Summary
الراتنج المزدوج الصب التصوير المقطعي المصغر، أو DUCT، تمكن التصور والرقمنة، وتجزئة نظامين أنبوبي في وقت واحد لتسهيل تحليل 3D من بنية الجهاز. DUCT يجمع بين حقن الجسم الحي السابق من اثنين من راتنجات المشعة تليها المسح المقطعي المحوسبة الدقيقة وتجزئة البيانات الطبوغرافية.
Abstract
الكبد هو أكبر عضو داخلي في البشر والفئران ، وارتفاع السيارات الفلورسينس يمثل تحديا كبيرا لتقييم الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد (3D) للجهاز على مستوى الجهاز كله. تتميز بنية الكبد بهياكل متفرعة متعددة ، والتي يمكن ملؤها بالراتنج ، بما في ذلك الأشجار الوعائية والبيليارية ، مما يؤسس لنمط نمطي للغاية في parenchyma الغنية بالخلايا الكبدية. يصف هذا البروتوكول خط أنابيب لإجراء التصوير المقطعي الدقيق للراتنج المزدوج، أو "DUCT". DUCT ينطوي على حقن الوريد البوابة والقناة الصفراوية المشتركة مع اثنين من الراتنجات الاصطناعية المشعة المختلفة، تليها تثبيت الأنسجة. مراقبة الجودة عن طريق إزالة فص واحد، أو الكبد بأكمله، مع عامل المقاصة البصرية، يسمح للفحص المسبق للعينات حقن مناسب. في الجزء الثاني من خط أنابيب DUCT ، يمكن استخدام الفص أو الكبد بأكمله لمسح التصوير المقطعي المصغر (microCT) ، (شبه) التقسيم الآلي ، وتقديم ثلاثي الأبعاد للشبكات الوريدية والقبيلية للبوابة. ينتج عن MicroCT بيانات تنسيق ثلاثية الأبعاد للراتنجين تسمح بإجراء تحليل نوعي وكمي للنظم وعلاقتهما المكانية. يمكن تطبيق DUCT على كبد الفأر بعد الولادة والبالغين ويمكن توسيعه إلى شبكات أنبوبية أخرى ، على سبيل المثال ، شبكات الأوعية الدموية والخطوط الجوية في الرئتين.
Introduction
صب راتنج الجهاز هو تقنية يعود تاريخها إلى القرن السابع عشر1. تم إجراء أحد الأمثلة الأولى على صب الراتنج الحديث على الكبد البشري من تشريح الجثة. امتلأت القنوات الصفراوية داخل الدماغ بعامل تباين ممزوج بالجيلاتين، يليه التصوير بالأشعة المقطعية بالأشعة السينية 2. والهدف من تقنية DUCT هو تصور ورقمنة وتحليل شبكتين أنبوبيتين من الراتنج المصبوب ، جنبا إلى جنب ، في 3D.
ويستند DUCT على المعرفة القائمة واسعة من الصب راتنج الكبد نظام واحد3,4,5,6,7,8 ويمتد إلى التصور 3D في وقت واحد وتحليل نظامين9. قناة متقدمة الصب راتنج واحد لمضاعفة الصب الراتنج عن طريق خلط اثنين من راتنجات الراديوباك من تباين مختلف وحقن هذه الراتنجات في شبكتين مختلفتين، وتحديدا القناة الصفراوية المشتركة والوريد البوابة. يمكن تطبيق DUCT على الفئران الصغيرة بعد الولادة مع نتائج قابلة للاستنساخ في وقت مبكر من يوم ما بعد الولادة 15 (P15). بالمقارنة مع تقنيات التصوير المستندة إلى المجهر ، فإن الميزة الرئيسية هي أن DUCT أسرع وخالية من الأجسام المضادة ، ولا تتداخل الفلورة الذاتية لأنسجة الكبد مع التصوير. علاوة على ذلك ، توفر DUCT بيانات كمية تصف حالة التجويف والقطر الداخلي واتصال الشبكة والتشويش. التمييز بين وجود الخلايا تشكيل التجويف ومورفوجينيس بحكم الأمر الواقع في أنابيب أمر ضروري لتحليل الأعضاء التي الخلايا اللاصقة موجودة ولكن لا تشكل أنابيب، كما يمكن أن يكون الحال في متلازمة ألاجيل10. العيب الرئيسي من DUCT هو اختراق محدود من الراتنج، وهو لزج ولا يدخل أنابيب مع عيار صغير (<5 ميكرومتر). يمكن تطبيق DUCT على أي هيكل أنبوبي بعد تحديد نقطة دخول الحقن ، مثل الأنظمة الدموية الشريانية والنووية ، أو الشعب الهوائية ، أو القناة الصفراوية خارج الهيباتية ، أو الأوعية اللمفاوية. وبالتالي يمكن أن تسهل تحليل بنية الجهاز كله من الأنسجة الأخرى مثل الرئتين والبنكرياس.
يمكن معالجة الصور المجزأة MicroCT باستخدام برامج التصوير المتاحة تجاريا ، مثل ImageJ ، أو خطوط الأنابيب المكتوبة خصيصا (على سبيل المثال ، MATLAB). يمكن تحليل الكبد الذي يتم حقنه بالراتنج نوعيا لتوسيع الشبكة والاتصال بها أو كميا لحجم نظام واحد وطوله وتفريعاه وتوركتوسيتيه والتفاعل بين نظامين مثل المسافة بين نظامين أو تبعية نقطة الفرع (هل يتفرع النظام 1 بالقرب من النظام 2 المتفرع؟). خط أنابيب DUCT يشمل حقن الراتنج، ومسح microCT، وتجزئة بيانات CT، جنبا إلى جنب مع تحليل كمي مفصل للآليات المعمارية من نظامين أنبوبي، يمكن أن توفر معيارا لتحليل الكبد كله في النماذج الحيوانية.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة ويتبع قواعد ولوائح رعاية الحيوان في ستوكهولم نورا Djurförsöksetiska nämnd (مجلس أخلاقيات أبحاث الحيوانات في ستوكهولم). كانت الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة من النوع البري أو الفئران المتحولة المثلية Jag1H268Q على خلفية مختلطة C3H/N و C57bl6J. وشملت الدراسة الذكور والإناث على حد سواء. تم استخدام الحيوانات في يوم ما بعد الولادة 15 أو كبالغين بين 3-8 أشهر.
1. حقن الراتنج المزدوج
- اعداد
- إعداد محلول الراتنج. لحقن راتنج النظام المزدوج، قم بإعداد الراتنجات الصفراء والخضراء على حد سواء كما هو موضح في الخطوات 1.1.2-1.1.4.
- إعداد 1 مل aliquots من الراتنج المخفف لكل فأر.
- الراتنج الأصفر: تمييع المطاط السيليكون الأصفر (ارتفاع التعتيم الإشعاعي) مع مخفف واضحة في تخفيف 3:1 لإعداد الراتنج الأصفر للحقن.
- الراتنج الأخضر: مزيج المطاط السيليكون الأزرق (اللاكشف عن التعتيم الإشعاعي) مع مخفف واضحة في تخفيف 1:1 لإعداد الراتنج الأزرق. لتوليد الراتنج الأخضر، اخلطي الراتنج الأزرق المخفف مع الراتنج الأصفر المخفف بنسبة 1:1. دوامة الراتنج الأخضر جيدا حتى اللون متجانسة.
ملاحظة: الراتنج الأزرق لديه تعتيم إشعاعي منخفض جدا لا يمكن اكتشافه مع microCT ، مما يستلزم تخفيفه مع الراتنج الأصفر لإنشاء راتنجين مع تعتيمات إشعاعية مختلفة.
تنبيه: قد يحتوي الراتنج على كرومات الرصاص، وهو مادة مسرطنة. وتنتج غازات سامة في النار. التعامل مع بعناية والتخلص من الراتنج والنفايات الخطرة. - إعداد مجموعتين حقن (حقن مجموعة # 1 والحقن مجموعة # 2) مع أنابيب كما هو موضح في الخطوات 1.1.6-1.1.11.
ملاحظة: بالنسبة للفئران البالغة (>P30 (يوم ما بعد الولادة 30) = P30 - 2 سنة)، استخدم مجموعة الحقن رقم 1 (أنابيب PE10 بقطر خارجي 0.6 مم) لحقن القناة الصفراوية الشائعة وتعيين الحقن رقم 2 (أنابيب PE50 بقطر خارجي 0.96 مم) لحقن الوريد المدخلي. للفئران الصغيرة بعد الولادة (حتى P30)، قم بإعداد مجموعتين من الحقن رقم 1، واحدة للقنوات الصفراوية وواحدة لحقن الوريد البوابي (لا توجد مجموعة حقن رقم 2 لأن وريد البوابة ضيق للغاية لاستيعاب أنابيب PE50). - لإعداد الحقن مجموعة # 1، وقطع 30 سم من أنابيب PE10 وتمتد نهاية واحدة من الأنابيب باليد عن طريق سحبه حتى يصبح رقيقة قدر الإمكان (الشكل 1A، B، ما يقرب من 0.15 مم قطرها، غير امتدت أنابيب PE10 هو قطر 0.6 ملم).
- قطع غيض من أنابيب PE10 امتدت قطريا لإنشاء تلميح مشطوف (الشكل 1B).
- ربط نهاية غير امتدت من أنابيب PE10 إلى إبرة 30 G (الشكل 1A، حقن تعيين # 1).
- لإعداد الحقن مجموعة # 2، وقطع 30 سم من أنابيب PE50 وتمتد نهاية واحدة من الأنابيب باليد عن طريق سحبه حتى يصبح رقيقة بما يكفي لتناسب في الوريد البوابة (الشكل 1A، B، ما يقرب من 0.7 ملم، أنابيب PE50 غير امتدت هو 0.96 مم القطر).
- قطع غيض من أنابيب PE50 امتدت قطريا لإنشاء تلميح مشطوف (الشكل 1B).
- قم بتوصيل الطرف غير الممتد من أنابيب PE50 بإبرة 23 G (الشكل 1A، مجموعة الحقن رقم 2).
ملاحظة: كل مجموعة حقن يمكن استخدامها لحقنة واحدة فقط لأن الراتنج سوف تصلب في الحقنة والأنابيب. ضبط حجم الطرف الممتد والمغلف استنادا إلى حجم القناة الصفراوية الشائعة وعروق المدخل للفأر ، اعتمادا على عمره ، والنمط الجيني ، والنمط الظاهري. عندما لا تكون متأكدا من حجم وتناسب الأنابيب، أدخل الأنابيب في القناة المناسبة أو السفينة المناسبة بعد الشق وقبل أن تمتلئ الأنابيب مع الراتنج. إذا كان الأنبوب واسعا جدا بحيث لا يتناسب مع القناة / السفينة ، فمدده أكثر. - تخدير الحيوان عن طريق استنشاق isoflurane (أول 4٪ في غرفة التعريفي و ~ 2٪ باستخدام مخروط الأنف).
- ضع الماوس على مقعد التهوية على لوحة تشريح بينما يتنفس الماوس isoflurane من خلال مخروط الأنف. تحقق من أن الحيوان فاقد الوعي بواسطة طريقة أوصى بها المعهد / IRB ، على سبيل المثال ، عن طريق قرص أحد الكفوف.
تنبيه: قد يسبب الأيزوفلوران النعاس أو الدوخة عند الاستنشاق وقد يسبب تلفا في نظام القلب والأوعية الدموية والجهاز العصبي المركزي من خلال التعرض لفترات طويلة أو متكررة. لا تستنشقه. التعامل مع هذه المادة على مقاعد البدلاء التهوية وفي المناطق جيدة التهوية.
ملاحظة: من الممكن استخدام طريقة تخدير أخرى، طالما أنها متوافقة مع تغلغل القلب. - بمجرد أن يفقد الحيوان وعيه ، رش الجانب البطني بالإيثانول بنسبة 70٪ لمنع التداخل من الفراء.
- باستخدام مقص الجلد، وقطع الجلد، اللفافة، وطبقة العضلات بدءا من خط منتصف تجويف البطن وقطع من خلال لتجويف الصدر لفضح الأعضاء الداخلية.
- الاستيلاء على عملية xiphoid مع ملقط لرفع القص وقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري على كلا الجانبين لفضح القلب والرئتين.
- إزالة القفص الصدري عن طريق قطع من خلال الأضلاع على الجانبين الأيسر والأيمن من القفص الصدري مع مقص. اتخاذ مزيد من الحذر لا لتلف الكبد لأن هذا سيؤدي إلى تسرب الراتنج.
- باستخدام ملقط مستقيم، سحب القلب نحو الكبد وقطع الأذين الأيمن.
- أدخل إبرة فراشة (23 جم)، متصلة بمضخة التثابر التثابر، في البطين الأيسر. Perfuse الماوس عبر القلب مع هانكس متوازن محلول الملح (HBSS) وهيبارين (1 U / غرام من وزن جسم الماوس). Perfuse لمدة 3 دقائق مع معدل التغلغل من 5 مل / دقيقة.
ملاحظة: إذا كان يتم perfused الماوس بشكل صحيح، الأعضاء الداخلية سوف تصبح باهتة، وخاصة الكبد. إذا، بدلا من ذلك، تتحول الرئتين الأبيض، يتم إدراج الإبرة في البطين الأيمن وينبغي إعادة وضعها. بعد التغلغل ، يتم تقشير الماوس ويمكن إزالته من مخروط الأنف والإيزوفلوران. - إيقاف مضخة ايزوفلوران.
- حقن الراتنج - الصب الراتنج النظام الصفراوي
- حرك الماوس إلى مجهر التشريح ، والبطن لأعلى ، والذيل نحو المجرب ، والابتعاد عن المجرب. يتم تصوير المعالم التشريحية ذات الأهمية في الشكل 2A.
- حدد موقع الوريد الأجوف السفلي (الشكل 2A) عن طريق تحريك الأمعاء إلى الجانب. استخدام مقص الربيع لجعل شق عرضية صغيرة في الوريد الأجوف أدنى للسماح للافراج عن ضغط الأوعية الدموية الكبدية (الشكل 2Bi).
- كشف القناة الصفراوية الشائعة والوريد المدخل كما هو موضح في الخطوات 1.2.4- 1.2.6.
- نقل الأمعاء والبنكرياس إلى الجانب الأيمن (من المجرب) باستخدام مسحة القطن المالحة العازلة بالفوسفات (PBS).
- الوجه الجانب البطني من الكبد نحو القلب باستخدام مسحة القطن PBS الرطب لفضح السطح الحشوي ومنطقة مرح.
- حدد موقع القناة الصفراوية الشائعة التي تمتد من منطقة الهلال عبر البنكرياس وإلى الأمعاء عند العضلة العاصرة في أودى (الشكل 2Bii ، القناة الصفراوية الشائعة المبينة مع الخط الأصفر المنقط ، تشير رؤوس الأسهم السوداء إلى العضلة العاصرة من أودي).
ملاحظة: تأكد من أن الكبد رطب طوال العملية عن طريق رشه مع برنامج تلفزيوني. - مسح الأنسجة المحيطة (منطقة ~ 5 ملم) من القناة الصفراوية المشتركة باستخدام ملقط مستقيم. ضع خيوط خياطة الحرير (مقاس 4-0، 0.17 مم، 3 - 5 سم) تحت القناة الصفراوية الشائعة (الشكل 2Bii) وربط عقدة فضفاضة حول القناة الصفراوية المشتركة (الشكل 2Biii).
ملاحظة: اختر منطقة لعقدة في منتصف الطريق بين منطقة الهلال والعاصرة أودى وعلى مسافة ما من الوريد البوابة بحيث بعد أن يتم تشديد خياطة حول القناة الصفراوية المشتركة، فإنه لن تتداخل مع حقن الوريد البوابة. - عقد مقص الربيع شقة ضد القناة الصفراوية المشتركة لجعل شق مائل إلى القناة الصفراوية المشتركة في المكان الذي تدخل القناة الصفراوية المشتركة البنكرياس والأمعاء بجوار العضلة العاصرة من أودي. (الشكل 2Biv)، خط منقط أصفر يحدد العضلة العاصرة لمنطقة أودي، وأكد من قبل رؤوس الأسهم السوداء).
ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. جعل مائل وليس قطع عرضية، وجعل شق. لا تقطع القناة الصفراوية. قطع من خلال القناة الصفراوية بأكملها يجعل إدراج الأنابيب صعبة للغاية. - قبل الاستخدام مباشرة، اخلط 1 مل من الراتنج الأصفر مع 50 ميكرولتر من عامل المعالجة (عن طريق ملء وإفراغ حقنة 1 مل) وملء حقنة 1 مل لوير مع الراتنج - خليط عامل المعالجة.
- قم بتوصيل المحاقن المملوءة بالأنابيب (مجموعة رقم 1). اضغط المكبس لملء الأنابيب تماما. تأكد من أن مزيج الراتنج / عامل المعالجة يقطر من طرف الأنابيب.
ملاحظة: تجنب وإزالة فقاعات في الحقنة والأنابيب للحصول على أفضل النتائج. - باستخدام ملقط، تصويب المنطقة المحيطة شق القناة الصفراوية المشتركة وإدراج الأنابيب في الفتحة في القناة الصفراوية المشتركة (الشكل 2Bv)، مع أطول حافة من طرف مشطوف إلى أسفل نحو الجانب الظهري من القناة الصفراوية. يضمن هذا التوجه أن الراتنج يمكن الخروج من فتحة الأنابيب، التي تواجه صعودا، في القناة (الشكل 2Bv).
- شد عقدة الخيط الحريري لتأمين الأنابيب داخل القناة الصفراوية المشتركة (الشكل 2Bvi).
- حقن الراتنج في القناة الصفراوية المشتركة. مراقبة المرارة والفص الكبد الفردية.
- تدليك الكبد مع مسحة القطن PBS الرطب للمساعدة في نشر الراتنج على قدم المساواة. فروع القناة الصفراوية المليئة بالراتنج (في الفئران البرية) مرئية بشكل ضعيف على سطح الكبد.
ملاحظة: الوقت المتوقع لملء الكبد هو 30-100 s. - توقف عن حقن الراتنج عندما تظهر نقاط الراتنج على سطح الكبد (الشكل 2Ci، رؤوس الأسهم الزرقاء) أو عندما يتم الوفاء بالمقاومة.
ملاحظة: العمل في أسرع وقت ممكن منذ الراتنج يبدأ تصلب بعد إضافة عامل معالجة الراتنج. وقت العمل من إضافة عامل المعالجة هو حوالي 15 دقيقة. - إزالة الأنابيب عن طريق سحبه من القناة الصفراوية المشتركة وتشديد بسرعة عقدة الحرير باستخدام ملقط لمنع الراتنج من التسرب. قطع النهايات فضفاضة من خياطة الحرير، حتى أنها لا تتداخل مع حقن الوريد البوابة.
- التخلص من أنابيب تحتوي على الراتنج والراتنج المتبقية في النفايات الخطرة والإبرة في النفايات حادة.
- حقن الراتنج - بوابة الصب راتنج الوريد
- مسح الوريد البوابة (منطقة ~ 5 ملم) من الأنسجة المحيطة بها حوالي 2 سم من دخولها إلى الكبد باستخدام ملقط مستقيم. ضع خيوط خياطة الحرير (مقاس 4-0، 0.17 مم، 3 - 5 سم) تحت المنطقة التي تم مسحها من الوريد البوابي (الشكل 2Ci) وربط عقدة فضفاضة (الشكل 2Cii).
- إجراء شق طولي في الوريد بوابة القاصي إلى الكبد وعقدة (الشكل 2Ciii).
- مزيج 1 مل من الراتنج الأخضر مع 50 ميكرولتر من عامل المعالجة (عن طريق ملء وتفريغ حقنة 1 مل) وملء حقنة لوير 1 مل مع خليط عامل معالجة الراتنج.
- قم بتوصيل المحاقن المملوءة بالأنابيب (تعيين # 2 للفئران >P30 ، مجموعة جديدة # 1 للفئران
- باستخدام ملقط، تصويب الوريد البوابة عن طريق سحب الأنسجة المحيطة بها نحو المجرب وإدراج الأنابيب مع أطول حافة من طرف مشطوف نحو الجانب الظهري من السفينة (الشكل 2Ciii).
- شد الخيط الحريري لتأمين الأنابيب في الوريد المدخل.
- حقن الراتنج في الوريد المدخل. مراقبة الأوعية الدموية تملأ مع الراتنج. تدليك الكبد مع مسحة القطن PBS الرطب للمساعدة في نشر الراتنج على قدم المساواة (الشكل 2Civ).
- توقف عن حقن الراتنج عندما تمتلئ جميع الأوعية الدموية (تكون أطراف الأوردة المدخلية مرئية في محيط الكبد) أو عندما يتم الوفاء بالمقاومة.
ملاحظة: العمل بسرعة منذ الراتنج يبدأ تصلب بعد إضافة عامل المعالجة. وقت العمل من إضافة عامل المعالجة هو ما يقرب من 15 دقيقة للحقن مجموعة # 1 و 25 دقيقة للحقن مجموعة # 2. - إزالة الأنابيب عن طريق سحب الأنابيب من الوريد البوابة وتشديد بسرعة عقدة الحرير باستخدام ملقط لمنع الراتنج من التسرب.
- التخلص من أنابيب تحتوي على الراتنج والراتنج المتبقية في النفايات الخطرة والإبرة في النفايات حادة.
- تشريح الكبد والتثبيت
- تشريح الكبد كله عن طريق قطع بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها والحجاب الحاجز.
- ضع الكبد كله برفق في أنبوب مخروطي فارغ سعة 50 مل مع مواجهة الجانب البطني والجانب الظهري يستريح على جدار الأنبوب المخروطي لمنع تشوه الكبد. تخزين أنبوب مخروطي أفقيا بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية للراتنج لتصلب تماما.
ملاحظة: يمكن استخدام أي حاوية كبيرة بما يكفي لتناسب الكبد بدلا من أنبوب مخروطي سعة 50 مل. استخدام حاوية أسفل مسطحة سيزيد من احتمال أن الكبد ليست مشوهة. - فصل الكبد إلى فصوص فردية. قم بعمل مجموعة مختارة من الفصوص التي سيتم استخدامها لتحليل microCT (1.4.4-1.4.5) أو مراقبة الجودة (1.4.6-1.4.8). اختياريا استخدام الكبد كله لكل من المقاصة البصرية وmicroCT دون فصله إلى فصوص الفردية.
ملاحظة: تختلف بنية الكبد في الأنظمة الصفراوية والأوعية الدموية في كل فص، وبالتالي يلزم إجراء تحليلات الفص المتطابقة. ولا تتداخل المقاصة البصرية مع المسح المجهري، ويمكن بعد ذلك مسح الفص (الفص) المستخدم لمراقبة الجودة باستخدام ميكروكت. وعلى العكس من ذلك، يمكن مسح العينات الممسوحة ضوئيا باستخدام الميكروت في وقت لاحق بصريا للمقارنة. وبالتالي فإن تحليل الكبد كله ممكن. في الفئران البرية من النوع (C3H/C57bl6 الخلفية الوراثية)، يتم تعبئة الفص الوسطي الأيمن أولا عن طريق حقن الراتنج، مما يجعل هذا الفص مناسبة لتحليل microCT، مع أعلى استنساخ. الفص الجانبي الأيسر هو أكبر فص ، والذي يكون فيه مباشرا قبل الشاشة للحصول على جودة الحقن. يعتمد اختيار الفص (أو الكبد كله) المستخدم في مراقبة الجودة ومسح microCT على النموذج الحيواني والسؤال البحثي. - في غطاء محرك السيارة التهوية، وإعداد محلول الفورمالديهايد 4٪ (10 -20 مل لكل أنبوب). إصلاح الفصوص المستخدمة لmicroCT مع 4٪ الفورمالديهايد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية وبعد ذلك يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني (10-20 مل لكل أنبوب).
- جمع النفايات الفورمالديهايد في حاوية منفصلة. احتفظ بفص الكبد في PBS عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل أو الإيثانول بنسبة 70٪ للتخزين على المدى الطويل. تابع القسم 2: التصوير المقطعي المحوسب بالميكرو.
تنبيه: يسبب الفورمالديهايد سمية حادة إذا ابتلع أو استنشق أو ملامس للبشرة. الفورمالديهايد هو سائل قابل للاشتعال وبخار. يسبب حروق الجلد الشديدة وتلف العين. قد يسبب رد فعل تحسسي الجلد. قاتلة إذا استنشقت (مركزة أو في مسحوق). قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي. يشتبه في أنه تسبب في عيوب وراثية. قد يسبب السرطان. يسبب تلفا في الأعضاء (العينين والجهاز العصبي المركزي). البيانات التحوطية - الابتعاد عن الحرارة والأسطح الساخنة والشرر واللهب المفتوح ومصادر الاشتعال الأخرى. ممنوع التدخين. ارتداء قفازات واقية وملابس واقية. في حالة الانسكاب، قم على الفور بخلع جميع الملابس الملوثة. إذا كنت على اتصال مع الجلد: شطف المنطقة الملوثة بالماء. إذا استنشقت: إزالة الشخص إلى الهواء النقي ومراقبة التنفس إذا مريحة. اتصل فورا بمركز السموم / الطبيب. إذا كان في العينين: شطف العينين بالماء لعدة دقائق. إذا كان ذلك ممكنا، قم بإزالة العدسات اللاصقة. - لمراقبة الجودة، قم بإصلاح الفصوص المتبقية (واحدة على الأقل) مع الميثانول 50٪ (مختلطة مع الماء deionized) لمدة لا تقل عن 4 ساعات، هزاز في درجة حرارة الغرفة، تليها 100٪ الميثانول بين عشية وضحاها هزاز في درجة حرارة الغرفة. جمع نفايات الميثانول في حاوية منفصلة.
تنبيه: يسبب الميثانول سمية حادة إذا ابتلع أو استنشق أو ملامس للبشرة. الميثانول سائل قابل للاشتعال وبخار. ارتداء قفازات واقية والملابس. تجنب التنفس عند التعامل معها والابتعاد عن النار والحرارة. غسل الجلد جيدا بعد الاستخدام. في حالة الانسكاب ، قم على الفور بخلع جميع الملابس الملوثة. شطف الجلد بالماء. إذا استنشقت: إزالة الشخص إلى الهواء النقي والحفاظ على راحة للتنفس. إذا استنشقت أو ابتلعت أو تعرضت، اتصل بمركز السموم / الطبيب. - في غطاء التهوية، قم بإعداد الكحول البنزيل والبنزيل بنزوات (BA: BB، 1:2) (5-10 مل لكل فص) الحل.
- ضع فص الكبد في أنبوب بولي بروبلين سعة 15 أو 50 مل (اعتمادا على حجم الفص) يحتوي على محلول BABB. اتركه يهتز في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح شفافا. يمكن أن تستغرق هذه الخطوة ما بين 2-16 ساعة اعتمادا على حجم الفص.
ملاحظة: حل BABB يذوب أنواع معينة من البلاستيك. فمن الآمن لتخزين العينات في أنابيب البولي بروبلين أو حاويات زجاجية.
تنبيه: يمكن أن يسبب البنزيل بنزوات سمية حادة عند ابتلاعه. وهو سام للحياة المائية مع آثار طويلة الأمد. البيانات الاحترازية: غسل الجلد جيدا بعد التعامل معها. وهو ضار عند ابتلاعه أو ملامسته للجلد أو استنشاقه. تجنب تنفس الدخان / الأبخرة. غسل اليدين جيدا بعد التعامل معها. لا تأكل أو تشرب أو تدخن عند استخدام هذا المنتج. إذا ابتلع - استدعاء مركز السموم / الطبيب إذا كان على ما يرام استخدام في المناطق التهوية. جمع الانسكاب. التخلص من المحتويات/ الحاوية إلى مصنع معتمد للتخلص من النفايات. - فحص نوعية الحقن. يجب فحص الكبد المحقون جيدا فقط باستخدام microCT.
2. التصوير المقطعي المحوسبة الدقيقة
- إعداد العينة
- إعداد هلام agarose 1٪ عن طريق خلط 100 مل من الماء المقطر و 1 غرام من مسحوق الآغاروز. ضعي الخليط في ميكروويف واغلي المحلول حتى يذوب مسحوق الآغاروز.
- خفف من جل الآغاروز بنسبة 1٪ إلى ~ 40 درجة مئوية لتجنب الضرر الحراري لعينة الكبد.
- ضع الفص (الفص) من الفائدة في أنبوب مخروطي 15 مل وملئه مع هلام agarose 1٪ إلى ما يقرب من 2/3 من الحجم الإجمالي للأنبوب. تقلل هذه الخطوة من حركة العينة غير المرغوب فيها أثناء قياس CT.
- قياس CT
ملاحظة: الخطوات التالية تعتمد على جهاز CT، وقد تختلف إعدادات وإجراءات محددة لأجهزة CT مختلفة والشركات المصنعة. في هذا البروتوكول، تم تجهيز الماسح الضوئي التصوير المقطعي المحوسبة الدقيقة المستخدمة مع أنبوب الأشعة السينية نانوفوكوس (180 كيلو فولت/15 واط)، ودينامية مسطحة لوحة 41|100 (4048 بكسل × 4048 بكسل، حجم بكسل 100 ملم مع binning 2) لقياسات CT.- تركيب أنبوب مخروطي 15 مل مع العينة على مرحلة دوران جهاز CT والسماح لها للتكيف حراريا مع غرفة القياس لمدة 1 ساعة على الأقل.
- عندما يتم تكييف العينة حراريا، قم بمركزها في مجال الرؤية (FOV).
- تحسين مسافات عينة المصدر وكشف العينة (SSD، SDD) للوصول إلى دقة voxel كافية، على سبيل المثال، 12 ميكرومتر لعينة كبد مورين الكبار أو 6.5 ميكرومتر
- تعيين معلمات الاستحواذ (أي الجهد المتسارع والتيارات، والتعرض، والطي، والمتوسط) وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للجهاز CT للوصول إلى مستوى كاف من الإشارة المكتشفة. هذه المعلمات هي ليس فقط CT الجهاز تعتمد ولكن أيضا تعتمد على العينة وينبغي تحسين لكل عينة. في Hankeova et al.9 ، كانت الإعدادات: 80 كيلو فولت جهد متسارع ، و 160 ميكرونا متسارعا الحالية ، و 400 مللي ثانية وقت التعرض ، و 2000 صورة.
- بدء قياس CT. استخدم برنامجا مخصصا لإعادة إنشاء الخرائط لإعادة بناء بيانات CT.
3. التحليل وتجزئة البيانات
ملاحظة: الخطوات التالية تعتمد على برامج معالجة الصور; قد تختلف إعدادات وإجراءات محددة حسب البرامج المستخدمة.
- تحميل بيانات CT: حدد أمر استيراد > > الملف. ويتوقف اختيار آخر على الشكل المحدد لبيانات CT التي يتعين معالجتها.
- استخدم وظيفة تحديد السطح على اللوحة العلوية لتقسيم الراتنج في البيانات باستخدام العتبات العالمية. في إطار الحوار، حدد قيمة العتبة مع تقييم المدرج التكراري عن طريق تعيين موضع خط "Isovalue" الأحمر لتقسيم الأوعية المليئة بالراتنج فقط (أي يشملها الخط الأصفر في "لوحة المعاينة") المعروضة (الشكل 3A).
- على اللوحة اليسرى، حدد الوحدة إنشاء عائد الاستثمار من الحجم/CAD/Mesh لإنشاء منطقة اهتمام (ROI) للأوعية المليئة بالراتنج. في إطار الحوار، استخدم الخيار إنشاء ROI(s) من Solid، وحدد اسم وحدة التخزين المعالجة وتأكد.
- القضاء على تجزئة خاطئة من مجموعات الضوضاء في المنطقة الخلفية من هذا العائد على الاستثمار. ضع علامة على عائد الاستثمار هذا على اللوحة اليمنى، وانقر بزر الماوس الأيمن عليه وحدد وحدة Split ROI.
- في إطار الحوار، قم بتعيين المعلمة الحد الأدنى لوحدة التخزين [voxel] لاستبعاد كافة جزيئات الضوضاء - هذه القيمة تعتمد على التجربة والبيانات ويجب تحسينها لكل عينة ليتم تحليلها (الشكل 3B).
- إنشاء أقنعة قناة ناعمة ومستمرة وصلبة دون قطع أثرية في عائد الاستثمار الراتنج المدلى بها - على سبيل المثال، وجود فقاعات الهواء أو تسرب الراتنج.
- على اللوحة اليسرى، استخدم وحدة Smoothing، واعين معلمة Smoothing Strength إلى 1 أو 2 (اعتمادا على البيانات الفردية، عندما قد تؤدي القيم الأعلى إلى تشوه النموذج، خاصة عند التعامل مع الهياكل الدقيقة). إذا لزم الأمر، قم بتشغيل هذه العملية مرتين (الشكل 3C).
- تحديد وفصل الأنظمة الأنبوبية الفردية في قناع الراتنج المجزأ.
- إنشاء عائد استثمار منفصل للنظام مليئة الراتنج أكثر absorptive (الراتنج الأصفر المستخدمة لحقن القناة الصفراوية المشتركة) مع قيم كثافة أعلى في البيانات CT. اتبع الإجراء الموضح في الخطوة 3.2. (الشكل 3دي).
- وضع علامة على عائد الاستثمار الجديد وقناع الراتنج ROI، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد طرح ROI (S) وطرح عائد الاستثمار الجديد من ROI قناع الراتنج لإنشاء عائد استثمار جديد للنظام الأنبوبي المتبقي (الشكل 3Dii، iii).
- تصدير ROIs الناتجة عن كلا النظامين أنبوبي في أشكال مختلفة، استنادا إلى تفضيلات المشغل، للمعالجة اللاحقة في برامج مختلفة. علاوة على ذلك، قم بمعالجة ROIs الناتجة في برنامج رسومات وحدة تخزين لتصدير التصور النهائي في شكل صورة أو فيديو.
Representative Results
ما يجب القيام به
يتم تحقيق حقن الراتنج المزدوج الناجح عندما تمتلئ كل من القنوات الصفراوية داخل الهيباتية وبوابة الوريد الأوعية الدموية بشكل جيد. كخطوة لمراقبة الجودة، مسح فص واحد (على سبيل المثال، الفص الجانبي الأيسر) يسمح للتحقق من حقنة ناجحة، تليها تصوير فصوص ذات أهمية. ويمكن مسح الفص مسح بصريا في وقت لاحق باستخدام microCT; ومن ثم فمن الممكن لمسح بصريا الكبد كله. في كبد الفأر المحقون جيدا ، يجب ملء الأوعية الوريدية المدخلية بالراتنج حتى يكون محيط الكبد والراتنج مرئيين في الفروع الجانبية (الشكل 4) ، ويتم تلخيص هذه البنية بأمانة في بيانات ميكروكت ممسوحة ومجزأة. علاوة على ذلك ، يجب أن تكون القنوات الصفراوية داخل الهيباتية المحقونة بشكل جيد مرئية بجوار فروع الوريد المدخلية الرئيسية الممتدة تقريبا إلى المحيط ، ويجب أن يكون الراتنج مرئيا في الفروع الجانبية الرئيسية. إذا اجتاز فص التحكم خطوة التحكم في الجودة ، يمكن مسح فصوص الاهتمام (بما في ذلك الفص الذي تم مسحه بصريا) باستخدام microCT. تظهر نتيجة البيانات المجزأة من الكبد المحقون جيدا لفأرة P15 (الشكل 4A، B) وفأر بالغ (الشكل 4C، D).
ما لا يجب القيام به
أنسجة الكبد سليمة هو شرط أساسي لحقن ناجحة. اتخاذ مزيد من الحذر عند قطع تجويف البطن والحجاب الحاجز لا ل بطريق الخطأ أنسجة الكبد. إذا كان هناك تلف مادي للكبد أثناء هذا الإجراء، فمن المرجح جدا أن يتسرب الراتنج أثناء حقن الوريد البوابي (الشكل 5A). ليس من الممكن تحقيق حقن جيدة من نظام الأوعية الدموية إذا كان الكبد معطوب جسديا.
واحدة من الأخطاء الشائعة هي ملء الكبد مع الراتنج التي يمكن أن تؤدي إلى تحديات للتصور أو التحليل. أحد أسباب ملء النظام هو تصلب الراتنج قبل الأوان في الإبرة أو طرف الأنبوب قبل اكتمال الحقن (الشكل 5B ، رؤوس الأسهم الزرقاء ، الأقواس تصور فقاعات كبيرة). وهناك ممارسة جيدة لاستخدام حقنة واحدة مجموعة لكل والعمل بسرعة بعد أن يضاف عامل المعالجة إلى الراتنج. إذا كان الراتنج يتصلب أثناء الحقن (والتي يمكن ملاحظتها من قبل نظام نصف مملوءة، وهنا تجسدت مع الوريد بوابة نصف مملوءة vasculature) إزالة الأنابيب، وقطع غيض من الأنابيب (دائما قطريا لخلق طرف مشطوف)، ودفع المكبس. إذا بدأ الراتنج بالتنقيط مرة أخرى، بعناية إعادة إدراج الأنابيب وتأمينه مع خياطة. إذا كان الراتنج قد تصلب في الإبرة، واستبدال الأنابيب تماما، وملئه مع الراتنج (تجنب فقاعات)، بعناية إعادة إدراج الأنابيب، وتأمينه مع خياطة. قد يكون من الصعب استبدال الأنابيب ، خاصة في الفئران الصغيرة بعد الولادة
وعلى العكس من ذلك، يصبح واحد أو كلاهما من الأنظمة مملوءا بالراتنج (الشكل 5D). فمن الضروري لمراقبة بصريا الكبد في جميع أنحاء الحقن. الصب النظام الصفراوي مع الراتنج هو أكثر تحديا من الصب راتنج الوريد البوابة منذ القنوات المليئة الراتنج مرئية فقط خافت على سطح الكبد، وأنه من الصعب تقييم عندما يكون النظام ممتلئا تقريبا ومتى تتوقف. عندما تظهر نقاط راتنج صفراء صغيرة على سطح الكبد (الشكل 2Ci، رأس السهم الأزرق)، وهذا هو علامة على أن يتم تعبئة النظام الصفراوي تماما، والراتنج هو بداية لتسرب من القنوات. ويمكن تصحيح تسرب الراتنج طفيفة يدويا خلال تجزئة البيانات microCT (الشكل 5D، لوحات الحق).
إذا كان ضغط الحقن مرتفعا جدا ، يمكن أن يتسبب ذلك في تمزق الأوعية أو القنوات (الشكل 5E) ، أو إتلاف الأوعية أو بنية القناة بشكل لا رجعة فيه. لن يكون الكبد مناسبا لمسح أو تحليل microCT. لتجنب تعبئة الراتنج، قم بتحسين الحجم والضغط المناسبين المستخدمين للحقن في كل نموذج فأر. عند العمل مع الفئران التي تم تحديها مع اتباع نظام غذائي سام ، أو التعديل الوراثي ، أو إصابة الكبد التي تؤثر على الأنظمة الصفراوية أو الوريدية ، أو تصلب الكبد ، قد يحتاج ضغط الحقن وحجمها إلى تعديل حيث قد يختلف الحجم والضغط المسموح به عن الفئران البرية. يصف هذا البروتوكول الحقن اليدوي للنظامين ، ولكن من الممكن توصيل المحقنة بمضخة لتوحيد ضغط الحقن. فقاعات هي آخر قطعة أثرية حقن شائعة جدا أن يؤدي إلى ملء متناثرة من الشبكات أنبوبي (الشكل 5F-H، رؤوس الأسهم الزرقاء). لتجنب تشكيل فقاعة، تأكد من أن الحقنة والأنابيب لا تحتوي على أي فقاعات، مليئة تماما مع الراتنج، والراتنج يقطر من غيض من الأنابيب قبل الحقن. يمكن تصحيح الفقاعات الصغيرة التي تظهر كمجالات سلبية على بيانات microCT يدويا أثناء خطوات ما بعد المعالجة ، على الرغم من أن هذا أمر شاق.
الطازجة هي الأفضل
استخدام الراتنج الأصفر الطازج هو عامل حاسم، مما يؤثر بشكل كبير على النقيض من الراتنجات اثنين وتجزئة البيانات microCT. عند استخدام الراتنج الطازج (الشكل 6A) هناك فرق واضح في التباين بين القنوات الصفراء الصفراء التي تحقنها الراتنج (أبيض ساطع) وعروق البوابة الخضراء التي يحقنها الراتنج (رمادي ساطع). الكبد الذي يتم حقنه مع الراتنج الطازج تتم معالجته بسهولة باستخدام العتبات العالمية الآلي. مع التخزين لفترات طويلة، والراتنج يعجل، ويقلل التباين. بعد 3 أشهر من التخزين ، يمكن أن يكون التباين كافيا لتمييز الوريد البوابي عن القناة الصفراوية (الشكل 6B) ، ولكن هطول الأمطار يؤثر على خلط الراتنجين ، والذي يظهر كتعتيم غير متجانس في الوريد البوابي المملوء (الشكل 6B ، رؤوس الأسهم الزرقاء). ويؤثر التباين غير المتجانس سلبا على العتبة الآلية ويستلزم تصحيحات يدوية، مما يزيد من وقت المعالجة. إذا كان الراتنج أقدم من ستة أشهر، فقد تدهور التباين إلى درجة أنه لا يمكن التمييز بين القناة الصفراء المحقونة من وريد البوابة الذي يتم حقنه باللون الأخضر استنادا إلى تباينها وحده (الشكل 6C). في هذه الحالة، يجب تقسيم القناة الصفراوية وعروق البوابة يدويا استنادا إلى قطرها وموقعها في منطقة الهلال ومتابعتها يدويا في جميع بيانات microCT بأكملها. هذا الإجراء هو مضيعة للوقت للغاية وأفضل تجنبها.
الشكل 1: حقن مجموعة لصب الراتنج. (أ) مجموعة الحقن # 1 تضم إبرة 30 G وأنابيب PE10 التي هي ~ 30 سم طويلة. ويتكون حقن مجموعة # 2 من إبرة 23 G وأنابيب PE50 ~ 30 سم طويلة. (ب) يتم تمديد طرف الأنابيب وقطع في زاوية لخلق تلميح مشطوف. المسطرة في A و B هي مسطرة سنتيمتر، مع زيادات رئيسية من 1 سم، وزيادات متوسطة من 5 مم، وزيادات طفيفة من 1 مم . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم بياني تدفق الصب الراتنج مزدوجة. (أ) التخطيطي الذي يظهر نظام الدورة الدموية الوريدية مورين والقلب مع الأذين الأيمن أبرز, التي ينبغي قطع بعيدا قبل التخثر, والبطين الأيسر الذي ينبغي إدخال الإبرة للتشويش لغسل الدم من نظام الدورة الدموية. وينبغي قطع كافا الوريد السفلي تحت الكلى لتخفيف ضغط الأوعية الدموية. (ب) مخطط تدفق حقن القناة الصفراوية. (1) تكبير صورة (أ) التي تصور مكان قطع IVC. '2' صورة تصور القناة الصفراوية المشتركة (خط صفراء منقط) من منطقة فرح الكبد إلى العضلة العاصرة في أودى (رؤوس الأسهم السوداء)، مع خيوط خياطة تحت القناة الصفراوية المشتركة التي تم تطهيرها. '3' وضع مناسب لعقدة فضفاضة حول القناة الصفراوية المشتركة. '4' الخط الأصفر المنقط ورؤوس الأسهم السوداء تسمية العضلة العاصرة من أودي، مما يدل على زاوية مائلة لشق وكيف ينبغي أن تظهر الفتحة بعد شق زاوية مائلة. '5' تخطيطي يبين اتجاه فتحة شطبة أنابيب PE10 (صعودا) عند الإدراج. '6' ظهور الراتنج الأصفر الذي يجري حقنه؛ الراتنج يجب أن تمر بسهولة عقدة مربوطة فضفاضة. IVC, أدنى فينا كافا; CBD، القناة الصفراوية المشتركة. (ج) مخطط تدفق حقن راتنج الوريد المدخلي. '1' الخط الأخضر المنقط يشير إلى الوريد المدخلي من منطقة الهلال. تسمية رؤوس الأسهم الزرقاء النظام الصفراوية المشغولة. '2' موقع مناسب لعقدة فضفاضة حول الوريد المدخل. '3' تخطيطي يبين الفتحة الملبدة (إلى الأعلى) عند الإدراج. '4' ظهور الكبد عند حقن الراتنج الأخضر والراتنج الأصفر؛ لاحظ الأوعية الدموية المليئة الراتنج في محيط الكبد. PV، الوريد المدخل. تم إنشاء الشكل 2A مع Biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: معالجة بيانات التصوير المقطعي المحوسب الجزئي في برامج الرسومات الحجمية. (أ) تحديد السطح، (1) تقدير قيمة النظائر (تظهر المعاينة الحالية للاختيار باللون الأصفر)، (2) التقليل من قيمة النظائر، (3) الاختيار الأمثل للنظائر لتحديد السطح السليم للوريد البوابة والقنوات الصفراوية. (ب) تقسيم منطقة الاهتمام (ROI) التي تم إنشاؤها بواسطة تحديد السطح، (1) تعيين القيمة في إطار الحوار عالية بما يكفي أن شريحة واحدة فقط (أكبر واحد) ستبقى، (2) في إطارات صفراء تظهر أصغر (مستبعدة) الجسيمات. (ج) تنعيم سطح البيانات، '1' وظيفة التنعيم على اللوحة اليسرى، '2' تعيين قوة التنعيم إلى 1 (الحد الأقصى 2) وإنشاء عائد استثمار ممهد جديد، '3' بيانات ممهدة. (د) فصل الأنظمة الأنبوبية الفردية، '1' في وظيفة تحديد السطح تعيين isovalue بحيث يتم تضمين النظام الصفراوي فقط في الاختيار (المعاينة الحالية للاختيار يظهر باللون الأصفر)، '2' وضع علامة على العائد على الاستثمار من كلا النظامين وعائد الاستثمار من النظام الصفراوي فقط وطرح عائد الاستثمار النظام الصفراوي من عائد الاستثمار لكلا النظامين، '3' وريد البوابة المبين باللون الرمادي، وهو النظام الصفراوي المبين باللون الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: القناة الصفراوية المحقونة جيدا (BD) وأنظمة الوريد البوابي (PV). (A) الفص الوسطي الأيمن المطهي بصريا (RML) من كبد ما بعد الولادة 15 (P15) الذي تم حقنه براتنجين في النظامين. شريط مقياس 1 مم (B) 3D تقديم P15 RML هو مبين في (A) تصور الأوعية الوريد البوابة في النظام الأبيض والبيلياري باللون الأخضر. شريط مقياس 1 مم (C) RML مسح بصريا من الكبد الكبار حقن مع اثنين من الراتنجات في النظامين. شريط مقياس 1 مم (D) 3D تقديم RML الكبار هو مبين في (C) تصور الأوعية الوريد البوابة في النظام الأبيض والبيلياري باللون الأخضر. H = مرح، P = الطرفية. مقياس شريط 1 مم. لوحات A, B, D يتم تكييفها بإذن من Hankeova وآخرون.9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحديات الشائعة لحقن كبد الراتنج المزدوج. (أ) تصور الصورة كبدا تم سرقته عن طريق الخطأ أثناء الفتح الأولي لتجويف البطن ، ويتسرب الراتنج من خلال القطع (رأس السهم الأزرق). (ب) سوء حقن نظام الوريد البوابة بسبب تصلب الراتنج. تسمية رؤوس الأسهم الزرقاء فروع المحطة الطرفية فارغة، والأقواس الحمراء تسمية فقاعات كبيرة. شريط المقياس 1 مم (C) نظام الوريد المدخلي الذي تم حقنه بشكل سيئ بسبب ضعف التشوه عبر القلب. تسمي رؤوس الأسهم الزرقاء الدم المرئي في فروع المحطة الطرفية. شريط مقياس 1 مم(D) نظام الصفراوية المعبأة التي تتجلى في كرات معزولة من الراتنج. تظهر الألواح اليسرى الكبد المطهي بصريا، وتظهر اللوحات اليمنى الصورة المقدمة ثلاثية الأبعاد. تصور المخططات التفصيلية الزرقاء المنقطة مناطق التكبير/ التصغير. تسمية رؤوس الأسهم السوداء جزءا من الكبد الذي تضرر أثناء المقاصة البصرية بعد المسح المجهري. يمكن أن يسبب شريط المقياس 1 مم (E) الضغط العالي أثناء حقن الراتنج تمزق الوريد البوابي (يحمل الحيوان في هذه اللوحة طفرة Jag1H268Q) ، التي تتميز برؤوس الأسهم الزرقاء. مقياس شريط 1 مم(F) فقاعات في الراتنج أثناء حقن الوريد البوابة (رؤوس الأسهم الزرقاء) و (G) حقن النظام الصفراوي (رأس السهم الأزرق)، شريط مقياس 1 مم.(H) مسح MicroCT من فقاعات (رأس السهم الأزرق)، فروع المحطة الطرفية مليئة بشكل سيئ (الأقواس الحمراء) وتسرب الراتنج (رأس السهم الأصفر)، شريط مقياس 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تباين الراتنج التفاضلي. (أ) الراتنج الأصفر المفتوح حديثا يولد تباينا كافيا لتمييز وريد البوابة المحقونة الراتنج (الرمادي) والقنوات الصفراوية (أبيض). (ب) يؤدي تخزين الراتنج الأصفر لمدة ثلاثة أشهر إلى هطول الأمطار على الراتنج مما يؤدي إلى عدم التجانس (وريد البوابة الرمادية والبيضاء، رأس السهم الأزرق). (ج) التخزين المطول (>6 أشهر) من الراتنج الأصفر يقلل من التباين بين الوريد البوابي (الرمادي) والقنوات الصفراوية (الرمادي). شريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تحدد عدة خطوات هامة نجاح DUCT، بدءا من إعداد العينة إلى معلمات جهاز CT. لتحقيق أفضل النتائج، يجب استخدام الراتنج المتناقض جيدا والمحقن جيدا والخالي من الفقاعات للسماح للمعالجة الرقمية المباشرة مع العتبة التلقائية للحصول على البيانات والصور والأفلام ثلاثية الأبعاد. مع التدريب واتباع هذا البروتوكول، 90٪ من الحقن ناجحة وتؤدي إلى بيانات قابلة للاستنساخ. من المهم استخدام الراتنج الأصفر الطازج لتحقيق أفضل تباين بين النظامين المحقونين. الراتنج الأصفر لديه تعتيم إشعاعي قوي جدا، في حين أن الراتنج الأزرق لديه تعتيم إشعاعي لا يمكن اكتشافه. يتم تحقيق أفضل النتائج خلال الأشهر الثلاثة الأولى بعد فتح زجاجة راتنج صفراء جديدة. مع مرور الوقت، والراتنج يعجل، وبعد تخزين أطول (>6 أشهر)، والراتنجات الأصفر والأخضر لم يعد يمكن تمييزها في الأشعة المقطعية. وتستلزم الصور ذات التباين الضعيف التتبع اليدوي الشامل والمستهلك للوقت وتجزئة النظامين. بعد ذلك ، لا غنى عن الأنابيب الممتدة جيدا لتناسب القناة الصفراوية الشائعة للفئران البالغة والقناة الصفراوية الشائعة وعروق البوابة للفئران بعد الولادة. يجب إنشاء نقطة الدخول للحقن بعناية. إذا تم قطع القناة الصفراوية الشائعة بشكل عرضي ، فمن المرجح أن تنفصل عن الأنسجة المحيطة ، مما يمنع الدخول الناجح للأنابيب. هذه الخطوة حساسة بشكل خاص للفئران بعد الولادة التي تتراجع فيها القناة الصفراوية الشائعة و "تجعيد الشعر" إذا انفصلت عن الأنسجة المحيطة بها ، مما يجعل إدخال الأنابيب صعبا للغاية. قد يتطلب دخول القناة الصفراوية الشائعة وحقنها بعض الممارسة. أثناء إعداد الأنابيب مع الراتنج وطوال الحقن ، وتجنب تشكيل فقاعة كما فقاعات خلق مساحة سلبية في الصور CT وتتطلب تصحيح يدوي تستغرق وقتا طويلا. من المهم تدليك الكبد بلطف عن طريق التدحرج على سطحه بمسحة قطنية مبللة أثناء وبعد إجراء الحقن لأن هذا يسهل حتى انتشار الراتنج. بعد الانتهاء من حقن وإزالة الأنابيب ، يجب تشديد عقدة خياطة الحرير بسرعة وبعناية ، لذلك لا يتدفق الراتنج من الكبد قبل أن يبوليمر تماما. من أجل التصوير الناجح بالأشعة المقطعية الدقيقة، يجب إصلاح العينة بشكل صحيح في مكانها مع الآغاروز وتكييفها حراريا للقضاء على القطع الأثرية للحركة في بيانات CT. وتكاد تكون إعدادات الاقتناء ذات أهمية رئيسية، وينبغي تحسينها إلى أقصى حد للوصول إلى دقة مكانية كافية لحل الهياكل الدقيقة.
يمكن إجراء تعديلات تقنية على إجراء الحقن لتحقيق الحقن في الفئران الأصغر سنا. حاليا، يتم تقييد الصب الراتنج من كبد الماوس الأصغر سنا من خلال توافر أنابيب رقيقة بما فيه الكفاية، مع PE10 كونها أصغر الأنابيب المتاحة تجاريا. Tanimizu وآخرون حقن بنجاح حبر الكربون في اليوم الجنيني 17 (E17) القناة الصفراوية المشتركة باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية11. ولذلك فإن الاختبار المستقبلي لما إذا كان يمكن توصيل الراتنج عن طريق الشعيرات الدموية الزجاجية سيكون ذا أهمية. تم تكييف DUCT كذلك لحقن الأنظمة الأنبوبية الأخرى مثل الشعب الهوائية ورئة الشريان الوعائي للرئتين9. ويمكن أيضا تعديل حقن الراتنج المزدوج لاستخدامه مع راتنجات أخرى متاحة تجاريا، أو يمكن استخدام هذا البروتوكول للحقن بحبر الكربون.
أحد العوامل الرئيسية المقيدة لخط أنابيب DUCT هو لزوجة الراتنج. DUCT يمكن أن تستخدم فقط لصب الراتنج من الهياكل أنبوبي فوق قطر 5 ميكرومتر. في مجموعة البيانات هذه، يمكن للراتنج اختراق أنابيب ذات قطر أصغر يبلغ 5 ميكرومتر9. هذا الحد من الحجم يحول دون تحليل القناة الدقيقة والشعيرات الدموية الصغيرة. ولمواصلة دفع خط أنابيب DUCT إلى سفن أصغر حجما، ينبغي اختبار راتنجات أخرى متاحة تجاريا، أو قد يؤدي تطوير عوامل جديدة منخفضة اللزوجة للرواية الراديوية إلى تحسين اختراق التجويف.
في Hankeova et al.9 ، تمت مقارنة DUCT بتقنيات أخرى شائعة الاستخدام ، حقن حبر الكربون المزدوج تليها إزالة الأنسجة والتصوير القياسي ، و iDISCO + مع تلطيخ الأوعية الدموية مع خلايا العضلات ألفا الملساء أكتين والقنوات الصفراوية مع cytokeratin 7 ، تليها التصوير ثلاثي الأبعاد9. تفوقت DUCT على الطريقتين الأخريين من حيث التحليل المزدوج (الذي كان تحديا ل iDISCO + بسبب ارتفاع نسبة التفلور الذاتي للكبد) والتصوير ثلاثي الأبعاد والتحديد الكمي (غير ممكن مع حقن حبر الكربون) والتجويف (توفر DUCT بيانات لبنية التجويف الداخلية وتشويش النظام). كما ذكر أعلاه، فإن القيد الرئيسي ل DUCT هو الحد الأدنى لحجم التجويف الذي يمكن حقنه وتحليله (حد 5 ميكرومتر)، وهي معلمة كان فيها أداء كل من حقن حبر الكربون وiDISCO+ أفضل. قناة متفوقة على نظام واحد الصب الراتنج3،5،6 لأنه يسمح تحليل كل نظام حقن على حدة، ويسهل أيضا التحقيق 3D مزدوجة لدراسة العلاقة المعمارية بين النظامين.
يمكن تطبيق DUCT لدراسة أي شبكتين أنبوبيتين في 3D. كدليل على المبدأ ، تم استخدام DUCT لتصور نظم الكبد الصفراوية والوريد البوابي وشرايين الشريان الرئوي والشعب الهوائية في lung9. تتطور القنوات الصفراوية داخل الرحم بجوار الوريد البوابي ، ويوفر وريد البوابة قالبا هيكليا ومركز إشارات ينظم نمو وتمايز الشجرة الصفراوية12. في هانكوفا وآخرون.9، استكشف DUCT التجديد الصفراوي في نموذج فأر لمرض الأطفال البشري متلازمة ألاجيل. كشفت DUCT عن آليات معمارية لم يتم الإبلاغ عنها من قبل أن النظام الصفراوي يستخدم لتحقيق حجم يشبه النوع البري9. استخدمت فئران متلازمة ألاجيل استراتيجيتين مختلفتين: (1) في المناطق الهلالية والوسطى من الكبد ، زاد النظام الصفراوي من تفريعه ، و (2) في محيط الكبد ، كانت القنوات الصفراوية التي تم إنشاؤها بواسطة دي نوفو ملتوية للغاية. هذان العاملان معا لتسفر عن حجم نظام الصفراوية شبه العادية، على الرغم من الهندسة المعمارية غير طبيعية. وعلاوة على ذلك، اكتشفت DUCT تفريع القناة الصفراوية غير الطبيعية التي حدثت بشكل مستقل عن تفريع الوريد البوابي والقنوات الصفراوية التي تشكل الجسور بين اثنين من الأوردة البوابة9. هذه الأنماط الظاهرية سيكون من المستحيل الكشف عنها في الصب الراتنج واحد ويمكن أن يساء تفسيرها في أقسام الهسولوجية 2D وانتشار القناة الصفراوية. وبالتالي توفر DUCT بيانات تصف البنية ثلاثية الأبعاد لشبكتين أنبوبيتين على مستوى الجهاز أو الفص بأكمله مع إمكانية التحليل الكمي النوعي والمتعمق. يمكن أن تكون DUCT معيارا جديدا لتطوير الكبد بعد الولادة وتحليلات تجديد الكبد في نماذج حيوانية مختلفة.
Disclosures
يتم تمويل مشروع منفصل في مختبر ERA من قبل ModeRNA. لم يكن ل ModeRNA أي دور في المشروع / البروتوكول الموصوف هنا.
Acknowledgments
نشكر كاري هوبرت وستايسي هوبرت على خبرتهما ومساعدتهما فيما يتعلق بتكهن القناة الصفراوية وضيافتهما المختبرية. نشكر أيضا ناديا شولتز وشارلوت ل. ماتسون لمساعدتهما في قنية الصفراوية المشتركة.
نشكر وكالات المنح التالية على دعمها:
للعمل في مختبر ERA: معهد كارولينسكا (2-560/2015-280)، ستوكهولم لانس لاندستينغ (CIMED (2-538/2014-29))، راجنر سو 6- مؤسسة stiftelse (منحة البداية للمؤسسات السويدية)، والرابطة الأوروبية لدراسة الكبد (جائزة دانيال ألاغيل)، والمؤسسة السويدية للقلب والرئة (20170723)، وفيتينسكابسراديت (2019-01350).
للعمل في مختبر JK: نحن نعترف CzechNanoLab البنية التحتية للبحوث بدعم من MEYS CR (LM2018110). ج. ك. بفضل دعم منحة FSI-S-20-6353.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| 23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
| 23 G needle | BD bioscience | 305892 | |
| 30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
| Agarose | Top-Bio | P045 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
| Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
| Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
| Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
| Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
| Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm straight |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| Isolfurane | Baxter | FDG9623 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | synthetic resin yellow |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | synthetic resin blue |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | clear resin diluent |
| Pasteur pipette | Verkon | 130.690.424.503 | |
| Peristaltic pump | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 software | Baker Hughes | CT data reconstruction software | |
| Rocker | VWR | 444-0142 | |
| Silk suture | AgnThos | 14757 | Black silk, 4-0, sterile, 100 m |
| Skin scissor | Fine Science Tools | 14058-09 | Iris straight tip 9 cm |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas micro, straight tip 2 mm |
| Syringe 1 mL Luer | BD bioscience | 303172 | |
| Tubing PE10 | BD bioscience | 427401 | |
| Tubing PE50 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |
References
- Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. On the preparation of multicolored corrosion specimens. The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).
- Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction. American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
- Sparks, E. E., et al. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Cuervo, H., et al. Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice. Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63, 550-565 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).
- Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
- Andersson, E. R., et al. Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations. Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
- Ober, E. A., Lemaigre, F. P. Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis. Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).
