Summary
멀티플렉스 면역히스토케및 다스펙트럼 이미징의 발전에도 불구하고, 자궁내막에서 동시에 주요 면역 세포의 밀도와 군집을 특성화하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이 논문은 자궁 내막에서 4개의 면역 세포 모형의 동시 국소화를 위한 상세한 멀티플렉스 염색 프로토콜 및 화상 진찰을 기술합니다.
Abstract
면역 조직 화학은 생물학적 연구 및 임상 진단에서 조직 항원의 식별 및 시각화를 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 상처 치유, 면역 반응, 조직 거부 및 조직-생체 물질 상호 작용과 같은 다양한 생물학적 과정 이나 병리를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 종래의 면역조직화학(IHC)을 이용한 단일 조직 섹션에서 다중 항원(특히 면역세포용)의 시각화 및 정량화는 만족스럽지 못한 남아 있다. 따라서, 멀티플렉스 기술은 단일 조직 샘플 또는 상이한 조직 샘플의 앙상블에서 다중 생물학적 마커를 식별하기 위해 최근 몇 년 동안 도입되었다.
이러한 기술은 이식 중 재발성 유산을 가진 비옥한 여자와 여자 사이 내측 내의 면역 세포 세포-세포 상호 작용에 있는 변경을 분화에 특히 유용할 수 있습니다. 이 논문은 배아 이식 중 정확하게 시간조정된 자궁내막 표본에서 4가지 주요 면역 세포 유형의 밀도와 클러스터링을 동시에 조사하기 위해 멀티플렉스 형광 IHC 염색을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 심료 제제, 면역 세포 아류형을 위한 마커를 이용한 멀티플렉스 최적화, 슬라이드의 스캔, 데이터 분석, 자궁내막 면역 세포 검출에 대한 구체적인 참조등이 포함된다.
이 방법을 이용하여, 내측에서 4가지 주요 면역세포 유형의 밀도 및 군집은 단일 조직 섹션에서 동시에 분석될 수 있다. 또한, 이 논문에서는 적용중인 형광 프로브 사이의 가능한 형광 간섭을 극복하기 위한 중요한 요인과 문제 해결에 대해 논의할 것입니다. 중요한 것은, 이 멀티플렉스 염색 기술의 결과는 배아 이식 도중 면역학적 상호 작용 및 조절의 심층적인 이해를 제공하는 것을 도울 수 있습니다.
Introduction
재발성 유산(RM)은 임신1의24주 전에 2개 이상의 임신을 상실하는 것으로 정의될 수 있다. 이 빈번한 생식 상태는전세계2,3의부부의 1%까지 영향을 미칩니다. 병리학은 다인성이며 배아 중심의 원인 (주로 비정상적인 배아 karyotype으로 인한) 및 내측 및 / 또는 태반 발달에 영향을 미치는 모계 구동 원인으로 나눌 수 있습니다. 이 증상은 부모의 유전적 이상, 자궁 이상, 보혈증 조건, 내분비학 요인 및 면역 장애4에서발생할 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 면역 이펙터 세포 기능 장애는 조기 임신손실5의병인에 연루되어 있다. 이것은 생리 주기 도중 자궁 내막에 있는 면역 세포의 특정 인구를 해명하는 많은 조사를 영감을 주었습니다, 이식, 및 초기 임신, 초기 임신에 있는 특정 역할. 이러한 면역 세포 중, 자궁 자연 살인자 (uNK) 세포는 특히 열대 성 침략 및 혈관 신생 의 과정에서, 배아 이식 및 임신 동안 중요한역할을한다 6. 연구 결과는 RM7,8을가진 여자의 내분담관에 있는 증가한 uNK 세포 조밀도를 보여주었습니다, 그러나 이 사실 인정은 유산9의증가한 리스크와 연관되지 않았습니다. 그러나, 이러한 자극 연구는 RM10,11을가진 여성의 내막에서 다른 면역 세포 유형(대식세포, 자궁 수지상 세포 등)의밀도를평가하였다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 RM을 가진 여자에 있는 peri 이식 내막에 있는 면역 세포 조밀도에 있는 중요한 변경이 있는지 불확실합니다.
불확실성에 대한 한 가지 가능한 설명은 이식 기간 동안 자궁 내막 면역 세포 밀도의 평가가 어려울 수 있다는 것입니다. 24시간 동안, 내메트리움의 중요한 변화는 면역 세포 밀도와 사이토카인 분비를 변화시키고, 이러한결과(12)에변이의 근원을 소개한다. 또한, 대부분의 보고서는 주로 동일한 조직 섹션에서 여러 마커를 검사할 수 없는 단일 세포 염색(예를 들어, 전통적인 IHC 방법)의 사용에 의존한다. 유동 세포측정은 단일 샘플에서 다중 세포 집단을 검출하는 데 사용될 수 있지만, 필요한 많은 양의 세포와 시간이 많이 소요되는 최적화는 이 방법의 인기와 효율성을 저해한다. 따라서, 멀티플렉스 IHC 염색의 최근 발전은 개별 면역 하위 집단의 세포 계보 및 조직학적 국소화를 포함하여 다중 파라미터를 평가하기 위하여 동일한 슬라이드에 다중 마커를 면역염색하여 이 문제를 해결할 수 있었습니다. 또한, 이러한 기술은 조직 가용성이 제한된 경우 얻은 정보를 극대화할 수 있다. 궁극적으로, 이 기술은 비옥한 여자와 RM를 가진 여자 사이 내메트리움에 있는 면역 세포 상호 작용에 있는 다름을 해명하는 것을 도울 수 있습니다.
비옥한 통제 여자 (FC)와 설명할 수 없는 재발성 유산을 가진 여자를 포함하여 여자의 2개의 단은 웨일즈 병원의 왕자에서 모집되었습니다 (RM). 비옥한 통제는 자발적인 유산의 역사 없이 적어도 1개의 살아있는 출생이 있던 여자로 정의되고, RM 여자는 임신 20 주 전에 ≥2 연속 유산의 역사를 가진 사람들로 정의되었습니다. 두 그룹에서 피험자는 다음과 같은 포함 기준을 충족: (a) 나이 사이 20 받는 사람 42 세, (b) 비 흡연자, (c) 일반 생리 주기 (25-35 일) 및 정상적인 자궁 구조, (d) 자궁 내막 생검 전에 적어도 3 개월 동안 호르몬 처방의 사용, (e) 수산화 증에 의해 수산화 증에 의해 수산화 증. 또한, 모집된 모든 피험자는 정상적인 카요티핑, 정상 3차원 초음파 초음파 초음파 검사 히스테리살핀고그램, 2일째 여포 자극 호르몬 < 10 IU/L, 미드 루테알 프로게스테론 > 30nmol/L, 정상 갑상선 기능, 루푸스 항응고제 및 항심방지및 이그GM 항체에 대한 음의 검사를 받았습니다.
RM의 면역 학적 기초를 더 잘 이해하기 위해 이식 시 내메트란에 존재하는 주요 면역 세포 유형을 동시에 정량화하고 국소화하는 것이 가장 바람직할 것입니다. 이 논문은 샘플 제제, 면역 세포 아류형에 대한 마커를 가진 멀티플렉스 최적화, 슬라이드의 스캔, 자궁내막 면역 세포를 검출하는 특정 참조를 가진 데이터 분석을 설명합니다. 더욱이, 이 논문은 내분담관에서 면역 세포 모형의 조밀도 그리고 군집을 결정하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
연구 결과는 홍콩-새로운 영토 동쪽 클러스터 임상 연구 윤리 위원회의 합동 중국 대학에 의해 승인되었습니다. 자궁내막생검을 수집하기 전에 참가자들로부터 통보된 동의를 얻었다. 컨트롤 및 RM 그룹의 포함 기준에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.
1. 샘플 준비
- 이 연구의 모든 여성이 월경 주기의 9일째부터 매일 소변 딥스틱 검사를 받아야 배란을 검출하기 위해 황체화 호르몬(LH) 서지를 식별하고, LH 서지(LH+7) 다음7일째에 자궁내막생검을 정확하게 검사합니다.
- 비옥한 여성과 여성의 Pipelle 샘플러 또는 파이프 큐레를 사용하여 자궁내막 생검의 0.5cm2 단편을 획득하십시오.
참고: 고정의 부피는 조직의 5-10 배여야 합니다. - 용융 파라핀 왁스에 내장하기 전에 조직 처리 기계에 탈수카트리지에 조직을 배치합니다. 58-60°C에서 파라핀에 조직을 포함.
- 파라핀 블록을 실온에서 밤새 식힙니다. 마이크로토메를 사용하여 파라핀 블록을 3 μm 두께로 다듬습니다.
참고: 멀티플렉스 염색 을 통해 적절한 조직 마운팅 및 준수에 증류수 보조기구를 사용합니다. - 파라핀 리본을 40-45°C의 수조에 30s에 놓습니다.
- 폴리 L-리신 (0.1 % w / v)코팅 현미경 유리 슬라이드에 섹션을 마운트합니다. 조직을 위쪽으로 향하게 하여 슬라이드를 놓고 밤새 37°C에서 건조시합니다. 슬라이드를 극한의 온도에서 멀리 떨어진 슬라이드 상자에 보관하여 추가 사용까지 보관합니다.
2. 기존의 IHC를 사용하여 멀티플렉스 IHC에 대한 항체의 이상적인 농도를 결정한다.
참고: 이것은 내메트리엄 샘플에서 각 면역 마커의 발현 수준 및 패턴을 식별하고, 각 마커의 염색 서열뿐만 아니라 그들의 관련 티라미드 신호 증폭(TSA) 불소호레 페어링을 결정하는 데 중요하다.
- 수동 종래의 IHC13을사용하여 멀티플렉스 IHC에 대한 적합성에 대한 항체를 테스트한다.
- 단일 항체 테스트를 위해 내측 조직을 사용합니다.
- 각 항체의 염색 상태를 최적화하기 위한 양성 제어(예를 들어, 비장) 및 음의 제어(isotype control)를 포함한다.
- 항체의 데이터 시트에 의해 권장되는 희석을 사용하여 염색을 수행합니다.
- 2.3 단계에서 사용되는 권장 희석 위 및 아래 농도를 사용하여 추가 염색을 수행합니다.
참고: 임상 병리학자는 항체 프로빙 및 세포 무결성의 국소화를 확인하기 위해 얼룩진 슬라이드를 맹목적으로 평가해야합니다.
3. 멀티플렉스 염색 방법
- 슬라이드 준비 및 고정
- 오븐에서 위쪽으로 향하는 조직을 평평하게 놓고 60°C에서 적어도 1시간 동안 굽습니다.
- 오븐에서 슬라이드를 제거하고 수직 슬라이드 랙에 배치하기 전에 실온에서 적어도 20 분 동안 냉각 할 수 있습니다.
- 자일렌(2배), 100% 에탄올(2배), 95% 에탄올(1배), 에탄올(70% 에탄올(2배), 증류수(2배) 등 각 단계에 10분 할당된 포름린 고정 파라핀 임베디드 슬라이드를 탈밀하고 재수화한다.
- 슬라이드 랙을 플라스틱 슬라이드 상자에 놓고 트리스 버퍼식식라인(TBS, pH 7.6)에 담급니다.
참고: 슬라이드는 이 재수화 단계에서 마지막 단계에서 장착할 때까지 촉촉하게 유지되어야 합니다. - 미탄올(1:9)에 희석된 포름알데히드혼합물로 채워진 플라스틱 슬라이드 상자에 슬라이드를 잠수하여 샘플을 30분 동안 수정합니다.
- 슬라이드를 2분 동안 탈온된 물에 두 번 씻은 다음 항원 회수로 진행합니다.
- 에피토프 검색
- 슬라이드 랙을 내열 성 상자에 넣고 구연산 버퍼 (pH 6.0)로 채우면 슬라이드를 덮습니다.
- 상자를 전자레인지에 넣고 슬라이드를 100% 전원으로 가열한 다음 20분 동안 20분간 가열하여 동일한 온도를 유지합니다.
- 실온에서 약 15분 동안 슬라이드를 식힙니다.
- 2분 동안 물에 있는 슬라이드를 헹구고 TBS-Tween 20(TBST)이 2분 동안 헹구십시오.
참고: TBST는 25m Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 0.05% Tween 20(v/v)으로 구성됩니다.
- 블로킹
- 10분 동안 과산화제 차단용을 함유한 항아리에 슬라이드를 침수하여 조직 내 내인성 과산화증활성을 차단한다(재료의 표참조).
- TBST로 슬라이드를 5분 동안 세척합니다.
- 소수성 장벽 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주변경계를 표시합니다.
- 블로킹 버퍼(재료 표참조) 또는 소 세럼 알부민(5%, w/v)으로 조직 섹션을 덮고 15분 동안 가습된 챔버에서 슬라이드를 배양합니다.
- 항체 및 신호 응용 프로그램
- 차단 시약을 제거합니다.
- 1차 적시 항체(예를 들어, CD3, 1:100 희석항체 희석제, 표 1참조)를 30분 동안 실온에서 가습챔버에서 배양한다.
- 1 차적인 항체를 제거합니다. TBST로 3x를 매번 5분 동안 씻으시면 됩니다.
- 고분자 고추냉이 과산화효소(HRP)-표지된 이차 항체(표1)를실온에서 가습챔버에서 15분 동안 배양한다. TBST로 3x를 매번 5분 동안 씻으시면 됩니다.
- 오팔 플루오로포레 TSA 작업 용액(증폭 희석제 1:100)을 적용하고 1차 항체 결합 부위의 조직 샘플에 형광소 균주를 허용하도록 10분 동안 실온에서 배양한다. TBST로 트리플리케이트로 매번 5분 동안 씻으세요.
- 전자레인지 기반 스트리핑
- 항원 회수 버퍼(구연산 완충액, pH 6.0)로 헹구는다.
- 마이크로파 기반 스트리핑을 수행하여 1차 이차-HRP 복합체를 제거하여 다음 1차 항체(예를 들어, CD20)를 소개합니다.
- 슬라이드를 항원 검색 버퍼에 넣고 50초 동안 100% 전원으로 전자레인지에 전자레인지를 넣고 전자레인지에서 20분 동안 20%의 전력을 공급하고 실온에서 15분 동안 식힙니다.
- 조직 샘플이 모든 1 차 항체로 조사 될 때까지 3.2.4 ~ 3.5.2 단계를 반복하십시오.
- 카운터스테인 및 마운팅
- 항원 검색 버퍼의 전자 레인지 기반 스트리핑 및 냉각 후, 증류수 와 TBST에서 슬라이드를 헹구십시오.
- 4', 6-diamidino-2-페닐린돌(DAPI) 용액(1.0 μg/mL)을 실온에서 가습챔버에서 5분 동안 배양한다.
- TBST로 3x를 매번 5분 동안 씻으시면 됩니다. 물로 5분 동안 한 번 씻으시면 됩니다.
- 슬라이드를 공기 건조시키고 적절한 장착 매체로 장착합니다(재료 표참조).
참고: 모노플렉스 슬라이드를 스펙트럼 라이브러리 개발에 사용할 때는 카운터스테인링이 필요하지 않습니다.
4. 이미지 및 분석
- 스펙트럼 라이브러리 슬라이드 준비
- 다중 스펙트럼 이미지 분석을 위해 동일한 제어 조직으로 각 형광, DAPI 및 자동 형광에 대한 라이브러리 슬라이드(단일 얼룩 기준 이미지)를 만듭니다.
- RM 및 비옥한 여성을 가진 여자에게서 자궁내막 생검 견본의 슬라이드를 사용하여, 단계 1.1 에서 3.6.4 각 슬라이드에 대한 단 하나 항체 검출을 위한 단계 1.1 3.6.4를 수행합니다 (추가 항체 또는 불소 호퍼 추가 없이).
- 각 항체 검출에 대해, DAPI를 가진 슬라이드 중 하나를 염색하고 (단계 3.6.2에서와 같이) 스펙트럼에서 가능한 조직 자동 형광의 검출을 위해 하나의 슬라이드를 염색하지 않은 상태로 둡니다.
- 워크스테이션에서 적절한 필터를 사용하여 각 항체에 대한 이 슬라이드 세트에 대한 이미지를 얻고 이미지 분석 라이브러리에 업로드합니다(4.2단계에서 설명된 대로).
- 이미지가 캡처되면 inForm을 스펙트럼 라이브러리 소스로 선택하고 스펙트럼 라이브러리를 작성합니다.
- 형광을 사용하되 메뉴에서 얼룩/플루어를 선택합니다.
- 얼룩이나 형광을 선택하는 동안 하나 이상의 그룹을 선택하여 선택을 좁히게합니다. 모두를 선택하여 이미지와 호환되는 모든 스펙트럼을 표시합니다.
- 스펙트럼 이미징
참고: 이미지는 인폼 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 설정된 스펙트럼 라이브러리와 함께 만트라 워크스테이션을 사용하여 캡처되었습니다.- 워크스테이션을 사용하여 표 2(예: DAPI, 형광동체[FITC], CY3, 텍사스 레드 및 CY5)에 제안된 적절한 에피 형광 필터를 사용하여 단일 항체 염색 슬라이드의 이미지를 캡처합니다.
참고: 이 프로토콜에 사용되는 특정 형광에 대한 권장 필터는 표 2에표시됩니다. - 해당 형광 채널의 각 마커를 검사하여 최적의 신호에 적합한 노출 시간을 식별합니다.
참고: 최적 신호는 단일 항체 염색에서 얻은 양성 및 국소화에 대한 참조에 따라 결정된다. - 각 단량제(항체-플루오로포어 조합)에 대한 고정 된 노출 시간을 결정하여 교차 시료 비교를 표준화합니다.
참고: 고정 된 노출의 결정은 관심있는 샘플의 강도에 따라 달라집니다. - 임베디드 자동 초점 알고리즘을 통해 적절한 스캐닝 모드에서 멀티플렉스 스테인드 슬라이드를 스캔합니다.
참고: 설정된 스펙트럼 라이브러리는 다중 스펙트럼 이미지 큐브를 단일 개별 구성 요소(스펙트럼 언믹싱)로 구분하는 데 사용됩니다. 이렇게 하면 관심 있는 모든 마커에 대한 색상 기반 식별이 교육 세션 및 이미지 분석 세션의 다음 두 가지 주요 단계를 사용하여 처리할 수 있습니다.
- 워크스테이션을 사용하여 표 2(예: DAPI, 형광동체[FITC], CY3, 텍사스 레드 및 CY5)에 제안된 적절한 에피 형광 필터를 사용하여 단일 항체 염색 슬라이드의 이미지를 캡처합니다.
- 이미지 분석
- 내메트리엄에서 선택된 면역 세포 모형의 세포 계산
- 200배 배율 하에서 분석을 위해 최소 10개의 필드를 캡처합니다.
참고: 필드는 선택 없이 전체 섹션을 스캔하여 캡처되었습니다. 이것은 심노메트리움의 모든 세포 성분, 예를 들면, 발광 상피 테두리, 스트로마 및 땀샘의 동시 포획을 보장할 수 있습니다. - 셀을 계산하려면 단계 표시줄의 개체 수 단추를 클릭하여 개체 계산 설정 패널을 표시합니다.
- 이미지, 프로세스 영역 또는 조직 영역의 가장자리를 터치하는 개체를 제외하려면 Edge 상자를 터치하는 경우 개체 삭제를 확인합니다.
- 조직이 분할된 경우 개체를 찾을 수 있는 조직 범주를 선택합니다. 선택한 조직 범주 외부의 개체를 계산하지 마십시오.
- 객체를 식별하려면 원하는 접근 방식을 선택합니다: 개체 기반 또는 픽셀 기반(임계값).
참고: 간단한 임계값의 응용 프로그램이 개체 픽셀을 산출하는 신뢰할 수 있거나 일관된 얼룩의 경우 픽셀 기반(임계값) 접근 방식을 선택해야 합니다. 개체 기반 접근 방식은 일관성이 부족하고 개체 염색의 특이성이 없는 경우 고급 morphometry 기반 접근 방식이 필요한 경우에 권장됩니다. - 원하는 신호 크기 조정선택 : 자동 배율 또는 고정 축척.
참고: 자동 배율을 선택하면 개체 세분화를 수행하기 전에 각 구성 요소 평면이 자동으로 배율을 조정합니다. 고정 스케일 옵션은 더 나은 세분화 성능이 필요하며 얼룩 신호가 일관되고 신뢰할 수 있는 경우에 권장됩니다. - 드롭다운 목록에서 개체 세분화에 대한 기본 구성 요소를 선택합니다.
- 기본 구성 요소에 대한 최소 신호 값을 원하는 임계값으로 조정합니다.
- 개체의 구멍을 자동으로 채우려면 구멍 채우기를선택합니다.
- 다른 객체를 개별 객체로 터치하는 개체를 한 개체대신 개별 개체로 감지하려면 최대 크기(픽셀) 확인란을 선택한 후 분할 분할 확인란을 선택합니다.
- 오브젝트의 둥글림에 따라 객체를 제외하려면 둥글림 상자를 확인하고 원하는 최소 원형을 지정합니다.
- 혈관을 둘러싼 세포를 포함하여 모든 기질 세포 (CD3-/ CD20-/ CD68-/ CD56−및 DAPI+)를계산합니다.
- T 세포(CD3+와 DAPI+),B 세포(CD20+ 및 DAPI+),대식세포(CD68+ 및 DAPI+),uNK 세포(CD56 + 및 DAPI+)를 포함하여 면역 세포를 별도로 계산합니다.
- 각 캡처된 이미지에 대한 총 기질 세포 수에 비해 면역 세포의 백분율로 데이터를 표현하고 최종 세포 수를 모든 필드의 평균으로 보고합니다.
- 보기 편집기를 사용하여 결과 데이터 테이블 사후 처리를 볼 수 있습니다. 데이터 카운트 테이블을내보냅니다.
- 자궁내막 면역 세포 공간 분포의 정량화
- 200x 배율 하에서, 세포-세포 접촉 최대거리(14)로간주되는 0-20 μm 범위에 대한 R-프로그램을 사용하여 L 기능을 추정한다.
참고: R 언어 도구 상자 '스패츠스타트'는 L 기능을 측정하는 데 사용되었습니다.- L 기능의 곡선 (AUC) 아래 영역에 따라 면역 세포의 다른 쌍의 클러스터링 수준을 나타냅니다.
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Representative Results
4개의 자궁내막 면역 세포 모형의 검출을 위한 4색 멀티플렉스 분석능력을 수행하는 전반적인 회로도 과정은 도 1에도시된다. 간단히 말해서, 이 멀티플렉스 면역형광 염색에 대한 프로토콜은 8가지 주요 단계를 필요로 했습니다: 1. 슬라이드 제제, 2. Epitope 검색, 3. 차단, 4. 1 차 항체 응용 프로그램, 5. 이차 항체 응용 프로그램, 6. 신호 증폭, 항체 제거, 및 8. 카운터스테인 및 마운트. 영상 렌더링 및 분석은 인폼 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 생성된 스펙트럼 라이브러리를 이용한 만트라 워크스테이션을 사용하여 실시하여 4가지 면역세포 유형을 내메트리엄샘플(그림 2)에서분화하였다.
4개의 자궁내막 면역 세포 모형은 이 멀티플렉스 염색 기술을 사용하여 인간 내막심 견본에서 규명될 수 있습니다: CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD68+ 대식세포 및 CD56+ uNK 세포(그림 3). 그러나, 불소 간섭은 명확하고 사용 가능한 이미지를 얻기 위하여 주의 깊게 고려되어야 합니다. 만트라 워크스테이션을 이용한 이 다중 스펙트럼 기술은 최대 8플렉스 분석서를 지원할 수 있지만, 이 프로토콜에 사용된 4개의 형광을 적용하면 형광의 방출 스펙트럼의 차이로 인한 형광 간섭 없이 최적의 성능을 입증했습니다. 대조적으로, 5-8 형광을 포함하는 멀티플렉스 염색은 종종 공유 파장에서 방출로 인한 형광 간섭에 더 많은 주의를 필요로한다.
이러한 단점을 극복하기 위해서는, 단플렉스 염색은 멀티플렉스내각 항체의 순서를 결정하고 내메트리움 샘플에서 각 면역 마커의 발현 수준 과 패턴을 식별하는 데 필요할 것이다. 이것은 마커및 그들의 관련TSA 불소 쌍을 염색 순서를 결정하는 것을 도울 수 있습니다. 단플렉스 분석이 적용될 항체의 순서를 결정하기 위해 완료되면, 다음 단계는 멀티플렉스 염색 후 검출을 위한 플루오로포어를 선택하는 것이다. 관심있는 모든 항체에 대해 고유 한 불소 항성구를 선택해야합니다. 각 형광호와 관련된 숫자는 대략여기(표 1 및 표 2)에서방출되는 형광 파장이 될 것이다. 불소 경전 간섭을 방지하기 위한 한 가지 접근법은 가능한 한 파장이 있는 형광로포류 쌍을 선택하는 것입니다(특히 항체를 공동 국소화하기 위해). 이렇게 하면 과도한 스펙트럼 중복을 줄이고 선명한 이미지와 보다 안정적인 페노티핑을 제공할 수 있습니다. 더욱이, inForm 소프트웨어에서 멀티플렉스 복합 이미지로부터 레이저를 켜고 끄는 세심한 평가는 또한 플루오로피처 포화를 최소화하기 위해 염색 패턴을 인식하는 데 도움이 될 수있다(도 4).
이미지 분석을 위해, CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD68+ 대식세포, CD56+ uNK 세포, 및 자궁 내막 기질 기질 (CD3−/ CD20−/ CD68-/ CD56- 및 DAPI 염색)의 수를 사용하여 자동으로 계산될 수 있습니다양식 조직 찾기 소프트웨어 14.5). 각 면역 세포 형 밀도는 기질 세포의 총 수에 비해 백분율로 표현되었다(도 5). 유사하게, 자궁내막 면역 세포의 공간 분포의 정량화는 InForm계통(도 6)으로부터얻어진 모든 단일 면역 세포의 X 및 Y 위치에 기초하였다. R-언어를 사용하여 AUC에 기초한 면역 세포의 다른 쌍의 군집 수준은 그 때 구별될 수 있습니다.
그림 1: 염색 워크플로다이어그램. 약어: BSA = 소 세럼 알부민; HRP = 고추냉이 과산화증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 이미지 캡처 및 분석을 위한 워크스테이션. (A)만트라 이미징 워크스테이션,(B)처리되지 않은 스펙트럼 이미지,(C)복합 이미지,(D)조직 세분화(상피 및 스트롬 구획),(E)내측 조직의 복합 이미지는 4개의 색마커를 나타내며 다른 세포 집단을 식별한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 스펙트럼 이미징. 4가지 면역세포 유형의 멀티플렉스 면역염색은(A)비옥한 대조군 여성및(B)단일 다중 스펙트럼 영상으로 제시된 설명할 수 없는 RM을 가진 여자로부터 자궁내막생검에서 수행되었다. 단일 스테인드 라이브러리의 생산에 따라, 스펙트럼 미혼혼합은(C)CD3,(D)CD56,(E)CD68,(F)CD20,(G)DAPI를 나타내는 단일 형광의 이미징을 드러낼 수 있었다. 합성 이미지는 다중 스펙트럼이미징(H)후에모든 형광을 통합하여 생성되었습니다. 스케일 바 = 50 μm(A, B). 약어: LE = 발광 상피; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; RM = 재발성 유산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 양식 카운트 도구. inForm 소프트웨어 카운트 도구는 베이지 색 상자 아이콘을 선택하여 활성화됩니다 (↓에의해 표시). (A)이미지 제제,(B, C)분할 조직 손으로 그린 훈련 및 자동화,(D)분할 개별 세포,(E)플루오로포레 강도에 기초하여 세포를 phenotyping,(F)플루오로포레 강도에 대한 분석 (선택된 플루오로포레 강도에서 양수 세포의 수를 나타내는 레드 박스), 및(G)수출 결과를 사용용에 대한 수출 결과를 나타낸다. 약어: IHC = 면역중독제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 세포 계수. (A)추가 비교 및 통계 분석을 위해 분할 된 영역 (예를 들어, 기질)에서 양극 스테인드 셀의출력을위한 세포의 phenotyping. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 공간 밀도측정. (A)세분화된 영역에서 양분된 면역 세포의 위치를 자동 검출(예를 들어, 기질),(B)각 양수 염색CD20+ 면역 세포의 좌표의 출력 디스플레이,(C)Spatstat를 이용한 세그먼트 조직 영역에서 CD20+ 세포 및 기타 면역 세포 간의 공간 밀도 및 국소화를 결정한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 주문 | 항체 | 클론 | 복제 | 항체 희석 인자 | 단 백석 | 오팔 희석 계수 |
| 1 | CD3 | SP7 | 단일 클론 | 1/100 | 오팔 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | 단일 클론 | 1/100 | 오팔 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | SP251 | 단일 클론 | 1/100 | 오팔 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 | CD564 | 단일 클론 | 1/100 | 오팔 690 | 0.111111111 |
표 1: 사용되는 항체, 클론 및 농도 목록입니다.
| 염료 | 흥분 최대 (nm) | 배출 최대(nm) | 필터 집합에서 예상되는 검색(이름) | 예상 색상 |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | 파랑 |
| 오팔 520 | 494 | 525 | FITC | 녹색 |
| 오팔 620 | 588 | 616 | Cy3 및 텍사스 레드 | 호박 |
| 오팔 650 | 627 | 650 | 텍사스 레드와 사이5 | 오렌지 |
| 오팔 690 | 676 | 694 | 텍사스 레드와 사이5 | 맑다 |
표 2: 최대 여기 및 방출 파장이 있는 형광 목록, 적절한 필터 세트에서 예상되는 감지 및 관찰 가능한 색상입니다.
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Discussion
프로토콜 내의 중요한 단계
멀티플렉스 염색에는 부지런한 최적화가 필요합니다. 구연산 완충및 마이크로파 기술을 사용하여 항원 회수는 완전한 항체 제거를 보장하고 조직의 생존가능성을 유지하기 위해 최적화가 필요합니다. TSA 시약이 항원을 둘러싼 부위에 공유적으로 결합함에 따라, 그들은 잠재적으로 스테릭 방해를 통해 후속 1 차 항체의 결합을 억제 할 수 있습니다 (또한 "우산 효과"라고도 함). 이것은 다중 면역 마커가 단 하나 세포 구획에 거주하고 불소 로피홀 간섭을 일으키는 원인이 될 때 생기는 경향이 있습니다. 효과가 있을지 여부를 확인하기 위해 면역 세포의 국소화에 중복되는 것을 확인하기 위해 모노플렉스 IHC/IF를 사전에 수행하는 것이 중요합니다. 스펙트럼 라이브러리를 생성하기 위해 단일 샘플 염색이 필요하므로 검증된 스펙트럼 라이브러리는 개별 신호의 차별을 용이하게 하여 형광간섭을 더욱 방지할 수 있습니다. 필요한 경우, 1차 항체 농도 및 배양 시간, 불소-항체 페어링, TSA 플루오로포어 농도 및 염색 순서는 플루오로포레 간섭을 최소화하기 위해 수정될 수 있다. 마찬가지로 TSA 이머 형성을 방지하기 위해 HRP 농도의 균형을 적절히 조정하는 것이 중요합니다. 이것은 1 차 및 이차 항체의 적정에 의해 달성될 수 있다. 더욱이, 멀티플렉스 염색에 사용되는 1차 항체의 농도 및 잠복시간이 종래의 염색체 단일 염색에 사용되는 것과 다를 수 있다는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 따라서, 멀티플렉스 염색을 위해 적용하는 항체의 농도 및 순서의 결정은 사전에 수행되어야 한다.
수정 및 문제 해결
이 연구에서는, 우리는 RM유무에 관계없이 여성으로부터 내메트리움 생검에 있는 4개의 중요한 면역 세포 모형의 상호 작용을 동시에 검출하기 위하여 다중형광 면역히스토케 화학 염색을 채택했습니다. 이 기술은 T 세포를 위한 CD3에 대하여 항체, B 세포를 위한 CD20, 대식세포를 위한 CD68 및 uNK 세포에 대한 CD56를 사용하여 이 세포 모형 을 구별합니다. 이 방법에 기초하여, 우리는 RM 여성의 중앙CD3+,CD68+및 CD56+ 세포 밀도 값이 비옥한대조군(15)보다현저히 높다는 것을 발견했다. CD56+ uNK 세포와 CD68+ 대식세포 사이의 클러스터링은 비옥한 대조군보다 RM 그룹에서 상당히 높았다. 또한, 이 방법의 사용은 CD56+ uNK 세포가 여성의 두 그룹에서 CD68+ 대식세포와 수치 및 공간 상관관계를 모두 갖는 것으로 나타났다. 대조적으로,CD56+ uNK 세포는 RM15를가진 여자에 있는 CD3+ T 세포와 중요한 수치 그러나 공간 상관관계가 없습니다. 이 방법은 또한 내분담관에 있는 다중 면역 세포 모형의 공간 관계를 결정합니다. 그러나 특정 마커에 대한 긍정성은 경우에 따라 경계선이 될 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해 스펙트럼 라이브러리를 구성할 때 양성 임계값을 결정하는 양수 제어 및 음수 제어를 포함하는 것이 좋습니다. 또한 inForm 소프트웨어의 멀티플렉스 복합 이미지에서 레이저를 켜고 끄는 세심한 평가는 플루오로포레 포화를 최소화하는 스테인링 패턴을 인식하는 데도 도움이 될 수 있습니다.
기술의 한계
데이터 해석 중에 형광간섭을 식별하는 것은 마커의 진정한 지역화와 혼합되지 않는 아티팩트를 구별하는 데 필수적입니다. 이러한 멀티플렉스 염색 방법론은 효소 증폭에 의해 구동되는 TSA 기반 시약을 활용하며, 이는 기존의 간접 IF 방법에 비해 항원 마커 강도를 10-100배 높일 수 있다. 이것은 잠재적으로 우산 효과 및/ 또는 신호 출혈을 초래하는 과민성 티라미드 증착의 위험을 생성합니다. 오버스테인을 식별하기 위해, 신호 수준은 inForm에서 이미지를 혼합하고 멀티플렉스 조직 이미지에서 밝고 긍정적인 영역에 커서를 마우스로 가져가서 시각적으로 평가할 수 있습니다. 신호 수준은 일반적으로 30 이하와 특히 관상 인접한 형광에 대한 서로 의 요인 3 내에서 이상적으로 유지되어야합니다. 관적으로 인접한 형광에 대한 신호의 5 배 이상의 차이는 형광 간섭으로 이어질 수 있으며 혼합 되지 않는 아티팩트를 일으킬 수 있습니다. 어떤 불소류의 신호 수준이 인접한 형광로로부터 3 배 이상의 차이를 보이는 경우 TSA 플루오로포어 농도는 신호 균형을 달성하기 위해 조정되어야합니다. 신호가 올바른 범위에 있는 것으로 확인되면 신호 대 배경 비율을 <1:10에 유지하여 포지티브 염색이 비특이적 배경에서 거짓으로 감지되지 않도록 해야 합니다.
스펙트럼 크로스토크는 또한 상당한 불소 간섭을 만들 수 있기 때문에, 염색 순서는 마커의 순서와 발현 모두에서 관상인 염료를 분리하도록 조정되어야 합니다. 만트라 워크스테이션을 사용하는 이 다중 스펙트럼 기술은 최대 8플렉스 분석기를 지원하지만, 오팔 520, 540, 620 및 690과 같은 4개의 형광술을 적용하면 형광 간섭 없이 최상의 성능을 보여줍니다. ≥5형형광의 사용은 근접 파장을 공유하는 형광의 스펙트럼 프로파일로 인해 스펙트럼 크로스토크를 피하기 위해 더 많은 최적화와 유효성 검사가 필요합니다. 즉, 이 접근법에 의해 동시에 검출할 수 있는 표적의 수는 파장 대역및 발아/방출 필터 세트의 수에 의해서만 제한됩니다. 따라서 다른 TSA 형광의 추가 적용을 차단하는 TSA 형광의 잠재적 인 스태킹을 배제하고 신호 교차 토크를 식별하려면 inForm 소프트웨어의 멀티플렉스 복합 이미지에서 레이어를 켜고 끄는 것이 필수적입니다. 단일 IHC 염색패턴의 염색 패턴을 올바르게 해석하는 행위; 다른 평면의 현지화에 대응하는 한 평면에서 명백한 손실, 이득 또는 동일한 신호를 찾고 있습니다.
다중 스펙트럼 염색은 여러 마커를 동시에 검출하기 위해 특정 형광과 결합된 항체를 요구합니다. 이러한 형광-항체 페어링은 두 가지 규칙을 따릅니다: i) 공동 발현 마커에 할당된 형광은 관적으로 떨어져 있어야 하며, ii) 더 풍부한 표적은 더 낮은 밝기또는 그 반대의 경우도 마찬가지인형광과 결합되어야 한다. 스테인링순서는 또한 순차적 항체가 스테인드 셀내와 동일한 세포 구획에서 공동 국소화되지 않도록 배치될 필요가 있다. 따라서, 항체 농도 및 배양 시간 이외에, 종래의 염색 방법에 중요한 요인이되는, 적절한 플루오로포레 항체 페어링, TSA 플루오로포어 농도, 염색 서열 및 하나 이상의 마이크로파 치료에 특정 항체의 노출과 같은 추가 파라미터는 성공적인 멀티플렉스 염색을 위해 고려되어야 한다. 연구 샘플의 가변성이 높기 때문에 지정된 멀티플렉스 프로토콜은 다른 유형의 스터디 샘플에서 동일한 결과를 생성하지 못할 수 있습니다.
전체 오팔 멀티플렉스 순차 염색 과정은 패널 및 1 차 항체 잠복기와 관련된 마커의 수에 따라 1 일에서 며칠까지 걸릴 수 있습니다. 대조적으로, 표준 IF 메서드는 일반적으로 염색의 단일 라운드에서 4-5 마커의 시각화를 허용합니다. 종래의 IHC 방법을 사용하여 최적화된 조건은 멀티플렉스 염색 절차를 진행하기 전에 추가 최적화가 필요하며, 이는 여러 마이크로파 처리및 궁극적으로 각 항체의 염색 강도에 영향을 미칠 TSA 형광의 적용을 포함한다. 현재 다중 스펙트럼 기술을 활용하는 이미징 접근 법은 비용이 많이 들고 전용 계측이 필요할 수 있습니다. 또한 이미지 선택 된 관심 영역으로만 제한 될 수 있습니다. 따라서, 이것은 제한된 자원과 불확실한 항원 표적을 가진 조직의 스카우트를 가진 실험실에 대한 최적이 아닐 수 있습니다.
기존 방법에 대한 중요성
이러한 현재 방법의 특정 강도는 단일 조직 섹션에서 1~2개의 세포 유형만 라벨을 부착할 수 있는 기존의 IHC 방법과 달리 동시에 내메트리움에서 다중 면역 세포 유형의 밀도를 측정하는 기능이다. 유동 세포측정은 자궁내막 시편에서 상이한 면역세포 유형의 상대적 비율을 분석할 수 있는 또 다른 방법이다. 그러나, 그것은 다양 한 면역 세포 유형 및 다른 자궁 내 재판 구획 내에서 특정 분포 사이 공간 정보를 제공할 수 없을 것 이다. 더욱이, 조직 고갈은 임상 사례에 있는 심각한 관심사입니다, 특히 임상 시험 도중 및 생검 견본을 사용하는 때. 이 두 가지 통상적인 방법은 절차를 최적화하고 RM유무에 관계없이 여성의 내메트리움에서 다중 면역 세포 유형을 검출하기 위해 많은 수의 표본(섹션 또는 세포)을 필요로 합니다.
이 프로토콜에 설명된 바와 같이, 오팔 워크플로우는 만트라 워크스테이션을 사용하여 동일한 조직 섹션에서 최대 7개의 마커를 검출하도록 설계되었습니다. 또한, 항체 선택 중 종 교차 반응성은 이 기술의 한계가 아니다. 실제로, 이 기술의 장점은 최대 7개의 마커를 검출하기 위해 동일한 종에서 제기된 항체의 사용을 허용한다는 것입니다. 이 접근은 어떤 비특이적인 얼룩을 제거하기 위하여 전자레인지 처리에 선행된 형광 TSA 시약으로 검출을 관련시킵니다. 마이크로파 기반 스트리핑 후, 항체 교차 반응성의 위험없이 추가 표적 검출을 위해 염색의 또 다른 라운드를 수행 할 수 있습니다. 또한, 이 TSA 검출 방법은 최소 3일 이내에 수행되어 최대 7개의 플루오로크롬을 결합하면서도 저발현 단백질 표적을 검출할 수 있는 신뢰할 수 있는 결과를 생성할 수 있다. 기존의 IHC 연구에 비해 멀티플렉스 염색의 또 다른 장점은 측정이 자동화되어 주관적인 편견을 제거할 수 있기 때문에 향상된 효율성입니다. 생성된 정량 데이터는 분석의 최종 결과를 나타냅니다.
향후 응용 프로그램
이 멀티플렉스 프로토콜의 적용 범위는 엄청입니다. 중요한 것은, 이는 RM의 유무에 관계없이 여성의 다중 면역세포 집단을 분화하는 정확하고 재현가능한 결과를 제공하기 위한 InForm 2.2.1 소프트웨어를 이용한 만트라 워크스테이션 및 이미지 분석을 이용한 다중면역형마커 발현의 검출 방법을 설명하는 최초의 논문이다. 궁극적으로, 이것은 특정 표적 처리를 설치하기 위한 RM를 가진 여자에 있는 태아 이식 도중 면역 세포 미세 환경의 더 나은 이해로 이끌어 낼 것입니다.
더욱이, 우리의 현재 방법은 몇몇 면역 세포 및 그들의 상호 작용이 자궁 내분의 기능에 중요할 지도 모르다는 것을 증명하는 것을 도왔습니다. 이는 4개의 자궁내막 면역 세포 모형의 3의 조밀도에 있는 중요한 변경 및 CD68+ 와 CD56+ 세포 사이 군집에 있는 중요한 증가에 의해 도시됩니다. 반대로, 이러한 면역 세포 유형의 비정상적인 상호 작용은 RM에 대한 경향 요인일 수 있습니다. 추가적으로, 면역 마이크로 환경에 있는 공간 특징의 정량화 그리고 추가 이해는 면역 요법의 맥락에서 이 질병의 생물학에 빛을 비추는 것을 도울 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 2018년 홍콩 산부인과 신탁 기금과 홍콩 보건 의료 연구 기금(06170186, 07180226)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
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