Summary
Multipleks immünhistokimya ve multispektral görüntülemedeki gelişmelere rağmen, endometriyumda aynı anda majör immün hücrelerin yoğunluğunu ve kümelenişini karakterize etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu makalede, endometriyumdaki dört immün hücre tipinin eşzamanlı lokalizasyonu için ayrıntılı bir multipleks boyama protokolü ve görüntüleme açıklanmaktadır.
Abstract
İmmünohistokimizma, biyolojik araştırma ve klinik tanılarda doku antijenlerinin tanımlanması ve görselleştirilmesinde en sık kullanılan yöntemdir. Yara iyileşmesi, immün yanıt, doku reddi ve doku-biyomalzeme etkileşimleri gibi çeşitli biyolojik süreçleri veya patolojileri karakterize etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, konvansiyonel immünohistokimyasal (IHC) boyama kullanılarak tek bir doku bölümünde birden fazla antijenin (özellikle bağışıklık hücreleri için) görselleştirilmesi ve nicelemesi tatmin edici değildir. Bu nedenle, son yıllarda tek bir doku örneğinde veya farklı doku örneklerinden oluşan bir toplulukta birden fazla biyolojik belirteci tanımlamak için çoklayıcı teknolojiler tanıtıldı.
Bu teknolojiler özellikle implantasyon sırasında tekrarlayan düşükleri olan doğurgan kadınlar ve kadınlar arasında endometriyum içindeki bağışıklık hücresi-hücre etkileşimlerindeki değişiklikleri ayırt etmede yararlı olabilir. Bu makalede, embriyo implantasyonu sırasında tam olarak zamanlanmış endometriyal örneklerde aynı anda dört ana immün hücre tipinin yoğunluğunu ve kümelenmeyi araştırmak için çok faktörlü floresan IHC boyama için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, örnek hazırlama, immün hücre alt tipleri için belirteçlerle multipleks optimizasyonu ve endometriyal bağışıklık hücrelerinin tespit edilmesine özel referansla slaytların taranmasını ve ardından veri analizini içerir.
Bu yöntem kullanılarak, endometriyumdaki dört ana immün hücre tipinin yoğunluğu ve kümelenmesi aynı anda tek bir doku bölümünde analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu makalede, uygulanan floresan problar arasındaki olası florofor parazitinin üstesinden gelmek için kritik faktörler ve sorun giderme tartışılacaktır. Daha da önemlisi, bu multipleks boyama tekniğinden elde edilen sonuçlar, embriyo implantasyonu sırasında immünolojik etkileşimin ve regülasyonun derinlemesine anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Introduction
Tekrarlayan düşük (RM), 24 haftalık gebelik1'denönce iki veya daha fazla gebenin kaybı olarak tanımlanabilir. Bu sık üreme durumu dünya çapında çiftlerin% 1'ini etkiler2,3. Patofizyoloji multifaktöriyeldir ve embriyolojik olarak yönlendirilen nedenlere (esas olarak anormal embriyonik karyotip nedeniyle) ve endometrium ve/veya plasenta gelişimini etkileyen doğum odaklı nedenlere ayrılabilir. Bu tezahür ebeveyn genetik anormallikleri, rahim anomalileri, protropombotik durumlar, endokrinoloji faktörleri ve immünolojik bozukluklardan kaynaklanabilir4.
Son yıllarda, immün efektör hücre disfonksiyonu erken gebelik kaybının patogenezine bulaşmıştır5. Bu, adet döngüsü, implantasyon ve erken gebelik sırasında endometriyumdaki spesifik bağışıklık hücrelerinin popülasyonlarını, erken gebelikte belirli rollerle aydınlatıcı birçok araştırmaya ilham vermiştir. Bu bağışıklık hücreleri arasında, uterus doğal öldürücü (uNK) hücreler embriyo implantasyonu ve gebelik sırasında, özellikle trofoblastik invazyon ve anjiogenez süreçlerinde kritik bir rol oynar6. Çalışmalar RM7,8ile kadınların endometriumunda artan bir uNK hücre yoğunluğu göstermiştir , ancak bu bulgu düşük riskinin artmasıyla ilişkili değildi9. Bununla birlikte, bu RM10,11olan kadınlarda endometriyumdaki diğer bağışıklık hücresi türlerinin (makrofajlar, uterus dendritik hücreler gibi) yoğunluğunu değerlendiren araştırmayı teşvik etti. Bununla birlikte, RM'li kadınlarda peri implantasyon endometriyumunda bağışıklık hücre yoğunluğunda önemli bir değişiklik olup olmadığı belirsizliğini korumaktadır.
Belirsizliğin olası bir açıklaması, implantasyon penceresi sırasında endometriyumdaki hızlı değişiklikler nedeniyle endometriyal immün hücre yoğunluğunun değerlendirilmesinin zor olabileceğidir. 24 saat boyunca, endometriyumdaki önemli değişiklikler bağışıklık hücre yoğunluğunu ve sitokin salgısını değiştirir ve bu sonuçlarda bir varyasyon kaynağı12. Buna ek olarak, çoğu rapor esas olarak aynı doku bölümündeki birden fazla belirteci inceleyemeyen tek hücreli boyamanın (örneğin geleneksel IHC yöntemleri) kullanımına dayanır. Akış sitometrisi tek bir örnekte birden fazla hücre popülasyonunu tespit etmek için kullanılabilse de, gerekli olan büyük miktarda hücre ve zaman alıcı optimizasyon bu yöntemin popülaritesini ve verimliliğini engeller. Bu nedenle, multipleks IHC boyamadaki son gelişme, hücre soyu ve bireysel immün subpopulasyonların histolojik lokalizasyonu da dahil olmak üzere birden fazla parametreyi değerlendirmek için aynı slayttaki birden fazla belirteci immünostaining yaparak bu sorunu çözebilir. Ayrıca, bu teknoloji sınırlı doku kullanılabilirliği durumunda elde edilen bilgileri en üst düzeye çıkarabilir. Sonuçta, bu teknik, doğurgan kadınlar ve RM'li kadınlar arasındaki endometriyumdaki bağışıklık hücresi etkileşimlerindeki farklılıkların aydınlatıcı olmasına yardımcı olabilir.
Prince of Wales Hastanesi'nden doğurgan kontrol kadınları (FC) ve açıklanamayan tekrarlayan düşük (RM) olan kadınlar da dahil olmak üzere iki grup kadın işe alındı. Doğurganlık kontrolü, spontan düşük öyküsü olmadan en az bir canlı doğum yapan kadınlar, RM kadınları ise 20 haftalık gebelikten önce art arda ≥2 düşük öyküsü olanlar olarak tanımlandı. İki gruptan denekler aşağıdaki dahil etme kriterlerini karşılar: (a) 20 ila 42 yaş arası yaş, (b) sigara içmeyen, (c) düzenli adet döngüsü (25-35 gün) ve normal rahim yapısı, (d) Endometriyal biyopsiden önce en az 3 ay hormonal rejim kullanılmaması, (e) histerik-salpingogram ile hidrosalpinks kullanılmaması. Buna ek olarak, işe alınan tüm deneklerde normal karyotiping, normal 3 boyutlu ultrasonografi histerikalpingogram, 2. gün folikül uyarıcı hormon < 10 IU/L, orta luteal progesteron > 30 nmol/L, normal tiroid fonksiyonu vardı ve lupus antikoagülan ve antikardiyolinilin IgG ve IgM antikorları için negatif test edildi.
RM'nin immünolojik temelini daha iyi anlamak için, implantasyon sırasında endometriyumda bulunan başlıca immün hücre tiplerinin aynı anda ölçülmesi ve lokalize edilmesi en çok arzu edilir. Bu makalede, numune hazırlamadan tüm protokol, bağışıklık hücresi alt tipleri için belirteçlerle çoklama optimizasyonu ve slaytların taranmasının ardından endometriyal bağışıklık hücrelerinin tespitine özel referanslı veri analizi açıklanmaktadır. Ayrıca, bu makalede endometriyumda aynı anda bağışıklık hücre tiplerinin yoğunluğunun ve kümelenmesi nasıl belirlenecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, Hong Kong Ortak Çin Üniversitesi-Yeni Bölgeler Doğu Kümesi Klinik Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylandı. Endometriyal biyopsiler toplanmadan önce katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındı. Denetim ve RM gruplarının dahil edilme ölçütleri için giriş bölümüne bakın.
1. Numune hazırlama
- Bu çalışmadaki tüm kadınların yumurtlamayı tespit etmek için luteinize edici hormon (LH) dalgalanmasını tanımlamak için adet döngüsünün 9. gününden itibaren günlük idrar dipstick testinden geçmesini sağlayın ve endometriyal biyopsileri LH dalgalanmasından sonraki7.
- Açıklanamayan RM'li doğurgan kadınlardan ve kadınlardan Pipelle örnekleyici veya Pipet Curet kullanarak0,5 cm 2 endometriyal biyopsi parçası elde edin.
NOT: Fiksatifin hacmi dokudan 5-10 kat daha fazla olmalıdır. - Erimiş parafin balmumuna gömmeden önce, dokuyu bir doku işleme makinesine dehidrasyon için bir kartuşa yerleştirin. Dokuları 58-60 ° C'de parafin içine gömün.
- Parafin bloğunun oda sıcaklığında gece boyunca soğumasını bekleyin. Parafin bloklarını 3 μm kalınlıkte kırpmak için bir mikrotom kullanın.
NOT: Damıtılmış su kullanımı, çoklama lekeleme boyunca uygun doku montajında ve yapışmada yardımcı olur. - Parafin kurdelesini 30 sn boyunca 40-45 °C'de bir su banyosuna yerleştirin.
- Bölümleri poli-L-lizin (%0,1 w/v) kaplı mikroskop cam slaytlara monte edin. Slaytları doku yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'de kurumaya bırakın. Slaytları bir slayt kutusunda aşırı sıcaklıklardan uzak bir şekilde bir sonraki kullanıma kadar saklayın.
2. Geleneksel IHC kullanarak multipleks IHC için ideal antikor konsantrasyonunun belirlenmesi.
NOT: Bu, endometrium örneğindeki her bir immün belirtecin ifade düzeyini ve desenini tanımlamak ve her bir belirtecin boyama sırasını ve ilişkili tyramide sinyal amplifikasyonunu (TSA) florofor eşleşmelerini belirlemek için önemlidir.
- Manuel konvansiyonel IHC13kullanarak antikorları multipleks IHC'ye uygunlukları için test edin.
- Tek antikor testi için endometrium dokuları kullanın.
- Her antikorun boyama durumunu optimize etmek için pozitif bir kontrol (örneğin dalak) ve negatif kontrol (izotip kontrolü) ekleyin.
- Antikorun veri sayfası tarafından önerilen seyreltme kullanarak boyamayı gerçekleştirin.
- 2.3. adımda kullanılan önerilen seyreltmenin üstündeki ve altındaki konsantrasyonları kullanarak ek boyama gerçekleştirin.
NOT: Bir klinik patolog, antikor problama ve hücresel bütünlüğün lokalizasyonunu doğrulamak için lekeli slaytları körü körüne değerlendirmelidir.
3. Multipleks boyama yöntemi
- Slayt hazırlama ve sabitleme
- Slaytları (adım 1.6'dan itibaren) dokuyu bir fırına bakacak şekilde düzleştirin ve en az 1 saat boyunca 60 °C'de pişirin.
- Slaytları fırından çıkarın ve dikey bir slayt rafı içine yerleştirmeden önce oda sıcaklığında en az 20 dakika soğumalarını bekleyin.
- Formalin sabitlenmiş, parafin gömülü slaytları aşağıdaki adımların her birine 10 dakika tahsis ederek dewax ve rehidratlayın: ksilen (2x), % 100 etanol (2x), % 95 etanol (1x), % 70 etanol (2x) ve damıtılmış su (2x).
- Slayt rafını plastik bir slayt kutusuna yerleştirin ve Tris arabelleğe alınmış saline batırın (TBS, pH 7.6).
NOT: Slaytlar, bu rehidrasyon adımından başlayarak son adımda monte edilene kadar nemli kalmalıdır. - Slaytları karanlıkta 30 dakika boyunca metanol (1:9) ile seyreltilmiş formaldehit karışımı ile dolu plastik bir slayt kutusuna batırarak örnekleri düzeltin.
- Slaytları deiyonize suda iki kez 2 dakika yıkayın ve ardından antijen alımına devam edin.
- Epitop alma
- Slayt rafını ısıya dayanıklı bir kutuya yerleştirin ve slaytları örtmek için sitrik asit tamponu (pH 6.0) ile doldurun.
- Kutuyu mikrodalga fırına yerleştirin ve aynı sıcaklığı korumak için slaytları % 100 güçte 50 sn ve ardından% 20 güçte 20 dakika ısıtın.
- Slaytların oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika soğumasını bekleyin.
- Slaytları 2 dakika suda durulayın ve ardından TBS-Tween 20 (TBST) 2 dakika boyunca durulayın.
NOT: TBST, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl ve% 0.05 Ara 20'den (v/v) oluşur.
- Engelleme
- Slaytı peroksidaz bloke çözeltisi içeren bir kavanoza batırarak dokudaki endojen peroksidaz aktivitesini engelleyin (Malzeme Tablosunabakınız) 10 dakika boyunca.
- Slaytları TBST ile 5 dakika yıkayın.
- Slayttaki doku bölümünün etrafındaki bir sınırı işaretlemek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
- Doku bölümlerini bir bloke tamponu (bkz. Malzeme Tablosu)veya sığır serum albümini (%5, w/v) ile örtün ve slaytları nemli bir odada 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- Antikor ve sinyal uygulaması
- Engelleme reaktiflerini çıkarın.
- 30 dakika boyunca oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada birincil ilgi antikoru (örneğin, CD3, antikor seyreltmede 1:100seyreltme, bkz. Tablo 1) ile kuluçkaya yatın.
- Birincil antikoru çıkarın. Her seferinde 5 dakika BOYUNCA TBST ile 3x yıkayın.
- Oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada15dakika boyunca polimer yaban turpu peroksidaz (HRP) etiketli ikincil antikor ( Tablo 1 ) ile kuluçkaya yatırın. Her seferinde 5 dakika BOYUNCA TBST ile 3x yıkayın.
- Opal florofor TSA çalışma solüsyonunu (amplifikasyon seyrelticide 1:100) uygulayın ve birincil antikor bağlama bölgelerinde doku örneğine florofor konjugasyonu sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatın. TBST ile her seferinde 5 dakika üç taraflı yıkayın.
- Mikrodalga bazlı sıyırma
- Antijen alma tamponu ile durulayın (sitrat tampon çözeltisi, pH 6.0).
- Bir sonraki birincil antikoru (örneğin, CD20) tanıtmak için birincil-ikincil-HRP kompleksini çıkarmak için mikrodalga bazlı sıyırma gerçekleştirin.
- Slaytları antijen alma tampona yerleştirin, 50 s için% 100 güçte mikrodalgalayın ve mikrodalga güvenli kaplarda 20 dakika boyunca% 20 güçte pişirin ve oda sıcaklığında 15 dakika soğutun.
- Doku örnekleri tüm birincil antikorlarla araştırılana kadar 3.2.4 ile 3.5.2 adımlarını tekrarlayın.
- Sayaçlar ve montaj
- Mikrodalga bazlı sıyırma ve antijen alma tamponunun soğutulması sonrasında, slaytları damıtılmış suda ve TBST'de durulayın.
- Oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 5 dakika boyunca 4', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) çözeltisi (1,0 μg/mL) ile kuluçkaya yaslayın.
- Her seferinde 5 dakika BOYUNCA TBST ile 3x yıkayın. 5 dakika boyunca bir kez suyla yıkayın.
- Kaydırağı havayla kurulayın ve uygun montaj ortamıyla monte edin (Bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Spektral kitaplık geliştirme için kullanılacak çift yönlü slaytlar için karşı koyma gerekmez.
4. Görüntü ve analiz
- Spektral kütüphane slaytlarının hazırlanması
- Multispektral görüntü analizi için aynı kontrol dokusuna sahip her florofor, DAPI ve otomatik floresan için kitaplık slaytları (tek lekeli referans görüntüleri) oluşturun.
- RM'li ve doğurgan kadınlardan alınan endometriyal biyopsi örneklerinin slaytlarını kullanarak, her slayt için tek antikor tespiti için 1.1 ila 3.6.4 adımlarını gerçekleştirin (daha fazla antikor veya florofor ilavesi olmadan).
- Her antikor tespiti için, slaytlardan birini DAPI ile lekeleyin (adım 3.6.2'de olduğu gibi) ve spektrumdaki olası doku otomatik floresanlarının tespiti için bir slaytı lekesiz bırakın.
- Her antikor için bu slayt kümesinin görüntüsünü elde etmek ve bunları görüntü analizi kitaplığına yüklemek için iş istasyonundaki uygun filtreleri kullanın (adım 4.2'de açıklandığı gibi).
- Görüntü yakalandıktan sonra, Spectral Kitaplığı Kaynağı olarak InForm'u seçin ve spektral kitaplığı oluşturun.
- Floroforlar kullanılırken, menüden Lekeler/Florlar... öğesini seçin.
- Lekeleri veya floroforları seçerken, bir veya daha fazla Grup seçerek seçenekleri daraltın. Görüntülerle uyumlu tüm spektrumları göstermek için Tümü'yü seçin.
- Spektral görüntüleme
NOT: Görüntüler, inForm Image Analysis yazılımı kullanılarak kurulan spektral kütüphane ile Mantra İş İstasyonu kullanılarak yakalandı.- İş istasyonunu kullanarak Tablo 2'de (örneğin, DAPI, floresan izotiyosiyanat [FITC], CY3, Texas Red ve CY5) önerildiği gibi uygun epi-floresan filtrelerle tek antikor lekeli slaytların görüntüsünü yakalayın.
NOT: Bu protokolde kullanılan belirli floroforlar için önerilen filtreler Tablo 2'de gösterilmiştir. - İlgili floresan kanalındaki her bir işaretleyiciyi inceleyerek optimum sinyal için uygun bir pozlama süresi belirleyin.
NOT: Tek antikor lekelemede elde edilen pozitiflik ve lokalizasyon referanslarına göre en uygun sinyal belirlenir. - Çapraz numune karşılaştırmasını standartlaştırmak için her bir anallit (antikor-florofor kombinasyonu) için sabit bir maruz kalma süresi belirleyin.
NOT: Sabit pozlamanın belirlenmesi, ilgi alanlarının örneğindeki yoğunluğa bağlıdır. - Katıştırılmış otomatik netleme algoritması ile çoklamalı lekeli slaytları uygun tarama modunda tarayın.
NOT: Kurulan spektral kütüphane, multispektral görüntü küpünü tek tek bileşenlere (spektral karıştırma) ayırt etmek için kullanılır. Bu, tüm ilgi çekici işaretler için renk tabanlı tanımlamanın aşağıdaki iki ana adım kullanılarak işlenmesine izin verir: eğitim oturumu ve görüntü analizi oturumu.
- İş istasyonunu kullanarak Tablo 2'de (örneğin, DAPI, floresan izotiyosiyanat [FITC], CY3, Texas Red ve CY5) önerildiği gibi uygun epi-floresan filtrelerle tek antikor lekeli slaytların görüntüsünü yakalayın.
- Görüntü analizi
- Endometriyumda seçilen immün hücre tiplerinin hücre sayımı
- 200x büyütme altında analiz için en az 10 alan yakalayın.
NOT: Alanlar herhangi bir seçim yapılmadan tüm bölüm taranarak yakalandı. Bu, endometriumun tüm hücre bileşenlerinin, örneğin ışıksal epitel kenarlığının, stromanın ve bezlerin aynı anda yakalanmasını sağlayabilir. - Hücreleri saymak için, Nesne Sayma Ayarları panelini görüntülemek üzere adım çubuğundaki Nesneleri Say düğmesini tıklatın.
- Görüntünün, işlem bölgesinin veya doku bölgesinin kenarına dokunan nesnelerin dışlanması için Kenara Dokunuyorsa Nesneyi At kutusunu işaretleyin.
- Doku parçalanmışsa, nesnelerin bulunacağı Doku Kategorisi'ni seçin. Seçili doku kategorisinin dışındaki nesneleri sayma.
- Nesneleri tanımlamak için istediğiniz Yaklaşımı seçin: Nesne Tabanlı veya Piksel Tabanlı (Eşik).
NOT: Basit bir eşik uygulamasının nesne piksellerini vereceği güvenilir veya tutarlı bir leke olması durumunda Piksel Tabanlı (Eşik) yaklaşım seçilmelidir. Nesnelerin tutarlılığı ve özgüllüğü olmaması durumunda daha gelişmiş morfometri tabanlı yaklaşımlar gerektiğinde Nesne Tabanlı yaklaşım önerilir. - İstediğiniz Sinyal Ölçeklendirme : Otomatik Ölçekleme veya Sabit Ölçek'i seçin.
NOT: Otomatik Ölçek'in seçilmesi, nesne segmentasyonunu gerçekleştirmeden önce her bileşen düzleminin otomatik olarak ölçeklendirmesine neden olur. Daha iyi segmentasyon performansı gerektiğinde ve leke sinyalleri tutarlı ve güvenilir olduğunda Sabit Ölçek seçeneği önerilir. - Açılan listeden nesne segmentasyonu için Birincil bileşeni seçin.
- Birincil bileşen için Minimum Sinyal değerini istenen eşik değerine ayarlayın.
- Nesnelerdeki delikleri otomatik olarak doldurmak için Delikleri Doldur 'useçin.
- Diğer nesnelere dokunan nesneleri tek bir nesne olarak değil, tek bir nesne olarak algılamak için, En Büyük Boyut (piksel) onay kutusunu seçtikten sonra Bölmeyi İyileştir onay kutusunu seçin.
- Nesnenin yuvarlaklığına göre nesneleri dışlamak için Yuvarlaklık kutusunu işaretleyin ve istediğiniz Minimum Döngüselliğibelirtin.
- Kan damarlarını çevreleyen hücrelerde dahil olmak üzere tüm stromal hücreleri (CD3 − /CD20−/CD68 − /CD56−ve DAPI+) sayın.
- Bağışıklık hücrelerini T hücreleri (CD3 + veDAPI+ ), B hücreleri (CD20+ ve DAPI+), makrofajlar (CD68+ ve DAPI+) ve uNK hücreleri (CD56+ ve DAPI+) dahil olmak üzere ayrı ayrı sayın.
- Yakalanan her görüntü için toplam stromal hücre sayısına göre bağışıklık hücrelerinin yüzdeleri olarak verileri ifade edin ve son hücre sayısını tüm alanların ortalaması olarak bildirin.
- İşlem sonrası elde edilen veri tablolarını görüntülemek için Görünüm Düzenleyicisi'ni kullanın. Count Data tablosunuverin.
- Endometriyal immün hücre mekansal dağılımının nicelleştirilmesi
- 200x büyütme altında, bir hücre hücresi teması maksimum mesafe14olarak kabul edilen 0-20 μm aralığı için R programını kullanarak L işlevini tahmin edin.
NOT: R dili araç kutusu 'spatstat' L işlevini ölçmek için kullanıldı.- L fonksiyonlarının eğrisi (AUC) altındaki alana göre farklı bağışıklık hücrelerinin kümelenme düzeyini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4 endometriyal immün hücre tipinin tespiti için 4 renkli multipleks test gerçekleştirmenin genel şematik süreci Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısacası, bu multipleks immünofluoresans boyama protokolü 8 temel adım gerektiriyordu: 1. Slayt hazırlama, 2. Epitope alma, 3. Engelleme, 4. Birincil antikor uygulaması, 5. İkincil antikor uygulaması, 6. Sinyal amplifikasyonu, 7. Antikorun çıkarılması ve 8. Karşıtlık ve montaj. Görüntü işleme ve analiz daha sonra endometrium örneğindeki 4 bağışıklık hücresi tipini ayırt etmek için inForm Image Analysis yazılımı kullanılarak oluşturulan spektral kütüphane ile Mantra İş İstasyonu kullanılarak yapılmıştır (Şekil 2).
Bu multipleks boyama tekniği kullanılarak insan endometrium örneklerinde dört endometriyal immün hücre tipi tanımlanabilir: CD3+ T hücreleri, CD20+ B hücreleri, CD68+ makrofajlar ve CD56+ uNK hücreleri (Şekil 3). Bununla birlikte, net ve kullanılabilir bir görüntü elde etmek için florofor paraziti dikkatlice düşünülmelidir. Mantra İş İstasyonu'nun kullanıldığı bu multispektral teknoloji 8'li testlere kadar destekleyebilse de, bu protokolde kullanılan 4 floroforun uygulanması, floroforların emisyon spektrumlarındaki farklılıklar nedeniyle florofor müdahalesi olmadan optimum performans göstermiştir. Buna karşılık, 5-8 floresan içeren çok katlı boyama genellikle paylaşılan dalga boylarından yayılan floresan parazitine daha fazla dikkat gerektirir.
Bu dezavantajı aşmak için, çoklamadaki her antikorun sırasını belirlemek ve endometrium örneğindeki her bir bağışıklık işaretleyicisinin ifade seviyesini ve desenini tanımlamak için monokleks boyama gereklidir. Bu, belirteçlerin boyama sırasını ve ilişkili TSA florofor eşleşmelerini belirlemeye yardımcı olabilir. Uygulanacak antikorların sırasını belirlemek için monoplex testi tamamlandıktan sonra, bir sonraki adım multipleks boyamadan sonra tespit için floroforu seçmek olacaktır. Her ilgi antikoru için benzersiz bir florofor seçilmelidir. Her floroforla ilgili sayı kabaca eksize etme sırasında yayılan floresan dalga boyu olacaktır (Tablo 1 ve Tablo 2). Florofor parazitini önlemek için bir yaklaşım, dalga boyları birbirinden mümkün olduğunca uzak olan florofor çiftlerini seçmektir (özellikle antikorları birlikte lokalize etmek için). Bu, fazla spektral çakışmayı azaltmaya ve net bir görüntü ve daha güvenilir fenotipleme sağlamaya yardımcı olabilir. Ayrıca, inForm yazılımındaki multipleks kompozit görüntüden lazerleri açıp kapatarak yapılan titiz değerlendirme, florofor doygunluğunu en aza indirmek için boyama desenlerinin tanınmasına da yardımcı olabilir (Şekil 4).
Görüntü analizi için, endometriyal stromadaki CD3+ T hücreleri, CD20+ B hücreleri, CD68+ makrofajlar, CD56+ uNK hücreleri ve stromal hücrelerin sayısı (CD3−/ CD20−/ CD68−/ CD56− ve DAPI lekeli) inForm Doku Bulucu Yazılımı 14.0 (Şekil 5)kullanılarak otomatik olarak sayılabilir. Her immün hücre tipi yoğunluğu, toplam stromal hücre sayısına göre bir yüzde olarak ifade edildi (Şekil 5). Benzer şekilde, endometriyal immün hücrelerin mekansal dağılımının nicelemesi, InForm sisteminden elde edilen her bir bağışıklık hücresinin X ve Y pozisyonuna dayanıyordu (Şekil 6). R dilini kullanarak, AUC'ye dayanan farklı bağışıklık hücrelerinin kümelenme seviyesi daha sonra ayırt edilebilir.
Şekil 1: Boyama iş akışı diyagramı. Kısaltmalar: BSA = sığır serum albümini; HRP = yaban turpu peroksidaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Görüntü yakalama ve analiz için işistasyonu. (A) Mantra Görüntüleme İş İstasyonu, (B) işlenmemiş Spektral görüntü, (C) kompozit görüntü, (D) doku segmentasyonu (epitel ve stromal bölmeler), (E) farklı hücre popülasyonlarını tanımlamak için dört renkli belirteç gösteren endometrium dokusunun kompozit görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Spektral görüntüleme. (A)doğurgan kontrol kadınlarından ve(B)açıklanamayan RM'li bir kadından yapılan endometriyal biyopsilerde 4 farklı immün hücre tipinin multiplks immün yetmezliği tek multispektral görüntüleme olarak gerçekleştirildi. Tek lekeli bir kütüphanenin üretilmesinden sonra, spektral unmixing(C) CD3, (D) CD56, (E) CD68, (F) CD20, (G) DAPI'yı temsil eden tek floroforların görüntülenmesini ortaya çıkardı. Daha sonra multispektral görüntülemeden sonra tüm floroforlar birleştirilerek kompozit bir görüntü oluşturulmuştur (H). Ölçek çubukları = 50 μm (A, B). Kısaltmalar: LE = luminal epitel; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; RM = tekrarlayan düşük. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: InForm Sayım Aracı. inForm yazılım sayımları aracı, bej kutu simgesi seçilerek etkinleştirilir (↓ile gösterilir). (A) Elle çizilmiş eğitim ve otomasyon için görüntü hazırlama, (B, C) segmentleme dokusu, (D) tek tek hücrelerin segmentesi, (E) florofor yoğunluğuna göre hücrelerin fenotiplemesi, (F) florofor yoğunluğu için analiz (seçilen florofor yoğunluğundaki pozitif hücre sayısını gösteren kırmızı kutu) ve (G) kullanım sonuçlarının dışa verilmesi (kırmızı kutu dışa aktarma seçeneklerini gösterir). Kısaltma: IHC = immünohistokimyasal. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hücre Sayımı. (A) Otomatik hücre sayımı için hücrelerin fenotiplemesi ve (B) daha fazla karşılaştırma ve istatistiksel analiz için parçalı bölgedeki pozitif lekeli hücrelerin (örneğin, stromal) çıktısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Mekansal yoğunluğun ölçümü. (A) Parçalı bölgedeki pozitif lekeli bağışıklık hücrelerinin konumunun otomatik olarak algılanması (örneğin, stromal), (B) her pozitif lekeli CD20+ immün hücrenin koordinatının çıkış gösterimi ve (C) Spatstat kullanarak parçalanmış doku bölgelerindeki CD20+ hücreleri ile diğer bağışıklık hücreleri arasındaki mekansal yoğunluğun ve lokalizasyonun belirlenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sipariş | Antikor | Klon | Klonalite | Antikor Seyreltme Faktörü | Opaller | Opal Seyreltme Faktörü |
| 1 | CD3 | SP7 | Monoklonal | 100'de 1 | Opal 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | Monoklonal | 100'de 1 | Opal 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | SP251 | Monoklonal | 100'de 1 | Opal 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 | CD564 | Monoklonal | 100'de 1 | Opal 690 | 0.111111111 |
Tablo 1: Kullanılan antikorların, klonların ve konsantrasyonların listesi.
| Boya | Heyecan maksimum (nm) | Emisyon maksimumu (nm) | Filtre Kümesinde Beklenen Algılama (ad) | Beklenen Renk |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | Mavi |
| Opal 520 | 494 | 525 | FITC | Yeşil |
| Opal 620 | 588 | 616 | Cy3 ve Teksas Kırmızısı | Kehribar |
| Opal 650 | 627 | 650 | Teksas Kırmızısı ve Cy5 | Portakal |
| Opal 690 | 676 | 694 | Teksas Kırmızısı ve Cy5 | Berrak |
Tablo 2: Maksimum ekscitasyon ve emisyon dalga boyları, uygun filtre kümelerinde beklenen algılama ve gözlemlenebilir renkleri ile floroforların listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol içinde kritik adımlar
Multipleks boyamanın gayretli optimizasyon gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Sitrat tampon ve mikrodalga teknolojisini kullanan antijen alımı, tam antikor sıyırmasını sağlamak ve doku canlılığını korumak için optimizasyon gerektirir. TSA reaktifleri antijeni çevreleyen bölgelere kovalent olarak bağladıklarından, sterik engel ("şemsiye etkisi" olarak da bilinir) yoluyla sonraki primer antikorun bağlanmasını potansiyel olarak engelleyebilirler. Bu, birden fazla bağışıklık belirteci tek bir hücre bölmesinde ikamet ettiğinde ve florofor parazitine neden olduğunda ortaya çıkar. Bir etki olup olmayacağını belirlemek için, bağışıklık hücrelerinin lokalizasyonunda herhangi bir çakışmayı tanımlamak için önceden monoplex IHC / IF gerçekleştirmek kritik olacaktır. Spektral kütüphanenin oluşturulması için tek örnekli boyama gerektiğinden, doğrulanmış spektrum kütüphaneleri florofor parazitini daha da önlemek için bireysel sinyallerin ayrımcılığını kolaylaştırabilir. Gerekirse, birincil antikor konsantrasyonları ve kuluçka süreleri, florofor-antikor eşleştirme, TSA florofor konsantrasyonları ve boyama sırası florofor parazitini en aza indirmek için değiştirilebilir. Aynı şekilde, TSA dimer oluşumunu önlemek için HRP konsantrasyonlarının düzgün bir şekilde dengelenmesi önemlidir. Bu, primer ve sekonder antikorların titrasyonu ile elde edilebilir. Ayrıca, multipleks boyama için kullanılan primer antikorların konsantrasyonlarının ve kuluçka sürelerinin geleneksel kromojenik tek boyamada kullanılanlardan farklı olabileceğini hatırlamak hayati öneme sahiptir. Bu nedenle, multipleks boyama için uygulanacak antikorların konsantrasyonunun ve sırasının belirlenmesi önceden yapılmalıdır.
Değişiklikler ve sorun giderme
Bu çalışmada, RM'li ve RM'siz kadınlardan endometrium biyopsilerinde dört ana immün hücre tipinin etkileşimini aynı anda tespit etmek için multipleks floresan immünohistokimyasal boyamayı kullanmışızdır. Bu teknik, bu hücre tiplerini ayırt etmek için T hücreleri için CD3, B hücreleri için CD20, makrofajlar için CD68 ve uNK hücreleri için CD56'ya karşı antikorlar kullanır. Bu yönteme dayanarak, RM kadınlarında ortanca CD3+, CD68+ve CD56+ hücre yoğunluğu değerlerinin fertile kontrollerinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulduk15. CD56+ uNK hücreleri ve CD68+ makrofajlar arasındaki kümelenme RM grubunda verimli kontrollere göre önemli ölçüde daha yüksekti. Ek olarak, bu yöntemin kullanımı, CD56+ uNK hücrelerinin her iki kadın grubunda da CD68+ makrofajlarla hem sayısal hem de mekansal korelasyona sahip göründüğünü ortaya koydu. Buna karşılık, CD56+ uNK hücreleri RM15'likadınlarda CD3+ T hücreleri ile önemli bir sayısal ama mekansal korelasyona sahip değildir. Bu yöntem aynı zamanda endometriyumdaki birden fazla immün hücre tipinin mekansal ilişkisini belirler. Ancak, belirli bir işaretleyici için pozitiflik bazı durumlarda sınır olabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, spektral kütüphaneyi oluştururken pozitiflik eşiğini belirlemek için pozitif bir kontrol ve negatif bir kontrol içermesi önerilir. Ayrıca, inForm yazılımındaki multipleks kompozit görüntüden lazerleri açıp kapatarak yapılan titiz değerlendirme, florofor doygunluğunu en aza indirmek için boyama desenlerinin tanınmasına da yardımcı olabilir.
Tekniğin sınırlamaları
Veri yorumlama sırasında florofor parazitinin tanımlanması, belirteçlerin gerçek kolokalizasyonu ile karıştırmayan eserler arasında ayrım yapmak için gereklidir. Bu multipleks boyama metodolojisi, enzymatic amplifikasyon tarafından yönlendirilen TSA tabanlı reaktifleri kullanır ve bu da antijen işaretleyici yoğunluğunu geleneksel dolaylı IF yöntemlerine kıyasla 10-100 kat artırabilir. Bu, aşırı aktif tyramide biriktirme riski oluşturur ve potansiyel olarak bir şemsiye etkisine ve / veya sinyal kanamasına neden olabilir. Aşırıya binmeyi tanımlamak için, inForm'daki görüntülerin karıştırılmasının ve imlecin çok katlı doku görüntüsündeki parlak, pozitif alanların üzerine gelindiğinde sinyal düzeyleri görsel olarak değerlendirilebilir. Sinyal seviyeleri genellikle 30'un altında ve ideal olarak, özellikle spektral olarak bitişik floroforlar için birbirinin 3 faktörü içinde kalmalıdır. Spektral olarak bitişik floroforlar için sinyallerdeki 5 kat fark, florofor parazitine yol açabilir ve karıştırmayan eserlere neden olabilir. Herhangi bir floroforun sinyal seviyeleri bitişik florofordan 3 kat daha fazla fark gösteriyorsa, sinyal dengesini sağlamak için TSA florofor konsantrasyonlarının ayarlanması gerekir. Sinyalin doğru aralıkta olduğu doğrulandıktan sonra, pozitif boyamanın spesifik olmayan arka plandan yanlış algılanmadığından emin olmak için sinyal-arka plan oranı <1:10'da tutulmalıdır.
Spektral çapraz konuşma da önemli florofor paraziti yaratabileceğinden, lekelenme sırası, spektral olarak bitişik boyaları hem dizilimde hem de belirteçlerin ifadesinde ayıracak şekilde ayarlanmalıdır. Mantra İş İstasyonu'nun kullandığı bu multispektral teknoloji 8'li testlere kadar desteklese de, Opal 520, 540, 620 ve 690 olmak üzere 4 florofor uygulaması, florofor paraziti olmadan en iyi performansı gösterir. ≥5 floroforların kullanımı, yakın dalga boylarını paylaşan floroforların spektral profilleri nedeniyle spektral çapraz konuşmadan kaçınmak için genellikle daha fazla optimizasyon ve doğrulama gerektirir. Başka bir deyişle, bu yaklaşımla aynı anda tespit edilebilecek hedef sayısı sadece dalga boyu bantlarının ve mevcut heyecan/emisyon filtre kümelerinin sayısı ile sınırlıdır. Bu nedenle, diğer TSA floroforlarının daha fazla uygulanmasını engelleyen bir TSA floroforunun potansiyel aşırı yakalanmasını ekarte etmek ve / veya sinyal çapraz sapını tanımlamak için, inForm yazılımındaki çok katmanlı kompozit görüntüden katmanları açıp kapatarak titiz olmak önemlidir; tek IHC boyamadan lekeleme kalıplarının doğru yorumlanarak; ve başka bir düzlemde yerelleştirmeye karşılık gelen bir düzlemde bariz kayıp, kazanç veya özdeş sinyaller arar.
Multispektral boyama, birden fazla belirteci aynı anda tespit etmek için belirli floroforlarla eşleştirilmiş antikorlar gerektirir. Bu florofor-antikor eşleştirmesi iki kuralauyar: i) birlikte ifade edilen belirteçler için atanan floroforlar spektral olarak ayrı olmalı ve ii) daha bol hedefler daha düşük parlaklığa sahip floroforlarla eşleştirilmelidir veya bunun tersi de geçerlidir. Lekelenme sırasının, sıralı antikorların lekeli hücrelerdeki aynı hücre bölmelerinde birlikte lokalize olmaması için düzenlenmesi de gerekir. Bu nedenle, geleneksel boyama yöntemlerinde kritik faktörler olan antikor konsantrasyonları ve kuluçka süreleri dışında, uygun florofor-antikor eşleştirmesi, TSA florofor konsantrasyonları, boyama sırası ve belirli bir antikorun bir veya daha fazla mikrodalga tedavisine maruz kalması gibi ek parametreler başarılı çok faktörlü boyama için düşünülmek gerekir. Çalışma örneklerinde yüksek değişkenlik nedeniyle, belirli bir multipleks protokolü diğer çalışma örneklerinde aynı sonucu vermeyebilir.
Tüm Opal multipleks sıralı boyama işlemi, panelde yer alan belirteçlerin sayısına ve birincil antikor inkübasyon sürelerine bağlı olarak bir ila birkaç gün sürebilir. Buna karşılık, standart IF yöntemleri genellikle tek bir boyama turunda 4-5 işaretleyicinin görselleştirilmesine izin verir. Geleneksel IHC yöntemi kullanılarak optimize edilen koşulların, ek, çoklu mikrodalga tedavileri ve sonuçta her antikorun boyama yoğunluğunu etkileyecek TSA floroforlarının uygulanmasını içeren çoklamalı boyama prosedürlerine geçmeden önce daha fazla optimizasyona ihtiyaç duyduğu belirtilmelidir. Şu anda, multispektral teknolojileri kullanan görüntüleme yaklaşımları pahalı ve özel enstrümantasyon gerektirebilir. Ayrıca, yalnızca görüntü seçilen ilgi çekici bölgelerle sınırlı olabilir. Bu nedenle, bu sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar ve belirsiz antijen hedeflerine sahip dokuların scoutingi için en uygun olmayabilir.
Mevcut yöntemlere göre önemi
Bu mevcut yöntemin belirli bir gücü, tek bir doku bölümünde sadece bir ila iki hücre tipini etiketleyebilen geleneksel IHC yöntemlerinin aksine, endometriyumdaki birden fazla bağışıklık hücresi tipinin yoğunluğunu aynı anda ölçme yeteneğidir. Akış sitometrisi, endometriyal örnekteki farklı immün hücre tiplerinin göreli oranlarını analiz edelim; ancak, çeşitli immün hücre tipleri ile farklı endometriyal bölmelerdeki spesifik dağılım arasında mekansal bilgi sağlayamaz. Ayrıca, doku tükenmesi klinik uygulamalarda, özellikle klinik çalışmalar sırasında ve biyopsi örnekleri kullanırken ciddi bir endişe kaynağıdır. Bu iki geleneksel yöntem, prosedürü optimize etmek ve RM'li ve RM'siz kadınların endometriyumunda birden fazla bağışıklık hücresi tipini tespit etmek için çok sayıda örnek (bölüm veya hücre) gerektirecektir.
Bu protokolde açıklandığı gibi, Opal iş akışı Mantra İş İstasyonu kullanılarak aynı doku bölümünde en fazla yedi işaretleyicinin algılanmasını sağlamak için tasarlanmıştır. Ek olarak, antikor seçimi sırasında türler çapraz reaktivitesi bu teknolojinin bir sınırlaması değildir. Aslında, bu teknolojinin bir avantajı, yedi işaretleyiciye kadar tespit etmek için aynı türlerde yetiştirilen antikorların kullanılmasına izin veriyor olmasıdır. Bu yaklaşım, floresan TSA reaktifleri ile tespiti ve ardından spesifik olmayan lekeleri gidermek için mikrodalga tedavisini içerir. Mikrodalga bazlı sıyırma işleminden sonra, antikor çapraz reaktivite riski olmadan ek hedef tespiti için başka bir lekeleme turu yapılabilir. Ek olarak, bu TSA algılama yöntemi, düşük ekspresyonlu protein hedeflerini tespit etmek için güvenilir sonuçlar üretirken 7 florroma kadar birleştirmek için en az 3 günde gerçekleştirilebilir. Multipleks boyamanın geleneksel IHC çalışmasına göre bir başka avantajı, ölçüm otomatikleştirildikçe, öznel önyargıyı ortadan kaldırabilen gelişmiş verimliliğidir. Oluşturulan nicel veriler, tahlilin son sonuçlarını temsil eder.
Gelecekteki uygulamalar
Bu çoklayıcı iletişim kuralının uygulama aralığı çok büyük. Daha da önemlisi, bu, RM'li ve RM'siz kadınlarda birden fazla bağışıklık hücresi popülasyonunu ayırt etmek için Doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için Mantra İş İstasyonu ve görüntü analizi kullanılarak çok sayıda immünofluoresans işaretleyici ifadesinin algılanması için yöntemi açıklayan ilk makaledir. Sonuç olarak, bu, belirli hedefli tedaviyi kurmak için RM'li kadınlarda embriyo implantasyonu sırasında bağışıklık hücresi mikroçevrinin daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.
Ayrıca, mevcut yöntemlerimiz, birkaç bağışıklık hücresinin ve etkileşimlerinin endometriyumun işlevi için önemli olabileceğini göstermeye yardımcı oldu. Bu, dört endometriyal immün hücre tipinden üçünün yoğunluğundaki önemli değişiklikler ve CD68+ ve CD56+ hücreleri arasındaki kümelenmede önemli bir artış ile gösterilmiştir. Tersine, bu immün hücre tiplerinin anormal etkileşimleri RM için yatkın faktörler olabilir. Ek olarak, immün mikroçevripteki mekansal özelliklerin ölçülmesi ve daha fazla anlaşılması, immünoterapiler bağlamında bu hastalığın biyolojisine ışık tutmaya yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma 2018 yılında Hong Kong Kadın Hastalıkları ve Doğum Güven Fonu ve Hong Kong Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu (06170186, 07180226) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M.
- Rai, R., Regan, L.
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A.
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
