Summary
이중 수지 주조 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 또는 덕트(DUCT)는 두 관 시스템의 시각화, 디지털화 및 세분화를 동시에 통해 장기 아키텍처의 3D 분석을 용이하게 합니다. 덕트(DUCT)는 두 개의 방사성파크 수지의 전 생체 주입 을 결합한 다음, 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 스캐닝 및 지형 데이터의 세분화를 결합합니다.
Abstract
간은 인간과 마우스에 있는 가장 큰 내부 기관이고, 높은 자동 형광은 통 수준에서 기관의 3차원 (3D) 건축을 평가하기위한 중요한 도전을 제시합니다. 간 건축은 혈관과 담즙 나무를 포함하여 수지로 채워질 수 있는 여러 가지 루멘화 된 구조를 특징으로하며, 그렇지 않으면 간세포가 풍부한 파렌치마에서 매우 고정 관념적 패턴을 확립합니다. 이 프로토콜은 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 또는 "덕트"를 캐스팅하는 이중 수지 주조를 수행하기 위한 파이프라인을 설명합니다. 덕트에는 두 개의 다른 방사성 합성 수지와 함께 포털 정맥과 일반적인 담관을 주입하고 조직 고정을 수반합니다. 광학 클리어링 에이전트로 한 엽 또는 간 전체를 제거하여 품질 관리를 통해 적절하게 주입된 시료를 사전 선별할 수 있습니다. 덕트 파이프라인의 두 번째 부분에서, 로브 또는 전체 간은 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(microCT) 스캐닝,(semi-) 자동화된 세분화 및 포털 정맥 및 담즙 네트워크의 3D 렌더링에 사용될 수 있다. MicroCT는 두 수지의 3D 좌표 데이터를 생성하여 두 시스템과 공간 관계의 정량적 분석뿐만 아니라 정성적이었습니다. 덕트산후 및 성인 마우스 간을 적용할 수 있으며 폐내 혈관 네트워크 및 기도와 같은 다른 관형 네트워크로 더 확장될 수 있습니다.
Introduction
오르간 수지 주조는 17 세기 로 거슬러 올라가는 기술입니다1. 현대 수지 주조의 첫 번째 예 중 하나는 부검에서 인간의 간에서 수행되었다. 간 내 담관은 젤라틴과 혼합 된 조영제로 채워졌으며 X 선 CT 스캔2로 이미징했습니다. 덕트 기술의 목적은 3D로 두 개의 관 수지 캐스트 네트워크를 시각화, 디지털화 및 분석하는 것입니다.
덕트(DUCT)는 단일 시스템 간 수지 주조3,4,5,6,7,8에 대한 광범위한 기존 지식을 기반으로 하며, 두 시스템의 동시 3D 시각화 및 분석으로 확장된다9. 덕트 고급 단일 수지 주조는 서로 다른 콘트라스트의 두 개의 radiopaque 수지와 이러한 수지, 특히 일반적인 담관 및 포털 정맥에 주입하여 이중 수지 주조에 캐스팅. 덕트는 출생 후 15일(P15)부터 재현 가능한 결과를 가진 젊은 산후 마우스에 적용될 수 있다. 현미경 기지를 둔 화상 진찰 기술에 비해, 주요 이점은 덕트가 더 빠르고, 항체가 없고, 간 조직 자동형광이 화상 진찰을 방해하지 않는다는 것입니다. 또한 덕트에서는 루멘화 상태, 내부 직경, 네트워크 연결 및 관류를 설명하는 정량적 데이터를 제공합니다. Lumen 형성 세포의 존재와 사실상 의 형태 발생을 튜브로 분화하는 것은 덕성 세포가 존재하지만 Alagille 증후군10의 경우와 같이 튜브를 형성하지 않는 장기를 분석하는 데 필수적입니다. 덕트의 주요 단점은 점성이 있고 작은 구경 (<5 μm)으로 튜브에 들어가지 않는 수지의 제한된 침투입니다. 덕트는 동맥 및 정맥 순환 시스템, 기도, 외형 담관 또는 림프관과 같은 주입 진입점을 결정한 후 임의의 관 구조를 적용할 수 있다. 그것은 이렇게 폐와 췌장과 같은 그밖 조직의 전체 기관 건축 분석을 촉진할 수 있었습니다.
MicroCT 분할 이미지는 ImageJ와 같은 상업적으로 이용 가능한 이미징 소프트웨어 또는 사용자 지정 작성된 파이프라인(예: MATLAB)을 사용하여 처리할 수 있습니다. 수지 주입 간은 네트워크 확장 및 연결또는 단일 시스템의 부피, 길이, 분기, 고문및 두 시스템 간의 거리 또는 지점 의존성(시스템 2 분기에 근접하여 시스템 1 분기)과 같은 두 시스템 간의 상호 작용을 위해 질적으로 분석될 수 있다. 수지 주입, microCT 스캐닝 및 CT 데이터 세분화를 포함하는 덕트 파이프라인은 두 관 시스템의 건축 메커니즘에 대한 상세한 정량적 분석과 결합되어 동물 모델의 전체 간 분석에 대한 표준을 제공할 수 있습니다.
Protocol
이 연구에서 설명된 프로토콜은 승인되었으며 스톡홀름 노라 주르뢰르쇼크세티스카 네른드(스톡홀름 동물 연구 윤리 위원회)의 동물 복지 규칙 및 규정을 따릅니다. 이 연구에서 사용된 동물은 혼합 C3H/N 및 C57bl6J 배경에 야생 형 또는 homozygous Jag1H268Q 돌연변이 마우스였다. 남성과 여성 모두 연구에 포함 되었다. 동물은 산후 15 일 또는 3 - 8 개월 사이의 성인으로 사용되었습니다.
1. 이중 수지 주사
- 준비
- 수지 용액을 준비합니다. 이중 시스템 수지 주사의 경우 단계 1.1.2-1.1.4에 설명된 대로 노란색 및 녹색 수지 모두를 준비하십시오.
- 마우스 당 희석 된 수지의 1 mL 알리쿼트준비.
- 노란색 수지: 노란 실리콘 고무(높은 방사성)를 3:1 희석으로 희석하여 주입을 위해 노란색 수지를 준비합니다.
- 녹색 수지: 파란색 실리콘 고무(탐지할 수 없는 방사성)를 1:1 희석으로 투명 희석제와 혼합하여 파란색 수지준비합니다. 녹색 수지를 생성하려면 희석된 파란색 수지와 희석된 노란색 수지의 비율을 1:1의 비율로 혼합합니다. 색상이 균일 할 때까지 녹색 수지를 철저히 소용돌이.
참고: 블루 수지는 마이크로CT로 감지할 수 없는 매우 낮은 방사선파성을 가지므로 노란색 수지로 희석하여 다른 방사선 능력을 가진 두 개의 수지생성이 필요합니다.
주의: 수지는 발암 물질인 납 크로메이트를 포함할 수 있습니다. 그것은 화재에 유독 가스를 생산하고 있습니다. 수지를 조심스럽게 처리하고 수지를 유해 폐기물로 처리하십시오. - 단계 1.1.6-1.1.11에 설명된 대로 튜브를 사용하면 두 개의 주입 세트(주사 세트 #1 및 주입 세트 #2)를 준비하십시오.
참고: 성인 마우스(>P30(산후일 30) = P30-2년)의 경우, 포털 정맥 주입을 위한 일반적인 담즙 덕 주입 및 주입 세트 #2 (PE50 튜브 0.96 mm 외경)에 대한 주입 세트 #1 (PE10 튜브 0.6 mm 외경)을 사용합니다. 젊은 산후 마우스 (P30까지)의 경우, 담관에 대한 두 개의 #1 주사 세트를 준비하고 포털 정맥 주입을위한 세트 (포탈 정맥이 PE50 튜브를 수용하기에 너무 좁기 때문에 주사 세트 #2 없음). - 사출 세트 #1을 준비하려면, PE10 튜브30cm를 자르고 가능한 한 얇아질 때까지 손으로 튜브의 한쪽 끝을 스트레칭하십시오 (그림 1A, B, 직경 약 0.15 mm, 비 뻗어 PE10 튜브는 직경 0.6mm입니다).
- 베벨 팁을 만들기 위해 뻗은 PE10 튜브의 끝을 대각선으로 자른다(그림 1B).
- PE10 튜브의 비 늘어난 끝을 30 G 바늘에 연결합니다(그림 1A, 주입 세트 #1).
- 사출 세트 #2를 준비하기 위해, 30cm의 PE50 튜브를 자르고 포털 정맥에 들어갈 만큼 얇아질 때까지 손으로 튜브의 한쪽 끝을 스트레칭하십시오 (그림 1A, B, 약 0.7 mm, 비 뻗어 PE50 튜브는 직경 0.96mm입니다).
- 베벨 팁을 만들기 위해 뻗은 PE50 튜브의 끝을 대각선으로 자른다(그림 1B).
- PE50 튜브의 비 늘어난 끝을 23 G 바늘에 연결합니다(그림 1A, 사출 세트 #2).
참고: 각 주사 세트는 주사기와 튜브에서 수지가 강화되기 때문에 한 번의 주사에만 사용할 수 있습니다. 나이, 유전자형 및 표현형에 따라 마우스의 일반적인 담관 및 포털 정맥의 크기에 따라 늘어나고 베벨이 있는 팁의 크기를 조정합니다. 튜브의 크기와 적합성에 대해 확실하지 않은 경우 절개 후 와 튜브가 수지로 채워지기 전에 적절한 덕트 또는 용기에 튜브를 삽입하십시오. 튜브가 덕트 /용기에 맞게 너무 넓은 경우, 더 스트레칭. - 이소플루란 흡입에 의해 동물을 마취시한다(유도 챔버에서 처음 4%, 코 콘을 사용하여 ~2%).
- 마우스가 코 콘을 통해 이소플루란을 호흡하는 동안 해부 패드에 통풍벤치에 마우스를 놓습니다. 예를 들어, 발 중 하나를 꼬집어 서 동물이 종교 교육원/IRB 권장 방법에 의해 의식이 없는지 확인합니다.
주의: 이소플루란은 흡입시 졸음이나 현기증을 유발할 수 있으며 장기간 또는 반복된 노출을 통해 심혈관 시스템과 중추 신경계에 손상을 줄 수 있습니다. 흡입하지 마십시오. 통풍이 잘 되는 벤치와 통풍이 잘 되는 부위에서 물질을 처리합니다.
참고: 심장 관류와 호환되는 한 다른 마취 방법을 사용할 수 있습니다. - 동물이 의식이 없는 후에는 퍼의 간섭을 방지하기 위해 70%의 에탄올로 복부 측을 스프레이하십시오.
- 피부 가위를 사용하여 복강의 중간선에서 시작하여 피부, 근막 및 근육 층을 자르고 흉부 구멍을 뚫고 내부 장기를 노출시합니다.
- 흉골을 들어 올리고 양쪽에 다이어프램과 늑골 케이지를 잘라 심장과 폐를 노출하기 위해 집게로 xiphoid 과정을 잡아.
- 가위로 흉곽의 왼쪽과 오른쪽에 있는 갈비뼈를 절단하여 흉곽을 제거합니다. 이 수지의 누출 귀착될 것 이다 간 손상 하지 않도록 여분의주의.
- 직선 집게를 사용하여, 간쪽으로 심장을 당기고 오른쪽 아트리움을 잘라.
- 퍼강성 관류 펌프에 연결된 나비 바늘(23G)을 왼쪽 심실에 삽입합니다. 행크스 균형 소금 용액 (HBSS) 및 헤파린 (마우스 체중 1 U /g)와 마우스 를 트랜스카디에 퍼퓨즈합니다. 5 mL /분의 관류 비율로 3 분 동안 perfuse.
참고: 마우스가 올바르게 침투하는 경우 내부 장기는 창백해지고 특히 간이 창백해집니다. 대신 폐가 하얗게 변하면 바늘이 오른쪽 심실로 삽입되어 재배치되어야 합니다. 관류 후, 마우스는 멸종되고 코 콘과 이소플루란에서 제거 될 수있다. - 이소플루란 펌프를 끕니다.
- 수지 주입 - 담즙 시스템 수지 주조
- 마우스를 해부 현미경으로 이동시키고, 복부위로, 꼬리를 실험자쪽으로 향하게 하고, 실험자로부터 멀리 향한다. 관심의 해부학적 랜드 마크는 그림 2A에 묘사되어 있습니다.
- 장자를 측면으로 이동하여 열등한 베나 카바(도 2A)를 찾습니다. 스프링 가위를 사용하여 열등한 베나 카바에서 작은 트랜스버라시드 절개를 하여 간 혈관 압력의 방출을 허용합니다(도 2Bi).
- 1.2.4- 1.2.6 단계에 설명된 바와 같이 일반적인 담관 및 포탈 정맥을 노출한다.
- 인산염 완충식식염(PBS)-젖은 면봉을 사용하여 장과 췌장을 오른쪽(실험자의)으로 이동합니다.
- PBS 젖은 면봉을 사용하여 간 복부면을 심장쪽으로 뒤집어 내장 표면과 히어 영역을 노출시합니다.
- 췌장을 가로질러 장으로 흐르는 일반적인 담관을 찾아오디의 괄약근 (그림 2Bii, 노란색 점선으로 윤곽을 가진 일반적인 담관, 오디의 괄약근을 가리키는 검은 화살촉).
참고: 간이 PBS와 함께 뿌려시면 간이 시술 내내 촉촉한지 확인하십시오. - 직선 집게를 사용하여 일반적인 담관에서 주변 조직 (면적 ~ 5mm)을 지웁니다. 일반적인 담관(그림 2Bii) 아래에 실크 봉합실(크기 4-0, 0.17mm, 3~5cm 길이)을 놓고 일반적인 담즙 덕트(그림 2Biii)주위에 느슨한 오버핸드 매듭을 묶습니다.
참고: 히어 영역과 오디의 괄약근 사이의 중간 및 포탈 정맥에서 어느 정도 떨어진 곳에서 매듭을 위한 영역을 선택하여 봉합사가 일반적인 담관 주위에 조여진 후에는 포털 정맥 주입을 방해하지 않습니다. - 일반적인 담관에 대해 스프링 가위를 평평하게 잡고 일반적인 담즙 덕이 오디의 괄약근 옆에 췌장과 내장에 들어가는 지점에서 일반적인 담관에 경사 절개를 합니다. (그림 2Biv), 노란색 점선은 검은 화살촉에 의해 강조 오디 지역의 괄약근을 간략하게 설명합니다.).
참고: 이것은 중요한 단계입니다. 경사를 만들고 반적 컷이 아닌 절개를 한다. 담관은 끊어지지 마십시오. 전체 담관을 절단하면 튜브를 삽입하는 것이 매우 어렵습니다. - 사용하기 직전에 노란 수지 의 1 mL을 경화제의 50 μL (1 mL 주사기를 채우고 비우는 것)와 혼합하고 수지로 1 mL 루어 주사기를 채웁니다 - 경화 제 혼합물.
- 채워진 주사기를 튜빙(1세트)과 연결합니다. 플런저를 눌러 튜브를 완전히 채웁니다. 수지/경화제는 튜브 끝에서 드립을 혼합해야 합니다.
참고: 주사기와 튜빙의 거품을 피하고 제거하여 최상의 결과를 제공합니다. - 집게를 사용하여 일반적인 담관 절개 주변 영역을 곧게 펴고 관도(그림 2Bv)의 개구부에 튜브를 삽입하고 담관의 등쪽을 향해 베벨 팁의 가장 긴 가장자리가 아래쪽으로 삽입합니다. 이 방향을 사용하면 수지가 위쪽으로 향하고 있는 튜브 개구부를 덕트(그림 2Bv)로 종료할 수 있습니다.
- 실크 실 매듭을 조여 서 일반적인 담관 내부의 튜브를 고정합니다(그림 2Bvi).
- 수지를 일반적인 담관에 주입합니다. 담낭과 개별 간 엽을 관찰하십시오.
- PBS 젖은 면봉으로 간을 마사지하여 수지를 똑같이 퍼뜨리세요. 수지 로 채워진 담관의 말단 가지 (야생 형 마우스)는 간 표면에서 희미하게 볼 수 있습니다.
참고: 간을 채우는 예상 시간은 30-100s입니다. - 수지의 점이 간 표면에 나타날 때 수지 주입을 중지 (도 2Ci, 파란색 화살촉) 또는 저항이 충족 될 때.
참고: 수지 경화제를 추가한 후 수지가 강해지기 시작하기 때문에 가능한 한 빨리 작업합니다. 경화제를 첨가하는 작업 시간은 약 15분입니다. - 일반적인 담관에서 잡아내어 튜브를 제거하고 수지가 누출되는 것을 방지하기 위해 집게를 사용하여 실크 매듭을 빠르게 조입니다. 실크 봉합사의 느슨한 끝을 잘라, 그래서 그들은 포털 정맥 주입을 방해하지 않습니다.
- 수지와 남은 수지가 들어 있는 튜브를 유해 폐기물에 넣고 바늘을 날카로운 폐기물로 처리합니다.
- 수지 주입 - 포털 정맥 수지 주조
- 직선 집게를 사용하여 간으로 들어가는 입구에서 약 2cm 의 주변 조직에서 포털 정맥 (면적 ~5mm)을 지웁니다. 포털 정맥(도 2Cii)의 클리어 영역 아래에 실크 봉합사 실(크기 4-0, 0.17 mm, 3~5cm 길이)을 배치하고 느슨한 오버핸드 매듭(도 2Cii)을 묶습니다.
- 간 및 매듭에 대한 포털 정맥 에서 종방향 절개를 합니다(도 2Ciii).
- 녹색 수지의 1mL을 경화제의 50 μL(1mL 주사기를 채우고 비우는 것)과 섞어 수지 경화제 혼합물로 1mL 루어 주사기를 채웁니다.
- 채워진 주사기를 튜브와 연결합니다(>P30 마우스의 경우 #2,
참고: 주사기와 튜빙의 거품을 피하고 제거하여 최상의 결과를 제공합니다. - 집게를 사용하여 주변 조직을 실험자쪽으로 당겨서 포탈 정맥을 곧게 펴고 배의 등쪽을 향해 베벨 팁의 가장 긴 가장자리로 튜브를 삽입합니다(도 2Ciii).
- 실크 실을 조여 포털 정맥의 튜브를 고정합니다.
- 수지를 포털 정맥에 주입합니다. 수지로 가득 혈관을 관찰. PBS 젖은 면봉으로 간을 마사지하여 수지(그림 2Civ)를 동등하게 퍼뜨리세요.
- 모든 혈관이 채워지면 수지 주입을 중지 (포털 정맥의 끝은 간 주변에서 볼 수 있습니다) 또는 저항이 충족 될 때.
참고: 경화제를 추가한 후 수지가 굳어지기 시작한 후 빠르게 작업합니다. 경화제를 첨가하는 작업 시간은 주사 세트#1에 대해 약 15분, 주사 세트 #25분 #2.입니다. - 튜브를 포털 정맥에서 꺼내서 튜브를 제거하고 집게를 사용하여 실크 매듭을 빠르게 조이면 수지가 누출되는 것을 방지합니다.
- 수지와 남은 수지가 들어 있는 튜브를 유해 폐기물에 넣고 바늘을 날카로운 폐기물로 처리합니다.
- 간 해부 및 고정
- 주변 조직과 횡격막에서 절단하여 간 전체를 해부하십시오.
- 복부 면이 위로 향하고 등쪽이 원추형 관의 벽에 놓여 있는 빈 50mL 원추형 튜브에 간 전체를 부드럽게 배치하여 간 변형을 방지합니다. 수지가 완전히 굳어지도록 원문 튜브를 4°C에서 수평으로 하룻밤 동안 저장합니다.
참고: 간을 맞출 수 있을 만큼 큰 용기는 50mL 원원관 대신 사용할 수 있습니다. 평평한 바닥 용기를 사용하면 간이 변형되지 않을 가능성이 높아집니다. - 간을 개별 로브로 분리합니다. 마이크로CT 분석(1.4.4-1.4.5) 또는 품질 관리(1.4.6-1.4.8)에 사용될 로브를 선택한다. 선택적으로 개별 로브로 분리하지 않고 광학 클리어링 및 microCT 모두에 전체 간을 사용합니다.
참고: 담즙 및 혈관 시스템의 간 건축은 각 엽마다 다르며, 따라서 일치하는 엽 분석이 필요합니다. 광학 클리어링은 마이크로CT 스캐닝을 방해하지 않으며 품질 관리에 사용되는 로브(들)는 이후에 microCT로 스캔할 수 있습니다. 반대로, microCT로 스캔한 샘플은 비교를 위해 광학적으로 지울 수 있습니다. 전체 간 분석이 가능합니다. 야생형 마우스(C3H/C57bl6 유전배경)에서 오른쪽 내측 엽은 수지 주사에 의해 먼저 채워져 있어 가장 높은 재현성을 가진 미세 CT 분석에 적합한 엽입니다. 왼쪽 측면 엽은 가장 큰 엽, 따라서 사출 품질에 대 한 사전 화면 간단. 품질 관리 및 microCT 스캐닝에 사용되는 로브(또는 전체 간)의 선택은 동물 모델 및 연구 질문에 의존한다. - 통풍이 잘 되는 후드에서 포름알데히드 용액(튜브당 10~20mL)을 준비합니다. 마이크로CT에 사용되는 로브를 4°C에서 하룻밤 사이에 4% 포름알데히드로 고정하고 PBS(튜브당 10~20mL)로 한 번 세척합니다.
- 별도의 용기에 포름알데히드 폐기물을 수집합니다. 단기 저장을 위해 PBS에 간 엽을 4°C로 유지하거나 장기 보관을 위해 70% 에탄올을 보관하십시오. 섹션 2: 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영으로 진행합니다.
주의: 포름알데히드는 삼켜지거나 흡입되거나 피부와 접촉하면 급성 독성을 유발합니다. 포름알데히드는 인화성 액체및 증기입니다. 그것은 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킵니다. 알레르기 성 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 흡입 하는 경우 치명적인 (농축 또는 분말). 호흡 자극을 일으킬 수 있습니다. 유전적 결함을 유발하는 것으로 의심됩니다. 암을 일으킬 수 있습니다. 장기 (눈, 중추 신경계)에 손상을 입힙니다. 예방 명령문 - 열, 뜨거운 표면, 불꽃, 화염 및 기타 점화 원을 멀리하십시오. 금연. 보호 장갑과 보호복을 착용하십시오. 유출의 경우 오염 된 모든 옷을 즉시 벗습니다. 피부에 닿으면 오염된 부위를 물로 헹구세요. 흡입하는 경우 : 신선한 공기에 사람을 제거하고 편안하게 호흡을 모니터링합니다. 즉시 독 센터 / 의사에게 전화하십시오. 눈에 있는 경우: 몇 분 동안 물로 눈을 헹구세요. 존재하고 가능한 경우 콘택트 렌즈를 제거하십시오. - 품질 관리를 위해, 나머지 로브 (적어도 하나)를 50 % 메탄올 (탈온 화 된 물과 혼합)을 최소 4 시간 동안 수정하고 실온에서 흔들면 실온에서 100 % 메탄올 밤새 흔들수 있습니다. 별도의 용기에 메탄올 폐기물을 수집합니다.
주의: 메탄올은 삼키거나 흡입하거나 피부와 접촉하면 급성 독성을 유발합니다. 메탄올은 인화성 액체 및 증기입니다. 보호 장갑과 옷을 착용하십시오. 취급 할 때 호흡을 피하고 화재와 열을 멀리하십시오. 사용 후 피부를 철저히 씻어 내십시오. 유출의 경우 오염 된 모든 옷을 즉시 벗습니다. 물로 피부를 헹구는 다. 흡입하는 경우 : 신선한 공기에 사람을 제거하고 호흡에 대한 편안함을 유지합니다. 흡입, 삼킨 또는 노출된 경우 독센터/의사에게 전화하십시오. - 통풍이 잘 되는 후드에서 벤질 알코올과 벤질 벤조아테(BA: BB, 1:2) (로브 당 5-10mL)를 준비한다.
- 간 엽을 BABB 용액을 함유하는 15- 또는 50mL 폴리프로필렌 튜브(로브의 크기에 따라 다름)에 놓습니다. 투명해질 때까지 실온에서 흔들리십시오. 이 단계는 로브의 크기에 따라 2-16 h 사이걸릴 수 있습니다.
참고: BABB 솔루션은 특정 유형의 플라스틱을 용해합니다. 폴리프로필렌 튜브 또는 유리 용기에 샘플을 보관하는 것이 안전합니다.
주의: 벤질 벤조아테는 삼킬 때 급성 독성을 유발할 수 있습니다. 그것은 오래 지속 효과 수 생 생활에 독성. 주의 사항 : 취급 후 피부를 철저히 씻으십시오. 삼켜지거나, 피부에 닿거나, 흡입할 때는 유해합니다. 연기/증기를 호흡하지 마십시오. 취급 후 손을 철저히 씻으십시오. 이 제품을 사용할 때는 먹거나 마시거나 담배를 피우지 마십시오. 삼킨 경우 - 통풍이 잘되지 않는 경우 독 센터 / 의사에게 전화하십시오. 유출을 수집합니다. 승인된 폐기물 처리 공장에 내용/컨테이너를 폐기합니다. - 주사의 품질을 검사합니다. 잘 주입된 간만 microCT로 스캔해야 합니다.
2. 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영
- 샘플 준비
- 증류수 100mL와 아가로즈 파우더 1g을 혼합하여 1% 아가로즈 젤을 준비합니다. 혼합물을 전자레인지에 넣고 아가로즈 파우더가 녹을 때까지 용액을 끓입니다.
- 간 시료의 열 손상을 피하기 위해 1% 아가로즈 젤을 ~40°C로 부드럽게 합니다.
- 15mL 원문 튜브에 관심 있는 로브(들)를 놓고 1% 아가로즈 젤로 튜브의 총 부피의 약 2/3으로 채우십시오. 이 단계는 CT 측정 중에 원치 않는 샘플 모션을 최소화합니다.
- CT 측정
참고: 다음 단계는 CT 장치에 따라 다르며 특정 설정 및 작업은 다른 CT 장치 및 제조업체에 따라 다를 수 있습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 스캐너에는 CT 측정을 위한 나노 포커스 X선 튜브(180kV/15 W) 및 평면 패널 다이내믹 41|100(4048 px x 4048 px, 픽셀 크기 100mm+binning 2)가 장착되어 있었다.- CT 장치의 회전 단계에 시료와 함께 15mL 원추형 튜브를 장착하고 적어도 1h의 측정 챔버에 열적으로 적응할 수 있도록 한다.
- 샘플이 열적으로 조정되면 FOV(시야)에서 샘플링을 중심으로 합니다.
- 소스 시료 및 시료 검출기 거리(SSD, SDD)를 최적화하여 충분한 복셀 분해능, 예를 들어 성인 뮤린 간 샘플의 경우 12μm 또는
- CT 장치 제조업체의 권장 사항에 따라 획득 매개 변수(예: 전압 및 전류, 노출, 비닝, 평균)를 설정하여 충분한 수준의 검출된 신호에 도달합니다. 이러한 매개 변수는 CT 장치에 종속될 뿐만 아니라 샘플에 따라 다르며 각 샘플에 최적화되어야 합니다. Hankeova 외.9에서는 80kV 가속 전압, 160 μA 가속 전류, 400ms 노출 시간 및 2000 개의 이미지가 설정되었습니다.
- CT 측정을 시작합니다. 전용 토모그래픽 재구성 소프트웨어를 사용하여 CT 데이터를 재구성합니다.
3. 분석 및 데이터 세분화
참고: 다음 단계는 이미지 처리 소프트웨어에 따라 달라집니다. 특정 설정 및 작업은 사용되는 소프트웨어에 따라 다를 수 있습니다.
- CT 데이터 로드: > 가져오기 > 파일 을 선택합니다. 추가 선택은 처리할 CT 데이터의 특정 형식에 따라 달라집니다.
- 상단 패널의 함수 Surface 측정 을 사용하여 전역 임계값을 사용하여 데이터의 수지를 분할합니다. 대화 창에서, 빨간색 "Isovalue" 선의 위치를 수지 채워진 용기(즉, 제시된 "미리 보기 패널"에서 노란색 선으로 포괄)로 분할하여 히스토그램 평가를 사용하여 임계 값을 결정합니다(그림 3A).
- 왼쪽 패널에서 모듈 만들기 ROI를 볼륨/CAD/메시에서 선택하여 수지로 채워진 용기의 관심 영역(ROI)을 만듭니다. 대화 상자 창에서 솔리드에서 ROI 만들기 옵션을 사용하여 처리된 볼륨의 이름을 선택하고 확인합니다.
- 이 ROI의 백그라운드 영역에서 노이즈 클러스터의 잘못된 세분화를 제거합니다. 오른쪽 패널에 이 ROI를 표시하고 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 모듈 분할 ROI를 선택합니다.
- 대화 상자 창에서 최소 볼륨 [복셀] 매개 변수를 설정하여 모든 노이즈 입자를 제외합니다-이 값은 실험 및 데이터 종속이며 각 샘플을 분석하도록 최적화해야 합니다(그림 3B).
- 수지 주조 ROI의 아티팩트없이 부드럽고 연속적이며 견고한 운하 마스크를 만듭니다 ( 예 : 기포 또는 수지 누출의 존재) .
- 왼쪽 패널에서 모듈 스무딩을 사용하여 스무딩 강도 매개 변수를 1 또는 2로 설정합니다(개별 데이터에 따라 값이 높을수록 특히 미세 구조를 처리할 때 모델 변형으로 이어질 수 있음). 필요한 경우 이 프로세스를 두 번 실행합니다(그림 3C).
- 분할된 수지 마스크의 개별 관 시스템을 식별하고 분리합니다.
- CT 데이터에서 더 높은 강도 값을 가진 더 많은 흡수성 수지(일반적인 담관 주입에 사용되는 노란색 수지)로 채워진 시스템에 대해 별도의 ROI를 만듭니다. 3.2 단계에서 설명된 절차를 따르십시오. (그림 3Di).
- 새로운 ROI 및 수지 마스크 ROI를 표시하고, 마우스 오른쪽 클릭 및 빼ROI(S) 를 선택하고 수지 마스크 ROI에서 새로운 ROI를 빼서 남은 관 계통에 대한 새로운 ROI를 만듭니다(그림 3Dii, iii).
- 다른 소프트웨어에서 후속 처리를 위해 운전자 선호도에 따라 두 관 형 시스템에 대한 결과 ROI를 다양한 형식으로 내보냅니다. 또한 볼륨 그래픽 소프트웨어에서 결과 ROI를 처리하여 최종 시각화를 이미지 또는 비디오 형태로 내보냅니다.
Representative Results
수행할 일
성공적인 이중 수지 주입은 담관 내 담관과 포털 정맥 혈관 이 잘 채워질 때 달성됩니다. 품질 관리 단계로, 하나의 엽(예를 들어, 좌측 엽)을 지우면 성공적인 주사를 검증할 수 있으며, 그 다음에는 관심 있는 로브의 이미징이 뒤따릅니다. 광학적으로 지워진 엽은 microCT를 사용하여 나중에 스캔할 수 있습니다. 따라서 전체 간을 광학적으로 클리어할 수 있습니다. 잘 주입된 마우스 간에서, 포털 정맥 혈관은 간 주변과 수지가 측면 가지(그림 4)에서 보일 때까지 수지로 채워져야 하며, 이 아키텍처는 microCT 스캔 및 세분화된 데이터에서 충실하게 재구성된다. 또한, 잘 주입된 간 담관은 주 포털 정맥 가지가 주변으로 거의 확장되는 옆에 표시되어야 하며, 주요 측면 지점에서 수지가 눈에 띄게 되어야 한다. 제어 로브가 품질 관리 단계를 통과하는 경우, 관심있는 로브 (광학적으로 지워진 것을 포함)는 microCT로 스캔 할 수 있습니다. 잘 주입된 간으로부터의 분할된 데이터의 결과는 P15 마우스(도 4A, B) 및 성인 마우스(도 4C, D)에 대해 도시된다.
하지 말아야 할 일
손상되지 않은 간 조직은 성공적인 주입을위한 전제 조건입니다. 복강과 다이어프램을 절단할 때 는 실수로 간 조직을 닉하지 않도록 주의하십시오. 이 절차 도중 간물리적 손상이 있는 경우에, 수지는 포털 정맥 주입 도중 밖으로 누출하기 위하여 아주 확률이 높습니다 (그림 5A). 간이 물리적으로 손상된 경우 혈관 시스템의 좋은 주입을 달성 할 수 없습니다.
일반적인 실수 중 하나는 시각화 또는 분석에 대 한 도전으로 이어질 수 있는 수 지와 간을 밑주. 시스템 밑약의 원인 중 하나는 주사가 완료되기 전에 바늘이나 튜브의 끝에서 조기에 경화되는 수지입니다 (그림 5B, 파란색 화살촉, 브래킷은 큰 거품을 묘사합니다). 좋은 방법은 동물 당 하나의 주사 세트를 사용하고 경화제가 수지에 추가 된 후 빠르게 작업하는 것입니다. 주사 중에 수지(반충전된 시스템에 의해 관찰될 수 있음) 튜브를 제거하고 튜브 의 끝을 잘라 (항상 대각선으로 굴기울 팁을 만들 수 있음) 플런저를 밀어 넣습니다. 수지가 다시 떨어지기 시작하면 튜브를 조심스럽게 다시 삽입하고 봉합사로 고정하십시오. 수지가 바늘에 경화된 경우 튜브를 완전히 교체하고 수지 (거품 을 피하고)로 채우고 튜브를 조심스럽게 다시 삽입하고 봉합사로 고정하십시오. 조직이 더 연약하기 때문에 특히 젊은 산후 마우스
반대로, 시스템의 하나 또는 둘 다 수지로 채워집니다(그림 5D). 주사 를 통해 간을 시각적으로 모니터링 할 필요가있다. 수지로 주조하는 담즙 시스템은 수지 채워진 덕트만 간 표면에 희미하게 보이기 때문에 포털 정맥 수지 주조보다 더 어렵고, 시스템이 거의 가득 차고 언제 멈출지 평가하기가 어렵습니다. 작은 노란 수지 점이 간 표면에 나타나면 (그림 2Ci, 파란색 화살표촉), 이것은 담즙 시스템이 완전히 채워지고 수지가 덕트에서 누출되기 시작한다는 신호입니다. microCT 데이터 세분화 중에 사소한 수지 누설을 수동으로 수정할 수 있습니다(그림 5D, 오른쪽 패널).
사출 압력이 너무 높으면 혈관이나 덕트파열(그림 5E), 돌이킬 수 없는 손상 용기 또는 덕트 아키텍처가 발생할 수 있습니다. 간은 microCT 스캐닝 또는 분석에 적합하지 않습니다. 수지 과충전을 방지하려면 각 마우스 모델에서 주입에 사용되는 적절한 볼륨과 압력을 최적화합니다. 담즙 또는 정맥 시스템에 영향을 미치는 독성 식단, 유전자 변형 또는 간 손상으로 어려움을 겪고 있는 마우스와 함께 작업할 때, 주입 압력및 부피는 용적한 양과 압력이 야생형 마우스와 다를 수 있기 때문에 조절될 필요가 있을 수 있다. 이 프로토콜은 두 시스템의 수동 주입을 설명하지만 주사기를 펌프에 연결하여 사출 압력을 표준화할 수 있습니다. 거품은 관 네트워크의 희소한 충전으로 이어지는 또 다른 매우 일반적인 주입 아티팩트입니다 (그림 5F-H, 파란색 화살표). 거품 형성을 피하기 위해 주사기와 튜브에 거품이 포함되어 있지 않고 수지로 완전히 채워지며 수지는 주입 전에 튜브 끝에서 떨어지는지 확인하십시오. microCT 데이터에 부정적인 영역으로 나타나는 작은 거품은 처리 후 단계에서 수동으로 수정할 수 있지만 이는 힘들다.
신선도가 최고입니다
신선한 노란색 수지의 사용이 중요한 요소이며, 두 수지와 microCT 데이터 세분화의 대비에 크게 영향을 미칩니다. 새로 개봉된 수지(도 6A)가 사용되는 경우(그림 6A)는 노란 수지 주입 담관(밝은 흰색)과 녹색 수지 주입 포털 정맥(밝은 회색)의 대비에 뚜렷한 차이가 있다. 신선한 수지주입되는 간은 자동화된 글로벌 임계값을 사용하여 쉽게 처리됩니다. 장시간 보관하면 수지 침전이 되고 대비가 감소합니다. 저장 3개월 후에도, 대조는 여전히 담관(도 6B)과 포털 정맥을 구별하기에 충분할 수 있지만, 침전은 채워진 포털 정맥에서 이질성 불투명도로 보이는 두 수지의 혼합에 영향을 미칩니다(도 6B, 블루 화살촉). 이기종 대비는 자동화된 임계값에 부정적인 영향을 미치고 수동 수정이 필요하므로 처리 시간이 증가합니다. 수지가 6개월 이상 더 오래된 경우, 대조가 대조만을 기준으로 노란색 주입 담관과 녹색 주입 된 포털 정맥을 구별할 수 없는 지점으로 저하되었습니다(그림 6C). 이 경우 담관 및 포털 정맥은 hilar 지역의 지름과 위치에 따라 수동으로 분할되어야 하며 전체 microCT 데이터 전반에 걸쳐 수동으로 따라야 합니다. 이 절차는 매우 시간이 많이 걸리며 피하는 것이 가장 좋습니다.
그림 1: 수지 주조를 위한 주입 세트. (A) 사출 세트 #1은 ~30cm 길이의 30G 바늘과 PE10 튜브를 포함한다. 사출 세트 #2는 23 G 바늘과 PE50 튜브 ~ 30cm 길이로 구성됩니다. (B) 튜브의 끝이 늘어나고 각도로 잘라서 경부된 팁을 만듭니다. A와 B의 눈금자1cm, 중간 5mm, 1mm의 경미한 증분이 있는 센티미터 의 통치자입니다 .
그림 2: 이중 수지 주조 흐름 차트. (A) 부류 정맥 순환 계통과 강조 된 오른쪽 아트리움을 가진 심장을 보여주는 회로도, 이는 관류 전에 잘라야하며, 바늘을 삽입해야하는 좌심실은 순환 시스템에서 혈액을 씻어 내도록 관류를 위해 삽입해야합니다. 열등한 베나 카바는 혈관 압력을 완화하기 위해 신장 아래에서 절단해야합니다. (B) 담관 수지 주입 흐름 차트. (i) IVC를 끊을 위치를 묘사하는 (A)의 확대/축소 이미지입니다. (ii) 간 힐라 부위에서 오디(블랙 화살촉)의 괄약근에 이르기까지 일반적인 담관(노란색 점선)을 묘사한 이미지로, 일반적인 담관 아래에 봉합사 실이 있습니다. (iii) 일반적인 담관 주위에 느슨한 오버 핸드 매듭에 적합한 위치. (iv) 노란색 점선과 검은 색 화살표 머리는 오디의 괄약근을 표시, 절개에 대한 경사 각도와 경사 각도 절개 후 개구부가 어떻게 표시해야하는지 시연. (v) 삽입 시 PE10 튜브 베벨 개구(위쪽)의 방향을 보여주는 회로도. (vi) 노란 수지의 출현이 주입되고; 수지쉽게 느슨하게 묶인 매듭을 통과해야합니다. IVC, 열등한 베나 카바; CBD, 일반적인 담관. (C) 포털 정맥 수지 주입 흐름 차트. (i) 녹색 점선은 히어 리전의 포털 정맥을 표시합니다. 파란색 화살표 헤드는 과충전된 담즙 시스템에 레이블을 지정합니다. (ii) 포털 정맥 주위에 느슨한 오버 핸드 매듭에 적합한 위치. (iii) 삽입 시 베벨 개구부(위쪽)를 보여주는 회로도. (iv) 녹색 수지와 노란 수지의 주입 시 간 모양; 간 주변에 수지로 채워진 혈관에 유의하십시오. PV, 포털 정맥. 그림 2A 는 Biorender.com 함께 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 볼륨 그래픽 소프트웨어의 마이크로 CT 데이터 처리. (A) 표면 결정, (i) 과대 평가 된 등가치 (현재 선택 미리보기는 노란색으로 표시됨), (ii) 과소 평가 된 등가치, (iii) 포털 정맥 및 담관의 적절한 표면 측정을위한 최적의 이소값 선택. (b) 표면 결정에 의해 생성된 관심 영역(ROI)을 분할하고, (i) 하나의 세그먼트(가장 큰)만 남을 정도로 높게 대화창에 값을 설정하고, (ii) 노란색 프레임으로 더 작은(제외) 입자가 도시된다. (C) 데이터의 표면 스무딩, (i) 스무딩 기능은 왼쪽 패널에, (ii) 스무딩 강도를 1(최대 2)로 설정하고 새로운 부드러운 ROI, (iii) 매끄러운 데이터를 생성한다. (D) 개별 관 시스템의 분리, (i) 표면 결정 기능에서 담즙 시스템만 선택에 포함되도록 isovalue를 설정 (선택의 현재 미리보기는 노란색으로 표시됨), (ii) 두 시스템의 ROI에서만 시스템 및 ROI의 ROI를 표시하고 두 시스템의 ROI로부터 의 하부 빌리 시스템 ROI를 표시, (iii) 녹색으로 표시된 담즙 시스템인 회색으로 표시된 포탈 정맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 잘 주입된 담관(BD) 및 포탈 정맥(PV) 시스템. (A) 산후 15일(P15) 간에서 두 개의 수지로 주입된 오른쪽 내측 엽(RML)을 광학적으로 지웠다. 녹색흰색 및 담즙 시스템의 포털 정맥 혈관을 그린으로 묘사한 (A)에 표시된 P15 RML의 스케일 바 1mm. (B) 3D 렌더링. 스케일 바 1mm. (C) 두 시스템에 두 개의 수지주입 성인 간 RML을 광학적으로 지웠다. 녹색흰색 및 담즙 시스템의 포털 정맥 혈관을 그린(C)에 도시된 성인 RML의 스케일 바 1mm.(D) 3D 렌더링. H = 하이라, P = 주변 장치. 스케일 바 1mm. 패널 A, B, D는 Hankeova 등의 허가하에 적응됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 이중 수지 간 주사의 일반적인 도전. (A) 이미지는 복강의 초기 개구부 도중 우연히 닉된 간을 묘사하고, 수지는 컷(블루 화살촉)을 통해 누출되고 있다. (B) 수지 경화로 인해 포털 정맥 시스템을 제대로 주입하지 않습니다. 파란색 화살표 헤드는 빈 단자 가지에 레이블을 지정하고 빨간색 브래킷은 큰 거품을 레이블. 스케일 바 1mm. (C) 가난한 경정맥 관류로 인해 제대로 주입 된 포털 정맥 시스템. 파란색 화살촉은 말단 가지에서 볼 수 있는 혈액에 라벨을 부착합니다. 스케일 바 1mm. (D) 수지의 고립 된 공에 의해 명시 된 과충전 담즙 시스템. 왼쪽 패널은 광학적으로 지워진 간을 표시하고 오른쪽 패널은 3D microCT 렌더링 된 이미지를 보여줍니다. 파란색 점선은 확대/축소 영역을 묘사합니다. 검은 화살장은 microCT 스캔 후 광학 클리어링 중에 손상된 간 부위에 라벨을 붙입니다. 스케일 바 1mm. (E) 수지 주입 중 고압은 파문 정맥의 파열을 일으킬 수 있습니다 (이 패널의 동물은 Jag1H268Q 돌연변이를 운반), 파란색 화살촉에 의해 표시. 축척 막대 1mm. (F) 포탈 정맥 주입 (블루 애살촉) 및 (G) 담즙 시스템 주입 (블루 애로우 헤드), 스케일 바 1mm . (H) MicroCT 스캔 기포 (블루 화살표 헤드), 불량 터미널 가지 (빨간 브래킷) 및 수지 누설 (노란색 화살표 헤드), 스케일 바 1mm이 더 큰 버전을 보려면 여기에 클릭하십시오.
도 6: 차동 수지 대비. (A) 새로 개봉된 노란색 수지는 수지 주입 포털 정맥(회색) 및 담관(흰색)을 구별하기에 충분한 대조를 생성한다. (B) 노란 수지의 3개월 보관은 수지의 침전으로 이질성 불투명도(회색-흰색 포털 정맥, 청색 화살촉)의 결과로 이어진다. (C) 노란 수지의 장기간 보관(>6개월)은 포털 정맥(회색)과 담관(회색)의 대비를 감소시다. 배율 막대 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
몇 가지 중요한 단계는 샘플 준비에서 CT 장치의 매개 변수에 이르기까지 덕트의 성공을 결정합니다. 최상의 결과를 얻으려면 잘 대조되고 잘 주입되고 거품이 없는 수지로 자동화된 임계값을 사용하여 3D 데이터, 이미지 및 영화를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜을 교육하고 따라 사용하면 주사의 90 %가 성공하여 재현 가능한 데이터를 초래합니다. 신선한 노란색 수지를 사용하여 두 주입 된 시스템 사이의 최상의 대비를 달성하는 것이 중요합니다. 노란색 수지는 매우 강한 방사선을 가지고 있으며, 파란색 수지는 탐지 할 수없는 방사선을 가지고 있습니다. 최고 결과는 새로운 노란색 수지 병을 연 후 처음 3 개월 이내에 달성된다. 시간이 지남에 따라 수지 침전및 더 이상 저장(>6개월) 후에는 CT 스캔에서 노란색 및 녹색 수지를 더 이상 구별할 수 없습니다. 콘트라스트가 좋지 않은 이미지는 두 시스템의 광범위하고 시간이 많이 소요되는 수동 추적 및 세분화가 필요합니다. 다음으로, 잘 뻗어 있는 튜브는 성인용 마우스의 일반적인 담관과 태아후 마우스의 일반적인 담관 및 포털 정맥에 맞추기 위하여 필수적입니다. 주입의 진입점은 주의하여 만들어야 합니다. 일반적인 담관이 반경으로 열리면 주변 조직에서 분리되어 튜브의 성공적인 진입을 방지할 수 있습니다. 이 단계는 일반적인 담관이 후퇴하고 관도의 삽입을 매우 어렵게 만드는 경우 "곱슬"산후 마우스에 특히 섬세하다. 일반적인 담관 항목 및 주입 몇 가지 연습을 필요로 할 수 있습니다. 수지와 주입 내내 튜브를 준비하는 동안 거품이 CT 이미지에 부정적인 공간을 만들고 시간이 많이 걸리는 수동 보정이 필요하므로 거품 형성을 피하십시오. 주사 시술 도중과 후에 젖은 면봉으로 표면을 부드럽게 통해 간을 마사지하는 것이 중요합니다. 튜브의 주입 및 제거가 완료 된 후 실크 봉합사 매듭을 신속하고 신중하게 조여야하므로 수지가 완전히 중합되기 전에 간에서 흘러 나오지 않습니다. 성공적인 microCT 이미징의 경우 샘플은 아가로즈를 사용하여 적절하게 고정되고 CT 데이터의 이동 아티팩트를 제거하기 위해 열적으로 조정되어야 합니다. 획득 설정도 중요한 중요성을 지니고 있으며, 미세 한 구조를 해결하기 위해 적절한 공간 해상도에 도달하기 위해 최적화되어야 합니다.
주입 절차에 대한 기술적 수정은 젊은 마우스에서 주사를 달성하기 위해 이루어질 수 있습니다. 현재, 젊은 마우스 간수 주조는 충분히 얇은 튜브의 가용성에 의해 제한, PE10은 가장 작은 상업적으로 사용할 수있는 튜브인. 타니미즈 외는 유리 모세혈관11을 사용하여 배아일 17일(E17) 일반적인 담관에 탄소 잉크를 성공적으로 주입하였다. 따라서 유리 모세관을 통해 수지를 전달할 수 있는지 여부에 대한 향후 테스트가 흥미로할 것입니다. 덕트는 폐의 기도 및 폐 동맥 혈관과 같은 다른 관 형 시스템을 주입하기 위해 더 적응되었다9. 이중 수지 주사는 또한 다른 상업적으로 이용 가능한 수지와 함께 사용하도록 수정될 수 있었습니다, 또는 이 프로토콜은 탄소 잉크를 가진 주사에 사용될 수 있었습니다.
덕트 파이프라인의 주요 제한 요인 중 하나는 수지 점도입니다. 덕트는 직경 5 μm 이상의 관 구조의 수지 주조에만 사용할 수 있습니다. 이 데이터 세트에서 수지는 5 μm9의 가장 작은 직경으로 튜브를 관통할 수 있습니다. 이 크기 제한은 미세 한 덕트와 작은 모세 혈관의 분석을 배제합니다. 덕트 파이프라인을 더 작은 구경 선박으로 발전시키기 위해 상업적으로 이용 가능한 다른 수지 또는 새로운 저점도 방사성파크 제제의 개발이 루멘 침투를 향상시킬 수 있습니다.
Hankeova et al.9에서, 덕트는 두 개의 다른 일반적으로 사용되는 기술, 이중 탄소 잉크 주사조직 청산 및 표준 사진, 그리고 iDISCO+와 알파-부드러운 근육 세포 액틴 및 사이토케라틴7담관7을 가진 혈관의 염색으로, 3D imaging9에 그 뒤를 이었다. 덕트는 이중 분석(높은 간 자동 불발성으로 인해 iDISCO+에 도전적이었던), 3D 이미징 및 정량화(탄소 잉크 주입이 불가능함) 및 루멘화(덕트)의 측면에서 다른 두 가지 방법을 능가했습니다( 덕트는 내부 루멘 아키텍처 및 시스템 관류에 대한 데이터를 제공합니다). 위에서 언급했듯이, 덕트의 주요 한계는 탄소 잉크 주입과 iDISCO+가 모두 더 잘 수행되는 파라미터인 주입 및 분석(5 μm 제한)의 최소 루멘 크기입니다. 덕트(DUCT)는 단일 시스템 수지 주조3,5,6에 우수하여 각 주입 된 시스템의 분석을 별도로 허용하고 이중 3D 조사를 용이하게하여 두 시스템 간의 건축 관계를 연구합니다.
덕트(DUCT)는 2개의 튜브 네트워크를 3D로 스터디하기 위해 적용할 수 있습니다. 원리의 증거로, 덕트는 간 담즙 및 포털 정맥 시스템과 폐9의 폐 동맥 혈관 및 기도를 시각화하는 데 사용되었다. 심폐소회관은 포탈 정맥에 인접해 있으며, 포탈 정맥은 담즙 나무의 성장과 분화를 조절하는 구조적 템플릿 및 신호 센터를 제공한다12. Hankeova 외.9에서, 덕트는 인간 소아성병 알라길 증후군을 위한 마우스 모형에 있는 담즙 재생을 탐구했습니다. 덕트(DUCT)는 이전에보고되지 않은 건축 메커니즘을 공개하여 담즙 시스템이 야생 형과 같은 볼륨9을 달성하는 데 사용되었습니다. 알라길 증후군 마우스는 두 가지 다른 전략을 활용: (1) 간의 hilar 및 중앙 지역에서, 담즙 시스템은 그것의 분기를 증가, 그리고 (2) 간 주변에서, 드 노보 생성 담관은 매우 고문했다. 이 두 가지 요인은 비정상적인 아키텍처에도 불구하고 거의 정상담체 시스템 볼륨을 산출하기 위해 결합되었습니다. 또한, 덕트에서는 두 포털 정맥 9 사이의 연결 교량을 형성하는 포털 정맥 분기 및 담관과 무관하게 발생한 비정상적인 담관 분기를 검출했습니다. 이러한 표현형은 단일 수지 주조에서 검출하는 것은 불가능할 것이며 담관 증식으로 2D 조직학적 섹션에서 잘못 해석될 수 있습니다. 따라서 덕트(DUCT)는 전체 기관 또는 로브 수준에서 두 개의 관 형 네트워크의 3D 아키텍처를 설명하는 데이터를 제공하여 질적이고 심층적인 정량적 분석의 가능성을 제공합니다. 덕트는 다른 동물 모형에 있는 산후 간 발달 및 간 재생 분석을 위한 새로운 표준일 수 있었습니다.
Disclosures
ERA 연구소의 별도 프로젝트는 ModeRNA에 의해 지원됩니다. ModeRNA는 여기에 설명된 프로젝트/프로토콜에 아무런 역할이 없었습니다.
Acknowledgments
우리는 카리 하퍼트와 스테이시 하퍼트의 전문 지식과 담관 수분 및 실험실 환대에 관한 도움을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 일반적인 담관 통 수분에 대한 그들의 도움에 대한 나드자 슐츠와 샬럿 L. 맷슨에게 감사드립니다.
우리는 그들의 지원에 대한 다음과 같은 부여 기관에 감사드립니다 :
ERA 연구소에서 일하기: 카롤린스카 연구소 (2-560/2015-280), 스톡홀름 란스 랜스팅 (CIMED (2-538/2014-29)), 라그나르 쇠데르 베르그스 스티펠스 (스웨덴 재단의 시작 교부금), 간 연구를위한 유럽 협회 (다니엘 알라길상), 스웨덴 심장 폐 재단 (20170723), 베텐스코프로데트 (2019-01350).
JK 랩의 작업: 우리는 MEYS CR (LM2018110)에 의해 지원 되는 체코 나노 랩 연구 인프라를 인정합니다. J.K. 보조금 FSI-S-20-6353의 지원 덕분에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| 23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
| 23 G needle | BD bioscience | 305892 | |
| 30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
| Agarose | Top-Bio | P045 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
| Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
| Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
| Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
| Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
| Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
| Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
| Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
| Rocker | VWR | 444-0142 | |
| Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
| Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
| Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
| Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
| Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |
References
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