Dobbelt harpiksstøbning mikro-computertomografi, eller DUCT, muliggør visualisering, digitalisering og segmentering af to rørformede systemer samtidigt for at lette 3D-analyse af orgel arkitektur. DUCT kombinerer ex vivo injektion af to radiopaque harpikser efterfulgt af mikro-computertomografi scanning og segmentering af tomografi data.
Leveren er det største indre organ hos mennesker og mus, og høj auto-fluorescens udgør en betydelig udfordring for vurderingen af den tredimensionelle (3D) arkitektur af orgelet på hele organniveau. Leverarkitektur er kendetegnet ved flere forgrenede lumeniserede strukturer, som kan fyldes med harpiks, herunder vaskulære og galdetræer, hvilket etablerer et meget stereotyp mønster i det ellers hepatocytrige parenkym. Denne protokol beskriver rørledningen til udførelse af dobbelt harpiksstøbning mikro-computertomografi, eller “DUCT”. DUCT indebærer indsprøjtning portalvene og fælles galdegang med to forskellige radiopaque syntetiske harpikser, efterfulgt af vævsfiksering. Kvalitetskontrol ved at rydde en lap, eller hele leveren, med en optisk clearing agent, giver mulighed for pre-screening af passende injicerede prøver. I den anden del af DUCT-rørledningen kan en lap eller hele leveren bruges til mikro-computertomografi (microCT) scanning, (semi-)automatiseret segmentering og 3D-gengivelse af portalen venøse og galdenetværk. MicroCT resulterer i 3D-koordinatdata for de to harpikser, der giver mulighed for kvalitativ såvel som kvantitativ analyse af de to systemer og deres rumlige forhold. DUCT kan anvendes på postnatal og voksen muselever og kan yderligere udvides til andre rørformede netværk, for eksempel vaskulære netværk og luftveje i lungerne.
Organharpiksstøbning er en teknik, der går tilbage til det 17. århundrede1. Et af de første eksempler på moderne harpiksstøbning blev udført på den menneskelige lever fra en obduktion. Intrahepatiske galdegange blev fyldt med et kontrastmiddel blandet med gelatine, efterfulgt af billeddannelse med en røntgen CT-scanning2. Formålet med DUCT teknikken er at visualisere, digitalisere og analysere to rørformede harpiksstøbte netværk, i tandem, i 3D.
DUCT er baseret på den omfattende eksisterende viden om enkeltsystem leverharpiks støbning3,4,5,6,7,8 og strækker sig til samtidig 3D visualisering og analyse af to systemer9. DUCT avanceret enkelt harpiks støbning til dobbelt harpiks støbning ved at blande to radiopaque harpikser af forskellig kontrast og injicere disse harpikser i to forskellige netværk, specielt den fælles galdegang og portal vene. DUCT kan anvendes på unge postnatale mus med reproducerbare resultater så tidligt som efternatal dag 15 (P15). Sammenlignet med mikroskopi-baserede billeddannelse teknikker, den største fordel er, at DUCT er hurtigere, antistof-fri, og levervæv autofluorescence ikke forstyrrer billeddannelse. Desuden indeholder DUCT kvantitative data, der beskriver lumeniseringsstatus, intern diameter, netværksforbindelse og perfusion. At skelne mellem tilstedeværelsen af lumendannende celler og deres de facto morfogenese i rør er afgørende for at analysere organer, hvor duklære celler er til stede, men ikke danner rør, som det kan være tilfældet i Alagille syndrom10. Den største ulempe ved DUCT er den begrænsede penetration af harpiksen, som er tyktflydende og ikke kommer ind i rør med en lille kaliber (<5 μm). DUCT kan anvendes til enhver rørformet struktur efter bestemmelse af injektion indgangspunktet, såsom arteriel og venøse kredsløbssystemer, luftveje, den ekstrahepatiske galdegang, eller lymfekar. Det kunne således lette hele organ arkitektur analyse af andre væv såsom lunger og bugspytkirtel.
MicroCT-segmenterede billeder kan behandles ved hjælp af kommercielt tilgængelig billedbehandlingssoftware, f.eks. Den harpiks-injicerede lever kan analyseres kvalitativt for netværksudvidelse og tilslutningsmuligheder eller kvantitativt for volumen, længde, forgrening, tortuositet af et enkelt system, og samspillet mellem to systemer såsom afstanden mellem to systemer, eller branchpoint afhængighed (gør system 1 filial i nærheden af system 2 forgrening?). DUCT-rørledningen, der omfatter harpiksindsprøjtning, microCT-scanning og CT-datasegmentering kombineret med detaljeret kvantitativ analyse af arkitektoniske mekanismer i to rørformede systemer, kunne give en standard for hele leveranalyse i dyremodeller.
Flere kritiske trin bestemmer DUCT-succesen, fra prøveforberedelse til parametrene for CT-enheden. For at opnå de bedste resultater skal godt kontrasteret, godt injiceret og boblefri harpiks bruges til at tillade enkel digital behandling med automatiseret tærskel for at opnå 3D-data, billeder og film. Med træning og efter denne protokol er 90% af injektionerne vellykkede og resulterer i reproducerbare data. Det er vigtigt at bruge frisk gul harpiks for at opnå den bedste kontrast mellem de to injicerede systemer. Den gule harpiks har en meget stærk radiopacitet, mens den blå harpiks har målbart radiopacitet. Topresultater opnås inden for de første tre måneder efter åbningen af en ny gul harpiksflaske. Med tiden, harpiks bundfald, og efter længere opbevaring (>6 måneder), vil de gule og de grønne harpikser ikke længere kunne skelnes i CT-scanninger. Billeder med dårlig kontrast kræver omfattende og tidskrævende manuel sporing og segmentering af de to systemer. Dernæst er velspændt slanger uundværlig for at passe ind i den fælles galdegang af voksne mus og fælles galdegang og portalåre af postnatale mus. Indgangspunktet for injektionen skal oprettes med omhu. Hvis den fælles galdegang skæres åben på transversalt, det er sandsynligt, at løsrive sig fra det omgivende væv, forhindrer en vellykket indtræden af slangen. Dette trin er især delikat for postnatal mus, hvor den fælles galdegang trækker sig tilbage og “krøller op”, hvis den har løsrevet sig fra det omgivende væv, hvilket gør indsættelsen af slangen ekstremt udfordrende. Den fælles galdegang indrejse og injektion kan kræve en vis praksis. Mens du forbereder slangen med harpiks og under hele injektionen, undgå bobledannelse, da bobler vil skabe negativ plads i CT-billederne og kræve tidskrævende manuel korrektion. Det er vigtigt at forsigtigt massere leveren ved at rulle over overfladen med en fugtet vatpind under og efter injektionsproceduren, da dette letter selv harpiksspredning. Efter afslutningen af injektion og fjernelse af slangen skal silke suturknuden strammes hurtigt og omhyggeligt, så harpiksen ikke strømmer ud af leveren, før den polymeriserer helt. For vellykket microCT-billeddannelse skal prøven være korrekt fastgjort på plads med agarose og termisk tilpasset for at eliminere bevægelsesartefakter i CT-dataene. Anskaffelsesindstillingerne er også af afgørende betydning, som bør optimeres for at nå frem til en passende rumlig opløsning til at løse fine strukturer.
Der kan foretages tekniske ændringer af injektionsproceduren for at opnå injektion hos yngre mus. I øjeblikket harpiks støbning af yngre muselever er begrænset af tilgængeligheden af tilstrækkeligt tynde slanger, med PE10 er den mindste kommercielt tilgængelige slanger. Tanimizu et al. med succes injiceres kulstof blæk i embryonale dag 17 (E17) fælles galdegang ved hjælp af glas kapillærer11. Fremtidige test af, om harpiks kan leveres via glas kapillær ville derfor være af interesse. DUCT blev yderligere tilpasset til at injicere andre rørformede systemer såsom luftvejene og lungepulsåren vaskulat af lungerne9. Den dobbelte harpiks injektion kunne også ændres til at blive brugt sammen med andre kommercielt tilgængelige harpikser, eller denne protokol kan bruges til injektioner med kulstof blæk.
En af de vigtigste begrænsende faktorer i DUCT-rørledningen er harpiksviskositeten. DUCT kan kun bruges til harpiksstøbning af rørformede strukturer over en diameter på 5 μm. I dette datasæt kan harpiksen trænge ind i rør med den mindste diameter på 5 μm9. Denne størrelsesbegrænsning udelukker analyse af fine duktuer og små kapillærer. For yderligere at fremme DUCT-rørledningen til mindre kaliberbeholdere bør andre kommercielt tilgængelige harpikser testes, eller udviklingen af nye radiopaquemidler med lav viskositet kan forbedre lumenindtrængningen.
I Hankeova et al.9 blev DUCT sammenlignet med to andre almindeligt anvendte teknikker, dobbelt carbon blæk injektioner efterfulgt af væv clearing og standard fotografering, og iDISCO + med farvning af blodkarrene med alfa-glat muskel celle actin og galde kanaler med cytokeratin 7, efterfulgt af 3D-billeddannelse9. DUCT udkonkurrerede de to andre metoder med hensyn til dobbelt analyse (hvilket var udfordrende for iDISCO+ på grund af høj lever autofluorescence), 3D-billeddannelse og kvantificering (ikke mulig med kulstofblækindsprøjtning) og lumenisering (DUCT leverer data for den interne lumenarkitektur og systemperfusion). Som nævnt ovenfor er den primære begrænsning af DUCT den mindste lumenstørrelse, der kan injiceres og analyseres (5 μm grænse), en parameter, hvor både kulstofblækindsprøjtning og iDISCO+ klarede sig bedre. DUCT er overlegen i forhold til enkelt system harpiks støbning3,5,6 fordi det giver mulighed for analyse af hver injiceret system separat og letter også dobbelt 3D undersøgelse for at studere det arkitektoniske forhold mellem de to systemer.
DUCT kan anvendes til at studere to rørformede netværk i 3D. Som bevis på princippet, DUCT blev brugt til at visualisere leveren galde og portal vene systemer og lungearterie vaskulatur og luftveje i lung9. De intrahepatiske galdegange udvikler sig ved siden af portalvenen, og portalvenen giver en strukturel skabelon og signalcenter, der regulerer væksten og differentieringen af galdetræet12. I Hankeova et al.9 udforskede DUCT galde regenerering i en musemodel for den menneskelige pædiatriske sygdom Alagille syndrom. DUCT afslørede tidligere urapporterede arkitektoniske mekanismer, som galdesystemet brugte til at opnå en vild typelignende volumen9. Alagille syndrom mus udnyttet to forskellige strategier: (1) i hilar og centrale regioner af leveren, galdesystemet øget sin forgrening, og (2) i leveren periferien, de novo-genererede galdegange var meget tortuous. Disse to faktorer kombineret til at give en næsten normal galde system volumen, på trods af den unormale arkitektur. Desuden, DUCT opdaget unormal galdegang forgrening, der opstod uafhængigt af portal vene forgrening og galdegange danner forbinder broer mellem to portal vener9. Disse fænotyper ville være umuligt at opdage i enkelt harpiks støbning og kunne fejlfortolkes i 2D histologiske sektioner som galdegang spredning. DUCT leverer således data, der beskriver 3D-arkitekturen i to rørformede netværk på hele organ- eller lobeniveau med mulighed for kvalitativ og dybdegående kvantitativ analyse. DUCT kunne være en ny standard for postnatal leverudvikling og leverregenereringsanalyser i forskellige dyremodeller.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Kari Huppert og Stacey Huppert for deres ekspertise og hjælp til galdegang cannulation og deres laboratorie gæstfrihed. Vi takker også Nadja Schultz og Charlotte L. Mattsson for deres hjælp med fælles galdegang cannulation.
Vi takker følgende bevillingsagenturer for deres støtte:
For arbejde i ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse 20170723 (2019-01350).
For arbejde i JK Lab: Vi anerkender CzechNanoLab Research Infrastructure støttet af MEYS CR (LM2018110). J.K. takket være støtten fra tilskud FSI-S-20-6353.
1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
25 G needle | BD bioscience | 305122 | |
30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
Agarose | Top-Bio | P045 | |
Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
Rocker | VWR | 444-0142 | |
Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |