डबल राल कास्टिंग माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी, या डक्ट, ऑर्गन आर्किटेक्चर के 3 डी विश्लेषण की सुविधा के लिए एक साथ दो ट्यूबलर सिस्टम के विज़ुअलाइज़ेशन, डिजिटलीकरण और विभाजन को सक्षम बनाता है। डक्ट दो रेडियोपेक रेजिन के पूर्व विवो इंजेक्शन को जोड़ती है, जिसके बाद माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी स्कैनिंग और टोमोग्राफिक डेटा का विभाजन होता है।
जिगर मनुष्यों और चूहों में सबसे बड़ा आंतरिक अंग है, और उच्च ऑटो-प्रतिदीप्ति पूरे अंग स्तर पर अंग के तीन आयामी (3 डी) वास्तुकला का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत करता है। लिवर आर्किटेक्चर को कई ब्रांचिंग लुमेनाइज्ड संरचनाओं की विशेषता है, जिसे राल से भरा जा सकता है, जिसमें संवहनी और पित्त के पेड़ शामिल हैं, अन्यथा हेपेटोसाइट-समृद्ध पैरेन्काइमा में एक अत्यधिक रूढ़िवादी पैटर्न स्थापित करते हैं। यह प्रोटोकॉल डबल राल कास्टिंग माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी, या “डक्ट” करने के लिए पाइपलाइन का वर्णन करता है। डक्ट दो अलग-अलग रेडियोपेक सिंथेटिक रेजिन के साथ पोर्टल शिरा और सामान्य पित्त नलिका को इंजेक्ट करने पर जोर देता है, जिसके बाद ऊतक निर्धारण होता है। एक पालि, या पूरे जिगर को साफ करके गुणवत्ता नियंत्रण, एक ऑप्टिकल समाशोधन एजेंट के साथ, उपयुक्त रूप से इंजेक्ट किए गए नमूनों की पूर्व-स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है। डक्ट पाइपलाइन के दूसरे भाग में, एक लोब या पूरे जिगर का उपयोग माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी) स्कैनिंग, (अर्ध-) स्वचालित विभाजन, और पोर्टल शिरापरक और पित्त नेटवर्क के 3 डी प्रतिपादन के लिए किया जा सकता है। माइक्रोसीटी के परिणामस्वरूप दो रेजिन के लिए 3 डी समन्वय डेटा होता है जो दो प्रणालियों के गुणात्मक और साथ ही मात्रात्मक विश्लेषण और उनके स्थानिक संबंधों के लिए अनुमति देता है। डक्ट को प्रसवोत्तर और वयस्क माउस जिगर पर लागू किया जा सकता है और इसे अन्य ट्यूबलर नेटवर्क तक बढ़ाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, फेफड़ों में संवहनी नेटवर्क और वायुमार्ग।
ऑर्गन राल कास्टिंग एक तकनीक है जो 17 वीं शताब्दी 1 में वापस आती है। आधुनिक राल कास्टिंग के पहले उदाहरणों में से एक एक ऑटोप्सी से मानव जिगर पर किया गया था। इंट्राहेपेटिक पित्त नलिकाओं को जिलेटिन के साथ मिश्रित एक विपरीत एजेंट से भरा गया था, इसके बाद एक्स-रे सीटी स्कैन 2 के साथ इमेजिंग की गई थी। DUCT तकनीक का उद्देश्य 3 डी में, अग्रानुक्रम में, दो ट्यूबलर राल-कास्ट किए गए नेटवर्क की कल्पना, डिजिटलीकरण और विश्लेषण करना है।
DUCT एकल-प्रणाली जिगर राल कास्टिंग 3,4,5,6,7,8 के व्यापक मौजूदा ज्ञान पर आधारित है और एक साथ 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और दो systems9 के विश्लेषण के लिए विस्तारित है। डक्ट ने अलग-अलग विपरीत के दो रेडियोपेक रेजिन को मिलाकर और इन रेजिन को दो अलग-अलग नेटवर्कों में इंजेक्ट करके, विशेष रूप से आम पित्त नलिका और पोर्टल शिरा को डबल राल कास्टिंग के लिए उन्नत किया। डक्ट को प्रसवोत्तर दिन 15 (पी 15) के रूप में जल्दी के रूप में पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के साथ युवा प्रसवोत्तर चूहों पर लागू किया जा सकता है। माइक्रोस्कोपी-आधारित इमेजिंग तकनीकों की तुलना में, मुख्य लाभ यह है कि DUCT तेज, एंटीबॉडी-मुक्त है, और यकृत ऊतक autofluorescence इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। इसके अलावा, DUCT लुमेनाइजेशन स्थिति, आंतरिक व्यास, नेटवर्क कनेक्टिविटी और परफ्यूजन का वर्णन करने वाला मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है। लुमेन बनाने वाली कोशिकाओं की उपस्थिति और ट्यूबों में उनके वास्तविक मॉर्फोजेनेसिस के बीच अंतर उन अंगों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है जिनमें डक्टुलर कोशिकाएं मौजूद हैं लेकिन ट्यूब नहीं बनाती हैं, जैसा कि अलागिल सिंड्रोम 10 में हो सकता है। डक्ट का मुख्य नुकसान राल का सीमित प्रवेश है, जो चिपचिपा है और एक छोटे से कैलिबर (<5 μm) के साथ ट्यूबों में प्रवेश नहीं करता है। इंजेक्शन प्रवेश बिंदु को निर्धारित करने के बाद डक्ट को किसी भी ट्यूबलर संरचना के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि धमनी और शिरापरक संचार प्रणाली, वायुमार्ग, एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिका, या लसीका वाहिकाएं। इस प्रकार यह फेफड़ों और अग्न्याशय जैसे अन्य ऊतकों के पूरे अंग वास्तुकला विश्लेषण की सुविधा प्रदान कर सकता है।
MicroCT खंडित छवियों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है, जैसे कि ImageJ, या कस्टम-लिखित पाइपलाइन (उदाहरण के लिए, MATLAB)। राल-इंजेक्टेड जिगर का विश्लेषण नेटवर्क विस्तार और कनेक्टिविटी के लिए गुणात्मक रूप से किया जा सकता है या मात्रात्मक रूप से मात्रा, लंबाई, ब्रांचिंग, एक एकल प्रणाली की टॉर्टुओसिटी के लिए, और दो प्रणालियों के बीच की बातचीत जैसे कि दो प्रणालियों के बीच की दूरी, या ब्रांचपॉइंट निर्भरता (क्या सिस्टम 1 शाखा सिस्टम 2 ब्रांचिंग की निकटता में है?)। राल इंजेक्शन, माइक्रोसीटी स्कैनिंग, और सीटी डेटा विभाजन को शामिल करने वाली डक्ट पाइपलाइन, दो ट्यूबलर प्रणालियों के वास्तुशिल्प तंत्र के विस्तृत मात्रात्मक विश्लेषण के साथ संयुक्त, पशु मॉडल में पूरे जिगर के विश्लेषण के लिए एक मानक प्रदान कर सकती है।
कई महत्वपूर्ण कदम DUCT सफलता का निर्धारण, नमूना तैयारी से लेकर सीटी डिवाइस के मापदंडों तक। सर्वोत्तम परिणामों को प्राप्त करने के लिए, 3 डी डेटा, छवियों और फिल्मों को प्राप्त करने के लिए स्वचालित थ्रेशोल्डिंग के साथ सीधे डिजिटल प्रसंस्करण की अनुमति देने के लिए अच्छी तरह से विपरीत, अच्छी तरह से इंजेक्ट किया गया, और बुलबुला-मुक्त राल का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रशिक्षण के साथ और इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, 90% इंजेक्शन सफल होते हैं और इसके परिणामस्वरूप पुन: प्रस्तुत करने योग्य डेटा होता है। दो इंजेक्टेड सिस्टम के बीच सबसे अच्छा विपरीत प्राप्त करने के लिए ताजा पीले राल का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। पीले राल में एक बहुत मजबूत रेडियोपेसिटी होती है, जबकि नीले राल में अनिर्धारित रेडियोपेसिटी होती है। शीर्ष परिणाम एक नई पीली राल की बोतल खोलने के बाद पहले तीन महीनों के भीतर प्राप्त किए जाते हैं। समय के साथ, राल अवक्षेप, और लंबे समय तक भंडारण (>6 महीने) के बाद, पीले और हरे रंग के रेजिन अब सीटी स्कैन में अलग-अलग नहीं होंगे। खराब विपरीत के साथ छवियों को व्यापक और समय लेने वाली मैनुअल ट्रेसिंग और दो प्रणालियों के विभाजन की आवश्यकता होती है। इसके बाद, अच्छी तरह से फैला हुआ ट्यूबिंग वयस्क चूहों और सामान्य पित्त नलिका और प्रसवोत्तर चूहों की पोर्टल नस के सामान्य पित्त नलिका में फिट होने के लिए अपरिहार्य है। इंजेक्शन के लिए प्रवेश बिंदु को देखभाल के साथ बनाया जाना चाहिए। यदि आम पित्त नलिका को पार करने के लिए खुला काट दिया जाता है, तो यह आसपास के ऊतकों से अलग होने की संभावना है, जिससे टयूबिंग के सफल प्रवेश को रोका जा सकता है। यह कदम प्रसवोत्तर चूहों के लिए विशेष रूप से नाजुक है जिसमें आम पित्त नलिका वापस ले लेती है और “कर्ल अप” करती है यदि यह अपने आसपास के ऊतकों से अलग हो गई है, जिससे टयूबिंग का सम्मिलन बेहद चुनौतीपूर्ण हो जाता है। सामान्य पित्त नलिका प्रविष्टि और इंजेक्शन को कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है। राल के साथ टयूबिंग तैयार करते समय और पूरे इंजेक्शन में, बुलबुले के गठन से बचें क्योंकि बुलबुले सीटी छवियों में नकारात्मक स्थान पैदा करेंगे और समय लेने वाले मैनुअल सुधार की आवश्यकता होगी। इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान और बाद में एक गीले कपास झाड़ू के साथ अपनी सतह पर रोलिंग करके धीरे से जिगर की मालिश करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह राल फैलाने की भी सुविधा प्रदान करता है। इंजेक्शन के पूरा होने और टयूबिंग को हटाने के बाद, रेशम सीवन गाँठ को जल्दी और सावधानी से कसना चाहिए, इसलिए राल पूरी तरह से पॉलिमराइज़ होने से पहले जिगर से बाहर नहीं निकलता है। सफल माइक्रोसीटी इमेजिंग के लिए, नमूने को सीटी डेटा में आंदोलन कलाकृतियों को खत्म करने के लिए एगारोज़ और थर्मल रूप से अनुकूलित के साथ ठीक से तय किया जाना चाहिए। अधिग्रहण सेटिंग्स भी महत्वपूर्ण महत्व की हैं, जिन्हें ठीक संरचनाओं को हल करने के लिए पर्याप्त स्थानिक संकल्प तक पहुंचने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
छोटे चूहों में इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया में तकनीकी संशोधन किए जा सकते हैं। वर्तमान में, युवा माउस लिवर की राल कास्टिंग पर्याप्त रूप से पतली टयूबिंग की उपलब्धता से सीमित है, जिसमें PE10 सबसे छोटा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध टयूबिंग है। Tanimizu et al. सफलतापूर्वक भ्रूण दिवस 17 (E17) आम पित्त नलिका में कार्बन स्याही इंजेक्ट कांच केशिकाओं 11 का उपयोग कर. भविष्य का परीक्षण कि क्या राल को ग्लास केशिका के माध्यम से वितरित किया जा सकता है, इसलिए ब्याज का होगा। डक्ट को अन्य ट्यूबलर प्रणालियों जैसे वायुमार्ग और फेफड़ों के फुफ्फुसीय धमनी वास्कुलचर को इंजेक्ट करने के लिए आगे अनुकूलित किया गया था9। डबल राल इंजेक्शन को अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रेजिन के साथ उपयोग करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, या इस प्रोटोकॉल का उपयोग कार्बन स्याही वाले इंजेक्शन के लिए किया जा सकता है।
डक्ट पाइपलाइन के मुख्य सीमित कारकों में से एक राल चिपचिपाहट है। डक्ट का उपयोग केवल 5 μm के व्यास से ऊपर ट्यूबलर संरचनाओं के राल कास्टिंग के लिए किया जा सकता है। इस डेटा सेट में, राल 5 μm9 के सबसे छोटे व्यास के साथ ट्यूबों में प्रवेश कर सकता है। यह आकार सीमा ठीक ductules और छोटे केशिकाओं के विश्लेषण को रोकती है। छोटे कैलिबर जहाजों के लिए डक्ट पाइपलाइन को आगे बढ़ाने के लिए, अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रेजिन का परीक्षण किया जाना चाहिए, या नए कम चिपचिपाहट वाले रेडियोपेक एजेंटों के विकास से लुमेन प्रवेश में सुधार हो सकता है।
Hankeova et al.9 में, DUCT की तुलना दो अन्य आमतौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीकों से की गई थी, डबल कार्बन स्याही इंजेक्शन के बाद ऊतक समाशोधन और मानक फोटोग्राफी, और अल्फा-चिकनी मांसपेशी कोशिका एक्टिन के साथ रक्त वाहिकाओं के धुंधला होने के साथ iDISCO + और साइटोकेराटिन 7 के साथ पित्त नलिकाएं, इसके बाद 3 डी इमेजिंग 9। डक्ट ने दोहरे विश्लेषण के संदर्भ में अन्य दो तरीकों को पछाड़ दिया (जो उच्च यकृत ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण iDISCO + के लिए चुनौतीपूर्ण था), 3 डी इमेजिंग, और परिमाणीकरण (कार्बन स्याही इंजेक्शन के साथ संभव नहीं), और लुमेनाइजेशन (डक्ट आंतरिक लुमेन आर्किटेक्चर और सिस्टम परफ्यूजन के लिए डेटा प्रदान करता है)। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, DUCT की मुख्य सीमा न्यूनतम लुमेन आकार है जिसे इंजेक्ट किया जा सकता है और विश्लेषण किया जा सकता है (5 μm सीमा), एक पैरामीटर जिसमें कार्बन स्याही इंजेक्शन और iDISCO + दोनों ने बेहतर प्रदर्शन किया। डक्ट एकल सिस्टम राल कास्टिंग 3,5,6 से बेहतर है क्योंकि यह प्रत्येक इंजेक्ट किए गए सिस्टम के विश्लेषण की अनुमति देता है और दो प्रणालियों के बीच वास्तुशिल्प संबंध का अध्ययन करने के लिए दोहरी 3 डी जांच की सुविधा भी देता है।
डक्ट को 3 डी में किसी भी दो ट्यूबलर नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, DUCT का उपयोग जिगर पित्त और पोर्टल शिरा प्रणालियों और फेफड़े में फुफ्फुसीय धमनी वास्कुलचर और वायुमार्ग की कल्पना करने के लिए किया गया था। इंट्राहेपेटिक पित्त नलिकाएं पोर्टल शिरा के बगल में विकसित होती हैं, और पोर्टल शिरा एक संरचनात्मक टेम्पलेट और सिग्नलिंग केंद्र प्रदान करती है जो पित्त ट्री 12 के विकास और भेदभाव को नियंत्रित करती है। Hankeova et al.9 में, DUCT ने मानव बाल रोग Alagille सिंड्रोम के लिए माउस मॉडल में पित्त पुनर्जनन का पता लगाया। डक्ट ने पहले से अप्रकाशित वास्तुशिल्प तंत्र का खुलासा किया कि पित्त प्रणाली ने जंगली-प्रकार-जैसे वॉल्यूम 9 को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया था। अलागिल सिंड्रोम चूहों ने दो अलग-अलग रणनीतियों का उपयोग किया: (1) जिगर के हिलर और केंद्रीय क्षेत्रों में, पित्त प्रणाली ने अपनी शाखाओं में वृद्धि की, और (2) जिगर की परिधि में, डे नोवो-जनित पित्त नलिकाएं अत्यधिक टॉर्चर थीं। इन दो कारकों को असामान्य वास्तुकला के बावजूद, एक निकट-सामान्य पित्त प्रणाली की मात्रा उत्पन्न करने के लिए संयुक्त किया जाता है। इसके अलावा, DUCT ने असामान्य पित्त नलिका ब्रांचिंग का पता लगाया जो पोर्टल शिरा ब्रांचिंग और पित्त नलिकाओं से स्वतंत्र होकर दो पोर्टल नसों के बीच कनेक्टिंग पुल ों का निर्माण करता है। इन फेनोटाइप्स को एकल राल कास्टिंग में पता लगाना असंभव होगा और पित्त नलिका प्रसार के रूप में 2 डी हिस्टोलॉजिकल वर्गों में गलत व्याख्या की जा सकती है। DUCT इस प्रकार गुणात्मक और गहराई से मात्रात्मक विश्लेषण की संभावना के साथ पूरे अंग या लोब स्तर पर दो ट्यूबलर नेटवर्क के 3 डी आर्किटेक्चर का वर्णन करने वाला डेटा प्रदान करता है। डक्ट विभिन्न पशु मॉडलों में प्रसवोत्तर जिगर के विकास और यकृत पुनर्जनन विश्लेषण के लिए एक नया मानक हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम अपनी विशेषज्ञता के लिए कारी Huppert और स्टेसी Huppert धन्यवाद और पित्त नलिका cannulation और उनके प्रयोगशाला आतिथ्य के बारे में मदद. हम आम पित्त नलिका कैनुलेशन के साथ उनकी मदद के लिए नदजा शुल्ज़ और चार्लोट एल मैटसन को भी धन्यवाद देते हैं।
हम उनके समर्थन के लिए निम्नलिखित अनुदान एजेंसियों को धन्यवाद देते हैं:
ईआरए लैब में काम के लिए: कैरोलिंस्का इंस्टीट्यूट (2-560/2015-280), स्टॉकहोम्स लांस लैंडस्टिंग (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (स्वीडिश फाउंडेशन ‘स्टार्टिंग ग्रांट), यूरोपीय एसोसिएशन फॉर द स्टडी ऑफ द लिवर (डैनियल अलागिल अवार्ड), स्वीडिश हार्ट-लंग फाउंडेशन (20170723), और वेटेन्सकाप्स्राडेट (2019-019)।
जेके लैब में काम के लिए: हम MEYS CR (LM2018110) द्वारा समर्थित चेकनानोलैब रिसर्च इन्फ्रास्ट्रक्चर को स्वीकार करते हैं। जे.के. अनुदान FSI-S-20-6353 के समर्थन के लिए धन्यवाद.
1.5 mL SafeSeal micro tubes | Sarstedt | 72.706 | |
23 G butterfly needle with tubing | BD bioscience | 367283 | |
25 G needle | BD bioscience | 305122 | |
30 G needle | BD bioscience | 305106 | |
Agarose | Top-Bio | P045 | |
Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 108006 | |
Benzyl benzoate | Sigma Aldrich | B6630 | |
Corning 50 mL tubes | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | polypropylene |
Cotton swabs | Medicarier | 60406 | |
Dissection Microscope | Leica Camera AG | Leica M60 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
Ethanol 70% | VWR | 83801.41 | |
Falcon tube 15 mL | Verkon | 331.850.084.006 | |
Forceps curved | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm curved |
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Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | micro computed tomography scanner | |
Hanks' Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
Heparin | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
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VG Studio MAX 3.3 software | Volume Graphics GmbH | CT data processing and analysis software |