Summary
Trotz der Fortschritte in der Multiplex-Immunhistochemie und der multispektralen Bildgebung bleibt die Charakterisierung der Dichte und Clusterbildung der wichtigsten Immunzellen gleichzeitig im Endometrium eine Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Multiplex-Färbeprotokoll und eine Bildgebung für die gleichzeitige Lokalisierung von vier Immunzelltypen im Endometrium.
Abstract
Die Immunhistochemie ist die am häufigsten verwendete Methode zur Identifizierung und Visualisierung von Gewebeantigenen in der biologischen Forschung und klinischen Diagnostik. Es kann verwendet werden, um verschiedene biologische Prozesse oder Pathologien wie Wundheilung, Immunantwort, Gewebeabstoßung und Gewebe-Biomaterial-Interaktionen zu charakterisieren. Die Visualisierung und Quantifizierung mehrerer Antigene (insbesondere für Immunzellen) in einem einzigen Gewebeschnitt mittels konventioneller immunhistochemischer (IHC) Färbung bleibt jedoch unbefriedigend. Daher wurden in den letzten Jahren multiplexe Technologien eingeführt, um mehrere biologische Marker in einer einzelnen Gewebeprobe oder einem Ensemble verschiedener Gewebeproben zu identifizieren.
Diese Technologien können besonders nützlich sein, um die Veränderungen der Immun-Zell-zu-Zell-Interaktionen innerhalb des Endometriums zwischen fruchtbaren Frauen und Frauen mit wiederkehrenden Fehlgeburten während der Implantation zu differenzieren. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die multiplexierte Fluoreszenz-IHC-Färbung, um die Dichte und Clusterbildung von vier wichtigen Immunzelltypen gleichzeitig in genau getimten Endometriumproben während der Embryonenimplantation zu untersuchen. Die Methode umfasst die Probenvorbereitung, die Multiplex-Optimierung mit Markern für Immunzellsubtypen und das Scannen der Objektträger, gefolgt von einer Datenanalyse mit spezifischem Bezug auf den Nachweis endometrialer Immunzellen.
Mit dieser Methode kann die Dichte und Clusterbildung von vier großen Immunzelltypen im Endometrium gleichzeitig in einem einzigen Gewebeschnitt analysiert werden. Darüber hinaus werden in diesem Artikel die kritischen Faktoren und die Fehlerbehebung diskutiert, um mögliche Fluorophor-Interferenzen zwischen den aufgetragenen Fluoreszenzsonden zu überwinden. Wichtig ist, dass die Ergebnisse dieser Multiplex-Färbetechnik dazu beitragen können, ein tiefes Verständnis der immunologischen Interaktion und Regulation während der Embryonenimplantation zu vermitteln.
Introduction
Wiederkehrende Fehlgeburten (RM) können als der Verlust von zwei oder mehr Schwangerschaften vor der 24. Schwangerschaftswoche definiert werden1. Diese häufige Fortpflanzungsstörung betrifft bis zu 1% der Paare weltweit2,3. Die Pathophysiologie ist multifaktoriell und kann in embryologisch getriebene Ursachen (hauptsächlich aufgrund eines abnormalen embryonalen Karyotyps) und mütterlich getriebene Ursachen unterteilt werden, die die Endometrium- und / oder Plazentaentwicklung beeinflussen. Diese Manifestation kann aus elterlichen genetischen Anomalien, Uterusanomalien, prothrombotischen Zuständen, endokrinologischen Faktoren und immunologischen Störungenresultieren 4.
In den letzten Jahren wurde die Dysfunktion der Immuneffektorzellen mit der Pathogenese des frühen Schwangerschaftsverlustes in Verbindung gebracht5. Dies hat viele Untersuchungen zur Aufklärung der spezifischen Populationen von Immunzellen im Endometrium während des Menstruationszyklus, der Implantation und der frühen Schwangerschaft mit spezifischen Rollen in der frühen Schwangerschaft inspiriert. Unter diesen Immunzellen spielen Uteruszellen des natürlichen Killers (uNK) eine entscheidende Rolle während der Embryonenimplantation und Schwangerschaft, insbesondere bei den Prozessen der trophoblastischen Invasion und Angiogenese6. Studien haben eine erhöhte uNK-Zelldichte im Endometrium von Frauen mit RM7, 8gezeigt,obwohl dieser Befund nicht miteinemerhöhten Risiko für eine Fehlgeburt verbunden war9. Dies stimulierte jedoch die Forschung zur Bewertung der Dichte anderer Immunzelltypen (wie Makrophagen, dendritische Uteruszellen) im Endometrium bei Frauen mit RM10,11. Dennoch bleibt ungewiss, ob es bei Frauen mit RM zu einer signifikanten Veränderung der Immunzelldichte im Periimplantations-Endometrium kommt.
Eine mögliche Erklärung für die Unsicherheit ist, dass die Bewertung der endometrialen Immunzelldichte aufgrund der schnellen Veränderungen des Endometriums während des Implantationsfensters schwierig sein könnte. Während des 24-Stunden-Zeitrahmens verändern signifikante Veränderungen im Endometrium die Immunzelldichte und die Zytokinsekretion, was zu einer Variationsquelle in diesen Ergebnissenführt 12. Darüber hinaus stützen sich die meisten Berichte hauptsächlich auf die Verwendung von Einzelzellfärbungen (z. B. traditionelle IHC-Methoden), die nicht mehrere Marker auf demselben Gewebeschnitt untersuchen konnten. Obwohl die Durchflusszytometrie zum Nachweis mehrerer Zellpopulationen in einer einzigen Probe verwendet werden kann, behindern die großen Mengen an benötigten Zellen und die zeitaufwändige Optimierung die Popularität und Effizienz dieser Methode. Daher könnte die jüngste Weiterentwicklung der Multiplex-IHC-Färbung dieses Problem lösen, indem mehrere Marker auf demselben Objektträger immungefärbt werden, um mehrere Parameter zu bewerten, einschließlich der Zelllinie und der histologischen Lokalisation einzelner Immunsubpopulationen. Darüber hinaus kann diese Technologie die erhaltenen Informationen im Falle einer begrenzten Gewebeverfügbarkeit maximieren. Letztendlich kann diese Technik helfen, die Unterschiede in den Immunzellinteraktionen im Endometrium zwischen fruchtbaren Frauen und Frauen mit RM aufzuklären.
Zwei Gruppen von Frauen wurden aus dem Prince of Wales Hospital rekrutiert, darunter fruchtbare Kontrollfrauen (FC) und Frauen mit unerklärlichen wiederkehrenden Fehlgeburten (RM). Fruchtbare Kontrolle war definiert als Frauen, die mindestens eine Lebendgeburt ohne spontane Fehlgeburt in der Vorgeschichte hatten, und RM-Frauen wurden als diejenigen definiert, die vor der 20. Schwangerschaftswoche eine Vorgeschichte von ≥2 aufeinanderfolgenden Fehlgeburten hatten. Die Probanden aus den beiden Gruppen erfüllten die folgenden Einschlusskriterien: (a) Alter zwischen 20 und 42 Jahren, (b) Nichtraucher, (c) regelmäßiger Menstruationszyklus (25-35 Tage) und normale Gebärmutterstruktur, (d) keine Anwendung eines hormonellen Regimes für mindestens 3 Monate vor der Endometriumbiopsie, (e) keine Hydrosalpinx durch Hystero-Salpingogramm. Darüber hinaus hatten alle rekrutierten Probanden eine normale Karyotypisierung, ein normales 3-dimensionales Ultraschall-Hysterosalpingogramm, ein follikelstimulierendes Hormon am Tag 2 < 10 IE / L, mittelluteales Progesteron > 30 nmol / L, eine normale Schilddrüsenfunktion und wurde negativ auf Lupus-Antikoagulans und Anticardiolipin-IgG- und IgM-Antikörper getestet.
Um die immunologischen Grundlagen der RM besser zu verstehen, wäre es am wünschenswertesten, die wichtigsten Immunzelltypen, die zum Zeitpunkt der Implantation im Endometrium vorhanden sind, gleichzeitig zu quantifizieren und zu lokalisieren. Dieser Beitrag beschreibt das gesamte Protokoll von der Probenvorbereitung über die Multiplex-Optimierung mit Markern für Immunzellsubtypen bis hin zum Scannen der Objektträger, gefolgt von einer Datenanalyse mit spezifischem Bezug zum Nachweis endometrieller Immunzellen. Darüber hinaus beschreibt diese Arbeit, wie die Dichte und Clusterbildung der Immunzelltypen gleichzeitig im Endometrium bestimmt werden kann.
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Protocol
Die Studie wurde vom Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee genehmigt. Die Einverständniserklärung der Teilnehmer wurde vor der Entnahme der Endometriumbiopsien eingeholt. Im Einleitungsabschnitt finden Sie die Einschlusskriterien der Kontroll- und RM-Gruppen.
1. Probenvorbereitung
- Stellen Sie sicher, dass sich alle Frauen in dieser Studie ab Tag 9 des Menstruationszyklus einem täglichen Urinmessstabtest unterziehen, um den Anstieg des luteinisierenden Hormons (LH) zu identifizieren, um den Eisprung zu erkennen, und die Endometriumbiopsien genau am7. Tag nach dem LH-Anstieg (LH + 7) zu timen.
- Erhalten Sie ein 0,5 cm2 Fragment der Endometriumbiopsie mit einem Pipelle-Probenehmer oder Pipet Curet von fruchtbaren Frauen und Frauen mit unerklärlicher RM. Beschriften Sie den Behälter und legen Sie die Probe sofort in 10% neutral-gepuffertes Formalin (pH 7) zur nächtlichen Fixierung bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Das Volumen des Fixiermittels sollte das 5-10-fache des Gewebes betragen. - Legen Sie das Gewebe in eine Kartusche zur Dehydrierung in eine Gewebeverarbeitungsmaschine, bevor Sie es in geschmolzenes Paraffinwachs einbetten. Das Gewebe bei 58-60 °C in Paraffin einbetten.
- Lassen Sie den Paraffinblock über Nacht bei Raumtemperatur abkühlen. Verwenden Sie ein Mikrotom, um die Paraffinblöcke auf eine Dicke von 3 μm zu trimmen.
HINWEIS: Die Verwendung von destilliertem Wasser hilft bei der ordnungsgemäßen Gewebemontage und Adhärenz während der Multiplexfärbung. - Legen Sie das Paraffinband 30 s lang in ein Wasserbad bei 40-45 °C.
- Montieren Sie die Schnitte auf Poly-L-Lysin (0,1% w/v)-beschichteten Objektträgern aus Mikroskopglas. Legen Sie die Objektträger mit dem Gewebe nach oben und lassen Sie sie über Nacht bei 37 °C trocknen. Bewahren Sie die Dias in einem Diakasten bis zur weiteren Verwendung von extremen Temperaturen auf.
2. Bestimmen Sie die ideale Konzentration von Antikörpern für Multiplex-IHC mit herkömmlicher IHC.
HINWEIS: Dies ist wichtig, um das Expressionsniveau und das Muster jedes Immunmarkers in der Endometriumprobe zu identifizieren und die Färbesequenz jedes Markers sowie die zugehörigen Tyramid-Signalverstärkungs-(TSA)-Fluorophorpaarungen zu bestimmen.
- Testen Sie die Antikörper auf ihre Eignung für Multiplex-IHC mit manueller konventioneller IHC13.
- Verwenden Sie Endometriumgewebe für Einzelantikörpertests.
- Umfassen Sie eine Positivkontrolle (z. B. Milz) und eine Negativkontrolle (Isotypkontrolle) zur Optimierung des Färbezustands jedes Antikörpers.
- Führen Sie die Färbung mit der im Datenblatt des Antikörpers empfohlenen Verdünnung durch.
- Führen Sie eine zusätzliche Färbung mit Konzentrationen oberhalb und unterhalb der empfohlenen Verdünnung durch, die in Schritt 2.3 verwendet wird.
HINWEIS: Ein klinischer Pathologe sollte die gefärbten Objektträger blind beurteilen, um die Lokalisation der Antikörpersondierung und die zelluläre Integrität zu bestätigen.
3. Multiplex-Färbemethode
- Folienvorbereitung und Fixierung
- Legen Sie die Objektträger (ab Schritt 1.6) flach mit dem Gewebe nach oben in einen Ofen und backen Sie sie bei 60 °C für mindestens 1 h.
- Nehmen Sie die Objektträger aus dem Ofen und lassen Sie sie mindestens 20 minuten bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie in ein vertikales Schiebegestell legen.
- Entwachsen und rehydrieren Sie die formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Objektträger mit 10 Minuten, die jedem der folgenden Schritte zugeteilt sind: Xylol (2x), 100% Ethanol (2x), 95% Ethanol (1x), 70% Ethanol (2x) und destilliertes Wasser (2x).
- Legen Sie das Dia-Rack in eine Kunststoff-Diabox und tauchen Sie sie in Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS, pH 7,6).
HINWEIS: Die Objektträger müssen ab diesem Rehydratationsschritt bis zur Montage im letzten Schritt feucht bleiben. - Fixieren Sie die Proben, indem Sie die Objektträger in eine Kunststoff-Objektträgerbox tauchen, die mit einer Mischung aus in Methanol (1:9) verdünntem Formaldehyd gefüllt ist, für 30 minuten im Dunkeln.
- Waschen Sie die Objektträger zweimal in entionisiertem Wasser für 2 minuten und fahren Sie dann mit der Antigengewinnung fort.
- Epitop-Abruf
- Legen Sie das Dia-Rack in eine hitzebeständige Box und füllen Sie es mit Zitronensäurepuffer (pH 6,0), um die Dias abzudecken.
- Stellen Sie die Box in die Mikrowelle und erhitzen Sie die Objektträger für 50 s bei 100% Leistung, gefolgt von 20 minuten bei 20% Leistung, um die gleiche Temperatur aufrechtzuerhalten.
- Lassen Sie die Folien bei Raumtemperatur ca. 15 min abkühlen.
- Spülen Sie die Objektträger 2 min lang in Wasser ab, gefolgt von TBS-Tween 20 (TBST) für 2 min.
HINWEIS: TBST besteht aus 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl und 0,05% Tween 20 (v/v).
- Blockierend
- Blockieren Sie die endogene Peroxidaseaktivität im Gewebe, indem Sie den Objektträger für 10 Minuten auf ein Glas mit Peroxidase-Blockierungslösung (siehe Materialtabelle)tauchen.
- Waschen Sie die Objektträger mit TBST für 5 min.
- Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um eine Grenze um den Gewebeabschnitt auf dem Objektträger zu markieren.
- Bedecken Sie die Gewebeschnitte mit einem Blockierpuffer (siehe Materialtabelle)oder Rinderserumalbumin (5%, w/v) und inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang in einer befeuchteten Kammer.
- Antikörper- und Signalanwendung
- Entfernen Sie die blockierenden Reagenzien.
- Inkubieren Sie mit dem primären Antikörper von Interesse (z. B. CD3, 1:100 Verdünnung in Antikörperverdünnungsmittel, siehe Tabelle 1) in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 30 min.
- Entfernen Sie den primären Antikörper. 3x mit TBST jeweils 5 min waschen.
- Inkubieren Sie mit dem Polymer Meerrettichperoxidase (HRP)-markierten sekundären Antikörper (Tabelle 1) für 15 min in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur. 3x mit TBST jeweils 5 min waschen.
- Tragen Sie die Opalfluorophor-TSA-Arbeitslösung (1:100 in Amplifikationsverdünnungsmittel) auf und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 min, um eine Fluorophorkonjugation zur Gewebeprobe an primären Antikörperbindungsstellen zu ermöglichen. Mit TBST in dreifacher Ausfertigung jeweils 5 min waschen.
- Mikrowellenbasiertes
- Spülen Sie mit dem Antigen-Retrieval-Puffer (Citrat-Pufferlösung, pH 6,0).
- Führen Sie mikrowellenbasiertes Stripping durch, um den Primär-Sekundär-HRP-Komplex zu entfernen und den nächsten primären Antikörper (z. B. CD20) einzuführen.
- Legen Sie die Objektträger in einen Antigen-Abrufpuffer, erhitzen Sie sie bei 100% Leistung für 50 s, gefolgt von 20% Leistung für 20 minuten in mikrowellensicheren Behältern, und kühlen Sie sie bei Raumtemperatur für 15 minuten.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4 bis 3.5.2, bis die Gewebeproben mit allen primären Antikörpern untersucht wurden.
- Gegenpflände und Montage
- Nach mikrowellenbasiertem und Abkühlen des Antigen-Retrieval-Puffers spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser und TBST ab.
- Mit 4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung (1,0 μg/ml) für 5 min in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur inkubieren.
- 3x mit TBST jeweils 5 min waschen. Einmal mit Wasser für 5 Min. waschen.
- Trocknen Sie den Schlitten an der Luft und montieren Sie ihn mit dem entsprechenden Montagemedium (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Für Monoplex-Dias, die für die Entwicklung von Spektralbibliotheken verwendet werden sollen, ist kein Counterstaining erforderlich.
4. Bild und Analyse
- Erstellung von Spectral Library Slides
- Erstellen Sie Bibliotheksobjektträger (Single-Stain-Referenzbilder) für jeden Fluorophor, DAPI und jede Autofluoreszenz mit demselben Kontrollgewebe für die multispektrale Bildanalyse.
- Führen Sie unter Verwendung der Objektträger der Endometriumbiopsieproben von Frauen mit RM und fruchtbaren Frauen die Schritte 1.1 bis 3.6.4 für den Einzelantikörpernachweis für jeden Objektträger durch (ohne weitere Antikörper- oder Fluorophorzugabe).
- Färben Sie für jeden Antikörpernachweis einen der Objektträger mit DAPI (wie in Schritt 3.6.2) und lassen Sie einen Objektträger ungefärbt, um eine mögliche Gewebeautofluoreszenz im Spektrum nachzuweisen.
- Verwenden Sie die entsprechenden Filter in der Workstation, um das Bild für diesen Satz von Objektträgern für jeden Antikörper zu erhalten und in die Bildanalysebibliothek hochzuladen (wie in Schritt 4.2 beschrieben).
- Sobald das Bild aufgenommen wurde, wählen Sie inForm als Spektralbibliotheksquelle und erstellen Sie die Spektralbibliothek.
- Wenn Fluorophore verwendet werden, wählen Sie Stains/Fluors... aus dem Menü.
- Schränken Sie bei der Auswahl der Flecken oder Fluorophore die Auswahl ein, indem Sie eine oder mehrere Gruppen auswählen. Wählen Sie Alle, um alle Spektren anzuzeigen, die mit den Bildern kompatibel sind.
- Spektrale Bildgebung
HINWEIS: Die Bilder wurden mit der Mantra Workstation aufgenommen, wobei die Spektralbibliothek mit der inForm Image Analysis-Software eingerichtet wurde.- Erfassen Sie das Bild der einzeln antikörpergefärbten Objektträger mit den geeigneten Epifluoreszenzfiltern wie in Tabelle 2 vorgeschlagen (z. B. DAPI, Fluoresceinisothiocyanat [FITC], CY3, Texas Red und CY5) mit der Workstation.
HINWEIS: Empfohlene Filter für die spezifischen Fluorophore, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in Tabelle 2 aufgeführt. - Identifizieren Sie eine geeignete Belichtungszeit für ein optimales Signal, indem Sie jeden Marker in seinem entsprechenden Fluoreszenzkanal untersuchen.
HINWEIS: Das optimale Signal wird gemäß der Referenz auf die Positivität und Lokalisation bestimmt, die in der Einzelantikörperfärbung erhalten wurde. - Bestimmen Sie eine feste Expositionszeit für jeden Analyten (Antikörper-Fluorophor-Kombination), um einen Probenvergleich zu standardisieren.
ANMERKUNG: Die Bestimmung des festen Engagements hängt von der Intensität der Interessenstichprobe ab. - Scannen Sie die multiplexgefärbten Dias im entsprechenden Scanmodus mit dem eingebetteten Autofokus-Algorithmus.
HINWEIS: Die etablierte Spektralbibliothek würde verwendet werden, um den multispektralen Bildwürfel in einzelne Einzelkomponenten zu differenzieren (spektrale Entmischung). Dies würde es ermöglichen, die farbbasierte Identifizierung für alle Marker von Interesse mit den folgenden zwei Hauptschritten zu verarbeiten: Trainingseinheit und Bildanalysesitzung.
- Erfassen Sie das Bild der einzeln antikörpergefärbten Objektträger mit den geeigneten Epifluoreszenzfiltern wie in Tabelle 2 vorgeschlagen (z. B. DAPI, Fluoresceinisothiocyanat [FITC], CY3, Texas Red und CY5) mit der Workstation.
- Bildanalyse
- Zellzählung ausgewählter Immunzelltypen im Endometrium
- Erfassen Sie mindestens 10 Felder für die Analyse unter 200-facher Vergrößerung.
HINWEIS: Die Felder wurden erfasst, indem der gesamte Abschnitt ohne Auswahl gescannt wurde. Dies kann die gleichzeitige Erfassung aller Zellbestandteile des Endometriums sicherstellen, z. B. der luminalen Epithelgrenze, des Stromas und der Drüsen. - Um die Zellen zu zählen, klicken Sie in der Schrittleiste auf die Schaltfläche Objekte zählen, um das Bedienfeld "Objektzählungseinstellungen" anzuzeigen.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Objekt verwerfen, wenn Sie eine Kante berühren, um auszuschließen, dass Objekte den Rand des Bildes, des Prozessbereichs oder des Gewebebereichs berühren.
- Wenn das Gewebe segmentiert wurde, wählen Sie die Gewebekategorie aus, in der die Objekte zu finden sind. Zählen Sie keine Objekte außerhalb der ausgewählten Gewebekategorie.
- Wählen Sie den gewünschten Ansatz zum Identifizieren von Objekten aus: Objektbasiert oder Pixelbasiert (Schwellenwert).
HINWEIS: Der Pixel-basierte (Schwellenwert) Ansatz sollte im Falle eines zuverlässigen oder konsistenten Flecks gewählt werden, bei dem die Anwendung eines einfachen Schwellenwerts die Objektpixel ergibt. Der objektbasierte Ansatz wird empfohlen, wenn fortgeschrittenere morphometriebasierte Ansätze bei mangelnder Konsistenz und Spezifität der Färbung von Objekten erforderlich sind. - Wählen Sie die gewünschte Signalskalierungaus: Automatische Skalierung oder feste Skalierung.
HINWEIS: Wenn Sie "Automatische Skalierung" wählen, wird jede Komponentenebene automatisch skaliert, bevor die Objektsegmentierung durchgeführt wird. Die Option "Feste Skalierung" wird empfohlen, wenn eine bessere Segmentierungsleistung erforderlich ist und die Fleckensignale konsistent und zuverlässig sind. - Wählen Sie in der Dropdown-Liste die primäre Komponente für die Objektsegmentierung aus.
- Passen Sie den Mindestsignalwert für die Primärkomponente an den gewünschten Schwellenwert an.
- Um Löcher in Objekten automatisch zu füllen, wählen Sie "Löcher füllen".
- Um Objekte, die andere Objekte berühren, als einzelne Objekte und nicht als ein Objekt zu erkennen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Aufteilung verfeinern, nachdem Sie das Kontrollkästchen Maximale Größe (Pixel) aktiviert haben.
- Um Objekte basierend auf der Rundheit des Objekts auszuschließen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Rundheit (Roundness), und geben Sie die gewünschte minimale Zirkularität an.
- Zählen Sie alle Stromazellen (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−und DAPI+), einschließlich der Zellen, die die Blutgefäße umgeben.
- Zählen Sie die Immunzellen separat, einschließlich T-Zellen (CD3+ und DAPI+),B-Zellen (CD20+ und DAPI+),Makrophagen (CD68+ und DAPI+) und uNK-Zellen (CD56+ und DAPI+).
- Drücken Sie die Daten als Prozentsätze der Immunzellen relativ zur Gesamtzahl der Stromazellen für jedes aufgenommene Bild aus und geben Sie die endgültige Zellzahl als Durchschnitt aller Felder an.
- Verwenden Sie den Ansichts-Editor, um die resultierenden Datentabellen nach der Verarbeitung anzuzeigen. Exportieren Sie die Tabelle Count Data.
- Quantifizierung der räumlichen Verteilung der endometrialen Immunzelle
- Schätzen Sie unter 200-facher Vergrößerung die L-Funktion mit dem R-Programm für einen Bereich von 0-20 μm, der als maximaler Zell-Zell-Kontaktabstand14betrachtet wird.
HINWEIS: Die R-Sprach-Toolbox 'spatstat' wurde verwendet, um die L-Funktion zu messen.- Bezeichnen Sie den Grad der Clusterbildung verschiedener Paare von Immunzellen basierend auf der Fläche unter der Kurve (AUC) ihrer L-Funktion.
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Representative Results
Der schematische Gesamtprozess zur Durchführung eines 4-Farben-Multiplex-Assays zum Nachweis von 4 endometrialen Immunzelltypen ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, das Protokoll für diese Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung erforderte 8 Schlüsselschritte: 1. Objektträgervorbereitung, 2. Epitop-Retrieval, 3. Blockierung, 4. Primäre Antikörperanwendung, 5. Sekundäre Antikörperanwendung, 6. Signalamplifikation, 7. Entfernung von Antikörpern und 8. Gegenfleck und Mount. Die Bildwiedergabe und -analyse wurde dann mit der Mantra Workstation durchgeführt, wobei die Spektralbibliothek mit der inForm Image Analysis-Software zur Differenzierung der 4 Immunzelltypen in der Endometriumprobe generiert wurde (Abbildung 2).
Vier endometriale Immunzelltypen können in menschlichen Endometriumproben mit dieser Multiplex-Färbetechnik identifiziert werden: CD3+ T-Zellen, CD20+ B-Zellen, CD68+ Makrophagen und CD56+ uNK-Zellen (Abbildung 3). Fluorophor-Interferenzen müssen jedoch sorgfältig abgewogen werden, um ein klares und brauchbares Bild zu erhalten. Obwohl diese multispektrale Technologie mit der Mantra Workstation bis zu 8-Plex-Assays unterstützen kann, zeigte die Anwendung der 4 in diesem Protokoll verwendeten Fluorophore eine optimale Leistung ohne Fluorophorinterferenzen aufgrund der Unterschiede in den Emissionsspektren der Fluorophore. Im Gegensatz dazu erfordert die Multiplexfärbung mit 5-8 Fluorophoren oft mehr Aufmerksamkeit für Fluorophorinterferenzen, die sich aus der Emittanz der gemeinsamen Wellenlängen ergeben.
Um diesen Nachteil zu überwinden, wäre eine Monoplex-Färbung notwendig, um die Reihenfolge jedes Antikörpers im Multiplex zu bestimmen und das Expressionsniveau und das Muster jedes Immunmarkers in der Endometriumprobe zu identifizieren. Dies kann helfen, die Färbereihenfolge der Marker und die damit verbundenen TSA-Fluorophorpaarungen zu bestimmen. Sobald der Monoplex-Assay zur Bestimmung der Reihenfolge der aufzutragenden Antikörper abgeschlossen ist, besteht der nächste Schritt darin, den Fluorophor für den Nachweis nach der Multiplexfärbung auszuwählen. Für jeden Antikörper von Interesse muss ein einzigartiges Fluorophor gewählt werden. Die Zahl, die sich auf jedes Fluorophor bezieht, wäre ungefähr die Fluoreszenzwellenlänge, die während der Anregung emittiert wird (Tabelle 1 und Tabelle 2). Ein Ansatz, um Fluorophorinterferenzen zu verhindern, besteht darin, Fluorophorpaare mit Wellenlängen so weit wie möglich voneinander entfernt zu wählen (insbesondere für kolokalisierende Antikörper). Dies kann dazu beitragen, übermäßige spektrale Überlappung zu reduzieren und ein scharfes Bild und eine zuverlässigere Phänotypisierung zu liefern. Darüber hinaus kann die sorgfältige Auswertung durch Ein- und Ausschalten von Lasern aus dem Multiplex-Composite-Bild in der inForm-Software auch dazu beitragen, die Färbemuster zu erkennen, um die Fluorophorsättigung zu minimieren (Abbildung 4).
Für die Bildanalyse kann die Anzahl der CD3+ T-Zellen, CD20+ B-Zellen, CD68+ Makrophagen, CD56+ uNK-Zellen und Stromazellen im Endometriumstroma (CD3−/CD20−/CD68−/ CD56− und DAPI-gefärbt) automatisch mit der inForm Tissue Finder Software 14.0 (Abbildung 5) gezählt werden. Jede Immunzelltypdichte wurde als Prozentsatz relativ zur Gesamtzahl der Stromazellen ausgedrückt (Abbildung 5). In ähnlicher Weise basierte die Quantifizierung der räumlichen Verteilung der endometrialen Immunzellen auf der X- und Y-Position jeder einzelnen Immunzelle, die aus dem InForm-System gewonnen wurde (Abbildung 6). Mit Hilfe der R-Sprache kann dann der Grad der Clusterbildung verschiedener Paare von Immunzellen basierend auf der AUC unterschieden werden.
Abbildung 1:Färben des Workflowdiagramms. Abkürzungen: BSA = Rinderserumalbumin; HRP = Meerrettichperoxidase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Workstation zur Bilderfassung und -analyse. (A) Mantra Imaging Workstation, (B) unverarbeitetes Spektralbild, (C) zusammengesetztes Bild, (D) Gewebesegmentierung (epitheliale und stromale Kompartimente), (E) zusammengesetztes Bild von Endometriumgewebe mit vier farbigen Markern zur Identifizierung verschiedener Zellpopulationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Spektrale Bildgebung. Die Multiplex-Immunfärbung von 4 verschiedenen Immunzelltypen wurde an den Endometriumbiopsien von (A) einer fruchtbaren Kontrollfrau und (B) einer Frau mit ungeklärter RM durchgeführt, die als einzelne multispektrale Bildgebung präsentiert wurde. Nach der Herstellung einer einfach gefärbten Bibliothek könnte die spektrale Entmischung die Abbildung einzelner Fluorophore zeigen, die (C) CD3, (D) CD56, (E) CD68, (F) CD20, (G) DAPI darstellen. Ein zusammengesetztes Bild wurde dann erstellt, indem alle Fluorophore nach multispektraler Bildgebung (H) einbezogen wurden. Maßstabsbalken = 50 μm (A, B). Abkürzungen: LE = luminales Epithel; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; RM = wiederkehrende Fehlgeburt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:Werkzeug "InForm Counts". Das Zählwerkzeug der inForm-Software wird durch Auswahl des beigen Box-Symbols (gekennzeichnet durch ↓ )aktiviert. (A) Bildvorbereitung, (B, C) Segmentierung von Gewebe für handgezeichnetes Training und Automatisierung, (D) Segmentierung einzelner Zellen, (E) Phänotypisierung der Zellen basierend auf der Fluorophorintensität, (F) Analyse für Fluorophorintensität (das rote Kästchen zeigt die Anzahl der positiven Zellen in der ausgewählten Fluorophorintensität) und (G) Exportieren der Ergebnisse zur Verwendung (das rote Feld zeigt die Exportoptionen an). Abkürzung: IHC = immunhistochemisch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Zellzählung. (A) Phänotypisierung der Zellen für die automatische Zellzählung und (B) Ausgabe der positiv gefärbten Zellen in der segmentierten Region (z.B. Stromal) zum weiteren Vergleich und zur statistischen Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Messung der räumlichen Dichte. (A) Automatische Erkennung der Position von positiv gefärbten Immunzellen in der segmentierten Region (z.B. Stromal), (B) Ausgabeanzeige der Koordinate jeder positiv gefärbten CD20+ Immunzelle und (C) Bestimmung der räumlichen Dichte und Lokalisation zwischen CD20+ Zellen und anderen Immunzellen in den segmentierten Geweberegionen mit Spatstat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Bestellung | Antikörper | Klonen | Klonalität | Antikörper-Verdünnungsfaktor | Opale | Opal-Verdünnungsfaktor |
| 1 | CD3 | SP7 | Monoklonal | 1 zu 100 | Opal 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | Monoklonal | 1 zu 100 | Opal 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | SP251 | Monoklonal | 1 zu 100 | Opal 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD-56 | CD-564 | Monoklonal | 1 zu 100 | Opal 690 | 0.111111111 |
Tabelle 1: Liste der verwendeten Antikörper, Klone und Konzentrationen.
| Färben | Erregungsmaximum (nm) | Emissionsmaximum (nm) | Erwartete Erkennung im Filterset (Name) | Erwartete Farbe |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | Blau |
| Opal 520 | 494 | 525 | FITC | Grün |
| Opal 620 | 588 | 616 | Cy3 und Texas Red | Bernstein |
| Opal 650 | 627 | 650 | Texas Red und Cy5 | Orange |
| Opal 690 | 676 | 694 | Texas Red und Cy5 | Klar |
Tabelle 2: Liste der Fluorophore mit ihren maximalen Anregungs- und Emissionswellenlängen, erwarteter Nachweis in geeigneten Filtersets und beobachtbaren Farben.
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Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Es ist wichtig zu beachten, dass die Multiplexfärbung eine sorgfältige Optimierung erfordert. Die Antigengewinnung unter Verwendung der Citratpuffer- und Mikrowellentechnologie erfordert eine Optimierung, um ein vollständiges Antikörper-Stripping sicherzustellen und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Da TSA-Reagenzien kovalent an Stellen binden, die das Antigen umgeben, können sie möglicherweise die Bindung eines nachfolgenden primären Antikörpers durch sterische Behinderung (auch bekannt als "Umbrella-Effekt") hemmen. Dies tritt tendenziell auf, wenn sich mehrere Immunmarker in einem einzigen Zellkompartiment befinden und Fluorophorstörungen verursachen. Um festzustellen, ob es einen Effekt geben wird, wäre es wichtig, vorher monoplex iHC/IF durchzuführen, um überschneidungen in der Lokalisation der Immunzellen zu identifizieren. Da für die Erzeugung der Spektralbibliothek eine Einzelprobenfärbung erforderlich wäre, können validierte Spektrenbibliotheken die Unterscheidung einzelner Signale erleichtern, um Fluorophorinterferenzen weiter zu verhindern. Falls erforderlich, können primäre Antikörperkonzentrationen und Inkubationszeiten, Fluorophor-Antikörper-Paarung, TSA-Fluorophorkonzentrationen und Färbereihenfolge modifiziert werden, um Fluorophorinterferenzen zu minimieren. Ebenso ist es wichtig, die HRP-Konzentrationen richtig auszugleichen, um die Bildung von TSA-Dimeren zu verhindern. Dies kann durch die Titration von primären und sekundären Antikörpern erreicht werden. Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, sich daran zu erinnern, dass die Konzentrationen und Inkubationszeiten von primären Antikörpern, die für die Multiplexfärbung verwendet werden, von denen abweichen können, die bei der herkömmlichen chromogenen Einzelfärbung verwendet werden. Daher sollte die Bestimmung der Konzentration und Reihenfolge der Antikörper, die für die Multiplexfärbung anzuwenden sind, vorher durchgeführt werden.
Änderungen und Fehlerbehebung
In dieser Studie verwendeten wir die immunhistochemische Multiplexfluoreszenzfärbung, um gleichzeitig die Interaktion von vier wichtigen Immunzelltypen in Endometriumbiopsien von Frauen mit und ohne RM nachzuweisen. Diese Technik verwendet Antikörper gegen CD3 für T-Zellen, CD20 für B-Zellen, CD68 für Makrophagen und CD56 für uNK-Zellen, um zwischen diesen Zelltypen zu unterscheiden. Basierend auf dieser Methode fanden wir heraus, dass die medianen CD3+, CD68+und CD56+ Zelldichtewerte bei den RM-Frauen signifikant höher waren als die der fruchtbaren Kontrollen15. Das Clustering zwischen CD56+ uNK-Zellen und CD68+ Makrophagen war in der RM-Gruppe signifikant höher als in den fruchtbaren Kontrollen. Darüber hinaus zeigte die Verwendung dieser Methode, dass CD56+ uNK-Zellen in beiden Frauengruppen sowohl eine numerische als auch eine räumliche Korrelation mit CD68+ Makrophagen zu haben schienen. Im Gegensatz dazu haben CD56+ uNK-Zellen eine signifikante numerische, aber nicht räumliche Korrelation mit CD3+ T-Zellen bei Frauen mit RM15. Diese Methode bestimmt auch die räumliche Beziehung mehrerer Immunzelltypen im Endometrium. Die Positivität für einen bestimmten Marker kann jedoch in einigen Fällen grenzwertig sein. Um dieses Problem zu überwinden, ist es ratsam, eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle einzubeziehen, um die Schwelle der Positivität beim Aufbau der Spektralbibliothek zu bestimmen. Darüber hinaus kann die sorgfältige Auswertung durch Ein- und Ausschalten von Lasern aus dem Multiplex-Composite-Bild in der inForm-Software auch dazu beitragen, die Färbemuster zu erkennen, um die Fluorophorsättigung zu minimieren.
Einschränkungen der Technik
Die Identifizierung von Fluorophorinterferenzen während der Dateninterpretation ist unerlässlich, um zwischen echter Kolokalisierung von Markern und unvermischten Artefakten zu unterscheiden. Diese Multiplex-Färbemethode verwendet TSA-basierte Reagenzien, die durch enzymatische Amplifikation angetrieben werden, was die Antigenmarkerintensität im Vergleich zu herkömmlichen indirekten IF-Methoden um das 10- bis 100-fache erhöhen kann. Dies erzeugt das Risiko einer überaktiven Tyramidablagerung, die möglicherweise zu einem Regenschirmeffekt und/oder Signaldurchbluten führt. Um eine Überfärbung zu identifizieren, können Signalpegel visuell beurteilt werden, indem Bilder in inForm entmischt und der Cursor über helle, positive Bereiche in einem Multiplex-Gewebebild bewegt wird. Die Signalpegel sollten in der Regel unter 30 und idealerweise innerhalb eines Faktors 3 voneinander bleiben, insbesondere bei spektral benachbarten Fluorophoren. Über 5-fache Signalunterschiede für spektral benachbarte Fluorophore können zu Fluorophorinterferenzen führen und ungemischungsfreie Artefakte verursachen. Wenn die Signalpegel eines Fluorophors mehr als das 3-fache der Differenz zum benachbarten Fluorophor aufweisen, müssen die TSA-Fluorophorkonzentrationen angepasst werden, um ein Signalgleichgewicht zu erreichen. Sobald bestätigt wurde, dass sich das Signal im richtigen Bereich befindet, sollte das Signal-Hintergrund-Verhältnis bei <1:10 gehalten werden, um sicherzustellen, dass die positive Färbung nicht fälschlicherweise aus dem unspezifischen Hintergrund erkannt wird.
Da spektrales Übersprechen auch signifikante Fluorophorinterferenzen erzeugen kann, muss die Reihenfolge der Färbung angepasst werden, um spektral benachbarte Farbstoffe sowohl in der Sequenz als auch in der Expression von Markern zu trennen. Obwohl diese multispektrale Technologie mit der Mantra Workstation bis zu 8-Plex-Assays unterstützt, zeigt die Anwendung von 4 Fluorophoren, nämlich Opal 520, 540, 620 und 690, die beste Leistung ohne Fluorophorinterferenz. Die Verwendung von ≥5-Fluorophoren erfordert oft mehr Optimierung und Validierung, um spektrales Übersprechen aufgrund der spektralen Profile von Fluorophoren, die nahe Wellenlängen teilen, zu vermeiden. Mit anderen Worten, die Anzahl der Ziele, die durch diesen Ansatz gleichzeitig detektiert werden können, ist nur durch die Anzahl der verfügbaren Wellenlängenbänder und Anregungs-/Emissionsfiltersätze begrenzt. Um eine mögliche Überfärbung eines TSA-Fluorophors auszuschließen, die die weitere Anwendung anderer TSA-Fluorophore blockiert und/oder Signalübersprechen identifiziert, ist es daher unerlässlich, akribisch zu sein, indem die Schichten des Multiplex-Composite-Bildes in der inForm-Software ein- und ausgeschaltet werden. die Färbemuster aus der einzelnen IHC-Färbung richtig zu interpretieren; und auf der Suche nach offensichtlichen Verlusten, Gewinnen oder identischen Signalen in einer Ebene, die der Lokalisierung in einer anderen Ebene entsprechen.
Die multispektrale Färbung erfordert Antikörper, die mit spezifischen Fluorophoren gepaart sind, um gleichzeitig nach mehreren Markern zu suchen. Diese Fluorophor-Antikörper-Paarung folgt zwei Regeln: i) Fluorophore, die co-exprimierten Markern zugeordnet sind, sollten spektral voneinander entfernt sein, und ii) häufigere Ziele sollten mit Fluorophoren mit geringerer Helligkeit gepaart werden oder umgekehrt. Die Reihenfolge der Färbung muss auch so angeordnet werden, dass sequentielle Antikörper nicht in den gleichen Zellkompartimenten in den gefärbten Zellen kolokalisieren. Daher müssen neben den Antikörperkonzentrationen und Inkubationszeiten, die bei herkömmlichen Färbemethoden kritische Faktoren sind, zusätzliche Parameter wie eine geeignete Fluorophor-Antikörper-Paarung, TSA-Fluorophorkonzentrationen, die Färbesequenz und die Exposition eines spezifischen Antikörpers gegenüber einer oder mehreren Mikrowellenbehandlungen für eine erfolgreiche Multiplexfärbung berücksichtigt werden. Aufgrund der hohen Variabilität der Studienstichproben führt ein bestimmtes Multiplex-Protokoll möglicherweise nicht zu demselben Ergebnis in anderen Arten von Studienproben.
Der gesamte sequentielle Färbungsprozess des Opal-Multiplex kann je nach Anzahl der am Panel beteiligten Marker und der primären Antikörper-Inkubationszeiten einen bis zu mehreren Tagen dauern. Im Gegensatz dazu erlauben Standard-IF-Methoden typischerweise die Visualisierung von 4-5 Markern in einer einzigen Färbungsrunde. Es sollte beachtet werden, dass die mit der herkömmlichen IHC-Methode optimierten Bedingungen einer weiteren Optimierung bedürfen, bevor zu Multiplex-Färbeverfahren übergegangen wird, die zusätzliche, mehrfache Mikrowellenbehandlungen und die Anwendung von TSA-Fluorophoren beinhalten, die letztendlich die Färbeintensität jedes Antikörpers beeinflussen. Derzeit können Bildgebungsansätze, die multispektrale Technologien verwenden, teure und dedizierte Instrumente erfordern. Darüber hinaus kann es nur auf bildgewählte Interessengebiete beschränkt sein. Daher ist dies möglicherweise nicht optimal für Labore mit begrenzten Ressourcen und das Scouting von Geweben mit unsicheren Antigenzielen.
Bedeutung gegenüber bestehenden Methoden
Eine besondere Stärke dieser aktuellen Methode ist die Fähigkeit, die Dichte mehrerer Immunzelltypen im Endometrium gleichzeitig zu messen, im Gegensatz zu herkömmlichen IHC-Methoden, die nur ein bis zwei Zelltypen in einem einzigen Gewebeschnitt markieren können. Die Durchflusszytometrie ist eine weitere Methode, die die relativen Anteile verschiedener Immunzelltypen in der Endometriumprobe analysieren kann; es wäre jedoch nicht in der Lage, räumliche Informationen zwischen verschiedenen Immunzelltypen und der spezifischen Verteilung innerhalb verschiedener Endometriumkompartimente bereitzustellen. Darüber hinaus ist die Gewebeverarmung ein ernstes Problem in der klinischen Praxis, insbesondere während klinischer Studien und bei der Verwendung von Biopsieproben. Diese beiden konventionellen Methoden würden eine große Anzahl von Proben (entweder Abschnitte oder Zellen) zur Optimierung des Verfahrens und zum Nachweis mehrerer Immunzelltypen im Endometrium von Frauen mit und ohne RM erfordern.
Wie in diesem Protokoll beschrieben, ist der Opal-Workflow für die Erkennung von bis zu sieben Markern im selben Gewebeabschnitt mithilfe der Mantra Workstation ausgelegt. Darüber hinaus ist die Kreuzreaktivität von Spezies während der Antikörperselektion keine Einschränkung dieser Technologie. Ein Vorteil dieser Technologie besteht darin, dass sie die Verwendung von Antikörpern ermöglicht, die in derselben Spezies aufgezogen wurden, um bis zu sieben Marker nachzuweisen. Dieser Ansatz beinhaltet die Detektion mit fluoreszierenden TSA-Reagenzien, gefolgt von einer Mikrowellenbehandlung, um unspezifische Flecken zu entfernen. Nach mikrowellenbasiertem Stripping kann dann eine weitere Runde der Färbung für den zusätzlichen Target-Nachweis ohne das Risiko einer Antikörper-Kreuzreaktivität durchgeführt werden. Darüber hinaus kann diese TSA-Nachweismethode in mindestens 3 Tagen durchgeführt werden, um bis zu 7 Fluorochrome zu kombinieren und gleichzeitig zuverlässige Ergebnisse für den Nachweis von Proteinzielen mit niedriger Expression zu liefern. Ein weiterer Vorteil der Multiplexfärbung gegenüber der traditionellen IHC-Studie ist ihre erhöhte Effizienz, da die Messung automatisiert ist, wodurch subjektive Verzerrungen beseitigt werden können. Die generierten quantitativen Daten stellen die Endergebnisse des Assays dar.
Zukünftige Anwendungen
Der Einsatzbereich dieses Multiplex-Protokolls ist immens. Wichtig ist, dass dies das erste Papier ist, das die Methode zum Nachweis der expression multiplexierter Immunfluoreszenzmarker mit der Mantra Workstation und die Bildanalyse mit der InForm 2.2.1-Software beschreibt, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse bei der Differenzierung mehrerer Immunzellpopulationen bei Frauen mit und ohne RM zu liefern. Letztendlich wird dies zu einem besseren Verständnis der Mikroumgebung von Immunzellen während der Embryonenimplantation bei Frauen mit RM führen, um eine spezifische gezielte Behandlung zu etablieren.
Darüber hinaus haben unsere aktuellen Methoden gezeigt, dass mehrere Immunzellen und ihre Wechselwirkungen für die Funktion des Endometriums wichtig sein können. Dies zeigt sich an den signifikanten Veränderungen der Dichte von drei von vier endometrialen Immunzelltypen und einer signifikanten Zunahme der Clusterbildung zwischen CD68+- und CD56+-Zellen. Umgekehrt können die abnormalen Wechselwirkungen dieser Immunzelltypen prädisponierende Faktoren für DIE RM sein. Wichtig ist, dass die Anwendung dieser Multiplex-IHC-Färbung im Gegensatz zum Nachweis eines einzelnen Subtyps von endometrialen Immunzellen ein tiefes Verständnis der immunologischen Regulation der Embryonenimplantation liefern kann. Darüber hinaus kann die Quantifizierung und das weitere Verständnis räumlicher Merkmale in der Immunmikroumgebung dazu beitragen, die Biologie dieser Krankheit im Rahmen von Immuntherapien zu beleuchten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen müssen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde 2018 vom Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund und dem Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
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