Summary
טומגוגרפיה מיקרו-ממוחשבת עם שרף כפול מאפשרת הדמיה, דיגיטציה וסגמנטציה של שתי מערכות צינוריות בו זמנית כדי להקל על ניתוח תלת-ממדי של ארכיטקטורת איברים. DUCT משלב הזרקת ex vivo של שני שרפים radiopaque ואחריו סריקת טומוגרפיה מיקרו ממוחשבת פילוח של הנתונים טומוגרפיים.
Abstract
הכבד הוא האיבר הפנימי הגדול ביותר בבני אדם ועכברים, ופלואורסצנטיות אוטומטית גבוהה מהווה אתגר משמעותי להערכת הארכיטקטורה התלת ממדית (3D) של האיבר ברמת האיברים המלאים. ארכיטקטורת הכבד מאופיינת במספר מבנים מסועפים, אשר ניתן למלא שרף, כולל עצי כלי דם ומרה, יצירת דפוס סטריאוטיפי מאוד בפרנצ'ימה עשירה בהפטוציט אחרת. פרוטוקול זה מתאר את הצינור לביצוע טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של יציקת שרף כפול, או "DUCT". DUCT כרוך בהזרקת וריד הפורטל וצינור המרה המשותף עם שני שרפים סינתטיים רדיופאק שונים, ואחריו קיבוע רקמות. בקרת איכות על ידי ניקוי אונה אחת, או הכבד כולו, עם חומר ניקוי אופטי, מאפשר הקרנה מראש של דגימות מוזרקות כראוי. בחלק השני של צינור DUCT, אונה או הכבד כולו יכול לשמש לסריקת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (microCT), (חצי) פילוח אוטומטי ועיבוד תלת-ממדי של רשתות ורידים ומרה. MicroCT תוצאות 3D לתאם נתונים עבור שני השרפים המאפשרים ניתוח איכותי כמו גם כמותי של שתי המערכות ואת היחסים המרחביים שלהם. צינור ניתן להחיל על כבד עכבר לאחר ה לידה ומבוגר והוא יכול להיות מורחב עוד יותר לרשתות צינוריות אחרות, למשל, רשתות כלי דם ודמתי הנשימה בריאות.
Introduction
יציקת שרף איברים היא טכניקה שתחילתה במאה ה -171. אחת הדוגמאות הראשונות של יציקת שרף מודרני בוצעה על הכבד האנושי מנתיחה שלאחר המוות. צינורות מרה תוך-הפטיים היו מלאים בסוכן ניגודיות מעורבב עם ג'לטין, ואחריו הדמיה עם סריקת CT רנטגן2. מטרת טכניקת DUCT היא לדמיין, להפוך את הדיגיטציה ולנתח שתי רשתות יצוקות שרף צינוריות, בד בבד, בתלת-ממד.
DUCT מבוסס על הידע הקיים הנרחב של יציקת שרף כבד חד-מערכתית3,4,5,6,7,8 וממשיך להדמיה וניתוח תלת-ממדיים בו זמנית של שתי מערכות9. DUCT מתקדם יציקת שרף יחיד יציקת שרף כפול על ידי ערבוב שני שרפים radiopaque של ניגודיות שונה והזרקת שרפים אלה לשתי רשתות שונות, במיוחד צינור המרה המשותף וריד הפורטל. צינור ניתן להחיל על עכברים צעירים לאחר ההולכה עם תוצאות לשחזור כבר ביום שלאחר ההולכה 15 (P15). בהשוואה לטכניקות הדמיה מבוססות מיקרוסקופיה, היתרון העיקרי הוא ש- DUCT מהיר יותר, נטול נוגדנים, ואוטפלואורסצנטיות של רקמת כבד אינה מפריעה להדמיה. יתר על כן, DUCT מספק נתונים כמותיים המתארים מצב לומן, קוטר פנימי, קישוריות רשת וחדירה. הבחנה בין נוכחות של תאים יוצרי לומן שלהם מורפוגנזה דה פקטו לתוך צינורות חיונית לניתוח איברים שבהם תאים צינוריים נוכחים אך אינם יוצרים צינורות, כפי שניתן במקרה בתסמונת Alagille10. החיסרון העיקרי של DUCT הוא החדירה המוגבלת של השרף, שהוא צמיג ואינו נכנס צינורות עם קליבר קטן (<5 מיקרומטר). צינור ניתן להחיל על כל מבנה צינורי לאחר קביעת נקודת הכניסה הזרקה, כגון מערכות הדם עורקים ורידים, דרכי הנשימה, צינור מרה חוץ-היפאטי, או כלי הלימפה. זה יכול להקל על ניתוח ארכיטקטורת איברים שלמה של רקמות אחרות כגון ריאות ולבלב.
ניתן לעבד תמונות מפולח MicroCT באמצעות תוכנת הדמיה זמינה מסחרית, כגון ImageJ, או צינורות שנכתבו בהתאמה אישית (למשל, MATLAB). ניתן לנתח את הכבד המוזרק בשרף באופן איכותי להרחבת הרשת ולקישוריות או כמותית לנפח, אורך, הסתעפות, טורטואוזיות של מערכת אחת, והאינטראקציה בין שתי מערכות כגון המרחק בין שתי מערכות, או תלות בסניפים (האם מערכת 1 מסתעפת בסמיכות למערכת 2 מסתעפת?). צינור DUCT הכולל הזרקת שרף, סריקת מיקרו-CT ופילוח נתוני CT, בשילוב עם ניתוח כמותי מפורט של מנגנונים אדריכליים של שתי מערכות צינוריות, יכול לספק תקן לניתוח כבד שלם במודלים של בעלי חיים.
Protocol
הפרוטוקול המתואר במחקר זה אושר ועוקב אחר הכללים והתקנות לרווחת בעלי החיים של שטוקהולם Norra Djurförsöksetiska nämnd (ועדת האתיקה לחקר בעלי חיים בשטוקהולם). בעלי החיים ששימשו במחקר זה היו סוג פראי או עכברים מוטנטיים הומוזיגוס Jag1H268Q על רקע מעורב C3H / N ו- C57bl6J. במחקר נכללו גם זכרים וגם נקבות. החיות שימשו ביום שלאחר ההונאה 15 או כמבוגרים בין 3 - 8 חודשים.
1. זריקות שרף כפולות
- הכנה
- הכן פתרון שרף. עבור זריקות שרף מערכת כפולה, להכין הן שרף צהוב וירוק כמתואר בשלבים 1.1.2-1.1.4.
- הכן 1 mL aliquots של שרף מדולל לכל עכבר.
- שרף צהוב: לדלל גומי סיליקון צהוב (רדיופציה גבוהה) עם דילול ברור בדילול 3:1 כדי להכין שרף צהוב להזרקה.
- שרף ירוק: מערבבים גומי סיליקון כחול (רדיופיציה בלתי ניתנת לגילוי) עם דילול ברור בדילול 1:1 להכנת שרף כחול. כדי ליצור שרף ירוק, מערבבים את השרף הכחול מדולל עם השרף הצהוב מדולל ביחס של 1:1. מערבולת את השרף הירוק ביסודיות עד שהצבע הומוגני.
הערה: שרף כחול יש רדיופציה נמוכה מאוד כי הוא לא ניתן לזהות עם microCT, ולכן מחייב דילול עם שרף צהוב כדי ליצור שני שרפים עם radiopacities שונים.
זהירות: שרף עשוי להכיל כרומט עופרת, שהוא מסרטן. הוא מייצר גזים רעילים בשריפה. לטפל בזהירות ולהיפטר שרף כמו פסולת מסוכנת. - הכן שתי ערכות הזרקה (ערכת הזרקה #1 וערכת הזרקה #2) עם צינורות כמתואר בשלבים 1.1.6-1.1.11.
הערה: עבור עכברים בוגרים (>P30 (יום לאחר ההילה 30) = P30 - 2 שנים), השתמש סט הזרקה #1 (צינורות PE10 עם קוטר חיצוני 0.6 מ"מ) עבור הזרקת צינור המרה נפוצה הסט הזרקה #2 (צינורות PE50 עם קוטר חיצוני 0.96 מ"מ) להזרקת וריד הפורטל. עבור עכברים צעירים לאחר ההולכה (עד P30), להכין שני ערכות הזרקה #1, אחד עבור צינור המרה ואחד עבור הזרקת וריד הפורטל (אין הזרקה להגדיר #2 כמו וריד הפורטל הוא צר מדי כדי להכיל צינורות PE50). - כדי להכין את ערכת ההזרקה #1, לחתוך 30 ס"מ של צינורות PE10 ולמתוח קצה אחד של הצינורות ביד על ידי משיכת אותו עד שהוא הופך דק ככל האפשר (איור 1A, B, כ 0.15 מ"מ קוטר, צינורות PE10 לא מתוח הוא בקוטר 0.6 מ"מ).
- חותכים את קצה צינורות PE10 הנמתחים באלכסון כדי ליצור קצה משופע (איור 1B).
- חבר את הקצה הלא מתוח של צינורות PE10 למחט 30 G (איור 1A, ערכת הזרקה #1).
- כדי להכין את ערכת ההזרקה #2, לחתוך 30 ס"מ של צינורות PE50 למתוח קצה אחד של הצינורות ביד על ידי משיכה אותו עד שהוא הופך דק מספיק כדי להתאים לתוך וריד הפורטל (איור 1A, B, כ 0.7 מ"מ, צינורות PE50 לא מתוח הוא בקוטר 0.96 מ"מ).
- חותכים את קצה צינורות PE50 הנמתחים באלכסון כדי ליצור קצה משופע (איור 1B).
- חברו את הקצה הלא מתוח של צינורות PE50 למחט 23 G (איור 1A, ערכת הזרקה #2).
הערה: כל ערכת הזרקה יכולה לשמש רק לזריקה אחת מכיוון שהשרף יתקשה במזרק ובצינורות. התאם את גודל הקצה המתוח והשופע בהתבסס על גודל צינור המרה המשותף וריד הפורטל של העכבר, בהתאם לגילו, הגנוטיפ והפנוטיפ שלו. כאשר לא בטוח לגבי הגודל וההתאמה של הצינורות, הכנס את הצינורות בצינור או בכלי המתאים לאחר החתירה ולפני הצינורות מלא שרף. אם הצינורות רחבים מכדי להתאים לצינור / כלי הדם, מתחו אותו עוד יותר. - מרדים את החיה על ידי שאיפת איזופלוראן (4% הראשונים בתא האינדוקציה ו ~ 2% באמצעות חרוט האף).
- הנח את העכבר על ספסל מאוורר על משטח ניתוח בזמן שהעכבר נושם איזופלוראן דרך חרוט האף. ודא כי החיה היא מחוסרת הכרה על ידי שיטה מומלצת מכון / IRB, למשל, על ידי צביטת אחת הכפות.
אזהרה: איזופלוראן עלול לגרום לנמנום או סחרחורת בעת השאיפה ועלול לגרום נזק למערכת הלב וכלי הדם ולמערכת העצבים המרכזית באמצעות חשיפה ממושכת או חוזרת ונשנית. אל תאאיפו את זה. יש לטפל בחומר על ספסל מאוורר ובאזורים מאווררים היטב.
הערה: ניתן להשתמש בשיטת נשימה אחרת, כל עוד היא תואמת זלוף לב. - ברגע שהחיה מחוסרת הכרה, רססו את הצד הגחון עם 70% אתנול כדי למנוע הפרעות מהפרווה.
- באמצעות מספריים בעור, לחתוך את העור, fascia, ואת שכבת השריר החל בקו האמצע של חלל הבטן לחתוך דרך חלל בית החזה כדי לחשוף את האיברים הפנימיים.
- תפוס את תהליך xiphoid עם מלקחיים כדי להרים את החזה לחתוך את הסרעפת ואת כלוב הצלעות משני הצדדים כדי לחשוף את הלב והריאות.
- הסר את כלוב הצלעות על ידי חיתוך דרך הצלעות בצד שמאל וימין של בית החזה עם מספריים. יש להקפיד במיוחד לא לפגוע בכבד שכן זה יגרום לדליפת השרף.
- באמצעות מלקחיים ישרים, למשוך את הלב לכיוון הכבד לחתוך את האטריום הנכון.
- הכנס מחט פרפר (23 G), מחובר משאבת זלוף peristaltic, לתוך החדר השמאלי. לחדיר את העכבר באופן transcardially עם תמיסת מלח מאוזנת Hanks (HBSS) והפרין (1 U / g של משקל גוף העכבר). לעיין במשך 3 דקות עם קצב זלוף של 5 מ"ל / דקה.
הערה: אם העכבר הוא להיות perfused כראוי, האיברים הפנימיים יהפכו חיוורים, במיוחד הכבד. אם, במקום זאת, הריאות הופכות לבנות, המחט מוכנסת לחדר הימני ויש למקם אותה מחדש. לאחר זלוף, העכבר הוא דימום וניתן להסיר מן חרוט האף ואיזופלוראן. - כבה את משאבת האיזופלוראן.
- הזרקת שרף - יציקת שרף מערכת מרה
- הזז את העכבר למיקרוסקופ הניתוח, הבטן למעלה, הזנב לכיוון הנסיין, והרחק את הראש מהנסיין. ציוני הדרך האנטומיים של עניין מתוארים באיור 2A.
- אתר את הוועד הנתון הנחות (איור 2A) על-ידי הזזת המעי לצד. השתמשו במספריים קפיציים כדי לבצע חתכה רוחבית קטנה בצמח הוועד הנחות כדי לאפשר שחרור של לחץ כלי דם כבד (איור 2Bi).
- לחשוף את צינור המרה הנפוצה ואת וריד הפורטל כמתואר בשלבים 1.2.4- 1.2.6.
- הזז את המעי והלבלב לצד ימין (של הנסיין) באמצעות תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) צמר גפן רטובה.
- הפוך את הצד הגחוני של הכבד לכיוון הלב באמצעות ספוגית כותנה רטוב PBS לחשוף את פני השטח הקרביים ואת אזור הילאר.
- אתר את צינור המרה המשותף העובר מאזור הילאר על פני הלבלב אל המעי הסוגר של אודי (איור 2Bii, צינור מרה נפוץ המסומן בקו המנוקד הצהוב, ראשי חץ שחורים מצביעים על הסוגר של אודי).
הערה: ודא הכבד לח לאורך כל ההליך על ידי התזת אותו עם PBS. - לנקות את הרקמה המקיפה (אזור ~ 5 מ"מ) מצינור המרה המשותף באמצעות מלקחיים ישרים. הניחו חוט תיל משי (גודל 4-0, 0.17 מ"מ, באורך 3 - 5 ס"מ) מתחת לצינור המרה המשותף (איור 2Bii) וקשרו קשר רופף סביב צינור המרה המשותף (איור 2Biii).
הערה: בחר אזור לקשר באמצע הדרך בין אזור הילאר לבין הסוגר של אודי ובמרחק מסוים מווריד הפורטל, כך שלאחר התפר מתהדק סביב צינור המרה המשותף, זה לא יפריע להזרקת וריד הפורטל. - החזק את מספריים האביב שטוח נגד צינור המרה המשותף כדי להפוך חתך אלחפוס לצינור המרה המשותף במקום שבו צינור המרה המשותף נכנס הלבלב והמעי ליד הסוגר של אודי. (איור 2Biv), קו מקווקו צהוב מתאר את הסוגר של אזור אודי, המודגש על ידי ראשי חץ שחורים).
הערה: זהו צעד מכריע. לעשות אלחוט ולא חתך רוחבי, ולעשות חתך; אין לנתק את צינור המרה. חיתוך דרך צינור המרה כולו הופך את החדרת הצינורות למאתגרת מאוד. - רגע לפני השימוש, מערבבים 1 מ"ל של השרף הצהוב עם 50 μL של סוכן ריפוי (על ידי מילוי וריקון מזרק 1 מ"ל) ולמלא מזרק Luer 1 מ"ל עם תערובת סוכן שרף - ריפוי.
- חבר את המזרק המלא עם הצינורות (סט #1). לחץ על הבוכנה כדי למלא את הצינורות לחלוטין. ודא כי סוכן שרף / ריפוי לערבב טפטוף מקצה הצינורות.
הערה: יש להימנע ולהסיר בועות במזרק ובצינורות לקבלת התוצאות הטובות ביותר. - באמצעות מלקחיים, יישרו את האזור סביב תעלת המרה הנפוצה והכניסו את הצינורות לפתח בצינור המרה המשותף (איור 2Bv), כאשר הקצה הארוך ביותר של הקצה המגולע כלפי מטה לכיוון הצד הגבי של צינור המרה. כיוון זה מבטיח שהשרף יוכל לצאת מפתח הצינורות, הפונה כלפי מעלה, אל התעלה (איור 2Bv).
- הדקו את קשר חוט המשי כדי לאבטח את הצינורות בתוך צינור המרה המשותף (איור 2Bvi).
- הזריקו את השרף לצינור המרה המשותף. שימו לב לשלפוחית המרה ולאונות הכבד הבודדות.
- יש לעסות את הכבד עם צמר גפן רטוב PBS כדי לעזור להפיץ את השרף באופן שווה. ענפי הטרמינל של תעלות מרה מלאות שרף (בעכברים מסוג בר) נראים קלושים על פני הכבד.
הערה: הזמן הצפוי למלא את הכבד הוא 30 -100 s. - הפסיקו להזריק את השרף כאשר נקודות שרף מופיעות על פני הכבד (איור 2Ci, ראשי חץ כחולים) או כאשר ההתנגדות מתקיימת.
הערה: לעבוד מהר ככל האפשר מאז השרף מתחיל להקשיח לאחר הוספת סוכן ריפוי שרף. זמן העבודה מהוספת סוכן הריפוי הוא כ-15 דקות. - הסר את הצינורות על ידי משיכת אותו מתוך צינור המרה המשותף במהירות להדק את קשר המשי באמצעות מלקחיים כדי למנוע את השרף מדלוף החוצה. חותכים את הקצוות הרופפים של תפר המשי, כך שהם לא מפריעים להזרקת וריד הפורטל.
- יש להיפטר מהצינורות המכילים שרף ואת השרף הנותר לפסולת המסוכנת והמחט לפסולת החדות.
- הזרקת שרף - יציקת שרף וריד פורטל
- נקה את וריד הפורטל (שטח ~ 5 מ"מ) מהרקמה הסובבת אותו כ -2 ס"מ מכניסתו לכבד באמצעות מלקחיים ישרים. הניחו חוט תפר משי (גודל 4-0, 0.17 מ"מ, באורך 3 - 5 ס"מ) מתחת לאזור המנוקה של וריד הפורטל (איור 2Ci) וקשר קשר רופף (איור 2Cii).
- בצעו תותח אורך בעורק השער כדי לגעת בכבד ובקשר (איור 2Ciii).
- מערבבים 1 מ"ל של שרף ירוק עם 50 μL של סוכן ריפוי (על ידי מילוי וריקון מזרק 1 מ"ל) ולמלא את מזרק 1 מ"ל Luer עם תערובת סוכן ריפוי שרף.
- חבר את המזרק המלא עם הצינורות (להגדיר #2 עבור עכברים >P30, קבוצה חדשה #1 עבור
הערה: יש להימנע ולהסיר בועות במזרק ובצינורות לקבלת התוצאות הטובות ביותר. - באמצעות מלקחיים, יישרו את וריד השער על ידי משיכת הרקמה המקיפה לכיוון הנסיין והכניסו את הצינורות לקצה הארוך ביותר של הקצה המ משופע לכיוון הצד החלקי של הכלי (איור 2Ciii).
- הדק את חוט המשי כדי לאבטח את הצינורות בווריד השער.
- הזרק את השרף לווריד השער. שימו לב שכלי הדם מתמלאים בשרף. יש לעסות את הכבד עם צמר גפן רטוב PBS כדי לעזור להפיץ את השרף באופן שווה (איור 2Civ).
- להפסיק להזריק את השרף כאשר כל כלי הדם מלאים (קצוות של ורידים פורטל נראים בפריפריה הכבד) או כאשר ההתנגדות מתקיימת.
הערה: לעבוד מהר מאז השרף מתחיל להקשיח לאחר התוספת של סוכן ריפוי. זמן העבודה מהוספת סוכן הריפוי הוא כ 15 דקות עבור ערכת הזרקה #1 ו 25 דקות עבור ערכת הזרקה #2. - הסר את הצינורות על ידי הוצאת הצינורות מן הווריד הפורטל במהירות להדק את קשר המשי באמצעות מלקחיים כדי למנוע את השרף מדלוף החוצה.
- יש להיפטר מהצינורות המכילים שרף ואת השרף הנותר לפסולת המסוכנת והמחט לפסולת החדות.
- ניתוח כבד קיבוע
- לנתח את כל הכבד על ידי חיתוך אותו מן הרקמה שמסביב ואת הסרעפת.
- מניחים בעדינות את הכבד כולו בצינור חרוט ריק של 50 מ"ל כאשר הצד הגחון פונה כלפי מעלה והצד הגבי נח על קיר הצינור החרוט כדי למנוע עיוות של הכבד. יש לאחסן את הצינור החרוט אופקית למשך הלילה ב-4 °C (60°F) כדי שהשרף יתקשה לחלוטין.
הערה: כל מיכל גדול מספיק כדי להתאים את הכבד ניתן להשתמש במקום צינור חרוט 50 מ"ל. שימוש במיכל תחתון שטוח יגדיל את הסבירות שהכבד אינו מעוות. - להפריד את הכבד לאונות בודדות. לעשות מבחר של האונות שישמשו לניתוח microCT (1.4.4-1.4.5) או בקרת איכות (1.4.6-1.4.8). לחלופיה, יש להשתמש בכבד כולו הן עבור ניקוי אופטי והן עבור microCT מבלי להפריד אותו לאונות בודדות.
הערה: ארכיטקטורת הכבד של מערכות המרה וכלי הדם שונה בכל אונה, ולכן נדרשים ניתוחי אונה תואמים. הסליקה האופטית אינה מפריעה לסריקת מיקרו-CT, וניתן לסרוק לאחר מכן את האונות המשמשות לבקרת איכות באמצעות microCT. לעומת זאת, דגימות שנסרקו עם microCT ניתן לנקות אופטית לאחר מכן להשוואה. ניתוח הכבד כולו אפשרי. בעכברים מסוג בר (רקע גנטי C3H/C57bl6), האונה המהונדסת הימנית מתמלאת תחילה על ידי זריקות שרף, מה שהופך אותה לאונת מתאימה לניתוח מיקרו-CT, עם יכולת הרבייה הגבוהה ביותר. האונה לרוחב השמאלית היא האונה הגדולה ביותר, שבה היא ולכן היא פשוטה למסך מראש לאיכות הזרקה. הבחירה של האונה (או הכבד כולו) המשמש לבקרת איכות וסריקת מיקרוCT תלויה במודל החי ושאלת המחקר. - במכסה המנוע מאוורר, להכין 4% פתרון פורמלדהיד (10-20 מ"ל לכל צינור). תקן את האונות המשמשות למיקרו-סי-טי עם 4% פורמלדהיד לילה ב-4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף פעם אחת עם PBS (10-20 מ"ל לכל צינור).
- לאסוף פסולת פורמלדהיד במיכל נפרד. שמור את אונות הכבד ב- PBS ב-4 °C לאחסון לטווח קצר או 70% אתנול לאחסון לטווח ארוך. המשך עם סעיף 2: טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו.
אזהרה: פורמלדהיד גורם לרעילות חריפה אם הוא נבלע, נשאף או במגע עם העור. פורמלדהיד הוא נוזל דליק ואדים. זה גורם לכוויות עור חמורות ונזק לעיניים. עלול לגרום לתגובת עור אלרגית. קטלני אם נשאף (מרוכז או באבקה). עלול לגרום לגירוי נשימתי. חשוד בגרימת פגמים גנטיים. עלול לגרום לסרטן. גורם נזק לאיברים (עיניים, מערכת העצבים המרכזית). הצהרות זהירות - יש להרחיק מחום, משטחים חמים, ניצוצות, להבות פתוחות ומקורות הצתה אחרים. אסור לעשן. ללבוש כפפות מגן וביגוד מגן. במקרה של שפיכה, מיד להוריד את כל הבגדים שהיו מזוהמים. אם במגע עם העור: לשטוף את האזור המזוהם עם מים. אם בשאיפה: יש להסיר את האדם לאוויר הצח ולנטר את הנשימה אם נוח. מיד להתקשר למרכז רעל / רופא. אם בעיניים: לשטוף את העיניים במים במשך כמה דקות. אם קיים ואפשרי, הסר עדשות מגע. - לבקרת איכות, תקן את האונות הנותרות (לפחות אחת) עם 50% מתנול (מעורבב עם מים דה-יוניים) למשך 4 שעות לפחות, מתנדנד בטמפרטורת החדר, ואחריו 100% מתנול לילה מתנדנד בטמפרטורת החדר. לאסוף פסולת מתנול במיכל נפרד.
אזהרה: מתנול גורם לרעילות חריפה אם הוא נבלע, נשאף או במגע עם העור. מתנול הוא נוזל דליק ואדים. ללבוש כפפות מגן ובגדים. יש להימנע מנשימה בעת הטיפול ולהימנע מאש וחום. יש לשטוף את העור ביסודיות לאחר השימוש. במקרה של שפיכה, מיד להוריד את כל הבגדים המזוהמים. יש לשטוף את העור במים. אם בשאיפה: יש להסיר את האדם לאוויר צח ולשמור על נוחות לנשימה. במקרה של שאיפה, בליעה או חשיפה, יש להתקשר למרכז רעל/רופא. - בברדס מאוורר, להכין בנזיל אלכוהול בנזיל בנזואט (BA: BB, 1:2) (5 -10 מ"ל לכל אונה) פתרון.
- מניחים את אונת הכבד בצינור פוליפרופילן 15- או 50 מ"ל (בהתאם לגודל האונה) המכיל פתרון BABB. השאירו אותו מתנדנד בטמפרטורת החדר עד שקוף. שלב זה יכול לקחת בין 2-16 שעות בהתאם לגודל האונה.
הערה: פתרון BABB ממיס סוגים מסוימים של פלסטיק. זה בטוח לאחסן את הדגימות צינורות פוליפרופילן או מיכלי זכוכית.
אזהרה: בנזיל בנזואט יכול לגרום רעילות חריפה כאשר נבלע. זה רעיל לחיים ימיים עם השפעות ארוכות טווח. הצהרות זהירות: לשטוף את העור ביסודיות לאחר הטיפול. זה מזיק כאשר נבלע, במגע עם העור, או בשאיפה. הימנע נשימה אדים / אדים. יש לשטוף ידיים ביסודיות לאחר הטיפול. אין לאכול, לשתות או לעשן בעת השימוש במוצר זה. במקרה של בליעה - יש להתקשר למרכז רעל/רופא אם אין לו טוב יש להשתמש באזורים מאווררים. לאסוף שפיכה. יש להיפטר מתכולה/מיכל למפעל סילוק פסולת מאושר. - בדוק את איכות הזריקה. רק כבד מוזרק היטב צריך להיות נסרק עם microCT.
2. טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת
- הכנת דוגמה
- הכן 1% ג'ל אגרוז על ידי ערבוב 100 מ"ל של מים מזוקקים ו 1 גרם של אבקת אגרוז. מניחים את התערובת במיקרוגל ומרתיחים את התמיסה עד אבקת אגרוז מתמוססת.
- מזג את ג'ל אגרוז 1% עד ~ 40 °C (50 °F) כדי למנוע נזק תרמי לדגימת הכבד.
- מניחים את האונה (ים) של עניין בצינור חרוט 15 מ"ל ולמלא אותו עם ג'ל אגרוז 1% לכ 2/3 של הנפח הכולל של הצינור. שלב זה ממזער תנועה מדגמית לא רצויה במהלך מדידת CT.
- מדידת CT
הערה: השלבים הבאים תלויים בהתקן CT, והגדרות ופעולות ספציפיות עשויות להיות שונות עבור התקני CT ויצרנים שונים. בפרוטוקול זה, סורק הטומוגרפיה במיקרו-מחשבים בו נעשה שימוש צויד בצינור רנטגן ננו-פוקוס (180 kV/15 W), ובדידות CT דינמיות בעלות פאנל שטוח 41|100 (4048 px x 4048 px, גודל פיקסל 100 מ"מ עם binning 2) למדידות ה-CT.- הר את הצינור החרוטי 15 מ"ל עם המדגם בשלב הסיבוב של התקן CT ולאפשר לו להסתגל תרמית לתא המדידה לפחות 1 שעה.
- כאשר המדגם מותאם תרמית, מרכז אותו בשדה הראייה (FOV).
- מטב את מרחקי דגימת המקור וגלאי הדגימה (SSD, SDD) כדי להגיע לרזולוציית ווקסל מספקת, למשל, 12 מיקרומטר לדגימת כבד מורינית בוגרת או 6.5 מיקרומטר לכבד
- הגדר את פרמטרי הרכישה (כלומר, האצת מתח וזרם, חשיפה, binning, ממוצע) בעקבות המלצות יצרן התקן CT כדי להגיע לרמה מספקת של אות שזוהה. פרמטרים אלה אינם תלויי התקן CT אלא גם תלויי דגימה ויש למטב אותם עבור כל דגימה. ב Hankeova et al.9, ההגדרות היו: 80 kV האצת מתח, 160 μA האצת זרם, זמן חשיפה 400 ms, ו 2000 תמונות.
- התחל מדידת CT. השתמש בתוכנת שחזור טומוגרפית ייעודית כדי לשחזר את נתוני ה- CT.
3. ניתוח פילוח נתונים
הערה: השלבים הבאים הם תלויי תוכנה לעיבוד תמונה; הגדרות ופעולות ספציפיות עשויות להשתנות בהתאם לתוכנה שבה נעשה שימוש.
- טעינת נתוני ה- CT: בחר קובץ > הפקודה ייבוא >. בחירה נוספת תלויה בתבנית הספציפית של נתוני ה- CT שיש לעבד.
- השתמש בפונקציה קביעת משטחים בחלונית העליונה כדי לפלח את השרף בנתונים באמצעות סף כללי. בחלון הדו-שיח, קבע את ערך הסף עם הערכת היסטוגרמה על-ידי הגדרת המיקום של הקו האדום "Isovalue" לפלח רק את כלי השיט המלאים בשרף (כלומר, המקיף את הקו הצהוב ב"חלונית התצוגה המקדימה") (איור 3A).
- בחלונית הימנית, בחר במודול יצירת החזר על הוצאות מנפח/CAD/רשת מחדש כדי ליצור אזור עניין (ROI) של כלי השיט המלאים שרף. בחלון הדו-שיח, השתמש באפשרות יצירת ROI(s) ממוצק, בחר את שם אמצעי האחסון המעובד ואשר.
- בטל פילוח שגוי של אשכולות רעש באזור הרקע של ROI זה. סמן את ההקלה על ההון על ההון בלוח הימני, לחץ עליו באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר את המודול פיצול ROI.
- בחלון הדו-שיח, הגדר את הפרמטר Minimum Volume [voxel] כדי לא לכלול את כל חלקיקי הרעש - ערך זה הוא ניסוי ותלוי נתונים ויש למטב אותו לניתוח כל דגימה (איור 3B).
- צור מסכות תעלה חלקות, רציפה ומוצקות ללא ממצאים ב- ROI יצוק שרף - למשל, נוכחות של בועות אוויר או דליפת שרף.
- בחלונית השמאלית, השתמש במודול החלקה, הגדר את הפרמטר Smoothing Strength ל- 1 או 2 (בהתאם לנתונים הבודדים, כאשר ערכים גבוהים יותר עלולים להוביל לעיוות מודל, במיוחד בעת התמודדות עם מבנים עדינים). במידת הצורך, הפעל תהליך זה פעמיים (איור 3C).
- זהה והפרד את המערכות הצינוריות הבודדות במסכת השרף המפולחת.
- צור החזר על הוצאות עלמה נפרד עבור המערכת מלא שרף קל יותר (שרף צהוב המשמש להזרקת צינור המרה הנפוצה) עם ערכי עוצמה גבוהה יותר בנתוני CT. בצע את ההליך המתואר בשלב 3.2. (איור 3די).
- סמן את החזר על ההחזרים החדש ואת מסכת השרף החזר על ROI, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הפחת החזר על ההחזר על ההחזר על עצמו והפחת את החזר על ההחזרה החדש ממסיכת השרף ROI כדי ליצור החזר על ROI חדש למערכת הצינורית הנותרת (איור 3Dii, iii).
- יצא את ה- ROIs המתקבל עבור שתי המערכות הצינוריות בפורמטים שונים, בהתבסס על העדפות המפעיל, לעיבוד עוקב בתוכנות שונות. יתר על כן, לעבד את ההמחאות המתקבלות בתוכנת גרפיקה של אמצעי אחסון כדי לייצא את הפריט החזותי הסופי בצורה של תמונה או וידאו.
Representative Results
מה לעשות
הזרקת שרף כפול מוצלחת מושגת כאשר הן צינורות מרה תוךhepatic ו vasculature וריד הפורטל מלאים היטב. כצעד בקרת איכות, ניקוי אונה אחת (למשל, האונה לרוחב השמאלית) מאפשר אימות של זריקה מוצלחת, ואחריו הדמיה של אונות עניין. האונה המנוקה אופטית ניתן לסרוק מאוחר יותר באמצעות microCT; לכן ניתן לנקות אופטית את הכבד כולו. בכבד עכבר מוזרק היטב, יש למלא את כלי ההשחתה של וריד הפורטל בשרף עד שפריפריית הכבד והשרף יהיו גלויים בענפים צדדיים (איור 4), וארכיטקטורה זו משוחזרת בנאמנות בנתונים סרוקים ומפולחים של מיקרו-CT. יתר על כן, צינורות מרה תוך-הפטיים מוזרקים היטב צריכים להיות גלויים ליד ענפי וריד הפורטל הראשי המשתרעים כמעט לפריפריה, ושרף צריך להיות גלוי בענפים הצדדיים העיקריים. אם אונת הבקרה עוברת את שלב בקרת האיכות, ניתן לסרוק את האונות העניין (כולל אחת שנוקתה אופטית) באמצעות microCT. התוצאה של הנתונים המפולחים מהכבד המוזרק היטב מוצגת עבור עכבר P15 (איור 4A,B) ועכבר בוגר (איור 4C, D).
מה לא לעשות
רקמת כבד שלמה היא תנאי מוקדם להזרקה מוצלחת. יש להקפיד במיוחד בעת חיתוך חלל הבטן והסרעפת לא בטעות לחתוך את רקמת הכבד. אם יש נזק פיזי לכבד במהלך הליך זה, סביר מאוד שהשרף ידלוף החוצה במהלך הזרקת ורידים בפורטל (איור 5A). לא ניתן להשיג זריקה טובה של מערכת כלי הדם אם הכבד פגום פיזית.
אחת הטעויות הנפוצות היא מילוי הכבד עם שרף שיכול להוביל אתגרים להדמיה או ניתוח. אחד הגורמים למילוי המערכת הוא התקשות שרף בטרם עת במחט או בקצה הצינורות לפני השלמת ההזרקה (איור 5B, ראשי חץ כחולים, סוגריים מתארים בועות גדולות). תרגול טוב הוא להשתמש סט זריקה אחד לכל בעל חיים ולעבוד מהר לאחר סוכן ריפוי מתווסף שרף. אם השרף מתקשה במהלך ההזרקה (אשר ניתן לראות על ידי מערכת חצי מלאה, כאן לידי הדגמה עם vasculature וריד פורטל מלא למחצה) להסיר את הצינורות, לחתוך את קצה הצינורות (תמיד באלכסון כדי ליצור קצה משופע), ולדחוף את הבוכנה. אם שרף מתחיל לטפטף שוב, בזהירות להכניס מחדש את הצינורות ולאבטח אותו עם התפירה. אם השרף התקשה במחט, החלף את הצינורות לחלוטין, מלא אותו בשרף (הימנעות מבועות), הכנס מחדש בזהירות את הצינורות, ואבטח אותו עם התבר. זה יכול להיות מאתגר להחליף את הצינורות, במיוחד בעכברים צעירים לאחר ההולכה
לעומת זאת, אחת מהמערכות, או שתיהן, מתמלאות יתר על המידה בשרף (איור 5D). יש צורך לפקח חזותית על הכבד לאורך כל ההזרקה. יציקת מערכת מרה עם שרף היא מאתגרת יותר מאשר יציקת שרף וריד פורטל מאז צינורות מלאים שרף נראים רק קלוש על פני הכבד, וקשה להעריך מתי המערכת היא כמעט מלאה ומתי להפסיק. כאשר נקודות שרף צהובות קטנות מופיעות על פני הכבד (איור 2Ci, ראש חץ כחול), זהו סימן לכך שמערכת המרה מלאה לחלוטין, והשרף מתחיל לדלוף מהתעלות. ניתן לתקן באופן ידני דליפת שרף קלה במהלך פילוח נתוני מיקרו-CT (איור 5D, לוחות ימניים).
אם לחץ ההזרקה גבוה מדי, הדבר עלול לגרום לקרע בכלי שיט או תעלות (איור 5E), לארכיטקטורת כלי שיט או צינור מזיקים באופן בלתי הפיך. הכבד לא יתאים לסריקה או לניתוח מיקרו-CT. כדי להימנע ממילוי יתר של שרף, מיטוב הנפח והלחץ הנכונים המשמשים להזרקה בכל דגם עכבר. כאשר עובדים עם עכברים כי כבר מאותגרים עם דיאטה רעילה, שינוי גנטי, או פגיעה בכבד המשפיעה על מערכות מרה או ורידים, או נוקשות הכבד, לחץ ההזרקה ואת נפח ייתכן שיהיה צורך להתאים כמו נפח ולחץ נסבל עשוי להיות שונה עכברים סוג הבר. פרוטוקול זה מתאר את ההזרקה הידנית של שתי המערכות, אך ניתן לחבר את המזרק למשאבה כדי לתקנן את לחץ ההזרקה. בועות הן עוד חפץ הזרקה נפוץ מאוד שמוביל למילוי דליל של הרשתות הצינוריות (איור 5F-H, ראשי חץ כחולים). כדי למנוע היווצרות בועה, ודא כי המזרק ואת הצינורות אינם מכילים שום בועות, מלאים לחלוטין שרף, ואת השרף נוטף מקצה הצינורות לפני ההזרקה. בועות קטנות המופיעות כאזורים שליליים בנתוני המיקרוCT ניתנות לתיקון ידני במהלך שלבי לאחר העיבוד, אם כי הדבר מייגע.
טרי הוא הטוב ביותר
שימוש בשרף צהוב טרי הוא גורם מכריע, המשפיע באופן משמעותי על הניגודיות של שני השרפים ועל פילוח נתוני המיקרוCT. כאשר נעשה שימוש בשרף שנפתח זה עתה (איור 6A) יש הבדל ברור בניגוד בין צינורות המרה הצהובים המוזרקים שרף (לבן בהיר) לבין ורידים ירוקים שהוזרקו שרף (אפור בהיר). כבד המוזרק עם שרף טרי מעובד בקלות באמצעות סף גלובלי אוטומטי. עם אחסון ממושך, השרף מזרז, והחנידות פוחתת. לאחר 3 חודשים של אחסון, הניגודיות עדיין יכולה להספיק כדי להבחין בין וריד הפורטל לבין צינור המרה (איור 6B), אך משקעים משפיעים על ערבוב שני השרפים, הנראים כאטימות הטרוגנית בווריד הפורטל המלא (איור 6B, ראשי חץ כחולים). ניגוד הטרוגניים משפיע לרעה על הסף האוטומטי ומחייב תיקונים ידניים, מה שמגדיל את זמן העיבוד. אם השרף ישן משישה חודשים, הניגודיות הושחתה עד לנקודה שבה לא ניתן להבחין בין צינור המרה שהוזרק בצהוב לבין וריד הפורטל שהוזרק בירוק בהתבסס על הניגודיות שלהם בלבד (איור 6C). במקרה זה, צינור המרה וריד הפורטל חייב להיות מקוטע באופן ידני בהתבסס על הקוטר שלהם ואת המיקום באזור הילאר ועקב באופן ידני לאורך כל נתוני microCT. הליך זה הוא מאוד זמן רב ועדיף להימנע.
איור 1: ערכת הזרקה ליהוק שרף. (A) ערכת הזרקה #1 כוללת מחט 30 G וצינורות PE10 באורך ~ 30 ס"מ. סט הזרקה #2 מורכב מחט 23 G וצינורות PE50 ~ 30 ס"מ. (B) קצה הצינורות נמתח וחתוך בזווית כדי ליצור קצה משופע. הסרגל ב- A ו- B הוא סרגל סנטימטר, עם תוספת משמעותית של 1 ס"מ, תוספת ביניים של 5 מ"מ, והמרווחים הקטנים של 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרשים זרימת יציקה כפול של שרף. (א) סכמטי המציג את מערכת הדם ורידית מורין ואת הלב עם אטריום ימני מודגש, אשר צריך להיחתך לפני זלוף, ואת החדר השמאלי שבו המחט יש להכניס עבור זלוף לשטוף את הדם ממערכת הדם. הוועד הנתון הנחות צריך להיות מנותק מתחת לכליות כדי להקל על לחץ כלי הדם. (B) תרשים זרימת הזרקת שרף צינור מרה. (i) תמונת זום של (A) המתארת היכן לנתק את ה- IVC. (ii) תמונה המתארת את צינור המרה המשותף (קו מקווקו צהוב) מאזור הכבד הילאר אל הסוגר של אודי (ראשי חץ שחורים), עם חוט תפר מתחת לצינור המרה המשותף שפונה. (iii) מיקום מתאים לקשר רופף סביב צינור מרה משותף. (4) הקו המנוקד הצהוב וראשי החצים השחורים מתייגים את הסוגר של אודי, ומדגים את הזווית האלקטרולית לחתיכה וכיצד הפתח צריך להופיע לאחר חתכת הזווית האלקטרומלית. (v) סכמטי המדגים את הכיוון של פתח שיפוע הצינורות PE10 (כלפי מעלה) עם הכניסה. (vi) מראה של שרף צהוב מוזרק; שרף צריך בקלות לעבור את הקשר קשור באופן רופף. IVC, וונה קאווה נחותה; CBD, צינור מרה משותף. (C) תרשים זרימת שרף וריד פורטל. (i) הקו המקווקו הירוק מסמן את וריד הפורטל מאזור הילאר. ראשי החצים הכחולים מתייגים את מערכת המרה המולאה יתר על המידה. (ii) מיקום מתאים לקשר רופף סביב וריד הפורטל. (iii) סכמטי המדגים את פתיחת שיפוע (כלפי מעלה) עם הכניסה. (4) הופעת כבד בהזרקת שרף ירוק ושרף צהוב; שימו לב לכלי הדם המלא שרף בפריפריה הכבדית. PV, וריד פורטל. איור 2A נוצר עם Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עיבוד נתוני Micro CT בתוכנת גרפיקת נפח. (A) קביעת פני השטח, (i) איזו-ערך מוערך יתר על המידה (תצוגה מקדימה נוכחית של בחירה מוצגת בצבע צהוב), (ii) איזו-ערך מוערך, (iii) בחירה אופטימלית של isovalue לקביעת משטח נכונה של צינורות ורידים ומרה פורטל. (ב) פיצול אזור עניין (ROI) שנוצר על-ידי קביעת פני השטח, (i) הגדר את הערך בחלון הדו-שיח גבוה מספיק כדי שרק מקטע אחד (הגדול ביותר) יישאר, (ii) במסגרות צהובות מוצגים החלקיקים הקטנים יותר (לא כלולים). (C) החלקת משטח של הנתונים, (i) פונקציית החלקה נמצאת בחלונית השמאלית, (ii) להגדיר את עוצמת ההחלקה ל-1 (מקסימום 2) וליצור ROI חדש החלק, (iii) נתונים חלקים. (D) הפרדה של מערכות צינוריות בודדות, (i) בפונקציית קביעת פני השטח קבעה את isovalue כך שרק מערכת המרה כלולה בבחירה (תצוגה מקדימה נוכחית של הבחירה מוצגת בצבע צהוב), (ii) לסמן את ה- ROI של שתי המערכות ואת ROI של מערכת המרה בלבד ומערכת המרה לחסר ROI של ROI של שתי המערכות, (iii) וריד הפורטל מוצג באפור, מערכת המרה המוצגת בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מערכות צינור מרה (BD) וריד פורטל (PV) מוזרקות היטב. (A) ניקוי אופטי של האונה הימנית המהודדת (RML) של הכבד לאחר האונה 15 (P15) שהוזרק עם שני שרפים לשתי המערכות. סרגל קנה מידה 1 מ"מ. (B) עיבוד תלת-ממדי של P15 RML המוצג (A) המתאר כלי ורידים בפורטל במערכת לבנה ומרה בירוק. מוט קנה מידה 1 מ"מ. (C) RML פינה אופטית של כבד בוגר מוזרק עם שני רפים לתוך שתי המערכות. סרגל קנה מידה 1 מ"מ. (D) עיבוד תלת-ממדי של RML למבוגרים המוצג (C) המתאר vasculature וריד הפורטל במערכת לבנה ומרה בירוק. H = הילאר, P = היקפי. סרגל קנה מידה 1 מ"מ. לוחות A, B, D מותאמים באישור מ Hankeova et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אתגרים נפוצים של הזרקות כבד שרף כפול. (א) התמונה מתארת כבד שנחתך בטעות במהלך הפתיחה הראשונית של חלל הבטן, והשרף דולף דרך החתך (ראש חץ כחול). (B) מערכת ורידים פורטל מוזרק בצורה גרועה עקב התקשות שרף. ראשי חץ כחולים מתייגים ענפי מסוף ריקים, ו בסוגריים מרובעים אדומים מתייגים בועות גדולות. סרגל קנה מידה 1 מ"מ. (C) מערכת ורידים פורטל מוזרק בצורה גרועה עקב זלוף עירוי קרדית לקוי. ראשי חץ כחולים מתייגים דם הנראה בענפי המסוף. מוט קנה מידה 1 מ"מ. (D) מערכת מרה ממולאת יתר על המידה המתבטאת בכדורי שרף מבודדים. החלוניות השמאליות מציגות את הכבד המנוקה אופטית, והפאנלים הימניים מציגים את התמונה המעובדת של מיקרו-סי-טי תלת-ממדי. קווי המתאר הכחולים המנוקדים מתארים אזורי הגדלה. ראשי החצים השחורים מתייגים חלק מהכבד שנפגע במהלך הסליקה האופטית לאחר סריקת מיקרוCT. סרגל קנה מידה 1 מ"מ. (E) לחץ גבוה במהלך הזרקת שרף יכול לגרום לקרע של וריד הפורטל (החיה בלוח זה נושא מוטציה Jag1H268Q), מסומן על ידי ראשי חץ כחולים. סרגל קנה מידה 1 מ"מ. (ו) בועות בשרף במהלך הזרקת וריד הפורטל (ראשי חץ כחולים) ו -(G) הזרקת מערכת מרה (ראש חץ כחול), סרגל קנה מידה 1 מ"מ. (H) סריקת MicroCT של בועות (ראש חץ כחול), ענפי מסוף מלאים בצורה גרועה (סוגריים אדומים) ודליפת שרף (ראש חץ צהוב), סרגל קנה מידה 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניגודיות שרף דיפרנציאלית. (A) שרף צהוב שנפתח זה עתה יוצר ניגודיות מספקת כדי להבחין בין וריד פורטל מוזרק שרף (אפור) וצינורות מרה (לבן). (B) אחסון של שלושה חודשים של שרף צהוב להוביל משקעים של השרף וכתוצאה מכך אטימות הטרוגנית (וריד פורטל אפור-לבן, ראש חץ כחול). (ג) אחסון ממושך (>6 חודשים) של שרף צהוב מפחית את הניגוד בין וריד הפורטל (אפור) לבין צינורות המרה (אפור). סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
מספר שלבים קריטיים קובעים הצלחה DUCT, מהכנה לדוגמה לפרמטרים של התקן CT. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, יש להשתמש בשרף מנוגד היטב, מוזרק היטב וללא בועות כדי לאפשר עיבוד דיגיטלי פשוט עם סף אוטומטי כדי להשיג נתונים תלת-ממדיים, תמונות וסרטים. עם אימון ועקבות פרוטוקול זה, 90% של זריקות מוצלחות וכתוצאה מכך נתונים לשחזור. חשוב להשתמש שרף צהוב טרי כדי להשיג את הניגוד הטוב ביותר בין שתי מערכות מוזרק. לשרף הצהוב יש רדיו-תחלואה חזקה מאוד, בעוד שלשרף הכחול יש רדיו-תחלואה בלתי ניתנת לגילוי. התוצאות המובילות מושגות בשלושת החודשים הראשונים לאחר פתיחת בקבוק שרף צהוב חדש. עם הזמן, שרף מזרז, ולאחר אחסון ארוך יותר (>6 חודשים), את השרף הצהוב והירוק כבר לא יהיה להבחין בסריקות CT. תמונות עם ניגודיות לקויה מחייבות מעקב ידני נרחב וגוזל זמן רב וסגמנטציה של שתי המערכות. הבא, צינורות מתוחים היטב הוא הכרחי כדי להתאים לתוך צינור המרה המשותף של עכברים בוגרים צינור מרה משותף וריד פורטל של עכברים לאחר ה לידתי. נקודת הכניסה של הזריקה חייבת להיווצר בזהירות. אם צינור המרה המשותף נחתך לרוחב, סביר להניח שהוא יתנתק מהרקמה שמסביב, ולמנוע כניסה מוצלחת של הצינורות. שלב זה עדין במיוחד לעכברים לאחר הלידה שבה צינור המרה המשותף נסוג ו"מתכרבל "אם הוא התנתק מהרקמה הסובבת אותו, מה שהופך את החדרת הצינורות למאתגרת ביותר. הכניסה הנפוצה צינור המרה והזרקה עשוי לדרוש קצת תרגול. בעת הכנת הצינורות עם שרף ולאורך כל ההזרקה, הימנע היווצרות בועה כמו בועות ייצרו מרחב שלילי בתמונות CT ודורשים זמן רב תיקון ידני. חשוב לעסות בעדינות את הכבד על ידי גלגול על פני השטח שלו עם צמר גפן רטוב במהלך ואחרי הליך ההזרקה כמו זה מקל אפילו שרף מתפשט. לאחר השלמת הזרקה והסרת הצינורות, יש להדק את קשר תפר המשי במהירות ובזהירות, כך שהשרף אינו זורם מהכבד לפני שהוא מתמלא לחלוטין. עבור הדמיית microCT מוצלחת, המדגם חייב להיות קבוע כראוי במקום עם agarose ו מותאם תרמית כדי לחסל ממצאי תנועה בנתוני CT. הגדרות הרכישה הן גם בעלי חשיבות מרכזית, אשר צריך להיות אופטימיזציה כדי להגיע לפתרון מרחבי הולם כדי לפתור מבנים בסדר.
שינויים טכניים בהליך ההזרקה ניתן לבצע כדי להשיג הזרקה בעכברים צעירים. נכון לעכשיו, יציקת שרף של כבדי עכבר צעירים מוגבלת על ידי הזמינות של צינורות דקים מספיק, עם PE10 להיות הצינורות המסחריים הזמינים הקטן ביותר. Tanimizu ואח ' הזריק בהצלחה דיו פחמן לתוך יום עוברי 17 (E17) צינור מרה משותף באמצעות נימי זכוכית11. בדיקה עתידית אם שרף יכול להיות מועבר באמצעות נימי זכוכית ולכן יהיה עניין. DUCT הותאם עוד יותר להזרקת מערכות צינוריות אחרות כגון דרכי הנשימה ו vasculature עורק הריאות של הריאות9. הזרקת שרף כפול יכול גם להיות שונה כדי לשמש עם צפים אחרים זמינים מסחרית, או פרוטוקול זה יכול לשמש עבור זריקות עם דיו פחמן.
אחד הגורמים המגבילים העיקריים של צינור צינור הוא צמיגות שרף. צינור יכול לשמש רק עבור יציקת שרף של מבנים צינוריים מעל קוטר של 5 מיקרומטר. בערכת נתונים זו, השרף יכול לחדור צינורות עם הקוטר הקטן ביותר של 5μm9. מגבלת גודל זו מונעת ניתוח של ductules בסדר נימים קטנים. כדי לקדם עוד יותר את צינור DUCT לכלי קליבר קטנים יותר, שרפים אחרים הזמינים מסחרית צריכים להיבדק, או פיתוח של סוכני רדיו-צמיגות נמוכה חדשים עשוי לשפר את חדירת לומן.
ב Hankeova et al.9, DUCT הושווה לשתי טכניקות נפוצות אחרות, זריקות דיו פחמן כפול ואחריו ניקוי רקמות וצילום סטנדרטי, ו- iDISCO + עם כתמים של כלי הדם עם אקטין תא שריר חלק אלפא צינורות מרה עם ציטוקרטין 7, ואחריו הדמיה 3D9. DUCT השיג ביצועים טובים יותר משתי השיטות האחרות במונחים של ניתוח כפול (שהיה מאתגר עבור iDISCO+ עקב אוטופלואורסצנטיות כבד גבוהה), הדמיה תלת-ממדית וכימות (לא אפשרי עם הזרקת דיו פחמן), ולומניזציה (DUCT מספק נתונים עבור ארכיטקטורת לומן הפנימית זלוף המערכת). כפי שהוזכר לעיל, המגבלה העיקרית של DUCT היא גודל לומן המינימלי שניתן להזריק וניתוח (מגבלת 5 מיקרומטר), פרמטר שבו הן הזרקת דיו פחמן ו- iDISCO + ביצעו טוב יותר. DUCT עדיף על יציקת שרף מערכת אחת3,5,6 מכיוון שהוא מאפשר ניתוח של כל מערכת מוזרקת בנפרד וגם מאפשר חקירה תלת-ממדית כפולה כדי לחקור את היחסים האדריכליים בין שתי המערכות.
צינור ניתן להחיל כדי ללמוד כל שתי רשתות צינוריות בתלת-ממד. כהוכחה לעיקרון, DUCT שימש כדי לדמיין את מערכות ורידי המרה הכבד ואת עורק הריאות vasculature ודרכי הנשימה בריאות9. צינורות המרה התוך-היפים מתפתחים בסמוך לווריד הפורטל, וריד הפורטל מספק תבנית מבנית ומרכז איתות המסדיר את הצמיחה וההבחנה של עץ המרה12. ב Hankeova ואח '9, DUCT חקר התחדשות מרה במודל עכבר עבור מחלת הילדים האנושית תסמונת Alagille. DUCT חשף מנגנונים אדריכליים שלא דווחו בעבר שמערכת המרה השתמשה בהם כדי להשיג נפח דמוי סוג פראי9. עכברי תסמונת אלג'יל השתמשו בשתי אסטרטגיות שונות: (1) באזורים הילאר והמרכזיים של הכבד, מערכת המרה הגדילה את הסתעפותה, ו -(2) בפריפריה הכבדית, צינורות המרה שנוצרו על ידי דה נובו היו עינויים מאוד. שני גורמים אלה יחד כדי להניב נפח מערכת מרה כמעט נורמלי, למרות הארכיטקטורה החריגה. יתר על כן, DUCT זיהה הסתעפות צינור מרה חריג שהתרחש ללא תלות של הסתעפות וריד הפורטל צינורות מרה להרכיב גשרים מחברים בין שני ורידים פורטל9. פנוטיפים אלה יהיה בלתי אפשרי לזהות יציקת שרף יחיד יכול להתפרש לא נכון בחלקים היסתולוגיים 2D כמו התפשטות צינור המרה. כך מספק DUCT נתונים המתארים את הארכיטקטורה התלת-ממדית של שתי רשתות צינוריות בכל רמת האיבר או האונה עם אפשרות לניתוח כמותי איכותי ומעמיק. DUCT יכול להיות תקן חדש להתפתחות כבד לאחר הולדתי ניתוחי התחדשות הכבד במודלים שונים של בעלי חיים.
Disclosures
פרויקט נפרד במעבדת ERA ממומן על ידי ModeRNA. ל- ModeRNA לא היה תפקיד בפרוייקט/פרוטוקול המתוארים כאן.
Acknowledgments
אנו מודים לקארי הופרט וסטייסי הופרט על המומחיות והעזרה שלהם בנוגע לצינורות המרה והאירוח במעבדה שלהם. אנו מודים גם לנדיה שולץ ושרלוט ל. מאטסון על עזרתן בצינור צינור המרה המשותף.
אנו מודים לסוכנויות הענק הבאות על תמיכתן:
לעבודה במעבדת ERA: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), שטוקהולם לאנס לנדסטינג (CIMED (2-538/2014-29)), רגנאר סודרברגס סטיפלסה (מענק ההתחלה של הקרן השבדית), האגודה האירופית לחקר הכבד (פרס דניאל אלגיל), קרן הלב-לונג השבדית (20170723) ו-Vetenskapsrådet (2019-01350).
לעבודה במעבדת JK: אנו מכירים בתשתית המחקר CzechNanoLab הנתמכת על ידי MEYS CR (LM2018110). J.K. הודות לתמיכתו של מענק FSI-S-20-6353.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| 23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
| 23 G needle | BD bioscience | 305892 | |
| 30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
| Agarose | Top-Bio | P045 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
| Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
| Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
| Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
| Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
| Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
| Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
| Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
| Rocker | VWR | 444-0142 | |
| Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
| Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
| Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
| Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
| Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |
References
- Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. On the preparation of multicolored corrosion specimens. The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).
- Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction. American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
- Sparks, E. E., et al. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Cuervo, H., et al. Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice. Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63, 550-565 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).
- Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
- Andersson, E. R., et al. Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations. Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
- Ober, E. A., Lemaigre, F. P. Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis. Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).
