रोगविज्ञान बहुरूपी है और इसे भ्रूणीय रूप से संचालित कारणों (मुख्य रूप से असामान्य भ्रूणीय कारियोटाइप के कारण) और मातृ चालित कारणों में विभाजित किया जा सकता है जो एंडोमेट्रियम और/या अपरा विकास को प्रभावित करते हैं । इस अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप माता-पिता की आनुवंशिक असामान्यताएं, गर्भाशय विसंगतियां, प्रोथ्रोम्बोटिक स्थितियां, एंडोक्राइनोलॉजी कारक और इम्यूनोलॉजिकल विकार4हो सकते हैं।

हाल के वर्षों में, प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिका रोग जल्दी गर्भावस्था हानि5के रोगजनन में फंसाया गया है । इसने प्रारंभिक गर्भावस्था में विशिष्ट भूमिकाओं के साथ मासिक धर्म चक्र, प्रत्यारोपण और प्रारंभिक गर्भावस्था के दौरान एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी को स्पष्ट करने में कई जांचों को प्रेरित किया है। इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, गर्भाशय प्राकृतिक हत्यारा (यूएनके) कोशिकाएं भ्रूण प्रत्यारोपण और गर्भावस्था के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, विशेष रूप से ट्रोफोब्लास्टिक आक्रमण और एंजियोजेनेसिस6की प्रक्रियाओं में। अध्ययनों से पता चला है कि आरएम7,8वाली महिलाओं के एंडोमेट्रियम में यूएनके सेल घनत्व में वृद्धि हुई है,हालांकि यह निष्कर्ष गर्भपात के बढ़ते जोखिम से जुड़ा नहीं था9. हालांकि, इस ने आरएम10, 11के साथ महिलाओं में एंडोमेट्रियम में अन्य प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों (जैसे मैक्रोफेज, गर्भाशय डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं) के घनत्व का मूल्यांकन करने वाले शोध को प्रेरित किया। फिर भी, यह अनिश्चित रहता है कि क्या आरएम के साथ महिलाओं में पेरी-इम्प्लांटेशन एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा कोशिका घनत्व में महत्वपूर्ण परिवर्तन होता है।

अनिश्चितता के लिए एक संभव स्पष्टीकरण यह है कि एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा सेल घनत्व का मूल्यांकन प्रत्यारोपण की खिड़की के दौरान एंडोमेट्रियम में तेजी से परिवर्तन के कारण मुश्किल हो सकता है। 24 घंटे की समय सीमा के दौरान, एंडोमेट्रियम में महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रतिरक्षा कोशिका घनत्व और साइटोकिन स्राव को बदलते हैं, इन परिणामों में भिन्नता का स्रोत पेश करतेहैं 12। इसके अलावा, अधिकांश रिपोर्टें मुख्य रूप से एकल-सेल धुंधला (जैसे, पारंपरिक आईएचसी विधियों) के उपयोग पर निर्भर करती हैं जो एक ही ऊतक अनुभाग पर कई मार्कर की जांच नहीं कर सकते थे। यद्यपि प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग एक ही नमूने में कई सेल आबादी का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, लेकिन आवश्यक कोशिकाओं की बड़ी मात्रा और समय लेने वाली अनुकूलन इस विधि की लोकप्रियता और दक्षता में बाधा डालता है। इसलिए, मल्टीप्लेक्स आईएचसी धुंधला में हाल ही में उन्नति सेल वंश और व्यक्तिगत प्रतिरक्षा उपआबादी के हिस्टोलॉजिकल स्थानीयकरण सहित कई मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए एक ही स्लाइड पर कई मार्कर इम्यूनोदाता द्वारा इस समस्या को हल कर सकता है । इसके अलावा, यह तकनीक सीमित ऊतक उपलब्धता के मामले में प्राप्त जानकारी को अधिकतम कर सकती है। अंततः, यह तकनीक उपजाऊ महिलाओं और आरएम के साथ महिलाओं के बीच एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा सेल इंटरैक्शन में अंतर को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है।

महिलाओं के दो समूहों को प्रिंस ऑफ वेल्स अस्पताल से भर्ती किया गया, जिसमें उपजाऊ नियंत्रण महिलाओं (एफसी) और अस्पष्टीकृत आवर्ती गर्भपात (आरएम) वाली महिलाएं शामिल हैं । उपजाऊ नियंत्रण महिलाओं को जो सहज गर्भपात के किसी भी इतिहास के बिना कम से एक जीवित जंम था के रूप में परिभाषित किया गया था, और आरएम महिलाओं को जो 20 सप्ताह के गर्भ से पहले ≥२ लगातार गर्भपात का इतिहास था के रूप में परिभाषित किया गया । दोनों समूहों के विषयों ने निम्नलिखित समावेशन मानदंडों को पूरा किया: (क) 20 से ४२ वर्ष के बीच की आयु, (ख) धूम्रपान न करने वाले, (ग) नियमित मासिक धर्म चक्र (25-35 दिन) और सामान्य गर्भाशय संरचना, (घ) एंडोमेट्रियल बायोप्सी से कम से कम 3 महीने पहले किसी भी हार्मोनल आहार का कोई उपयोग नहीं, (ई) हिस्टेरो-साल्पिंगोग्राम द्वारा हाइड्रोसालपिंक्स नहीं। इसके अलावा भर्ती किए गए सभी विषयों में सामान्य कारियोटाइपिंग, सामान्य 3-डायमेंशनल अल्ट्रासोनोग्राफी हिस्टीरोसलपिंगोग्राम, दिन 2 कूप उत्तेजक हार्मोन < 10 आईयू/एल, मिड-ल्यूटल प्रोजेस्टेरोन > 30 एनएमओल/एल, नॉर्मल थायराइड फंक्शन, और ल्यूपस एंटीकोगुलांट और एंटीकार्डियोलीपिन आईजीजीजी और इग्म एंटीबॉडीज के लिए निगेटिव टेस्ट किया गया ।

आरएम के प्रतिरक्षा आधार को बेहतर ढंग से समझने के लिए, प्रत्यारोपण के समय एंडोमेट्रियम में मौजूद प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों को एक साथ मात्रा निर्धारित करना और स्थानीयकरण करना सबसे वांछनीय होगा। यह पेपर नमूना तैयार करने से पूरे प्रोटोकॉल, प्रतिरक्षा सेल उपप्रकारों के लिए मार्कर के साथ मल्टीप्लेक्स अनुकूलन, और स्लाइडों की स्कैनिंग का वर्णन करता है, इसके बाद एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने के लिए विशिष्ट संदर्भ के साथ डेटा विश्लेषण किया जाता है। इसके अलावा, यह पेपर एंडोमेट्रियम में एक साथ प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के घनत्व और क्लस्टरिंग को निर्धारित करने का वर्णन करता है।

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Protocol

इस अध्ययन को हांगकांग के संयुक्त चीनी विश्वविद्यालय-न्यू टेरिटरीज ईस्ट क्लस्टर क्लीनिकल रिसर्च एथिक्स कमेटी ने मंजूरी दी थी । एंडोमेट्रियल बायोप्सी एकत्र करने से पहले प्रतिभागियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। नियंत्रण और आरएम समूहों के समावेश मापदंड के लिए परिचय अनुभाग को देखें।

1. नमूना तैयार करना

  1. सुनिश्चित करें कि इस अध्ययन में सभी महिलाओं को मासिक धर्म चक्र के 9 दिन से दैनिक मूत्र डिपस्टिक परीक्षण से गुजरना के बाद ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) वृद्धि की पहचान करने के लिए ovulation का पता लगाने के लिए, और समय एंडोमेट्रियल बायोप्सी ठीक 7वें दिन पर LH वृद्धि (LH + 7) के बाद ।
  2. अस्पष्टीकृत आरएम के साथ उपजाऊ महिलाओं और महिलाओं से पिपेले पारखी या पिपेट क्यूरेट का उपयोग करके एंडोमेट्रियल बायोप्सी का 0.5 सेमी2 टुकड़ा प्राप्त करें। कंटेनर को लेबल करें और कमरे के तापमान पर रात भर के निर्धारण के लिए 10% तटस्थ-बफर फॉर्मेलिन (पीएच 7) में नमूना तुरंत रखें।
    नोट: सुधारक की मात्रा ऊतक की 5-10 गुना होनी चाहिए।
  3. पिघले हुए पैराफिन वैक्स में एम्बेड करने से पहले टिश्यू प्रोसेसिंग मशीन में डिहाइड्रेशन के लिए टिश्यू को एक कारतूस में रखें। पैराफिन में ऊतकों को 58-60 डिग्री सेल्सियस पर एम्बेड करें।
  4. पैराफिन ब्लॉक कमरे के तापमान पर रात भर ठंडा करने के लिए अनुमति दें। पैराफिन ब्लॉक को 3 माइक्रोन की मोटाई में ट्रिम करने के लिए एक माइक्रोटॉम का उपयोग करें।
    नोट: उचित ऊतक बढ़ते और मल्टीप्लेक्स धुंधला भर में पालन में आसुत पानी एड्स का उपयोग करें ।
  5. पैराफिन रिबन को 30 एस के लिए 40-45 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें।
  6. पॉली-एल-लिसिन (0.1% w/v) पर वर्गों माउंट-लेपित माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड। स्लाइड्स को ऊपर की ओर आते हुए टिश्यू के साथ रखें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सूखने दें। आगे के उपयोग तक चरम तापमान से दूर स्लाइड बॉक्स में स्लाइड स्टोर करें।

2. पारंपरिक आईएचसी का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स आईएचसी के लिए एंटीबॉडी की आदर्श एकाग्रता निर्धारित करें।

नोट: यह एंडोमेट्रियम नमूने में प्रत्येक प्रतिरक्षा मार्कर के अभिव्यक्ति स्तर और पैटर्न की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, और प्रत्येक मार्कर के धुंधला अनुक्रम के साथ-साथ उनके संबद्ध टायमाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) फ्लोरोफोर पेयरिंग का निर्धारण करता है।

  1. मैनुअल पारंपरिक आईएचसी13का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स आईएचसी के लिए उनकी उपयुक्तता के लिए एंटीबॉडी का परीक्षण करें।
  2. एकल एंटीबॉडी परीक्षण के लिए एंडोमेट्रियम ऊतकों का उपयोग करें।
  3. प्रत्येक एंटीबॉडी की धुंधला स्थिति को अनुकूलित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण (जैसे, तिल्ली) और नकारात्मक नियंत्रण (आइसोटाइप नियंत्रण) शामिल करें।
  4. एंटीबॉडी की डेटाशीट द्वारा अनुशंसित कमजोर पड़ने का उपयोग करके धुंधला प्रदर्शन करें।
  5. चरण 2.3 में उपयोग किए जाने वाले अनुशंसित कमजोर पड़ने के ऊपर और नीचे सांद्रता का उपयोग करके अतिरिक्त धुंधला करें।
    नोट: एक नैदानिक रोगविज्ञानी एंटीबॉडी जांच और सेलुलर अखंडता के स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए आंख बंद करके दाग स्लाइड का आकलन करना चाहिए ।

3. मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि

  1. स्लाइड तैयारी और निर्धारण
    1. स्लाइड्स (चरण 1.6 से) एक ओवन में ऊपर की ओर का सामना करना पड़ ऊतक के साथ फ्लैट और कम से कम 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना।
    2. ओवन से स्लाइड निकालें और उन्हें एक ऊर्ध्वाधर स्लाइड रैक में रखने से पहले कमरे के तापमान पर कम से कम 20 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. डेवैक्स और फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड स्लाइड्स को निम्नलिखित चरणों में से प्रत्येक को आवंटित 10 मिनट के साथ फिर से हाइड्रेट करें: जाइलीन (2x), 100% इथेनॉल (2x), 95% इथेनॉल (1x), 70% इथेनॉल (2x), और आसुत पानी (2x)।
    4. स्लाइड्स के रैक को प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स में रखें और उन्हें ट्रिस-बफर खारा (टीबीएस, पीएच 7.6) में जलमग्न करें।
      नोट: स्लाइड्स अंतिम चरण में बढ़ते जब तक इस रिहाइड्रेशन कदम से शुरू नम रहना चाहिए .
    5. स्लाइड्स को एक प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स में डूबकर नमूनों को ठीक करें, जो अंधेरे में 30 मिनट के लिए मेथनॉल (1:9) में पतला फॉर्मलडिहाइड के मिश्रण से भरा हुआ है।
    6. स्लाइड्स को 2 मिनट के लिए डिएकोनाइज्ड वॉटर में दो बार धोएं और फिर एंटीजन रिट्रीवल के लिए आगे बढ़ें ।
  2. एपिटोप पुनः प्राप्ति
    1. स्लाइड्स के रैक को हीट-रेसिस्टेंट बॉक्स में रखें और स्लाइड्स को कवर करने के लिए साइट्रिक एसिड बफर (पीएच 6.0) से भरें।
    2. बॉक्स को माइक्रोवेव में रखें, और 100% बिजली पर 50 एस के लिए स्लाइड गर्म करें और इसी तापमान को बनाए रखने के लिए 20% बिजली पर 20 मिनट के बाद।
    3. स्लाइड कमरे के तापमान पर लगभग 15 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए अनुमति दें ।
    4. 2 मिनट के लिए पानी में स्लाइड कुल्ला के बाद 2 मिनट के लिए TBS-ट्वीन 20 (TBST) ।
      नोट: टीबीएसटी 25 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.5), 150 mm NaCl, और 0.05% ट्वीन 20 (v/v) से बना है।
  3. अवरुद्ध
    1. 10 मिनट के लिए पेरोक्सिडेस ब्लॉकिंग समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) वाले जार पर स्लाइड को विसर्जित करके ऊतक में अंतर्जात पेरोक्सिडास गतिविधि को अवरुद्ध करें।
    2. 5 मिनट के लिए TBST के साथ स्लाइड धो लें।
    3. स्लाइड पर ऊतक अनुभाग के चारों ओर एक सीमा को चिह्नित करने के लिए हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन का उपयोग करें।
    4. एक अवरुद्ध बफर के साथ ऊतक वर्गों को कवर करें (सामग्री की तालिकादेखें) या गोजातीय सीरम एल्बुमिन (5%, w/v), और 15 मिनट के लिए एक आर्द्रीकृत कक्ष में स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
  4. एंटीबॉडी और सिग्नल एप्लिकेशन
    1. ब्लॉकिंग रिएजेंट्स को हटा दें।
    2. ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट (उदाहरण के लिए, सीडी 3, एंटीबॉडी पतला में 1:100 कमजोर पड़ने, टेबल 1देखें) 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक आर्द्रीकृत कक्ष में।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें। हर बार 5 मिनट के लिए टीबीटी के साथ 3x धोएं।
    4. पॉलीमर सहिजन पेरोक्सिडेज (एचआरपी) के साथ इनक्यूबेट-कमरे के तापमान पर एक आर्द्रीकृत कक्ष में 15 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी(तालिका 1)लेबल। हर बार 5 मिनट के लिए टीबीटी के साथ 3x धोएं।
    5. ओपल फ्लोरोफोर टीएसए वर्किंग सॉल्यूशन (प्रवर्धन मंदता में 1:100) और प्राथमिक एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों पर ऊतक नमूने के लिए फ्लोरोफोर कंजूगेशन की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। हर बार 5 मिनट के लिए ट्रिपलीकेट में टीबीसेंट के साथ धोएं।
  5. माइक्रोवेव आधारित स्ट्रिपिंग
    1. एंटीजन रिट्रीवल बफर (साइट्रेट बफर समाधान, पीएच 6.0) के साथ कुल्ला।
    2. अगले प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, सीडी 20) को पेश करने के लिए प्राथमिक-माध्यमिक-एचआरपी परिसर को हटाने के लिए माइक्रोवेव-आधारित स्ट्रिपिंग करें।
    3. एंटीजन रिट्रीवल बफर में स्लाइड रखें, उन्हें 50 एस के लिए 100% बिजली पर माइक्रोवेव करें और इसके बाद माइक्रोवेव-सुरक्षित कंटेनरों में 20 मिनट के लिए 20% बिजली हो, और उन्हें 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
    4. जब तक ऊतक के नमूनों की सभी प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जांच नहीं की गई है तब तक 3.2.4 से 3.5.2 चरणों को दोहराएं।
  6. काउंटरटाइन और बढ़ते
    1. माइक्रोवेव आधारित विपठ्ठन और एंटीजन रिट्रीवल बफर के ठंडा करने के बाद, आसुत पानी और TBST में स्लाइड कुल्ला ।
    2. कमरे के तापमान पर आर्द्रीकृत कक्ष में 5 मिनट के लिए 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडलोल (डीएपीआई) समाधान (1.0 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ इनक्यूबेट।
    3. हर बार 5 मिनट के लिए टीबीटी के साथ 3x धोएं। 5 मिनट के लिए एक बार पानी से धो लें।
    4. एयर-स्लाइड को सुखा लें और उपयुक्त बढ़ते माध्यम के साथ माउंट करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी विकास के लिए मोनोप्लेक्स स्लाइड का उपयोग करने के लिए काउंटरस्टैनिंग की आवश्यकता नहीं होगी।

4. छवि और विश्लेषण

  1. स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी स्लाइड की तैयारी
    1. मल्टीस्पेक्ट्रल इमेज एनालिसिस के लिए एक ही कंट्रोल टिश्यू के साथ प्रत्येक फ्लोरोफोर, डीएपीआई और ऑटो फ्लोरेसेंस के लिए लाइब्रेरी स्लाइड (सिंगल-स्टेन रेफरेंस इमेज) बनाएं।
    2. आरएम और उपजाऊ महिलाओं के साथ महिलाओं से एंडोमेट्रियल बायोप्सी नमूनों की स्लाइड का उपयोग करना, प्रत्येक स्लाइड के लिए एकल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए चरण 1.1 से 3.6.4 प्रदर्शन (आगे एंटीबॉडी या फ्लोरोफोर अतिरिक्त के बिना)।
    3. प्रत्येक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए, DAPI के साथ स्लाइड में से एक दाग (चरण 3.6.2 के रूप में) और स्पेक्ट्रम में किसी भी संभावित ऊतक ऑटो फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए एक स्लाइड को दाग दें।
    4. प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए स्लाइड के इस सेट के लिए छवि प्राप्त करने के लिए वर्कस्टेशन में उपयुक्त फ़िल्टर का उपयोग करें और उन्हें छवि विश्लेषण पुस्तकालय में अपलोड करें (जैसा कि चरण 4.2 में वर्णित है)।
    5. एक बार छवि पर कब्जा कर लिया है, स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी स्रोत के रूप में inForm का चयन करें और स्पेक्ट्रल पुस्तकालय का निर्माण करें।
    6. के रूप में फ्लोरोफोरस का उपयोग किया जाता है, मेनू से दाग/Fluors का चयन करें.
    7. दाग या फ्लोरोफोरस चुनते समय, एक या एक से अधिक समूहों का चयन करके विकल्पों को संकीर्ण करें। छवियों के साथ संगत सभी स्पेक्ट्रा दिखाने के लिए सभी का चयन करें।
  2. स्पेक्ट्रल इमेजिंग
    नोट: इनफॉर्म इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्थापित स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के साथ मंत्र वर्कस्टेशन का उपयोग करके छवियों को कैप्चर किया गया था।
    1. वर्कस्टेशन का उपयोग करके टेबल 2 (जैसे, डीएपीआई, फ्लोरोथियोसायनेट [फिटसी], CY3, टेक्सास रेड और CY5) में प्रस्तावित उपयुक्त एपीआई-फ्लोरेसेंस फिल्टर के साथ एकल-एंटीबॉडी-दाग वाली स्लाइडों की छवि को कैप्चर करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट फ्लोरोफोरस के लिए अनुशंसित फ़िल्टर तालिका 2में दिखाए गए हैं।
    2. अपने इसी फ्लोरेसेंस चैनल में प्रत्येक मार्कर की जांच करके एक इष्टतम संकेत के लिए एक उपयुक्त जोखिम समय की पहचान करें।
      नोट: इष्टतम संकेत सकारात्मकता और स्थानीयकरण पर संदर्भ के अनुसार निर्धारित किया जाता है जो एकल एंटीबॉडी धुंधला में प्राप्त होता है।
    3. क्रॉस-सैंपल तुलना को मानकीकृत करने के लिए प्रत्येक विश्लेषण (एंटीबॉडी-फ्लोरोफोर संयोजन) के लिए एक निश्चित एक्सपोजर समय निर्धारित करें।
      नोट: निश्चित एक्सपोजर का निर्धारण हितों के नमूने में तीव्रता पर निर्भर करता है।
    4. एम्बेडेड ऑटोफोकस एल्गोरिदम के साथ उपयुक्त स्कैनिंग मोड में मल्टीप्लेक्स दाग स्लाइडों को स्कैन करें।
      नोट: स्थापित स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का उपयोग मल्टीस्पेक्ट्रल इमेज क्यूब को एकल व्यक्तिगत घटकों (स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग) में अंतर करने के लिए किया जाएगा। यह निम्नलिखित दो मुख्य चरणों का उपयोग करके ब्याज के सभी मार्कर के लिए रंग-आधारित पहचान की अनुमति देगा: प्रशिक्षण सत्र और छवि विश्लेषण सत्र।
  3. छवि विश्लेषण
    1. एंडोमेट्रियम में चयनित प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की सेल गिनती
    2. 200x आवर्धन के तहत विश्लेषण के लिए न्यूनतम 10 फ़ील्ड कैप्चर करें।
      नोट: खेतों को बिना किसी चयन के पूरे खंड को स्कैन करके कब्जा कर लिया गया था। यह एंडोमेट्रियम के सभी सेल घटकों का एक साथ कब्जा सुनिश्चित कर सकता है, उदाहरण के लिए, चमकदार एपिथेलियल सीमा, स्ट्रोमा और ग्रंथियों।
    3. कोशिकाओं की गिनती करने के लिए, ऑब्जेक्ट काउंटिंग सेटिंग पैनल प्रदर्शित करने के लिए स्टेप बार में काउंट ऑब्जेक्ट्स बटन पर क्लिक करें।
    4. छवि, प्रक्रिया क्षेत्र या ऊतक क्षेत्र के किनारे को छूने वाली किसी भी वस्तु के बहिष्कार के लिए एज बॉक्स को छूने पर डिस्कार्ड ऑब्जेक्ट की जांच करें।
    5. यदि ऊतक को खंडित किया गया है, तो ऊतक श्रेणी का चयन करें जिसमें वस्तुओं को पाया जाना है। चयनित ऊतक श्रेणी के बाहर वस्तुओं की गिनती न करें।
    6. ऑब्जेक्ट्स की पहचान करने के लिए वांछित दृष्टिकोण का चयन करें: ऑब्जेक्ट-बेस्ड या पिक्सेल-बेस्ड (थ्रेसहोल्ड)।
      नोट: पिक्सेल-आधारित (थ्रेसहोल्ड) दृष्टिकोण का चयन एक विश्वसनीय या लगातार दाग के मामले में किया जाना चाहिए जिसके लिए एक साधारण सीमा का आवेदन ऑब्जेक्ट पिक्सल निकलेगा। ऑब्जेक्ट-आधारित दृष्टिकोण की सिफारिश तब की जाती है जब वस्तुओं के धुंधला होने की स्थिरता और विशिष्टता की कमी के मामले में अधिक उन्नत रूपोमेट्री-आधारित दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है।
    7. वांछित सिग्नल स्केलिंगका चयन करें: ऑटो स्केल या फिक्स्ड स्केल।
      नोट: ऑटो स्केल चुनने से ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन करने से पहले प्रत्येक घटक विमान की स्वचालित स्केलिंग होगी। बेहतर विभाजन प्रदर्शन की आवश्यकता होने पर फिक्स्ड स्केल विकल्प की सिफारिश की जाती है, और दाग संकेत सुसंगत और विश्वसनीय होते हैं।
    8. ड्रॉप-डाउन सूची से ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन के लिए प्राथमिक घटक का चयन करें।
    9. प्राथमिक घटक के लिए न्यूनतम सिग्नल मूल्य को वांछित सीमा मूल्य में समायोजित करें।
    10. वस्तुओं में छेद को स्वचालित रूप से भरने के लिए, फिल होलका चयन करें।
    11. एक वस्तु के रूप में अन्य वस्तुओं को छूने वाली वस्तुओं का पता लगाने के लिए, एक वस्तु के रूप में, अधिकतम आकार (पिक्सल) चेक बॉक्स का चयन करने के बाद रिफाइन एज़िंग चेक बॉक्स का चयन करें।
    12. वस्तुओं की गोलाई के आधार पर वस्तुओं को बाहर करने के लिए, गोलाई बॉक्स की जांच करें और वांछित न्यूनतम गोलाकारतानिर्दिष्ट करें।
    13. रक्त वाहिकाओं के आसपास की कोशिकाओंसहित सभी स्ट्रोमल कोशिकाओं (सीडी3−/सीडी20−/सीडी 68−सीडी56−औरडीएपीआई+)को गिनें।
    14. टी कोशिकाओं (सीडी 3+ और DAPI+),बी कोशिकाओं (सीडी 20 + और DAPI+), मैक्रोफेज (सीडी 68 + और DAPI+),और uNK कोशिकाओं (सीडी 56+ और DAPI+)सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग से गिनें।
    15. प्रत्येक कैप्चर की गई छवि के लिए स्ट्रोमल कोशिकाओं की कुल संख्या के सापेक्ष प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में डेटा व्यक्त करें, और अंतिम सेल गणना को सभी क्षेत्रों के औसत के रूप में रिपोर्ट करें।
    16. परिणामस्वरूप डेटा टेबल पोस्ट प्रोसेसिंग देखने के लिए व्यू एडिटर का उपयोग करें। काउंट डेटा टेबलका निर्यात करें।
    17. एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा सेल स्थानिक वितरण का मात्राकरण
    18. 200x आवर्धन के तहत, 0-20 माइक्रोन की एक श्रृंखला के लिए आर कार्यक्रम का उपयोग कर एल-फ़ंक्शन का अनुमान लगाएं जो सेल-सेल संपर्क अधिकतम दूरी14माना जाता है।
      नोट: आर भाषा टूलबॉक्स 'स्पैटस्टेट' का उपयोग एल-फ़ंक्शन को मापने के लिए किया गया था।
      1. उनके एल-फंक्शन के वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र के आधार पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न जोड़े के क्लस्टरिंग के स्तर को निरूपित करें।

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Representative Results

4 एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा सेल प्रकारों का पता लगाने के लिए 4 रंग मल्टीप्लेक्स परख करने की समग्र योजनाबद्ध प्रक्रिया चित्र 1में दिखाई गई है। संक्षेप में, इस मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए प्रोटोकॉल के लिए 8 प्रमुख चरणों की आवश्यकता होती है: 1. स्लाइड तैयारी, 2. एपिटोप रिट्रीवल, 3. ब्लॉकिंग, 4. प्राथमिक एंटीबॉडी एप्लिकेशन, 5. माध्यमिक एंटीबॉडी आवेदन, 6. सिग्नल प्रवर्धन, 7. एंटीबॉडी को हटाना, और 8. काउंटरटेन और माउंट। इसके बाद एंडोमेट्रियम सैंपल(चित्रा 2)में 4 प्रतिरक्षा सेल प्रकारों में अंतर करने के लिए इनफॉर्म इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के साथ मंत्र वर्कस्टेशन का उपयोग करके छवि प्रतिपादन और विश्लेषण किया गया।

इस मल्टीप्लेक्स स्टेनिंग तकनीक का उपयोग करके मानव एंडोमेट्रियम नमूनों में चार एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की पहचान की जा सकती है: सीडी 3 + टी कोशिकाएं, सीडी 20 + बी कोशिकाएं, सीडी 68 + मैक्रोफेज, और सीडी 56 + यूएनके कोशिकाएं(चित्र 3)। हालांकि, फ्लोरोफोर हस्तक्षेप को स्पष्ट और उपयोग योग्य छवि प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। यद्यपि मंत्र वर्कस्टेशन का उपयोग करने वाली यह बहुस्पेक्ट्रल तकनीक 8-प्लेक्स परख का समर्थन कर सकती है, लेकिन इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले 4 फ्लोरोफोरस के आवेदन ने फ्लोरोफोरेस के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में अंतर के कारण फ्लोरोफोर हस्तक्षेप के बिना इष्टतम प्रदर्शन का प्रदर्शन किया। इसके विपरीत, मल्टीप्लेक्स धुंधला जिसमें 5-8 फ्लोरोफोरस शामिल हैं, अक्सर साझा तरंगदैर्ध्य से उत्सर्जक के परिणामस्वरूप फ्लोरोफोर हस्तक्षेप की ओर अधिक ध्यान देने की आवश्यकता होती है।

इस खामी को दूर करने के लिए, मल्टीप्लेक्स में प्रत्येक एंटीबॉडी के क्रम को निर्धारित करने और एंडोमेट्रियम नमूने में प्रत्येक प्रतिरक्षा मार्कर के अभिव्यक्ति स्तर और पैटर्न की पहचान करने के लिए मोनोप्लेक्स धुंधला आवश्यक होगा। यह मार्कर और उनके जुड़े टीएसए फ्लोरोफोर पेयरिंग के धुंधला अनुक्रम को निर्धारित करने में मदद कर सकता है। एक बार मोनोप्लेक्स परख लागू करने के लिए एंटीबॉडी के आदेश का निर्धारण करने के लिए पूरा हो गया है, अगले कदम मल्टीप्लेक्स धुंधला के बाद पता लगाने के लिए फ्लोरोफोर का चयन करने के लिए किया जाएगा । ब्याज की हर एंटीबॉडी के लिए एक अद्वितीय फ्लोरोफोर चुना जाना चाहिए। प्रत्येक फ्लोरोफोर से संबंधित संख्या मोटे तौर पर उत्तेजन(तालिका 1 और तालिका 2)के दौरान उत्सर्जित फ्लोरोसेंट तरंगदैर्ध्य होगी। फ्लोरोफोर हस्तक्षेप को रोकने के लिए एक दृष्टिकोण यह है कि वेरोफोर जोड़े को तरंगदैर्ध्य के साथ यथासंभव एक दूसरे से चुनें (विशेष रूप से एंटीबॉडी को सह-स्थानीयकरण के लिए)। यह अतिरिक्त स्पेक्ट्रल ओवरलैप को कम करने में मदद कर सकता है और एक कुरकुरा छवि और अधिक विश्वसनीय फेनोटाइपिंग प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, इनफॉर्म सॉफ्टवेयर में मल्टीप्लेक्स कंपोजिट इमेज से लेजर को चालू और बंद करके सावधानीपूर्वक मूल्यांकन भी फ्लोरोफोर संतृप्ति(चित्रा 4)को कम करने के लिए धुंधला पैटर्न को पहचानने में मदद कर सकता है।

इमेज एनालिसिस के लिए सीडी 3+ टी सेल्स, सीडी20+ बी सेल्स, सीडी 68+ मैक्रोफेज, सीडी 56+ यूएनके सेल्स और एंडोमेट्रियल स्ट्रोमा (सीडी3− सीडी20−सीडी68−/सीडी56− और डीएपीआई-दाग) की संख्या को इनफॉर्म टिशू फाइंडर सॉफ्टवेयर 14.0(चित्रा 5)का उपयोग करके स्वचालित रूप से गिना जा सकता है । प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार घनत्व स्ट्रोमल कोशिकाओं की कुल संख्या(चित्र 5)के सापेक्ष एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था । इसी तरह, एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानिक वितरण का मात्राकरण इनफॉर्म सिस्टम(चित्र 6)से प्राप्त हर एक प्रतिरक्षा कोशिका की एक्स और वाई स्थिति पर आधारित था। आर भाषा का उपयोग करना, AUC पर आधारित प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न जोड़े के क्लस्टरिंग के स्तर को फिर प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:स्टेनिंग वर्कफ़्लो आरेख। संक्षिप्त: बीएसए = गोजातीय सीरम एल्बुमिन; HRP = सहिजन पेरोक्सिडास। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:इमेज कैप्चर एंड एनालिसिस के लिए वर्कस्टेशन। (A)मंत्र इमेजिंग वर्कस्टेशन,(B)असंसाधित स्पेक्ट्रल इमेज,(सी)कंपोजिट इमेज, (डी)टिश्यू सेगमेंटेशन (एपिथेलियल और स्ट्रोमल कंपार्टमेंट),(ई)एंडोमेट्रियम टिश्यू की कंपोजिट इमेज विभिन्न सेल आबादी की पहचान करने के लिए चार रंगीन मार्कर दिखाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:स्पेक्ट्रल इमेजिंग। 4 विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्पेनिंग(ए)एक उपजाऊ नियंत्रण महिला और(बी)एक महिला से एंडोमेट्रियल बायोप्सी पर किया गया था, जिसमें एक बहुस्पेक्ट्रल इमेजिंग के रूप में प्रस्तुत किया गया था। एक एकल-दाग पुस्तकालय के उत्पादन के बाद, स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग(सी)सीडी 3,(D)सीडी 56,(ई)सीडी 68,(एफ)सीडी 20,(जी)DAPI का प्रतिनिधित्व करने वाले एकल फ्लोरोफोरस की इमेजिंग प्रकट कर सकता है। इसके बाद मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग(एच)के बाद सभी फ्लोरोफोरस को शामिल करके एक समग्र छवि बनाई गई । स्केल बार = 50 माइक्रोन(ए, बी)। संक्षिप्त रूप: ले = चमकदार एपिथेलियम; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; आरएम = बार-बार गर्भपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:इनफॉर्म काउंट टूल। इनफॉर्म सॉफ्टवेयर काउंट टूल को बेज बॉक्स आइकन (↓द्वारा इंगित) का चयन करके सक्रिय किया जाता है। (A)छवि तैयारी,(बी, सी)हाथ से तैयार प्रशिक्षण और स्वचालन के लिए ऊतक खंडित,(घ)अलग कोशिकाओं को खंडित,(ई)फ्लोरोफोर तीव्रता के आधार पर कोशिकाओं को फेनोटाइपिंग,(एफ)फ्लोरोफोर तीव्रता के लिए विश्लेषण (चयनित फ्लोरोफोर तीव्रता में सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या दिखाता है) और(जी)उपयोग के लिए परिणामों का निर्यात (लाल बॉक्स निर्यात विकल्पों को इंगित करता है) । संक्षिप्त: IHC = इम्यूनोहिस्टोकेमिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:सेल काउंटिंग। (ए)आगे की तुलना और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए खंडित क्षेत्र (जैसे, स्ट्रोमल) में सकारात्मक-दाग कोशिकाओं के स्वचालित सेल काउंटिंग के लिए कोशिकाओं की फेनोटाइपिंग और(बी)उत्पादन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:स्थानिक घनत्व का मापन। (ए)खंडित क्षेत्र (जैसे, स्ट्रोमल),(बी)प्रत्येक सकारात्मक दाग सीडी 20+ प्रतिरक्षा कोशिका के समन्वय का उत्पादन प्रदर्शन, और(ग)स्थानिक घनत्व और स्थानिक घनत्व और स्थानिक घनत्व का निर्धारण CD20+ कोशिकाओं और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच स्थानिक घनत्व और स्थानीकरण का निर्धारण कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

आदेश रोग-प्रतिकारक क्लोन क्लोनलिटी एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का कारक ओपल्स ओपल कमजोर पड़ने का कारक
1 सीडी 3 सपा7 मोनोक्लोनल 1 में 100 ओपल 620 0.111111111
2 सीडी20 L26 मोनोक्लोनल 1 में 100 ओपल 650 0.215277778
3 सीडी68 एसपी251 मोनोक्लोनल 1 में 100 ओपल 520 0.111111111
4 सीडी56 सीडी564 मोनोक्लोनल 1 में 100 ओपल 690 0.111111111

तालिका 1: एंटीबॉडी, क्लोन और सांद्रता की सूची का उपयोग किया जाता है।

रंग उत्तेजन अधिकतम (एनएम) उत्सर्जन अधिकतम (एनएम) फ़िल्टर सेट में अपेक्षित पहचान (नाम) अपेक्षित रंग
दापी 350 470 दापी नीला
ओपल 520 494 525 फिटसी हरा
ओपल 620 588 616 Cy3 और टेक्सास लाल तृणमणि
ओपल 650 627 650 टेक्सास रेड और Cy5 नारंगी
ओपल 690 676 694 टेक्सास रेड और Cy5 स्पष्ट

तालिका 2: उनके अधिकतम उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ फ्लोरोफोरस की सूची, उपयुक्त फ़िल्टर सेट में अपेक्षित पहचान, और नमूदार रंग।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि मल्टीप्लेक्स धुंधला करने के लिए मेहनती अनुकूलन की आवश्यकता होती है। एंटीजन पुनर्प्राप्ति, साइट्रेट बफर और माइक्रोवेव तकनीक का उपयोग करके, पूर्ण एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग सुनिश्चित करने और ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है। जैसा कि टीएसए रिएजेंट्स एंटीजन के आसपास की साइटों से सहसंबद्ध रूप से बांधते हैं, वे संभावित रूप से स्टेरिक बाधा के माध्यम से बाद में प्राथमिक एंटीबॉडी के बाध्यकारी को रोक सकते हैं (जिसे "छाता प्रभाव" के रूप में भी जाना जाता है)। यह तब होता है जब कई प्रतिरक्षा मार्कर एक सेल डिब्बे में रहते हैं और फ्लोरोफोर हस्तक्षेप का कारण बनते हैं। यह पहचानने के लिए कि क्या कोई प्रभाव होगा, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानीयकरण में किसी भी ओवरलैप की पहचान करने के लिए मोनोप्लेक्स आईएचसी/आईएफ पहले से करना महत्वपूर्ण होगा । चूंकि स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी पैदा करने के लिए एकल-नमूना धुंधला होना आवश्यक होगा, इसलिए मान्य स्पेक्ट्रा पुस्तकालय फ्लोरोफोर हस्तक्षेप को रोकने के लिए व्यक्तिगत संकेतों के भेदभाव को सुविधाजनक बना सकते हैं। यदि आवश्यक हो, तो प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता और इनक्यूबेशन बार, फ्लोरोफोर-एंटीबॉडी पेयरिंग, टीएसए फ्लोरोफोर सांद्रता, और धुंधला आदेश फ्लोरोफोर हस्तक्षेप को कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसी तरह, टीएसए डिमर गठन को रोकने के लिए एचआरपी सांद्रता को ठीक से संतुलित करना महत्वपूर्ण है। यह प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के टिटररेशन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि मल्टीप्लेक्स धुंधला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की सांद्रता और इनक्यूबेशन समय पारंपरिक क्रोमोजेनिक एकल-धुंधला में उपयोग किए जाने वाले लोगों से भिन्न हो सकते हैं। इसलिए, मल्टीप्लेक्स धुंधला के लिए आवेदन करने के लिए एंटीबॉडी की एकाग्रता और आदेश का निर्धारण पहले से किया जाना चाहिए।

संशोधन और समस्या निवारण
इस अध्ययन में, हमने मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला को एक साथ आरएम के साथ और बिना महिलाओं से एंडोमेट्रियम बायोप्सी में चार प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की बातचीत का पता लगाने के लिए नियोजित किया। यह तकनीक टी कोशिकाओं के लिए सीडी 3 के खिलाफ एंटीबॉडी, बी कोशिकाओं के लिए सीडी 20, मैक्रोफेज के लिए सीडी 68 और इन सेल प्रकारों के बीच अंतर करने के लिए यूएनके कोशिकाओं के लिए CD56 का उपयोग करती है। इस विधि के आधार पर, हमने पाया कि आरएम महिलाओं में औसत सीडी 3++, सीडी 68 + और सीडी 56+ सेल घनत्व मूल्य उपजाऊ नियंत्रण15की तुलना में काफी अधिक थे। CD56+ uNK कोशिकाओं और CD68+ मैक्रोफेज के बीच क्लस्टरिंग उपजाऊ नियंत्रण की तुलना में आरएम समूह में काफी अधिक थी। इसके अलावा, इस विधि के उपयोग से पता चला कि CD56+ uNK कोशिकाओं में महिलाओं के दोनों समूहों में CD68+ मैक्रोफेज के साथ संख्यात्मक और स्थानिक संबंध दोनों दिखाई दिए। इसके विपरीत, CD56+ uNK कोशिकाओं में आरएम15वाली महिलाओं में सीडी 3+ टी कोशिकाओं के साथ एक महत्वपूर्ण संख्यात्मक लेकिन स्थानिक संबंध नहीं होता है। यह विधि एंडोमेट्रियम में कई प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के स्थानिक संबंध को भी निर्धारित करती है। हालांकि, एक विशिष्ट मार्कर के लिए सकारात्मकता कुछ मामलों में सीमा रेखा हो सकती है। इस समस्या को दूर करने के लिए, स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का निर्माण करते समय सकारात्मकता की दहलीज निर्धारित करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने की सलाह दी जाती है। इसके अतिरिक्त, इनफॉर्म सॉफ्टवेयर में मल्टीप्लेक्स कंपोजिट इमेज से लेजर को चालू और बंद करके सावधानीपूर्वक मूल्यांकन भी फ्लोरोफोर संतृप्ति को कम करने के लिए धुंधला पैटर्न को पहचानने में मदद कर सकता है।

तकनीक की सीमाएं
डेटा व्याख्या के दौरान फ्लोरोफोर हस्तक्षेप की पहचान मार्कर और अनमिक्सिंग कलाकृतियों के वास्तविक कोलोकैलाइजेशन के बीच अंतर करने के लिए आवश्यक है। यह मल्टीप्लेक्स धुंधला पद्धति एंजाइमेटिक प्रवर्धन द्वारा संचालित टीएसए-आधारित अभिकर्मकों का उपयोग करती है, जो पारंपरिक अप्रत्यक्ष आईएफ विधियों की तुलना में एंटीजन मार्कर तीव्रता को 10-100 गुना तक बढ़ा सकती है। यह अति सक्रिय टायरामाइड बयान का खतरा उत्पन्न करता है, जिसके परिणामस्वरूप संभावित रूप से छाता प्रभाव और/या सिग्नल ब्लीड-थ्यिंग होता है । ओवरसंतुण की पहचान करने के लिए, सिग्नल के स्तर को इनफॉर्म में अनमिक्सिंग छवियों द्वारा नेत्रहीन मूल्यांकन किया जा सकता है और मल्टीप्लेक्स ऊतक छवि में उज्ज्वल, सकारात्मक क्षेत्रों पर कर्सर मंडरा सकता है। सिग्नल का स्तर आमतौर पर 30 से नीचे रहना चाहिए और आदर्श रूप से एक दूसरे के कारक 3 के भीतर, विशेष रूप से स्पेक्टरली आसन्न फ्लोरोफोरस के लिए। स्पेक्टरली आसन्न फ्लोरोफोरस के संकेतों में 5 गुना से अधिक अंतर फ्लोरोफोर हस्तक्षेप का कारण बन सकता है और कलाकृतियों को अनमिक्सिंग का कारण बन सकता है। यदि किसी भी फ्लोरोफोर के सिग्नल स्तर आसन्न फ्लोरोफोर से 3 गुना अधिक अंतर दिखाते हैं, तो टीएसए फ्लोरोफोर सांद्रता को संकेत संतुलन प्राप्त करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है। एक बार सिग्नल सही रेंज में होने की पुष्टि हो जाने के बाद, सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात को <1:10 पर बनाए रखा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सकारात्मक धुंधला गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि से झूठा पता न चल सके।

चूंकि स्पेक्ट्रल क्रॉसटॉक भी महत्वपूर्ण फ्लोरोफोर हस्तक्षेप बना सकता है, धुंधला करने के क्रम को मार्कर के अनुक्रम और अभिव्यक्ति दोनों में अलग-अलग स्पेक्टरली आसन्न रंगों में समायोजित किया जाना चाहिए। यद्यपि मंत्र वर्कस्टेशन का उपयोग करने वाली यह बहुस्पेक्ट्रल तकनीक 8-प्लेक्स परख का समर्थन करती है, लेकिन 4 फ्लोरोफोरस का अनुप्रयोग, अर्थात् ओपल 520, 540, 620 और 690, फ्लोरोफोर हस्तक्षेप के बिना सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन को दर्शाता है। ≥5 फ्लोरोफोरस के उपयोग के लिए अक्सर फ्लोरोफोरेस के स्पेक्ट्रल प्रोफाइल के कारण स्पेक्ट्रल क्रॉसटॉक से बचने के लिए अधिक अनुकूलन और सत्यापन की आवश्यकता होती है जो समीपस्थ तरंगदैर्ध्य साझा करते हैं। दूसरे शब्दों में, इस दृष्टिकोण द्वारा एक साथ पता लगाया जा सकता है कि लक्ष्यों की संख्या केवल तरंगदैर्ध्य बैंड और उत्तेजन/उत्सर्जन फिल्टर उपलब्ध सेट की संख्या से सीमित है । इसलिए, टीएसए फ्लोरोफोर के संभावित ओवरसैनिंग से इंकार करने के लिए जो अन्य टीएसए फ्लोरोफोरस के आगे आवेदन को अवरुद्ध करता है और/या सिग्नल क्रॉसटॉक की पहचान करने के लिए, इनफॉर्म सॉफ्टवेयर में मल्टीप्लेक्स कंपोजिट इमेज से परतों को चालू और बंद करके सावधानीपूर्वक होना आवश्यक है; एक आईएचसी धुंधला सही ढंग से धुंधला से धुंधला पैटर्न की व्याख्या; और एक विमान में स्पष्ट नुकसान, लाभ, या समान संकेतों की तलाश में एक और विमान में स्थानीयकरण के अनुरूप।

मल्टीस्पेक्ट्रल स्टेनिंग के लिए विशिष्ट फ्लोरोफोर के साथ जोड़ा गया एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है ताकि एक साथ कई मार्कर का पता लगाया जा सके। यह फ्लोरोफोर-एंटीबॉडी पेयरिंग दो नियमों का पालन करता है: i) सह-व्यक्त मार्कर के लिए सौंपे गए फ्लोरोफोरस को स्पेक्टरली के अलावा होना चाहिए, और ii) अधिक प्रचुर मात्रा में लक्ष्यों को कम चमक या इसके विपरीतफ्लोरोफोरस के साथ जोड़ा जाना चाहिए। धुंधला करने के क्रम को भी व्यवस्थित करने की आवश्यकता है ताकि अनुक्रमिक एंटीबॉडी दाग कोशिकाओं में एक ही कोशिका डिब्बों में सह-स्थानीयकरण न करें। इसलिए, एंटीबॉडी सांद्रता और इनक्यूबेशन बार के अलावा, जो पारंपरिक धुंधला तरीकों में महत्वपूर्ण कारक हैं, अतिरिक्त मापदंडों, जैसे उपयुक्त फ्लोरोफोर-एंटीबॉडी पेयरिंग, टीएसए फ्लोरोफोर सांद्रता, धुंधला अनुक्रम, और एक या एक से अधिक माइक्रोवेव उपचार के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी के जोखिम, सफल मल्टीप्लेक्स धुंधला के लिए विचार किया जाना चाहिए । अध्ययन नमूनों में उच्च परिवर्तनशीलता के कारण, एक दिए गए मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल अन्य प्रकार के अध्ययन नमूनों में समान परिणाम उत्पन्न नहीं कर सकता है।

पैनल में शामिल मार्कर की संख्या और इनक्यूबेशन बार प्राथमिक एंटीबॉडी के आधार पर पूरे ओपल मल्टीप्लेक्स अनुक्रमिक धुंधला प्रक्रिया एक से कई दिनों तक लग सकती है। इसके विपरीत, मानक यदि विधियां आम तौर पर धुंधला होने के एक दौर में 4-5 मार्कर के दृश्य की अनुमति देती हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पारंपरिक आईएचसी विधि का उपयोग करके अनुकूलित शर्तों को मल्टीप्लेक्स धुंधला प्रक्रियाओं में आगे बढ़ने से पहले और अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जिसमें अतिरिक्त, कई माइक्रोवेव उपचार और टीएसए फ्लोरोफोरस का अनुप्रयोग शामिल है जो अंततः प्रत्येक एंटीबॉडी की धुंधला तीव्रता को प्रभावित करेगा। वर्तमान में, इमेजिंग दृष्टिकोण जो मल्टीस्पेक्ट्रल प्रौद्योगिकियों का उपयोग करते हैं, उन्हें महंगे और समर्पित इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, यह केवल रुचि के छवि-चयनित क्षेत्रों तक ही सीमित हो सकता है। इसलिए, यह सीमित संसाधनों वाली प्रयोगशालाओं और अनिश्चित एंटीजन लक्ष्यों के साथ ऊतकों की स्काउटिंग के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
इस वर्तमान विधि की एक विशेष ताकत पारंपरिक आईएचसी विधियों के विपरीत एंडोमेट्रियम में कई प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के घनत्व को मापने की क्षमता है जो केवल एक ऊतक अनुभाग में एक से दो सेल प्रकारों को लेबल कर सकती हैं। फ्लो साइटोमेट्री एक और विधि है जो एंडोमेट्रियल नमूने में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के सापेक्ष अनुपात का विश्लेषण कर सकती है; हालांकि, यह विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों और विभिन्न एंडोमेट्रियल डिब्बों के भीतर विशिष्ट वितरण के बीच स्थानिक जानकारी प्रदान करने में सक्षम नहीं होगा। इसके अलावा, ऊतक की कमी नैदानिक अभ्यास में एक गंभीर चिंता का विषय है, विशेष रूप से नैदानिक परीक्षणों के दौरान और जब बायोप्सी नमूनों का उपयोग कर । इन दो पारंपरिक तरीकों के साथ और आरएम के बिना महिलाओं के एंडोमेट्रियम में कई प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों का पता लगाने के लिए प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए नमूनों (या तो वर्गों या कोशिकाओं) की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होगी ।

जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, ओपल वर्कफ्लो को मंत्र वर्कस्टेशन का उपयोग करके एक ही ऊतक अनुभाग में सात मार्कर तक का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसके अलावा, एंटीबॉडी चयन के दौरान प्रजातियों के पार प्रतिक्रियाशीलता इस तकनीक की एक सीमा नहीं है। दरअसल, इस तकनीक का एक फायदा यह है कि यह सात मार्कर तक का पता लगाने के लिए एक ही प्रजाति में उठाए गए एंटीबॉडी के उपयोग की अनुमति देता है । इस दृष्टिकोण में फ्लोरोसेंट टीएसए रिएजेंट्स के साथ पता लगाना शामिल है जिसके बाद माइक्रोवेव उपचार किसी भी गैर-विशिष्ट धुंधला को हटाने के लिए है। माइक्रोवेव आधारित विपठ्ठन के बाद, धुंधला का एक और दौर फिर एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी के जोखिम के बिना अतिरिक्त लक्ष्य का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस टीएसए डिटेक्शन विधि को कम से कम 3 दिनों में 7 फ्लोरोक्रोम को संयोजित करने के लिए किया जा सकता है, जबकि अभी भी कम अभिव्यक्ति वाले प्रोटीन लक्ष्यों का पता लगाने के लिए विश्वसनीय परिणाम का उत्पादन किया जा सकता है। पारंपरिक आईएचसी अध्ययन पर मल्टीप्लेक्स धुंधला होने का एक और लाभ इसकी बढ़ी हुई दक्षता है क्योंकि माप स्वचालित है, जो व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह को खत्म कर सकता है। उत्पन्न मात्रात्मक डेटा परख के अंतिम परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

भविष्य के आवेदन
इस मल्टीप्लेक्स प्रोटोकॉल के आवेदन की सीमा बहुत है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह पहला पेपर है जिसमें मंत्र वर्कस्टेशन और छवि विश्लेषण का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स्ड इम्यूनोफ्लोरेसेंस मार्कर अभिव्यक्ति का पता लगाने की विधि का वर्णन किया गया है, जो आरएम के साथ और बिना महिलाओं में कई प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को अलग करने में सटीक और प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करने के लिए सटीक और प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि एक ही ऊतक अनुभाग में कई लक्ष्यों का स्थानीयकरण उनके सेलुलर बातचीत में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है । अंततः, यह विशिष्ट लक्षित उपचार की स्थापना के लिए आरएम के साथ महिलाओं में भ्रूण प्रत्यारोपण के दौरान प्रतिरक्षा सेल माइक्रोएनवायरमेंट की बेहतर समझ के लिए नेतृत्व करेंगे ।

इसके अलावा, हमारे वर्तमान तरीकों ने यह प्रदर्शित करने में मदद की कि एंडोमेट्रियम के कार्य के लिए कई प्रतिरक्षा कोशिकाएं और उनकी बातचीत महत्वपूर्ण हो सकती है। यह चार एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों में से तीन के घनत्व में महत्वपूर्ण परिवर्तन और CD68 + और CD56 + कोशिकाओं के बीच क्लस्टरिंग में उल्लेखनीय वृद्धि से दिखाया गया है। इसके विपरीत, इन प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की असामान्य बातचीत आरएम के लिए प्रीडिस्पोजिंग कारक हो सकती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक उपप्रकार का पता लगाने के विपरीत, इस मल्टीप्लेक्स आईएचसी स्टेनिंग का उपयोग भ्रूण प्रत्यारोपण के इम्यूनोलॉजिक विनियमन की गहराई से समझ प्रदान कर सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रतिरक्षा माइक्रोएनवायरमेंट में स्थानिक विशेषताओं की मात्रा और आगे की समझ इम्यूनोथेरपी के संदर्भ में इस बीमारी के जीव विज्ञान पर प्रकाश डालने में मदद कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे हितों का कोई टकराव का खुलासा किया है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को हांगकांग प्रसूति और स्त्री रोग ट्रस्ट फंड द्वारा 2018 में और हांगकांग स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान कोष (06170186, 07180226) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplification Diluent Perkin Elmer FP1498 Fluorophore diluent buffer
Antibody diluent Perkin Elmer ARD1001EA Diluting the antibody
CD3 Spring Bioscience M3072 Primary antibody
CD20 Biocare Medical CM004B Primary antibody
CD56 Leica NCL-CD56-504 Primary antibody
CD68 Spring Bioscience M5510 Primary antibody
Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) Abcam AB64214 Antigen retrieval solution
EMSURE Xylene (isomeric mixture) Merck 108297 Dewaxing
Ethanol absolute Merck 107017 Ethyl alcohol for rehydration
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome Leica RM2125RTS Sectioning of paraffin-embedded tissue
inForm Advanced Image Analysis Software Perkin Elmer inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) Data Analysis software
Mantra® Workstation Akoya Biosciences CLS140089 Spectral imaging
Microwave Panasonic Inverter Microwave stripping
Opal 520 Perkin Elmer FP1487A Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 620 Perkin Elmer FP1495A Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 650 Perkin Elmer FP1496A Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 690 Perkin Elmer FP1497A Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Oven Memmert U10 Dewaxing
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 Removal of tissue peroxidase activities
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum Perkin Elmer ARH1001EA Secondary antibody
ProLong™ Gold Antifade Mountant ThemoFisher Scientific P36930 Mounting
Spatstat / Version 2.1-0 Spatial point pattern analysis
Spectral DAPI Perkin Elmer FP1490A Nucleic acid staining
Tissue Processor Thermo Fischer Excelsior ES Tissue processing for dehydration and paraffination
Tris Buffer Saline (TBS), 10x Cell Signaling Technology 12498S Washing solution
Tween 20 Sigma-Aldrich P1370-1L Nonionic detergent

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References

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आवर्ती गर्भपात में चार एंडोमेट्रियल इम्यून सेल प्रकारों के मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग
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