Summary
Trots framstegen inom multiplex immunohistochemistry och multispektral imaging, känneteckna densitet och kluster av stora immunceller samtidigt i livmoderslemhinnan är fortfarande en utmaning. Detta dokument beskriver en detaljerad multiplex färgning protokoll och imaging för samtidig lokalisering av fyra immun cell typer i livmoderslemhinnan.
Abstract
Immunohistokemi är den vanligaste metoden för identifiering och visualisering av vävnadsantigener inom biologisk forskning och klinisk diagnostik. Det kan användas för att karakterisera olika biologiska processer eller patologier, såsom sårläkning, immunsvar, vävnadsavstötning och vävnad-biomaterial interaktioner. Visualisering och kvantifiering av flera antigener (särskilt för immunceller) i en enda vävnad avsnitt med konventionella immunohistochemical (IHC) färgning är dock fortfarande otillfredsställande. Därför introducerades multiplexerad teknik under de senaste åren för att identifiera flera biologiska markörer i ett enda vävnadsprov eller en ensemble av olika vävnadsprover.
Dessa tekniker kan vara särskilt användbara för att skilja förändringarna i immun cell-till-cell interaktioner inom livmoderslemhinnan mellan fertila kvinnor och kvinnor med återkommande missfall under implantation. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för multiplexed fluorescence IHC färgning att undersöka densitet och kluster av fyra stora immun celltyper samtidigt i exakt tidsbestämma endometrie exemplar under embryo implantation. Metoden inkluderar provberedning, multiplexoptimering med markörer för immuncellsundertyper och skanning av bilderna, följt av dataanalys, med specifik hänvisning till att upptäcka endometrie immunceller.
Med denna metod kan densiteten och klustring av fyra stora immuncelltyper i livmoderslemhinnan samtidigt analyseras i en enda vävnadssektion. Dessutom kommer detta dokument att diskutera de kritiska faktorerna och felsökningen för att övervinna eventuella fluoroforstörningar mellan de fluorescerande sonder som appliceras. Viktigt är att resultaten från denna multiplexfärgningsteknik kan bidra till att ge en djupgående förståelse för den immunologiska interaktionen och regleringen under embryoimplantation.
Introduction
Återkommande missfall (RM) kan definieras som förlust av två eller flera graviditeter före 24 veckors graviditet1. Detta frekventa reproduktiva tillstånd påverkar upp till 1% av par över hela världen2,3. Patofysiologi är multifaktoriell och kan delas in i embryologiskt drivna orsaker (främst på grund av en onormal embryonal karyotyp) och moderns drivna orsaker som påverkar livmoderslemhinnan och/eller placental utveckling. Denna manifestation kan bero på föräldrarnas genetiska avvikelser, livmoderavvikelser, protrobotiska tillstånd, endokrinologiska faktorer och immunologiska störningar4.
Under de senaste åren har immuneffektorcelldysfunktion varit inblandad i patogenesen vid tidig graviditetsförlust5. Detta har inspirerat många undersökningar för att klargöra de specifika populationerna av immunceller i livmoderslemhinnan under menstruationscykeln, implantation och tidig graviditet, med specifika roller i tidig graviditet. Bland dessa immunceller spelar livmoderns naturliga mördarceller (uNK) en kritisk roll under embryoimplantation och graviditet, särskilt i processerna för trofolastisk invasion och angiogenes6. Studier har visat en ökad uNK celltäthet i livmoderslemhinnan hos kvinnor med RM7,8, även om detta fynd inte var förknippat med en ökad risk för missfall9. Detta stimulerade dock forskning som utvärderade densiteten hos andra immuncelltyper (såsom makrofager, livmoder dendritiska celler) i livmoderslemhinnan hos kvinnor med RM10,11. Det är dock fortfarande osäkert om det finns en betydande förändring i immuncellens densitet i peri-implantation endometrium hos kvinnor med RM.
En möjlig förklaring till osäkerheten är att utvärdering av endometrie immuncell densitet kan vara svårt på grund av de snabba förändringarna i livmoderslemhinnan under fönstret av implantation. Under tidsramen på 24 timmar förändrar signifikanta förändringar i endometrium immuncellens densitet och cytokinsekreation, vilket introducerar en källa till variation i dessa resultat12. Dessutom är de flesta rapporter huvudsakligen beroende av användning av encellsfärgning (t.ex. traditionella IHC-metoder) som inte kunde undersöka flera markörer på samma vävnadssektion. Även om flödescytometri kan användas för att upptäcka flera cellpopulationer i ett enda prov, hindrar de stora mängder celler som krävs och den tidskrävande optimeringen populariteten och effektiviteten hos denna metod. Därför kan den senaste utvecklingen i multiplex IHC färgning lösa detta problem genom att immunstaining flera markörer på samma bild för att utvärdera flera parametrar, inklusive cell härstamning och histologiska lokalisering av enskilda immun subpopulationer. Vidare kan denna teknik maximera den information som erhålls vid begränsad vävnad tillgänglighet. I slutändan kan denna teknik hjälpa till att klargöra skillnaderna i immuncellinteraktioner i livmoderslemhinnan mellan fertila kvinnor och kvinnor med RM.
Två grupper av kvinnor rekryterades från Prince of Wales Hospital, inklusive fertila kontroll kvinnor (FC) och kvinnor med oförklarliga återkommande missfall (RM). Fertil kontroll definierades som kvinnor som hade minst en levande födsel utan någon historia av spontana missfall, och RM kvinnor definierades som de som hade en historia av ≥2 på varandra följande missfall före 20 veckor dräktighet. Försökspersonerna från de två grupperna uppfyllde följande inklusionskriterier: a) ålder mellan 20 och 42 år, b) icke-rökare, c) regelbunden menstruationscykel (25-35 dagar) och normal livmoderstruktur, d) ingen användning av någon hormonell regim under minst 3 månader före endometriebiopsi, e) ingen hydrosalpinx med hystero-salpingogram. Dessutom hade alla ämnen som rekryterats normala karyotypning, normala 3-dimensionella ultrasonography hysterosalpingogram, dag 2 follikelstimulerande hormon < 10 IE/L, mid-luteal progesteron > 30 nmol/L, normala sköldkörteln funktion och testat negativt för lupus antikoagulantia och antikardiolipin IgG och IgM antikroppar.
För att bättre förstå den immunologiska grunden för RM, skulle det vara mest önskvärt att samtidigt kvantifiera och lokalisera de stora immuncelltyperna som finns i livmoderslemhinnan vid implantationstillfället. Detta dokument beskriver hela protokollet från provberedning, multiplexoptimering med markörer för immuncellsundertyper och skanning av bilderna, följt av dataanalys med specifik hänvisning till att upptäcka endometrie immunceller. Dessutom beskriver detta dokument hur man bestämmer densiteten och klustring av immuncelltyperna samtidigt i livmoderslemhinnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien godkändes av Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Informerat samtycke erhölls från deltagarna innan de samlade in endometriebiopsierna. Se introduktionsavsnittet för inkluderingskriterier för kontroll- och RM-grupperna.
1. Provberedning
- Se till att alla kvinnor i denna studie genomgår ett dagligt urinstickstest från dag 9 av menstruationscykeln och framåt för att identifiera det luteiniserande hormonet (LH) för att upptäcka ägglossning och tid endometriebiopsierna exakt den7: e dagen efter LH-överspänningen (LH + 7).
- Få ett 0,5 cm2 fragment av endometriebiopsi med hjälp av en Pipelleprovtagare eller Pipet Curet från fertila kvinnor och kvinnor med oförklarlig RM.
OBS: Fixativets volym ska vara 5-10 gånger större än vävnadens. - Placera vävnaden i en patron för uttorkning i en vävnadsbehandlingsmaskin innan den bäddas in i smält paraffinvax. Bädda in vävnaderna i paraffin vid 58-60 °C.
- Låt paraffinblocket svalna över natten vid rumstemperatur. Använd en mikrotom för att trimma paraffinblocken till en tjocklek av 3 μm.
OBS: Användning av destillerat vatten hjälper till vid korrekt vävnadsmontering och vidhäftning under hela multiplexfärgning. - Placera paraffinbandet i ett vattenbad vid 40-45 °C i 30 s.
- Montera sektionerna på poly-L-lysin (0,1% w/v)-belagda mikroskopglasglas. Placera rutschkanorna med vävnaden vänd uppåt och låt torka vid 37 °C över natten. Förvara bilderna i en bildruta borta från extrema temperaturer tills de används vidare.
2. Bestäm den ideala koncentrationen av antikroppar mot multiplex IHC med konventionell IHC.
OBS: Detta är viktigt för att identifiera uttrycksnivån och mönstret för varje immunmarkör i livmoderslemhinnans prov och bestämma färgningssekvensen för varje markör samt deras tillhörande tyramid signalförstärkning (TSA) fluoroforpar.
- Testa antikropparna för deras lämplighet för multiplex IHC med hjälp av manuell konventionell IHC13.
- Använd endometriumvävnader för enkroppstestning.
- Inkludera en positiv kontroll (t.ex. mjälte) och negativ kontroll (isotypkontroll) för att optimera färgningstillståndet för varje antikropp.
- Utför färgningen med den utspädning som rekommenderas av antikroppens datablad.
- Utför ytterligare färgning med koncentrationer över och under den rekommenderade utspädningen som används i steg 2.3.
OBS: En klinisk patolog bör bedöma de färgade bilderna blint för att bekräfta lokalisering av antikroppssökning och cellulär integritet.
3. Multiplexfärgningsmetod
- Bildförberedelse och fixering
- Lägg rutschkanorna (från steg 1.6) platta med vävnaden vänd uppåt i en ugn och grädda vid 60 °C i minst 1 timme.
- Ta bort bilderna från ugnen och låt dem svalna i minst 20 minuter vid rumstemperatur innan du placerar dem i ett vertikalt skjutställ.
- Dewax och rehydrera de formalin-fasta, paraffin-inbäddade bilderna med 10 min tilldelade till vart och ett av följande steg: xylen (2x), 100% etanol (2x), 95% etanol (1x), 70% etanol (2x) och destillerat vatten (2x).
- Placera gallret med diabilder i en plastrutschbana och doppa dem i Tris-buffrad saltlösning (TBS, pH 7.6).
OBS: Bilderna måste förbli fuktiga från och med detta rehydreringssteg tills de monteras i det sista steget. - Fixera proverna genom att dränka bilderna i en plastrutschbana fylld med en blandning av formaldehyd utspädd i metanol (1:9) i 30 minuter i mörker.
- Tvätta rutschkanorna två gånger i avjoniserat vatten i 2 minuter och fortsätt sedan till antigenhämtning.
- Epitope hämtning
- Placera gallret med diabilder i en värmebeständig låda och fyll den med citronsyrabuffert (pH 6.0) för att täcka rutschkanorna.
- Placera lådan i mikrovågsugnen och värm rutschkanorna i 50 s vid 100% effekt följt av 20 min vid 20% effekt för att bibehålla samma temperatur.
- Låt rutschkanorna svalna i ca 15 min vid rumstemperatur.
- Skölj rutschkanorna i vatten i 2 min följt av TBS-Tween 20 (TBST) i 2 min.
OBS: TBST består av 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl och 0,05% Interpol 20 (v/v).
- Blockering
- Blockera endogen peroxidasaktivitet i vävnaden genom att nedsänka bilden på en burk som innehåller peroxidasblockeringslösning (se materialförteckningen)i 10 minuter.
- Tvätta rutschkanorna med TBST i 5 min.
- Använd en hydrofobisk barriärpenna för att markera en gräns runt vävnadssektionen på bilden.
- Täck vävnadssektionerna med en blockerande buffert (se materialtabellen)eller bovint serumalbumin (5%, w/v) och inkubera bilderna i en fuktad kammare i 15 minuter.
- Antikropps- och signalapplikation
- Ta bort de blockerande reagenserna.
- Inkubera med den primära antikroppen av intresse (t.ex. CD3, 1:100 utspädning i antikroppsdluent, se tabell 1) i en fuktad kammare vid rumstemperatur i 30 min.
- Ta bort den primära antikroppen. Tvätta 3x med TBST i 5 min varje gång.
- Inkubera med den polymera pepparrotsperoxidasen (HRP)-märkta sekundära antikroppen(tabell 1) i 15 minuter i en fuktad kammare vid rumstemperatur. Tvätta 3x med TBST i 5 min varje gång.
- Applicera Opal fluorofor TSA arbetslösning (1:100 i förstärkningsdluent) och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter för att tillåta fluoroforkonjugation till vävnadsprovet vid primära antikroppsbindningsställen. Tvätta med TBST i tre exemplar i 5 min varje gång.
- Mikrovågsbaserad strippning
- Skölj med antigenhämtningsbufferten (citratbuffertlösning, pH 6.0).
- Utför mikrovågsbaserad strippning för att ta bort det primära sekundär-HRP-komplexet för att introducera nästa primära antikropp (t.ex. CD20).
- Placera bilderna i antigenhämtningsbuffert, mikron dem vid 100% effekt i 50 s följt av 20% effekt i 20 min i mikrovågssäkra behållare och kyl dem vid rumstemperatur i 15 min.
- Upprepa steg 3.2.4 till 3.5.2 tills vävnadsproverna har undersökts med alla primära antikroppar.
- Mothåll och montering
- Skölj rutschkanorna i destillerat vatten och TBST efter mikrovågsbaserad strippning och kylning av antigenhämtningsbufferten.
- Inkubera med 4', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) lösning (1,0 μg/ml) i 5 min i en fuktad kammare vid rumstemperatur.
- Tvätta 3x med TBST i 5 min varje gång. Tvätta med vatten en gång i 5 min.
- Lufttorka glidningen och montera med lämpligt monteringsmedium (se materialtabellen).
OBS: Mottaining kommer inte att krävas för att monoplexbilder ska användas för spektralbiblioteksutveckling.
4. Bild och analys
- Förberedelse av Spektrala biblioteksbilder
- Skapa biblioteksbilder (referensbilder med en fläck) för varje fluorofor, DAPI och automatisk fluorescens med samma kontrollvävnad för multispektral bildanalys.
- Använd diabilderna från endometriebiopsiprover från kvinnor med RM och fertila kvinnor, utför steg 1, 1 till 3, 6,4 för en antikroppsdetektering för varje bild (utan ytterligare antikropp eller fluorofortillskott).
- För varje antikroppsdetektion, färga en av bilderna med DAPI (som i steg 3.6.2) och lämna en bild oförseglad för påvisande av eventuell vävnadsautomatisk fluorescens i spektrumet.
- Använd lämpliga filter i arbetsstationen för att hämta bilden för den här uppsättningen bilder för varje antikropp och ladda upp dem till bildanalysbiblioteket (enligt beskrivningen i steg 4.2).
- När bilden har tagits väljer du inForm som Spektralbibliotekskälla och bygger spektralbiblioteket.
- När fluoroforer används väljer du Stains/Fluors... på menyn.
- När du väljer fläckar eller fluoroforer, begränsa valen genom att välja en eller flera grupper. Välj Alla om du vill visa alla spektra som är kompatibla med bilderna.
- Spektral avbildning
BILDER togs med hjälp av Mantra Workstation med spektralbiblioteket som upprättats med hjälp av inForm Image Analysis-programvaran.- Fånga bilden av de enkroppsfärgade bilderna med lämpliga epifluorescensfilter enligt tabell 2 (t.ex. DAPI, fluorescein isotiocyanate [FITC], CY3, Texas Red och CY5) med hjälp av arbetsstationen.
OBS: Rekommenderade filter för de specifika fluoroforer som används i detta protokoll visas i tabell 2. - Identifiera en lämplig exponeringstid för en optimal signal genom att undersöka varje markör i motsvarande fluorescenskanal.
OBS: Den optimala signalen bestäms enligt referensen för positivitet och lokalisering som erhålls vid den enda antikroppsfärgningen. - Bestäm en fast exponeringstid för varje analyt (antikroppsfluoforkombination) för att standardisera en jämförelse mellan prov.
OBS: Fastställandet av den fasta exponeringen beror på intensiteten i intresseprovet. - Skanna de multiplexfärgade bilderna i lämpligt skanningsläge med den inbäddade autofokusalgoritmen.
OBS: Det etablerade spektralbiblioteket skulle användas för att differentiera den multispektrala bildkuben i enskilda enskilda komponenter (spektralavblandning). Detta skulle göra det möjligt att bearbeta den färgbaserade identifieringen för alla markörer av intresse med hjälp av följande två huvudsteg: utbildningssession och bildanalyssession.
- Fånga bilden av de enkroppsfärgade bilderna med lämpliga epifluorescensfilter enligt tabell 2 (t.ex. DAPI, fluorescein isotiocyanate [FITC], CY3, Texas Red och CY5) med hjälp av arbetsstationen.
- Bildanalys
- Cellräkning av valda immuncellstyper i endometrium
- Fånga minst 10 fält för analys under 200x förstoring.
Fälten fångades genom att skanna hela avsnittet utan något val. Detta kan säkerställa samtidig insamling av alla cellkomponenter i endometrium, t.ex. den lysande epitelgränsen, stroma och körtlar. - Om du vill räkna cellerna klickar du på knappen Räkna objekt i stegfältet för att visa panelen Inställningar för objekträkning.
- Markera rutan Ignorera objekt om du vidrör en kant för att utesluta objekt som rör bildens, processområdets eller vävnadsområdets kant.
- Om vävnaden har segmenterats väljer du den vävnadskategori där objekten ska hittas. Räkna inte objekt utanför den valda vävnadskategorin.
- Välj önskad metod för att identifiera objekt: Objektbaserad eller Pixelbaserad (Tröskelvärde).
Den pixelbaserade metoden (Tröskelvärde) bör väljas i händelse av en tillförlitlig eller konsekvent fläck för vilken tillämpningen av ett enkelt tröskelvärde ger objektet pixlar. Den objektbaserade metoden rekommenderas när mer avancerade morfometribaserade metoder krävs i händelse av brist på konsekvens och specificitet i färgning av objekt. - Välj önskad signalskalning: Automatisk skalning eller fast skala.
Om du väljer Automatisk skalning sker automatisk skalning av varje komponentplan innan objektsegmenteringen utförs. Alternativet Fast skala rekommenderas när bättre segmenteringsprestanda krävs och färgsignalerna är konsekventa och tillförlitliga. - Välj den primära komponenten för objektsegmentering i listrutan.
- Justera minimisignalvärdet för den primära komponenten till önskat tröskelvärde.
- Om du vill fylla hål i objekt automatiskt väljer du Fyllningshål.
- Om du vill identifiera objekt som rör andra objekt som enskilda objekt markerar du kryssrutan Förfina delning när du har markerat kryssrutan Maximal storlek (pixlar).
- Om du vill utesluta objekt baserat på objektets rundhet markerar du rutan Rundhet och anger önskad minsta cirkularitet.
- Räkna alla stromalceller (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−och DAPI+), inklusive cellerna som omger blodkärlen.
- Räkna immuncellerna separat, inklusive T-celler (CD3+ och DAPI+), B-celler (CD20+ och DAPI+), makrofager (CD68+ och DAPI+ )och uNK-celler (CD56+ och DAPI+).
- Uttryck data som procentandelar av immuncellerna i förhållande till det totala antalet stromalceller för varje infångad bild och rapportera det slutliga cellantalet som ett genomsnitt av alla fält.
- Använd Visa-redigeraren om du vill visa de resulterande datatabellerna efter bearbetningen. Exportera tabellen Antal data.
- Kvantifiering av rumslig fördelning av endometrieceller
- Under 200x förstoring, uppskatta L-funktionen med hjälp av R-programmet för ett intervall på 0-20 μm anses vara en cell-cell kontakt maximalt avstånd14.
OBS: R-språkverktygslådan "spatstat" användes för att mäta L-funktionen.- Ange graden av klustring av olika par av immunceller baserat på området under kurvan (AUC) av deras L-funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den övergripande schematiska processen att utföra en 4-färgs multiplexanalys för detektion av 4 endometrie immuncelltyper visas i figur 1. I korthet krävde protokollet för denna multiplex immunofluorescensfärgning 8 viktiga steg: 1. Glidberedning, 2. Epitope retrieval, 3. Blockering, 4. Primär antikroppsapplikation, 5. Sekundär antikroppsapplikation, 6. Signalförstärkning, 7. Avlägsnande av antikroppar och 8. Mottain och montering. Bildåtergivning och analys utfördes sedan med hjälp av Mantra Workstation med spektralbiblioteket som genererades med hjälp av inForm Image Analysis-programvaran för att differentiera de 4 immuncelltyperna i livmoderslemhinnan(figur 2).
Fyra endometrie immuncelltyper kan identifieras i humana endometriumprover med hjälp av denna multiplexfärgningsteknik: CD3 + T-celler, CD20 + B-celler, CD68 + makrofager och CD56 + uNK-celler(figur 3). Fluoroforinterferens måste dock noga övervägas för att få en tydlig och användbar bild. Även om denna multispektrala teknik som använder Mantra Workstation kan stödja upp till 8-plexanalyser, visade tillämpningen av de 4 fluoroforer som används i detta protokoll optimal prestanda utan fluoroforinterferens på grund av skillnaderna i fluoroforernas utsläppsspektra. Multiplaxfärgning som involverar 5-8 fluoroforer kräver däremot ofta mer uppmärksamhet mot fluoroforstörningar till följd av emittens från de delade våglängderna.
För att övervinna denna nackdel skulle monoplexfärgning vara nödvändig för att bestämma ordningen på varje antikropp i multiplexen och identifiera uttrycksnivån och mönstret för varje immunmarkör i livmoderslemhinnans prov. Detta kan hjälpa till att bestämma färgningssekvensen av markörerna och deras tillhörande TSA fluorophore parningar. När monoplexanalysen har slutförts för att bestämma ordningen på de antikroppar som ska appliceras, kommer nästa steg att vara att välja fluorofor för detektion efter multiplexfärgning. En unik fluorofor måste väljas för varje antikropp av intresse. Det antal som är relaterat till varje fluorofor skulle ungefär vara den fluorescerande våglängd som avges under excitationen(tabell 1 och tabell 2). Ett tillvägagångssätt för att förhindra fluoroforinterferens är att välja fluoroforpar med våglängder så långt ifrån varandra som möjligt (särskilt för samlokalisering av antikroppar). Detta kan bidra till att minska överdriven spektral överlappning och ge en skarp bild och mer tillförlitlig fenotypning. Dessutom kan den noggranna utvärderingen genom att slå på och stänga av lasrar från multiplexkompositbilden i inForm-programvaran också hjälpa till att känna igen färgningsmönstren för att minimera fluoroformättnaden (figur 4).
För bildanalys kan antalet CD3+ T-celler, CD20+ B-celler, CD68+ makrofager, CD56+ uNK-celler och stromalceller i endometrie stroma (CD3−/CD20−/CD68−/ CD56− och DAPI-färgade) räknas automatiskt med hjälp av inForm Tissue Finder Software 14.0 (Figur 5). Varje immuncellstyptäthet uttrycktes i procent i förhållande till det totala antalet stromalceller (figur 5). På samma sätt baserades kvantifieringen av den rumsliga fördelningen av endometrie immuncellerna på X- och Y-positionen hos varje enskild immuncell som erhållits från InForm-systemet (figur 6). Med hjälp av R-språket kan nivån av klustring av olika par av immunceller baserat på AUC sedan särskiljas.
Bild 1: Färgning av arbetsflödesdiagram. Förkortningar: BSA = bovin serumalbumin; HRP = pepparrotperoxidas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Arbetsstation för bildtagning och analys. (A) Mantra Imaging Workstation, (B) obearbetad spektralbild, (C) sammansatt bild, (D) vävnadssegmentering (epitel- och stromalfack), (E) sammansatt bild av endometriumvävnad som visar fyra färgade markörer för att identifiera olika cellpopulationer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Spektral avbildning. Multiplex immunostaining av 4 olika immun cell typer utfördes på endometriebiopsier från (A) en fertil kontroll kvinna och (B) en kvinna med oförklarliga RM presenteras som enda multispektrala imaging. Efter produktionen av ett enfärgat bibliotek kan spektralavblandning avslöja avbildning av enstaka fluoroforer som representerar (C) CD3, (D) CD56, (E) CD68, (F) CD20, (G) DAPI. En sammansatt bild skapades sedan genom att alla fluoroforer införlivades efter multispektral avbildning (H). Skalstänger = 50 μm (A, B). Förkortningar: LE = luminal epitel; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; RM = återkommande missfall. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Verktyg för informat antal. Verktyget inForm-programräkning aktiveras genom att välja beige-lådikonen (indikeras av ↓). ( A) Bildberedning, (B, C) segmenteringsvävnad för handritad träning och automatisering, (D) segmentering av enskilda celler, (E) fenotypning av cellerna baserat på fluoroforintensiteten, (F) analys för fluoroforintensitet (den röda rutan som visar antalet positiva celler i den valda fluoroforintensiteten) och (G) exportera resultaten för användning (den röda rutan anger exportalternativen). Förkortning: IHC = immunohistochemical. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Cellräkning. (A) Fenotypning av cellerna för automatisk cellräkning och (B) utmatning av de positivfärgade cellerna i det segmenterade området (t.ex. stromal) för ytterligare jämförelse och statistisk analys. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Mätning av rumslig densitet. (A) Automatisk detektion av positionen för positivt färgade immunceller i det segmenterade området (t.ex. stromal), (B) utdatavisning av koordinaten för varje positivt betsad CD20+ immuncell, och (C) som bestämmer rumslig densitet och lokalisering mellan CD20+ celler och andra immunceller i de segmenterade vävnadsregionerna med spatstat. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Ordning | Antikropp | Klon | Klonalitet | Utspädningsfaktor för antikroppar | Opaler | Opal utspädningsfaktor |
| 1 | CD3 | SP7 | Monoklonal | 1 av 100 | Opal 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | Monoklonal | 1 av 100 | Opal 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | SP251 | Monoklonal | 1 av 100 | Opal 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 | CD564 | Monoklonal | 1 av 100 | Opal 690 | 0.111111111 |
Tabell 1: Förteckning över antikroppar, kloner och koncentrationer som används.
| Färg | Excitation maximalt (nm) | Utsläpp högst (nm) | Förväntad identifiering i filteruppsättning (namn) | Förväntad färg |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | Blå |
| Opal 520 | 494 | 525 | FITC | Grön |
| Opal 620 | 588 | 616 | Cy3 och Texas Röd | Bärnsten |
| Opal 650 | 627 | 650 | Texas Röd och Cy5 | Apelsin |
| Opal 690 | 676 | 694 | Texas Röd och Cy5 | Klar |
Tabell 2: Förteckning över fluoroforer med maximal excitation och emissionsvåglängder, förväntad detektion i lämpliga filteruppsättningar och observerbara färger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Det är viktigt att notera att multiplexfärgning kräver noggrann optimering. Antigenhämtning, med hjälp av citratbuffert och mikrovågsteknik, kräver optimering för att säkerställa fullständig antikroppsborttagning och upprätthålla vävnadens livskraft. Eftersom TSA-reagenser kovalent binder till platser som omger antigenet kan de potentiellt hämma bindningen av en efterföljande primär antikropp genom steriskt hinder (även känt som "paraplyeffekten"). Detta tenderar att inträffa när flera immunmarkörer finns i ett enda cellfack och orsakar fluoroforstörningar. För att identifiera om det kommer att finnas en effekt, skulle det vara viktigt att utföra monoplex IHC/IF i förväg för att identifiera eventuella överlappningar i lokalisering av immuncellerna. Eftersom färgning med ett enda prov skulle krävas för att generera spektralbiblioteket kan validerade spektrabibliotek underlätta diskriminering av enskilda signaler för att ytterligare förhindra fluoroforinterferens. Vid behov kan primära antikroppskoncentrationer och inkubationstider, fluorofor-antikroppskoppling, TSA-fluoroforkoncentrationer och färgningsordning ändras för att minimera fluoroforinterferens. På samma sätt är det viktigt att balansera HRP-koncentrationerna ordentligt för att förhindra TSA-dimerbildning. Detta kan uppnås genom titrering av primära och sekundära antikroppar. Dessutom är det av avgörande betydelse att komma ihåg att koncentrationerna och inkubationstiderna för primära antikroppar som används för multiplexfärgning kan variera från de som används vid konventionell kromogen enfärgning. Därför bör bestämning av koncentrationen och ordningen av antikroppar som ska tillämpas för multiplexfärgning utföras i förväg.
Ändringar och felsökning
I denna studie använde vi multiplex fluorescens immunohistochemical färgning för att samtidigt upptäcka interaktionen mellan fyra stora immun celltyper i endometrium tarmbiopsier från kvinnor med och utan RM. Denna teknik använder antikroppar mot CD3 för T-celler, CD20 för B-celler, CD68 för makrofager och CD56 för uNK-celler för att skilja mellan dessa celltyper. Baserat på denna metod fann vi att medianvärdet CD3+, CD68+och CD56+ celltäthetsvärdena hos RM-kvinnorna var betydligt högre än för de bördiga kontrollerna15. Klustring mellan CD56+ uNK-celler och CD68+ makrofager var betydligt högre i RM-gruppen än i de fertila kontrollerna. Dessutom visade användningen av denna metod att CD56+ uNK celler tycktes ha både numeriska och rumsliga korrelation med CD68+ makrofager i båda grupperna av kvinnor. Cd56+ uNK-celler har däremot en signifikant numerisk men inte rumslig korrelation med CD3+ T-celler hos kvinnor med RM15. Denna metod bestämmer också det rumsliga förhållandet mellan flera immuncelltyper i endometrium. Positiviteten för en viss markör kan dock i vissa fall vara gränsfall. För att övervinna detta problem är det lämpligt att inkludera en positiv kontroll och en negativ kontroll för att bestämma tröskeln för positivitet när du konstruerar spektralbiblioteket. Dessutom kan den noggranna utvärderingen genom att slå på och stänga av lasrar från multiplexkompositbilden i inForm-programvaran också hjälpa till att känna igen färgningsmönstren för att minimera fluoroformättnad.
Teknikens begränsningar
Identifiering av fluorofor interferens under data tolkning är avgörande för att skilja mellan äkta colocalization av markörer och unmixing artefakter. Denna multiplex färgning metod använder TSA-baserade reagenser drivs av enzymatiska förstärkning, som kan öka antigen markör intensitet med 10-100 gånger jämfört med konventionella indirekta IF metoder. Detta genererar en risk för överaktiv tyramiddeposition, vilket kan leda till en paraplyeffekt och/eller signalblödning. För att identifiera övertainering kan signalnivåer utvärderas visuellt genom att blanda bilder i inForm och hovra markören över ljusa, positiva områden i en multiplexvävnadsbild. Signalnivåerna bör vanligtvis ligga under 30 och helst inom en faktor 3 av varandra, särskilt för spektral angränsande fluoroforer. Över 5-faldiga skillnader i signaler för spektral angränsande fluoroforer kan leda till fluorofor interferens och orsaka blandning av artefakter. Om signalnivåerna för någon fluorofor visar mer än 3 gånger skillnaden från den intilliggande fluoroforen måste TSA:s fluoroforkoncentrationer justeras för att uppnå signalbalans. När signalen har bekräftats vara inom rätt intervall bör signal-till-bakgrund-förhållandet bibehållas vid <1:10 för att säkerställa att den positiva färgningen inte felaktigt detekteras från den ospecificerade bakgrunden.
Eftersom spektralkorstalk också kan skapa betydande fluoroforstörningar, måste färgningsordningen justeras för att separera spektralmässigt intilliggande färgämnen i både sekvens och uttryck av markörer. Även om denna multispektrala teknik som använder Mantra Workstation stöder upp till 8-plexanalyser, visar tillämpningen av 4 fluoroforer, nämligen Opal 520, 540, 620 och 690, den bästa prestandan utan fluoroforinterferens. Användningen av ≥5 fluoroforer kräver ofta mer optimering och validering för att undvika spektralkorstalk på grund av de spektralprofiler av fluoroforer som delar proximatvåglängder. Med andra ord begränsas antalet tillgängliga mål som kan detekteras samtidigt med denna metod endast av antalet våglängdsband och tillgängliga excitations-/utsläppsfilteruppsättningar. För att utesluta potentiell övertainering av en TSA-fluorofor som blockerar ytterligare tillämpning av andra TSA-fluoroforer och/eller för att identifiera signalkorstalk är det därför viktigt att vara noggrann genom att slå på och stänga av lager från multiplexkompositbilden i inForm-programvaran. tolka färgningsmönstren från den enda IHC-färgningen korrekt; och letar efter uppenbara förluster, vinst eller identiska signaler i ett plan som motsvarar lokalisering i ett annat plan.
Multispektral färgning kräver antikroppar i kombination med specifika fluoroforer för att samtidigt upptäcka för flera markörer. Denna fluorofor-antikroppsparning följer två regler: i) fluoroforer som tilldelas för med uttryckta markörer bör vara spektralt åtskilda, och ii) mer rikliga mål bör paras ihop med fluoroforer med lägre ljusstyrka eller vice versa. Färgningsordningen måste också ordnas så att sekventiella antikroppar inte samlokaliseras i samma cellfack i de färgade cellerna. Andra än antikroppskoncentrationerna och inkubationstiden, som är kritiska faktorer i konventionella färgningsmetoder, måste därför ytterligare parametrar, såsom lämplig fluorofor-antikroppsparning, TSA-fluoroforkoncentrationer, färgningssekvensen och exponeringen av en specifik antikropp för en eller flera mikrovågsbehandlingar, övervägas för framgångsrik multiplexfärgning. På grund av hög variabilitet i studieprover kan det genererar ett givet multiplexprotokoll inte samma resultat i andra typer av studieprover.
Hela Opal multiplex sekventiell färgningsprocessen kan ta från en till flera dagar beroende på antalet markörer som är involverade i panelen och de primära antikroppskubationstiderna. Däremot tillåter standard OM-metoder vanligtvis visualisering av 4-5 markörer i en enda färgning. Det bör noteras att de villkor som optimeras med den konventionella IHC-metoden behöver ytterligare optimering innan man fortsätter till multiplexfärgningsförfaranden, som innebär ytterligare, flera mikrovågsbehandlingar och applicering av TSA-fluoroforer som i slutändan kommer att påverka färgningsintensiteten hos varje antikropp. För närvarande kan bildframställningsmetoder som använder multispektral teknik kräva dyr och dedikerad instrumentering. Dessutom kan den endast begränsas till bildvalda regioner av intresse. Därför kanske detta inte är optimalt för laboratorier med begränsade resurser och scouting av vävnader med osäkra antigenmål.
Betydelse för befintliga metoder
En särskild styrka hos denna nuvarande metod är förmågan att mäta densiteten hos flera immuncelltyper i endometrium samtidigt till skillnad från konventionella IHC-metoder som bara kan märka en till två celltyper i en enda vävnadssektion. Flödescytometri är en annan metod som kan analysera de relativa proportionerna av olika immuncelltyper i endometrieprovet; Det skulle dock inte kunna ge rumslig information mellan olika immuncelltyper och den specifika fördelningen inom olika endometrieutrymmen. Dessutom är vävnadsutarmning ett allvarligt problem i klinisk praxis, särskilt under kliniska prövningar och vid användning av biopsiprover. Dessa två konventionella metoder skulle kräva ett stort antal exemplar (antingen sektioner eller celler) för att optimera förfarandet och för att upptäcka flera immuncelltyper i livmoderslemhinnan hos kvinnor med och utan RM.
Som beskrivs i detta protokoll, Opal arbetsflödet är utformad för detektion av upp till sju markörer i samma vävnad avsnitt genom att använda Mantra Workstation. Dessutom är artkorsreaktivitet vid antikroppsval inte en begränsning av denna teknik. En fördel med denna teknik är faktiskt att den tillåter användning av antikroppar som föds upp i samma art för att upptäcka upp till sju markörer. Detta tillvägagångssätt innebär detektion med fluorescerande TSA reagenser följt av mikrovågsbehandling för att ta bort eventuella ospecificerade färgning. Efter mikrovågsbaserad strippning kan ytterligare en omgång färgning sedan utföras för ytterligare måldetektering utan risk för antikroppskorreaktivitet. Dessutom kan denna TSA-detektionsmetod utföras på minst 3 dagar för att kombinera upp till 7 fluorokromer samtidigt som den ger tillförlitliga resultat för att upptäcka låguttrycksproteinmål. En annan fördel med multiplexfärgning över den traditionella IHC-studien är dess förbättrade effektivitet eftersom mätningen är automatiserad, vilket kan eliminera subjektiv partiskhet. De kvantitativa data som genereras representerar slutresultaten av analysen.
Framtida applikationer
Tillämpningsområdet för detta multiplexprotokoll är enormt. Viktigt är att detta är det första papperet som beskriver metoden för detektion av multiplexerade immunofluorescensmarköruttryck med hjälp av Mantra Workstation och bildanalys med hjälp av InForm 2.2.1-programvaran för att ge exakta och reproducerbara resultat för att differentiera flera immuncellpopulationer hos kvinnor med och utan RM. Viktigt, lokalisering av flera mål i samma vävnadssektion kan ge unik inblick i deras cellulära interaktioner. I slutändan kommer detta att leda till bättre förståelse för immuncellmikromiljön under embryoimplantation hos kvinnor med RM för att fastställa specifik riktad behandling.
Dessutom bidrog våra nuvarande metoder till att visa att flera immunceller och deras interaktioner kan vara viktiga för endometriums funktion. Detta framgår av de betydande förändringarna i densiteten hos tre av fyra endometrie immuncellstyper och en betydande ökning av klustring mellan CD68 + och CD56 + celler. Omvänt kan onormala interaktioner av dessa immuncelltyper vara predisponerande faktorer för RM. Viktigt, till skillnad från detektion av en enda subtyp av endometrie immunceller, tillämpningen av denna multiplex IHC färgning kan ge en djupgående förståelse av immunologisk reglering av embryo implantation. Dessutom kan kvantifiering och ytterligare förståelse av rumsliga funktioner i immun microenvironment hjälpa till att kasta ljus över biologin av denna sjukdom i samband med immunterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund 2018 och Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M.
- Rai, R., Regan, L.
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A.
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
